CS268803B2

CS268803B2 - Pesticide

Info

Publication number: CS268803B2
Application number: CS856546A
Authority: CS
Inventors: John Barrie Dr Ward; Hazel Mary Noble; Neil Dr Porter; Richard Alan Dr Fletton; David Noble
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1984-09-14
Filing date: 1985-09-13
Publication date: 1990-04-11
Also published as: RO92478A; SE8802985D0; BE903232A; IL76385A; FI87366C; PT81125B; ATA268485A; US4935531A; PL152148B1; BG44205A3; DK418085D0; SE8802985L; FI87366B; IL76385A0; JP2566385B2; PH21995A; FR2570390A1; ES557237A0; DK162099C; SE469173B

Description

Vynález ее týká způsobu výroby pesticidního prostředku e obsahem nových antibiotik, která je možno získat fermentaci mikroorganismů z čeledi Streptomyces.

Jde o novou třídu antibiotik, která je označena antibiotika S541. Tyto látky je možno připravit pěstováním mikroorganismů za řízených podmínek, к fermentaci se použije nový, dosud nepopsaný kmen mikroorganismů. Antibiotika S541 mají antibiotickou a zejména antifungální, insekticidní, nematocidní a akaricidní účinnost a mají velký význam při použití v zemědělství a zahradnictví. Tyto látky je rovněž možno užít jako meziprodukty pro výrobu dalších účinných sloučenin. Po uskutečněné fermentaci je možno svrchu uvedené nové sloučeniny získat v podstatě v čistém stavu, jak bude dále uvedeno.

Předmětem vynálezu je pesticidní prostředek, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje 0,01 až 99 % hmotnostních antibiotika obecného vzorce III

kde

R¹ znamená methyl, ethyl nebo isopropyl a

R znamená atom vodíku nebo methyl. ·

Vynález se týká způsobu výroby sloučenin obecného vzorce III, a to jednotlivě nebo ve směsích. Pro některé použití, například v zemědělství nebo zahradnictví může být vhodnější použít antibiotikum S541 bez dělení jednotlivé složky, avSak v jiných případech může být výhodnější užít jednotlivé sloučeniny. Vynález se tedy týká způsobu výroby sloučenin jednotlivě i ve vzájemné směsi alespoň dvou sloučenin ve v podstatě čisté formě nebo alespoň ve stavu, prostém jiných makrolidních sloučenin.

Předmětem vynálezu je tedy způsob výroby nového antibiotika obecného vzorce III

OH

kde

R¹ znamená methyl, ethyl nebo ieopropyl a o

R znamená atom vodíku nebo methyl, účinného podle bodu 1, vyznačující se tím, že se pěstuje mikroorganismus z čeledi Streptomyces thermoarchaensis, a to Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015, 12111, 12112, 12113 nebo 12114 za aerobních podmínek za přítomnosti využitelných zdrojů uhlíku, dusíku a anorganických solí, při teplotě 20 až 50 °C, při pH 5,5 až 8,5 po dobu alespoň 2 dny do nahromadění antibiotika, načež se popřípadě ze živného prostředí izoluje alespoň jedna sloučenina obecného vzorce III.

Antibiotikum S541, tak jak bylo původně izolováno, je možno chromatografií na oxidu křemičitém rozdělit, jak bude dále popsáno. Získají se dvě složky в antibiotickým, například anthelmintickým účinkem e fluorescencí v ultrafialovém světle při 254 nm. Složka I (R₂ znamená methyl) má hodnotu Rf v rozmezí 0,70 až 0,75 a složka II (R₂ znamená atom vodíku) má hodnotu Rf v rozmezí 0,39 až 0,46 při stanovení chromatografií na tenké vrstvě při použití desek z oxidu křemičitého (Merck 5735 silica 60), jako rozpouštědlo se užije směs chloroformu a ethylacetátu v poměru 3 ^: 1·

Složky I а II je možno dávat čistit, čímž ee získá šest sloučenin parciálního vzorce I s antibiotickým, například anthelmintickým účinkem.

Sloučeniny vzorce III byly tedy označeny jako faktor A (R¹ = isopropyl, R² = atom vodíku),

2 faktor В (R = methyl, R = methyl),

2 faktor C (R = methyl, R = atom vodíku), faktor D (R1 = ethyl, R² = atom vodíku), faktor E (R¹ = ethyl, R² = methyl) a _ faktor F (R¹ = ieopropyl, R² = methyl).

Faktory A a C jsou ze všech svrchu uvedených faktorů nejvýhodnější.

Faktory В, E a F je možno získat ze složky I, kdežto faktory A, C a D je možno získat ze složky II.

Sloučeniny obecného vzorce III jsou účinné proti ektoparasitům.

CS 268ΘΟ3 B2:

Příkladem ektoparasitů, které napadají zvířata mohou býti ektoparasiti typu arthropodů, například bodavý hmyz, jako komár, ovád, vosy a dále celý hmyz, například diptěra.

Příkladem rodů těchto ektoparasitů, kteří mohou napadat zvířata, mohou být: Ambylomma, Boophilus, Ceroptes, Culliphore, Damodex, Damolinia, Gastrophilus, Haematobia, Haematopinus, Haemophysalie, Hyalomma, Linognathus, Lucilia, Melophygus, Cestrus, Psororgates, Psoroptes, Hhipicephalus, Sarcoptes a Stemoxys.

Sloučeniny, vyrobené způsobem podle vynálezu, mají antifungální účinek, například proti kmenům čeledi Candida, jako Candida albicans a Candida glabrata a proti kvasinkám, například Saccharomyces carlebergensis.

Sloučeniny, vyrobené způsobem podle vynálezu, jsou účinné také proti volně žijícím nematodům Ceanorhabditis oleganz.

Tyto látky jsou účinné také proti hmyzu, roztočům a nematodům v zemědělství, zahradnictví, lesnictví a při skladování různých produktů. Je možno úspěšně chránit půdu a plodiny proti těmto škůdcům, včetně obilovin, jako pšenice, ječmene, kukuřice a rýže, zeleniny, například sóji, ovoce, jako jablek, vinné révy a citrusových plodů i kořenových plodin, jako cukrové řepy, brambor apod.

Zvláště bylo prokázáno, že sloučeniny, vyrobené způsobem podle vynálezu jsou účinné proti mšicím a jinému hmyzu na ovoci, například proti Aphis fabae, Aulacorthum circumflexus, Myzua persica, Nophetettix cinocticep6, Nilparvata lugena, Panohychus ulmi, Phorodon humuli, Phyllecoptruta oleivora, Tetranychus urticae a proti členům rodu Trialeuroides, proti nematodům, například členům rodu Aphelencoides, Globodera, Heterodera, Moloidogyne a Panagrellus, proti čeledi lepidoptera, jako Heliothiz, Plutella a Spodoptera, proti škůdcům obilovin, jako Anthonomus grandis a Sitophilus granarius, proti pilousům Tribolium castancum, mouchám, jako Musea domestica, jepicím, škůdcům žijícím na listech Pear psylla a Thrips tabaci, švábům, jako Blatella germanica a Periplaneta americana a moskytům, jako Aedes negypti.

Sloučeniny obecného vzorce III je tedy možno užít jako antibotika. Zejména je možno je užít v zemědělství, zahradnictví a lesnictví, jako pesticidy к hubení hmyzu, roztočů a nematodů. Je možno je rovněž obecně užít jako pesticidy к potlačení jakýchkoliv škůdců za jiných podmínek, například ve skladech, budovách a v jiných veřejných místech nebo kdekoliv jinde, kde se mohou škůdci vyskytovat. Sloučeniny mohou být naneseny na rostliny nebo přímo na škůdce nebo na místo, kde se škůdce vyskytuje. Zvláště výhodné jsou svrchu uvedené faktory, А, В, C, D, E a F. Sloučeniny, vyrobené způsobem podle vynálezu, je možno zpracovávat na prostředky, vhodné pro aplikaci. Tyto prostředky obsahují obvykle určité množství vhodných nosičů. ·

Sloučeniny, vyrobené způsobem podle vynálezu je možno dále zpracovávat do formy prášků, sprejů nebo koupelí.

Sloučeniny, vyrobené způsobem podle vynálezu, je možno zpracovávat také vhodným obvyklým způsobem pro použití v zemědělství nebo zahradnictví na prostředky, které jako účinnou složku obsahují sloučeniny, vyrobené způsobem podle vynálezu. Tyto prostředky mohou dále obsahovat různé pomocné látky a mohou být pevného nebo kapalného typu, takže jde například o poprašky včetně koncentrátů, prášky, včetně rozpustných a smáčivých prášků, o granuláty včetně mikrogranulí a dispergovaných granulí, pelety, emulze, například zředěné emulze a emulgovatelné koncentráty, roztoky určené к moření» například к moření kořenů nebo semen, olejové koncentráty, olejové roztoky a prostředky, určené ke vstřikování, například do stébla, dále spraye, prostředky určené к zakuřování а к tvorbě mlhoviny.

Prostředky tohoto typu obsahují obvykle sloučeninu, vyrobenou způsobem podle vynálezu, spolu e vhodným nosičem nebo ředidlem. Tyto nosiče mohou být kapalné nebo pevné povahy a jsou určeny к usnadnění aplikace sloučeniny buá tak, že sloučenina je dispergována před použitím nebo že je dodáván prostředek, z něhož si uživatel může dispergovatelný prostředek připravit. Tyto formy jsou v oboru dobře známé a je možno je získat různým způsobem, například tak, že se mísí a/nebo mele účinná složka nebo účinné složky spolu в nosičem nebo ředidlem, například pevným nosičem, rozpouštědlem nebo smáčedlem.

Vhodné pevné nosiče, určené pro použití například v poprašcích, granulátech nebo práficích, je možno volit z přírodních, minerálních plniv, jako j6ou diatomit, mastek, kaolinit, montmorillonit, pyrophylit nebo attapulgit. Doprostřed je možno popřípadě včlenit vysoce dispergovanou kyselinu křemičitou nebo vysoce dispergované absorbující polymery. Granulované nosiče, které je možno v tomto případě použít, mohou být porézní, jako jsou pemza, drcené cihly, sepiolit nebo bentonit nebo neporézní, například kalcit nebo písek. Vhodnými, předem granulovanými materiály, které je možno použít a které mohou být organického nebo anorganického původu, jsou například dolomit nebo také mleté rostlinné zbytky.

Vhodnými rozpouštědly pro použití jako nosiče nebo jako ředidla, jsou například aromatické uhlovodíky, alifatické uhlovodíky, alkoholy a glykoly nebo ethery glykolů, estery, ketony, amidy kyselin, silně polární rozpouštědla, rostlinné oleje, popřípadě epoxidované, á voda.

Běžná smáčedla neiontového, kationtového nebo aniontového typu jsou například ethoxylované alkylfenoly a alkoholy, soli kyselin alkylbenzensulfonových в alkalickými kovy nebo s kovy alkalických zemin, tytéž soli 8 kyselinami lithnosulfonovými nebo sulfojantarovými, dále sulfonáty polymerních fenolů, které mají dobrou účinnost jako emulgační činidla, dispergační činidla, a/nebo smáčedla. Všechny tyto látky je možno užít jednotlivě nebo ve směsích.

Do uvedených prostředků je možno včlenit také stabilizátory, prostředky proti spékání, protipěnivá činidla, regulátory, viskozity, pojivá a lepidla, fotostabilizátory, hnojivá, stimulační látky nebo jiné dalSÍ účinné látky. Do prostředků, které obsahují sloučeniny, vyrobené způsobem podle vynálezu, je možno přidávat dalSÍ insekticidy, akaricidy a nematócidní látky.

Koncentrace účinné látky v prostředku se obvykle pohybuje v rozmezí 0,01 až 99 s výhodou 0,01 až 40 % hmotnostních.

Obchodní produkty se obvykle dodávají jako koncentrované prostředky, které se pak ředí na přísluSnou koncentraci účinné látky, například 0,001 až 0,0001 % hmotnostních těsně před použitím.

Pro použití v zemědělství a zahradnictví může být žádoucí použití celého fermentačního prostředí bez dělení na složky nebo faktory jako zdroj účinné látky. Může být vhodné užít suSené živné prostředí s obsahem mycelia nebo je možno použít rozruěené myselium, živé nebo mrtvé myselium, oddělené od živného prostředí slitím nebo filtrací nebo odpa- ·> řením, popřípadě je možno užít fermentační prostředí, které zbývá, po oddělení mycelia. V případě potřeby je možno mycelium podrobit pasterizaci nebo s výhodou-myčelium sušit, například rozprašováním nebo suěením v bubnu. Mycelium nebo živné prostředí je možno také zpracovávat na prostředky, které obsahují běžné inertní nosiče nebo ředidla, jak již bylo 8vrchu uvedeno.

Je zřejmé, že obecně Je možno užít sloučeniny, vyrobené způsobem podle vynálezu к potlačování zamoření tak, že se organismy, odpovědné za infekci nebo zamoření nebo místo, na němž se tyto organismy nacházejí, vystaví působení jedné nebo většího počtu sloučenin vyrobených způsobem podle vynálezu.

Na základě taxonomických studií se užije к pěstování zvláštního mikroorganismu,který je schopen produkovat svrchu uvedené látky, jde o nový kmen Streptomyces, který byl pojmenován Streptomyces thermoarchaensis. Vzorek tohoto mikroorganismu, který byl izolován z půdy, byl uložen ve veřejné sbírce kultur National CoUections of Industrial and Marině Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Velká Británie, a byl označen číslem NCIB 12015· Morfologické a růstové vlastnosti Streptomyces thermoarchsensis NC1B 12015 budou dále uvedeny a bude také popsán způsob výroby antibiotika S541 pomocí uvedeného kmene i dalších kmenů Streptomyces· Vynález se zvláště týká způsobu výroby uvedených látek pomocí nových čeledí Streptomyces, jejichž zástupci mají stejné zásadní morfologické i růstové vlastnosti jako Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015.

Vynález se rovněž týká způsobu výroby dalších sloučenin,které jsou rovněž produkovány pěstováním S. thermoarchaensis NCIB 12015 a které je možno považovat za optické isomery sloučenin obecného vzorce I.

Použitým organismem rodu Streptomyces je s výhodou Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 nebo některá z jeho mutant.

Mutanty Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 mohou vzniknout spontánně nebo je možno je získat různými způsoby, tak jak jsou shrnuty například v publikaci Techniques for the Development of Micro-organisms, Η. I. Adler v Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms, Proceedings of the Symposium, Vídeň 1973, str. 241, International Atomic Energy Authority. Tyto způsoby zahrnují ionizační záření, chemické metody, například zpracování pomocí N-methyl-N*-nitro-N-nitrosoguanidinu (NIG), teplo, genetické způsoby, například rekombinaci, transdukci, transformaci, zpracování pomocí látek, rozrušujících buňky a selektivní způsoby pro vyvolání spontánních mutací· Tímto způsobem byl jako mutanta získán ve čtyřech variantách kmen Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015, každá ze získaných mutant byla uložena ve veřejné sbírce kultur National Collections of Industrial and Marině Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Velká Británie pod čísly NCIB 12111, NCIB 12113, NCIB 12113 a NCIB 12114. К výrobě účinných látek je tedy možno užít Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111, 12112,12113 a 12114 a jakékoliv mutanty tohoto kmene.

Mutanty NCIB 12111, 12112 a 12113 byly odvozeny tak, že spory Streptomyces thermoarchaen8i8 NCIB 12015 byly zpracovávány působením NIG a pak byly jejich vlastnosti určeny způsobem uvedeným v publikaci R. Holliday (1956) Nátuře 178 987.

Mutanta NCIB 12114 vzniká spontánní mutací kmene Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 a bylo prokázáno, že je odolná proti Streptomycinu tak, že byla pěstována na přítomnosti 100 yUg/ml streptomycineulfátu při teplotě 28 °C 5 dní.

Taxonomické studie ukazují, že Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 je dříve neznámý mikroorganismus nové čeledi, jehož vlastnosti budou dále popsány a jsou v podstatě společné pro celou čeleí. Je zapotřebí uvést, že к provádění způsobu podle vynálezu je možno užít všechny členy této čeledi a jakýkoliv jiný další organismus, který má v podstatě stejné základní vlastnosti·

Na výhodných sporulačních prostředích, kterými jsou agar s ovesnou moukou, agar se sladem a extraktem z kvasnic a agar s anorganickými solemi a Škrobem (Shirling, E.B. в Gottlieb, D. (1966) Ing. J. Syst. Bacteriol· 16, 313-340, Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 bohatě roste a produkuje v substrátu stále mycelium a mimoto vzdušné mycelium, které nese spory v otevřených spirálových řetězcích jako postranní ramena hlavní hyfy. Na těchto prostředích má zadní strana kultury Žlutý až hnědý nádech a sporofory jsou šedé. Při zvětšení spektra je možno pozorovat, že sporofory tvoří řetězce o 5 otáčkách spirály, přičemž každá otáčka je tvořena 5 až 10 sporami. Průměrně obsahují sporofory 20 až 50 spor. V elektronovém mikroskopu ve zvětšení 12000x je možno pozorovat, Že spory mají hladkou stěnu a elipsovitý tvar při rozměrech 0,7 x 1,4 um v nej širším místě.

CS 268803 В2;

Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 je gram-positivní a je achopen růst a vytvářet spory při teplotě v rozmezí 20 až 50 °G.

Při srovnání svrchu uvedených údajů в uveřejněným popisem v Bergey*s Manual of Determinative Bacteriology (8. vydání) se uvádí, že vlastnosti, které jsou připisovány Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 odpovídají rodu Streptomyces.

Identifikace Streptomyces thermoarchaeneis NCIB 12015 na úrovni čeledi bylo provedeno pomocí počítače tak, jak Je uvedeno v publikaci Williame a další (J. Gen. Microbiol (1983) 129, 1815-1830). Výsledky 41 taxonomických testů, popsaných svrchu uvedenými autory, jsou pro Streptomyces thermoarchaenBÍB NCIB 12015 následující:

vlastnost . hodnocení řetězce spor:

verticillatiretinaculiapertirectiflexibilesspirales * fragmentace myceliapovrch spor:

hladký+ dřenýbarva spor,

Sedá * černázelenázadní strana kultury:

žlutá až hnědá * červená až oranžováprodukce melaminuvyužití živin:

adonitolcellcbiosa+

D-fruktóza+ me8oino8itolinulin * mannitolraffinóza♦ rhamnóza+

D-xylóza .+ kyselina DL-ot -aminomáselnáL-histidin♦

L-hydroxyprolinrozklad allantoinu+ rozklad arbutinu+ rozklad xanthinu+ rozklad pektinu+ rozklad lecitinuredukce nitrátů+ produkce sirovodíku+ tolerance azidu sodíku v koncentraci 0,01 g/100 mltolerance chloridu eodného v koncentraci 7 g/100 mltolerance fenolu v koncentraci 0,1 g/100 ml+ vlastnost hodnocení růst při 45 °c odolnost proti neomycinu 50 odolnost proti rifampicinu 50 ^ig/ml antibiotický účinek vzhledem к Aspergillus niger LIV 131 antibiotický účinek vzhledem к Bacillus subtilis NCIB 3610 antibiotický účinek vzhledem к Streptomyces murinus ISP 5091 *

Podle této identifikace organismus nepatří к žádné z dosavadních 23 hlavních skupin čeledí (Williams, S.T. a další (1983) J. Gen. Microbiol. 129, 1815-1830) ani к Žádné z vedlejších malých skupin čeledí ani do žádného z jednotlivých kmenů podle definice uvedené v publikaci Williams a další, J. Gen. Microbiol.( 1983) 129, 1743-1813. Byly rovněž prováděny pokusy srovnat Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 a jeho vlastnosti,8 popisem vlastností známých čeledí Streptomyces tak jak jsou uvedeny v Eergey*s Manuál of Determinative Bacteriology (8. vydání), ve zprávách ISP, vydaných Shirlingem a Gottliebem (Ing. J. Syst. Bacteriol. (1968) 18, 69-189, Ing. J. Syst. Bacteriol. (1968) 18, 279-392, Int. J. Syst. Bacteriol (1969), 19, 391-512, Ing. J. Syst. Bacteriol (1972), 22, 265-394). Nový kmen nemá stejné vlastnosti ani s žádnou novou čeledí, tak jak jaou popisovány v International Journal of Systematic Bacteriology od r. 1980.

Vzhledem к tomu, že Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 nebylo možno vřadix do žádné známé čeledi, je uvedený kmen zřejmě prvním známým členem nové čeledi, náležející do rodu Streptomyces.

Mutanty NCIB 12111, 12112, 12113 a 12114 mají všechny v podstatě stejné nebo podobné základní vlastnosti jako původní kmen Streptomyces thermoarchaensis až na to, že kmen NCIB 12111 vyžaduje ke svému růstu přítomnosti adeninu, kmen NCIB 12112 vyžaduje pro růst serin, kmen NCIB 12113 vyžaduje к růstu hiBtidin a kmen NCIB 12114 je odolný proti působení 8třeptornyčinu.

Výroba antibiotika S541 fermentací vhodného organismu Streptomyces se provádí běžným způsobem, t.j. pěstováním organismu z rodu Streptomyces za přítomnosti využitelných zdrojů uhlíku, dusíku a anorganických solí.

Využitelné zdroje uhlíku, dusíku a anorganických solí je možno dodat ve formě jednoduchých nebo komplexních živin. Vhodným zdrojem uhlíku je obvykle glukóza, maltoza, škrob, glycerol, melasa, dextrin, laktóza, sacharóza, fruktóza, karboxylové kyseliny, aminokyseliny, glyceridy, alkoholy alkany a rostlinné oleje. Zdroj uhlíku je obvykle obsažen v množství 0,5 až 10 % hmotnostních, vztaženo na fermentační prostředí.

Zdrojem dusíku bude obvykle sojová mouka, kukuřičný výluh, lihovarské výpalky, extrakt z kvasnic, mouka z bavlníkových semen, peptony, mleté ořechy, sladový extrakt, kasein, směs aminokyselin, amoniak ve formě plynu nebo roztoku, dusičnany, užít je možno také močovinu a další amidy. Zdroj dusíku je obvykle obsažen v množství 0,1 až 10 % hmotnostních, vztaženo na fermentační prostředí.

Anorganické soli, včleněné do živného prostředí, jsou běžně užívané soli, které mohou dodat sodík, draslík, amonný iont, železo, hořčík, zinek, nikl, kobalt, mangan, vanad, chrom,vápník, mě3,molybden, bor, fosfáty, sírany, chloridy a uhličitanové ionty.

К živnému prostředí Je možno přidávat protipěnivé činidlo к zábraně velkého pěnění. Toto činidlo je možno popřípadě přidávat v Časových intervalech.

Pěstování organismů Streptomyces probíhá obvykle při teplotním rozmezí 2C až 50 °0, s výhodou 20 až 40 °C a zejména při teplotě přibližně 34 °C, s výhodou za provzdušňování a míchání jakýmkoliv způsobem, například protřepáváním nebo pomocí míchadla. Prostředí

CS 268803 В2 může být napočátku naočkováno malým množstvím suspenze sporulovaného mikroorganismu, avšak cílem vyvarovat se růstové ráze lag se obvykle užívá vegetativního očkovacího materiálu, který se připravuje tak, že se malé množství živného prostředí naočkuje sporami а к naočkování většího množství prostředí se pak užije získaného vegetativního materiálu· S výhodou je možno postupovat také tak, že se užije několika stupňů, v nichž se získává vždy větší množství očkovacího materiálu, kterým se pak očkuje výsledné feraentační prostředí. Fermentace se obvykle provádí při pH 5,5 až 8,5, в výhodou 5,5 až 7,5.

Fermentace se obvykle provádí 2 až 10 dní, například 5 dnů·

V případě, že je žádoucí oddělit materiál в obsahem antibiotik S541 nebo jeho složky nebo faktory z fermentačního prostředí nebo izolovat kteroukoliv složku nebo faktor, je možno toho docílit běžnými izolačními a dělicími postupy. Antibiotika S541 ве obvykle převážně nacházejí v buňkách, přecházejí však také do fermentačního prostředí a je tedy možno je izolovat i z fermentačního prostředí buň před odstraněním mycelia nebo po něm· Je zřejmé, Že je možno к tomuto účelu užít nejrůznějších izolačních způsobů.

Antibiotika S541 je možno izolovat a dělit různým způsobem, například adsorpcí 8 následnou elucí, vysrážením, frakční krystalizací nebo extrakcí pomocí rozpouštědel, přičemž tyto způsoby mohou být různě kombinované.

Nejvhodnějším způsobem pro izolaci a dělení sloučenin, vyrobených způsobem podle vynálezu, je patrně extrakce pomocí rozpouštědel, chromatografie a frakční krystelizace.

Po fermentaci je možno mycelium oddělit běžným způsobem, například filtrací nebo odstředěním. Pak je možno materiál například extrahovat z mycelia vhodným organickým rozpouštědlem, například ketonem, jako acetonem, methylethylketonem nebo methylisobutyketonem, uhlovodíkem, například hexanem, halogenovým uhlovodíkem, jako chloroformem, tetrachlorethanem nebo methylenchloridem, alkoholem, jako methanolem nebo ethanolem, diolem, například propan-1,2-diolem. nebo esterem, například methylacetátem nebo ethylacetátem. Je zřejmé, že v případě, Že mycelium obsahuje větší množství vody, bude výhodnější užít rozpouštědlo, mísitelné s vodou·

Obvykle je zapotřebí více než jedné extrakce к dosažení optimálního výtěžku· První extrakce se s výhodou provádí při použití rozpouštědla, míeitelného в vodou, například methanolu nebo acetonu. Antibiotikum je možno izolovat ve formě surového extraktu odstraněním rozpouštědla. Extrakty se pak dále extrahují, popřípadě po snížení objemu rozpouštědla, například odpařením. Na tomto stupni je výhodné užít rozpouštědla, němísitelného s vodou, například hexanu, chloroformu, methylenchloridu nebo ethylacetátu nebo směsi těchto rozpouštědel, přičemž je zapotřebí přidat dostatečné množství vody к dosažení uspokojivého rozdělení antibiotik. Odstranění fáze, která je nemísitelná s vodou, pak poskytuje materiál, který obsahuje antibiotika S541. V případě potřeby je možno izolovat samostatný faktor В krystalizací z vhodného rozpouštědla, například z isopropanolu.

čištění a/nebo oddělení účinných složek a/nebo jednotlivých faktorů, a to úplně nebo od dalších makrolidních sloučenin, které mohou být přítomny, je možno uskutečnit běžným způsobem, například chromatografií, včetně použití vysokotlaké kapalinové chromatograf ie na vhodném podkladu, například na oxidu křemičitém, je také možno užít nefunkční makroretikulární adsorpční pryskyřice, například některé ze zesítěných polystyrénových pryskyřic, jako jsou Amberlite XAD-2, XAD-4 nebo XAD-1180 (Rohm& Haas Ltd), nebo pryskyřice S112 (Kastell Ltd) nebo zesítěného dextranu, kompatibilního s organickým rozpouštědlem, například prostředku Sephadex LH20 (Pharmacia UK Ltd), nebo v případě vysokotlaké kapalinové chromatografie-je možno užít materiálu v reversní fázi, například oxidu křemičitého, vázaného na uhlovodík, například o 18 atomech uhlíku. Podložka může mít formu vrstvy nebo s výhodou je uložena ve sloupci· V případě nefunkční makroretikulární pryskyřice, jako je XAD-1180 nebo S112 je možno к eluci užít směsí organických rozpouštědel, například směsi acetonitrilu a vody.

Roztok sloučenin ve vhodném rozpouštědle se obvykle nanese na vrchol sloupce oxidu křemičitého nebo Sephadexu, popřípadě po předchozím snížení objemu rozpouštědla. Sloupec je popřípadě možno promýt a pak vymývat rozpouštědlem в vhodnou polaritou. V případě Sephadexu a oxidu křemičitého je možno užít jako rozpouštědlo alkoholy, například methanol, uhlovodík, například hexan, acetonitril, halogenové uhlovodíky, například chloroform nebo methylenchlorid nebo estery, například ethylacetát. Je možno užít také směsi uvedených rozpouštědel mezi sebou nebo в vodou.

Eluce a oddělení a Čištění těchto sloučenin může být rovněž sledováno běžnými způsoby, například chromatografií, jako chromatografií na tenké vrstvě a vysokotlakou kapalinovou chromatografií nebo využitím některých známých vlastností uvedených sloučenin, tak jak byly popsány svrchu.

Chromatografií na oxidu křemičitém в výhodným použitím směsi chloroformu a ethylacetátu jako elučního činidla je možno snadno rozdělit antibiotika S541 na složku I a II, přičemž složka I se vymývá jako první. Faktory В, E a F je pak snadno možno izolovat z takto získané složky I chromatografií, například vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Obdobným způsobem je možno izolovat také faktory A, C a D ze získané složky II. Je také možno postupovat tak, Že se faktor В oddělí od faktoru E a F krystalizaci z alkoholu, například z methenolu nebo isopropanolu. Matečné louhy, které obsahují faktory E a F, je možno popřípadě podrobit dalšímu čištění, například chromatografií na oxidu křemičitém a faktory E a F je pak možno izolovat použitím vysokotlaké kapalinové chromatografie. Takto získané jednotlivé faktory je možno dále čistit krystalizaci, například z methanolu, isopropanolu nebo ze směsi methanolu a vody, přičemž způsobem podle vynálezu je vždy možno získat sloučeniny v krystalické formě.

Při vhodné kombinaci svrchu uvedených postupů je tedy možno získat svrchu uvedené .účinné látky jako pevné látky. Je zřejmé, že pořadí jednotlivých čisticích stupňů a volba těchto stupňů se může měnit ve velmi Širokém rozmezí.

Uvedeným způsobem byl získán faktor В jako krystalická pevná látka o Čistotě vyšší než 90 %. Podobně faktory A, C, D, E a F byly rovněž získány s čistotou vyšší než 90 Jednotlivé faktory je však možno užívat, jak již bylo uvedeno, při takové Čistotě, která odpovídá způsobu jejich použití. V lékařství se vyžaduje čistota alespoň 90 %, s výhodou vyšší než 95 %· V případě veterinárního lékařství a v případě použití v zeměděl“ etví a zahradnictví je dostatečná daleko nižší čistota, například 50% nebo.ještě nižší.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady, v nichž bude užito následujících zkratek:

tle - chromatografie na tenké vrstvě při použití desek Merck 5735 silice 60 z oxidu křemičitého při použití směsi chloroformu a ethylacetátu v poměru 3:1, není-li uvedeno jinak;

CCM - chromatografie na sloupci při použití oxidu křemičitého Merck 7734 silica 60 ve sloupci o rozměrech 200 x 4 cm, není-li uvedeno jinak, sloupec je naplněn a vymýván směsí chloroformu a ethylacetátu, není-li uvedeno jinak;

hplc - vysokotlaká kapalinová chromatografie;

PE - petrolether o teplotě varu 60 až 00 °C, není-li uvedeno jinak:

EA - ethylacetát.

V příkladech je užito následujících prostředí А, В a C:

Prostředí A g/litr

D-glukóza	215,0
glycerol	15,0
sojový pepton	15,0
chlorid sodný	3,0
uhličitan vápenatý	1,0
Destilovaná voda do 1 litru> pH 7»0 po úpravě hydroxidem sodným před sterilizací v autoklávu. Prostředí В g/litr
D-glukóza	2,5
sladový dextrín MD ЗОЕ	25,0
Arkaeoy 50	12,5
melasa	1,5
hydrogenXosforečnan draselný	0,125
uhličitan vápenatý	i.b
MOPS (kyselina 3-(N-morfolin)-propansulfonová x) Roquette Ltd, Velká Británie xx) British Arkády Co.Ltd.	21,0
Prostředí se doplní destilovanou vodou na objem	1 litr, načež se pH upraví na hod
notu 6,5 přidáním hydroxidu sodného o koncentraci 5N	před sterilizací v autoklávu.
Prostředí C
	g/litr
D-glukóza	2,5
Malt dextrin MD ЗОЕ (sladový dextrin)	25,0
Arkasoy 50	12,5
řepná melasa	1,5
hydrogenfosforečnan draselný	0,125
uhličitan vápenatý	1,25
silikon 1520 (Dow Corning)	0,625

Prostředí se doplní destilovanou vodou na objem 1 litr a pH prostředí se upraví na hodnotu 6,5 před sterilizací·

Příklad 1

Spory Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 ae naočkují na šikmý agar následujícího složení: * složka g/litr extrakt z kvasnic (Oxoid L21) 0,5 sladový extrakt (Oxoid L39) 30,0 mykologický pepton (Oxoid L40) 5,0 agar č. 3 (Oxoid L13) 15,0 destilovaná voda do 1 litru, pH přibl. 5,4

Živné prostředí se inkubuje se sporami 10 dní při teplotě 28 °C. Pak se kultůra na Šikmém agaru převrství 6 ml 10 % roztoku glycerolu a pak se sterilním nástrojem uvolní spory a mycelium. Vždy 0,4 ml výsledné suspenze spor se přenese na sterilní polypropylenové misky, které se pak zataví a skladují v kapalném dusíku až do příštího použití·

Obsah jedné polypropylenové nádobky se pak užije к naočkování 10 ml prostředí A, které se pak inkubuje 3 dny při teplotě 28 °C na rotační třepačce s frekvencí otáčení 250 min“³· a s výkyvem 50 ml· Inkubované prostředí se pak užije v množství vždy 2 % к naočkování 15 zkumavek a dvou Erlenmeyerových baněk o objemu 250 ml, zkumavky obsahují 10 ml a baňky 50 ml prostředí B·

Zkumavky i banky se inkubují 5 dní při teplotě 28 °C, pak se kultury odděleně zfiltrují ve vakuu a buňky se protřepávají 30 minut ve stejném objemu v methanolu.

Účinnost proti Caenorhabditis elegans byla stanovena v extraktech z buněk, vypěstovaných ve zkumavkách i v baňkách, pak byly extrakty spojeny, odpařeny do sucha a znovu extrahovány methanolem, Čímž bylo získáno 6 ml koncentrátu, který byl nanesen na vrchol sloupce prostředku Sephadex LH20 o rozměrech 110 x 2,5 cm v methanolu, sloupec byl vymýván methanolem. Byly odebírány frakce o objemu 10 ml.

Frakce 20 až 28 byly spojeny a odpařeny na 156 mg olejovitého odparku, který byl extrahován směsí chloroformu a ethanolu v poměru 3-1, čímž byly získány 3 ml extraktu, který byl podroben CCM (sloupec o rozměrech 55x2,5 cm). Byly odebrány frakce po 10 ml a tyto frakce byly analyzovány tle při použití ploten s obsahem fluorescenčního indikátoru. Frakce 20 až 23 a frakce 36 až 44 daly vznik dvěma hlavním oblastem, které bránily fluorescenci a které byly identifikovány jako složka I o Rf 0,70 a složka II o P_f0,43· Odpařením frakce 20 až 23 bylo získáno 9 mg složky I v pevné formě, lambda^* 238 nm, E^34O, lambda_max245 nm, E^35O a lambda_max254 nm, E^200. Odpařením frakcí 36 až 44 bylo získáno 11 ml složky II jako pevná látka lambda 238 nm, Е^44О, lambda 245 nm, ч ч ШВл X Шал

E^460 a lambda_max254 nm, E^280.

Příklad 2

Dvě Erlenmeyerovy baňky o objemu 250 ml s obsahem 50 ml v prostředí A byly naočkovány vždy 0,2 ml suspenze spor Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 z polypropylenové nádobky, připravené způsobem podle příkladu 1. Baňky pak byly inkubovány 3 dny při teplotě 28 °C na rotační třepačce o frekvenci otáčení 250 min”³- в výkyvem 50 ml, pak byl obsah obou baněk užit к naočkování fermentoru o objemu 20 litrů s obsahem 12 litrů v prostředí B. Kultůra byla pěstována 5 dní a pak byla zpracována způsobem, uvedeným v příkladu 3^

CS 26Θ8Ο3 B2

P ř í к 1 в d 3

1 fermentačního proetředí získaného způsobem podle příkladu 2 bylo po 5 dnech růstu při teplotě 28 °C odstředěno při frekvenci otáčení 4200 min*¹ a teplotě 10 °C po dobu 15 minut. Usazenina buněk pak byla smí sena s 5 litry methanolu a ponechána 20 hodin při teplotě 4 °C. Мусeliálni extrakt byl zfiltrován, odpařen při teplotě 40 °C a podroben azeotropní destilaci po přidání 100 ml 1 ^butanolu. Extrakt byl pak pětkrát extrahován vždy 200 ml ethanolu, po slití byly extrakty odpařeny na objem 100 ml a roztok byl nanesen na vrchol sloupce в obsahem prostředku Sephadex LH20 o rozměrech 112x5 cm. Sloupec byl vymýván methanolem po předběžném promytí 200 ml methanolu a byly odebírány frakce o objemu 50 ml. Frakce 40 až 90 byly slity a odpařeny na 3,85 g olejovítého zbytku. Tento zbytek byl extrahován 77 ml szěei chloroformu a ethylacetátu v poměru 3:1, po filtraci pak byla provedena CCM a byly odebírány frakce o objemu 15 ml po předběžném promytí sloupce 200 ml rozpouštědla.

Frakce 124 až 142 složky I byly slity a odpařeny na 253 mg pevné látky, z čehož 216 mg bylo Čištěno hplc (Zorbax ODS, 25x2,1 cm, 80% roztok jnethylkyanidu ve vodě). Frakce 250 až 320 e obsahem složky II byly slity a odpařeny na 602 mg pevné látky, z níž 54C mg bylo čiětěno pomocí hplc stejně jako frakce 124 až 142 a znovu byly odebírány jednotlivé frakce.

Materiál, vymývaný ze sloupce pro vysokotlakou kapalinovou chromatografii, byl sledován spektroskopicky v ultrafialovém záření při 243 nm. Materiál, absorbující při této vlnové délce, byl získán v pevném stavu a i) byl zkoumán na účinnost proti Caenorhabditis elegans, a ii) byl analyzován chromatografii na tenké vrstvě. Byly získány čtyři složky, které byly účinné proti Caenorhabditis elegans měly všechny hodnoty R_f v oblasti 0,39 až 0,46 nebo 0,70 až 0,75»

Složka I byla obsažena v jediném vrcholu s hodnotou R^ 0,70 až 0,75, tento materiál byl pak označen jako faktor B. Složka II byla obsažena ve 3 vrcholech в hodnotami v rozmezí 0,39 až 0,46, Slo o faktory A, C a D.

Faktor A byl vymýván ze sloupce pro vysokotlakou kapalinovou chromatografii v rozmezí 260 až 340 ml po vstřiknutí vzorku a jeho hodnota pri chromatografii na tenké vrstvě byla 0,44. Faktor В byl vymýván ze sloupce pro vysokotlakou kapalinovou chromatografii v rozmezí 270 až 310 ml po vstřiknutí vzorku a hodnota R^ při chromatografii na tenké vrstvě byla 0,72. Faktor C byl vymýván v rozmezí 160 až 180 ml po vstřiknutí vzorku a hodnota při chromatografii na tenké vrstvě byla 0,4 tle. Faktor D je vymýván ze sloupce v rozmezí 220 až 250 ml po vstřiknutí vzorku a má hodnotu R^ 0,42 při tle. Další vlastnosti faktorů А, В, C a D budou dále popsány.

Příklad 4

0,4 ml suspenze spor organismu Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015, připravené způsobem podle příkladu 1, bylo užito к naočkování Erlenmeyerovy baňky o objemu 250 ml s obsahem 50 ml prostředí A. Banka byla inkubována 4 hodiny při teplotě 28 °C na rotační třepačce při frekvenci otáčení 250 min”¹ a výkyvu 50 mm. Vždy 8 ml materiálu pak bylo užito к naočkování dvou baněk s plochým dnem o objemu 2 litry vždy s obsahem 400 ml téhož prostředí a baňky byly inkubovány 3 dny za stejných podmínek.

Obsah obou baněk byl pak užit к naočkování fermentoru o objemu 70 litrů в obsahem ♦40 litrů v prostředí В doplněného prostředkem Silicone 525 (Dow-Corning, 0,0625 % objemových). Fermentace se provádí za stálého míchání a provzdušňování tak, aby koncentrace rozpuštěného kyslíku byla vyšší než 20 % nasycení, protipěnivý prostředek Silicone se přidává podle potřeby. Fermentace se ukončí po 10 dnech, 40 litrů získaného fermentačního prostředí se odstředí při frekvenci o otáčení 15 000 min“¹. Získaný supernatant se nahradí 5 litry vody a 1,4 kg buněk se zmrazí na teplotu -20 °C.

Po týdnu se zmrazené buňky nechají roztát, uvedou se do suspenze v 15 litrech methanolu a opatrně se míchají 15 hodin. Pak se suspenze zfiltruje a pevný zbytek se znovu extrahuje 10 litry methanolu. 25 litrů spojeného filtrátu se zředí 12 litry vody a extrahuje 25 litry PE. Po 30 minutách se fáze oddělí od sebe odstředěním.

Spodní methanolová fáze se třikrát znovu extrahuje 25, 15 a 15 litry PE. Celkem 80 litrů takto získané fáze se zahustí trojnásobným průchodem odpařovače (Pfaudler 8,8-12V-27), tlak par je 0,1 baru, teplota par 20 °C, teplota vyhřívací páry 127 °C, načež se 8 litrů získaného koncentrátu vysuší 1 kg síranu sodného a pak se roztok dále odpařuje v rotačním odpařovači při teplotě 40 °C. Získá se 15 ml olejovitého zbytku, který se rozpustí v 70 ml směsi chloroformu a ethylacetátu v objemovém poměru 3:1, pak se podrobí CCM a odebírají se frakce o objemu 40 ml po předběžném promytí sloupce 1400 ml rozpouštědla.

Frakce 45 až 65 se slijí a odpaří, čímž se získá 940 mg faktoru B, definovaného v příkladu 3, tento faktor se nechá dvakrát krystalizovat v methanolu a nakonec z nitromethanolu. Krystaly se podrobí analýze difrakcí pomocí rtg-záření, čímž je možno prokázat o orthorhombická čirá prismata s a = 10,171 (3), b = 13,317 (5), c = 25,032 (7) V = 3391 a\ Z = 4, prostorová skupina ^2^2^, D_c = 1,18 gcm~\ r = 0,053 pro 2169 nezávisle pozorovaných reflexí (< 58 °) měřeno na difraktometru s Cu-K Λ zářením (lambda = 1,54178πΓ^θ). Struktura, stanovená tímto způsobem, je znázorněna na obr. 5.

Příklad 5

Očkovací materiál Střeptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 byl připraven způsobem podle příkladu 4 při růstovém období 2 dny a byl užit к naočkování fermentoru o objemu 70 litrů s obsahem 40 litrů prostředí B, doplněného polypropylenem 2000 o koncentraci 0,06 % objemových místo prostředku Silicone 525· Polypropylen 2000 se přidává podle potřeby v průběhu fermentace к zábraně pěnění. Fermentace se provádí při teplotě 28 °C za míchání a provzdušňování tak, aby bylo možno udržet koncentraci kyslíku výše než na 30 % nasycení. Po 24 hodinách fermentace se 9 litrů fermentačního prostředí přenese do fermentoru o objemu 700 litrů s obsahem 450 litrů živného prostředí následujícího složení:

složka g/litr

D-glukóza2,8 sladový dextrin (MD30E)27,8

Arkasoy 5013,9 melasa1,7 hydrogenfosforečnan draselný0,14 uhličitan vápenatý1,39

Silicone 525 (Dow Corning) 0,06 % obj.

pH se upraví před sterilizací na hodnotu 6,5«

Fermentace se provádí při teplotě 28 °C za stálého míchání a provzdušňování tak, aby byla udržena koncentrace rozpuštěného kyslíku na hodnotě vyšší než 20 % nasycení. V případě potřeby se přidává jako protipěnivé činidlo polypropylen 2000. Po 2 dnech se pH upraví na hodnotu 7,2 přidáním kyseliny sírové. Fermentace se ukončí po 5 dnech.

450 litrů fermentačního prostředí se odstředí a supernatant se nahradí 20 litry vody.. 25,5 kg izolovaných buněk se hodinu míchá v takovém množství methanolu, aby výsledný objem byl 75 litrů. Pak se suspenze zfiltruje a pevný podíl se znovu extrahuje 35

CS 268802 Ba litry methanolu a pak se zfiltruje. 87 litrů spojených filtrátů se zředí 40 litry vody a extrahuje PE. Po 30 minutách ее fáze oddělí odstředěním a spodní methanolová fáze se znovu extrahuje 30 litry PE po přidání 40 litrů vody. Po izolaci se spodní fáze znovu extrahuje 30 litry PE. Fáze PE se spojí a získaných 85 litrů této fáze se zahustí trojím průchodem odpařovaném (Pfendler 8,8-12v-27), tlak par 13,3 Pa, teplota par 20 °C, teplota vyhřívací páry 127 °C. 9 litrů získaného koncentrátu se vysuší 2 kg síranu sodného a dále se zahustí za sníženého tlaku při teplotě 40 °C na rotačním odpařovači.

130 g takto získaného olejovitého zbytku se rozpustí v chloroformu na objem 190 ml a roztok se podrobí CCM (sloupec se naplní v chloroformu a promyje se 500 ml chloroformu), načež se odebírají frakce o objemu přibližně 40 ml po předběžném promytí 1400 ml rozpouštědla. .

Frakce 32 až 46 se slijí a odpaří na 21,2 g olejovitého zbytku· Frakce 47 až 93 se slijí a odpaří na 20,1 g olejovitého materiálu, který se rozpustí ve směsi chloroformu a ethylacetátu v poměrní 3 í 1 na 50 ml roztoku, který se podrobí CCM a po promytí sloupce 1400 ml rozpouštědla se bdebírají frakce o objemu přibližně 40 ml· Frakce 22 až 36 se slijí a odpaří na 3,1 g olejovitého zbytku, který se přidá к olejovítému materiálu z frakcí 32 až 46 z prvního sloupce· Slité olejovité zbytky se rozpustí ve 4 ml vroucího methanolu, roztok se pak přidá к 20 ml horkého 2-propanolu, stáním se pak získá 2,57 g krystalického faktoru B.

Matečný louh po kryetalizaci faktoru В ее odpaří* na olejovítý zbytek, který se pak rozpustí ve stejném objemu methylendichloridu a nanese na vrchol sloupce o rozměrech 30 x 2,2 cm 8 náplní eilikagelu (Merck Kieselgel 60) o rozměrech zrn 70 až 230 mesh, č. 7734 v methylendichloridu. Vrstva se promyje dvěma objemy směsi chloroformu a ethylacetátu v poměru 3 : 1· Odpařením eluátu se získá olejovítý zbytek, který se rozpustí v methanolu a podrobí preparativní hplc na prostředku Spherisorb S5 ODS-2 o rozměrech sloupce 250 x 20 mm (Phase Sep. Ltd.). 5 ml vzorku se pod tlakem nanese na sloupec v průběhu 1 minuty a sloupec se pak vymývá směsí acetonitrilu a vody v poměru 7 : 3 za následujících podmínek· doba v min průtok (ml/min)

0,00 0,00 doba vstříknutí

1,00 0,00

1,10

39,90

40,00

75,00

30,00

35,00

Materiál získaný vymýváním sloupce, se sleduje spektroskopií v ultrafialovém záření při 238 nm. Odpařením slitých frakcí, vymývaných přibližně do času 26,3 minut,se získá jako pevná látka faktor E· Odpařením slitých frakcí, vymytých do doby 36,4 minut se získá jako pevná látka faktor F· Další vlastnosti faktorů E a P budou dále uvedeny.

Příklad 6

Fermentační prostředí, obdobné prostředí z příkladu 2, po fermentaci, trvající 117 hodin, se sterilizuje hodinu v autoklávu při teplotě 121 °C, zchladí se na teplotu místnosti a pak se míchá magnetickým míchadlem za vzniku homogenní suspenze buněk. Dva podíly po 2 ml se odstředí při 12 000 otáčkách/min 2 minuty při teplotě místnosti, supernatanty se slijí a buňky se uvedou do suspenze ve 2 ml vody, důkladně se promísí a znovu se odstředí za stejných podmínek· Po slití supernatantů se buňky ještě dvakrát promyjí vždy dvěma ml destilované vody. Promyté buňky se pak důkladně smísí s dvěma ml vody nebo methanolu a

CS 26880$ B2 nechají se stát 1 1/2 hodiny při teplotě místnosti za občasného protřepání. Pak se získané suspenze znovu odstředí za stejných podmínek a supernatanty se postupně ředí vodou. Buňky z vodné suspenze se znovu uvedou do suspenze ve vodě a okamžitě se dále ředí vodou. Vždy 10 'Ul ředění se přidá к 200 _zul suspenze nematodu Caenorhabditis elegans v pufru, který obsahuje 6 g/litr hydrogenfosforečnanu sodného, 3 g/litr hydrogenfosforečnanu draselného, 5 g/litr chloridu sodného a 0,25 g/litr síranu hořečnatého se 7 molekulami vody. Pak se pH vždy upraví na hodnotu 7,0. Po 4 hodinách se suspenze nematodů sleduje, aby bylo možno zjistit, v jakém ředění sloučenina poskytuje úplnou inhibici více než 98 % nematodů v suspenzi. Bylo prokázáno, že ředění 1 : 5, 1 : 25, 1 : 250 a 1 : 500 methanolového extraktu, 1 : 5, 1 *· 25» 1 í 250, 1 : 500 a 1 : 1000 suspenze buněk 8 1:2,1: 4 a 1 : 8 vodného extraktu způsobuje požadovanou inhibici nematodů v případě, že se 10 /ul tohoto ředění přidá ke 200 /ul suspenze nematodů.

Příklad 7

Erlenmeyerovy baňky o objemu 250 ml s obsahem bučí 50 ml prostředí A nebo 50 ml prostředí В se naočkují 0,4 ml suspenze spor Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 připravené způsobem podle příkladu 1. Baňky, které obsahují prostředí A nebo prostředí B, se inkubují 2 dny při teplotě 28 °C na rotační třepačce s počtem otáček 250 min“^ s výkyvem 50 mm. 8 ml každého prostředí se pak užije к naočkování baněk s plochým dnem o objemu 2 litry 8 obsahem 400 ml prostředí A nebo B. Tyto baňky se inkubují 2 dny za stejných podmínek.

Fermentory o objemu 70 litrů se naočkují dvěma baňkami prostředí A a druhý fermentor o objemu 70 litrů se naočkuje dvěma baňkami prostředí B. Každý z fermentorů již obsahuje 40 litrů prostředí C. , ·

Fermentace se provádí při teplotě 34 °C za míchání a provzdušňování tak, aby koncentrace kyslíku byla vyšší než 30 % nasycení. Po přibližně 24 hodinách fermentace se pH nastaví na 7,2 přidáním vodného roztoku kyseliny sírové. V případě potřeby se přidává jako protipěnivé činidlo polypropylen 2000. Po 5 dnech se fermentace ukončí.

Fermentor o objemu 70 litrů, který byl naočkován baňkami s prostředím Б, obsahoval prostředí B, doplněné silikonem 1520 v množství 0,06 %♦ Fermentace byla prováděna při teplotě 28 °C za míchání a provzdušňování tak, aby hladina rozpuštěného kyslíku byla vyšší než 30 % nasycení. Podle potřeby byl přidáván propylenglykol 2000 к zábraně pěnění. Po 24 hodinách bylo 9 litrů tohoto fermentačního prostředí přeneseno do fermentorů o objemu 700 litrů в obsahem 450 litrů prostředí C.

Fermentace byla prováděna při teplotě 34 °C za míchání a provzdušňování tak, aby koncentrace rozpuštěného kyslíku byla vyšší než 30 % nasycení. Pěnění bylo potlačováno přidáváním polypropylenglýkolu 2000, přibližně po 24 hodinách bylo pH upraveno na hodnotu 7,2 přidáním vodné kyseliny sírové. Fermentace byla ukončena po 4 dnech a fermentační prostředí bylo spojeno s 3 podíly po 40 litrech, které byly získány svrchu. ’

Veškeré prostředí bylo odstředěno (Sharplee AS16PY) rychlostí 120 litrů/h. Zbývající supematant byl nahražen vodou.

11,65 kg takto získaných buněk bylo emulgováno ve 33 litrech methanolu v mísicím zařízení (Silverson). Po 60 minutách byla suspenze zfiltrována a zbytek byl znovu emulgován ve 34 litrech methanolu. Po 40 minutách byla suspenze znovu zfiltrována a filtráty z obou methanolových extrakcích byly slity.

53,5 litrů extraktů bylo smí seno 8 27 litry vody a 27 litry PE. Po míchání 20 minut byly obě fáze odděleny odstředěním (Westfalia MEM 1256). 70 litrů spodní methanolové fáze bylo smíseno s 37 litry vody a 27 litry PE a promícháno a odděleno jako svrchu. Emulse

CS 268603 B2 v PE-fázi byla rozrušena přidáním 4 litrů acetonu· 108 litrů spodní fáze ve směsi merhanolu a vody pak bylo smíseno se 40 litry vody a 27 litry PE potřetí a materiál byl znovu promíchán a rozdělen jako svrchu, přičemž bylo znovu užito 4 litrů acetonu к vyčeření emulze, tvořící ee na rozhraní fází. Při hexanové extrakci pak byly slity.

litrů PE-extraktu bylo koncentrováno v odpařovači při tlaku par 19,95 Pa a teplotě par 26 °C. 3 litry koncentrátu ee vysuěí 2 kg síranu sodného a pak se znovu odpaří za sníženého tlaku při teplotě 400 °C. 639 g výsledného oleje se rozpustí v 300 ml směsi chloroformu a ethy láce tátu v objemovém poměru 3 : 1 a po filtraci se promyje na skleněném filtru. Filtrát a promývací kapalina v objemu celkem 1060 ml ee podrobí OCM (1500 x 100 mm),eluce ee provádí rychlostí 6 litrů/h.

Frakce, která se vymyje mezi objemem 8,8 a 13,1 litru se slije a odpaří za sníženého tlaku na 56,3 g oleje, frakce mezi objemem 13»1 a 24,6 litrů se rovněž odpaří za sníženého tlaku na 153»4 g bleděžluté pevné látky. První frakce obsahuje převážně faktor B, kdežto druhá frakce obsahuje směs faktorů А, В, C a D. Faktor В v této druhé frakci se postupně odstraňuje opakováním chromatografie CCM svrchu uvedeným způsobem dvakrát, podruhé při použití Čerstvého oxidu křemičitého za stejných podmínek s tím rozdílem, že rychlost průtoku byla snížena na 3 litry/h.

Frakce s obsahem faktorů A, C a D z druhého sloupce ee vymývají mezi objemem 8,6 a

17,6 litrů, zbývající faktor B, které tyto frakce jeětě obsahují, se oddělí na třetím sloupci, na němž se faktory A, C a D vymývají mezi 14 a 28 litry. Tento eluát se odpaří za sníženého tlaku na 114 kg pevné látky. Frakce, které obsahují faktor Б z uvedených dvou sloupců (mezi 7,5 až 8,8 litrů a mezi 10,3 až 13,4 litry), se odpaří na 10,7 a 10 g oleje a pak se spojí s olejovou frakcí, získanou z prvního sloupce.

Olejovité materiály в obsahem faktoru B, se rozpustí ve 25 ml vroucího methanolu a smísí se se 100 ml vroucího 2-propanolu. Zchlazením na 4 °C dojde ke krystalizaci faktoru B. Tento faktor se oddělí filtrací promyje se 200 ml methanolu, zchladí se na -20 °C a vysuěí ve vakuu, čímž se získá 25,3 g faktoru B.

Pevná látka z třetího sloupce oxidu křemičitého, která obsahuje faktory A, C a D, ee vysuěí ve vakuu na stálou hmotnost 87 g. 20 g této pevné látky se rozpustí ve 190 ml methanolu a doplní na 230 ml směsí acetonitrilu a vody v objemovém poměru 7:3· Podíly po 5 ml tohoto roztoku se pak chromatografují na sloupci o rozměru 250 x 21,2 ml 8 náplní prostředku Spherisorb ODS-2 s průměrem částic 5 /um eluuje při použití směsi acetonitrilu a vody v poměru 7 : 3 jako elučního činidla. Rychlost průtoku se udržuje na ml/min na 10 в a pak se stále zrychluje v průběhu 22 minut až na 34 ml/min a na této rychlosti se udržuje dalěí 3 minuty. Eluát se sleduje při 238 nm. Faktor C se vymývá mezi 11,0 a 13,4 min, faktor D mezi 13,4 a 17,4 min a faktor A mezi 17,4 a 23,0 min.

Frakce s obsahem faktoru C z každého chromatografického* dělení se spojí a odpaří za sníženého tlaku na pevnou látku. Obdobně i frakce s obsahem faktoru A se spojí a odpaří. Frakce s obsahem faktoru D se spojí a Jejich odpařením se získá 7 g surového pevného produktu. Tento produkt se znovu rozpustí v 65 ml methanolu, smísí ae se směsí acetonitrilu a vody v poměru 7:3a znovu se chromatografuje na sloupci prostředku Spherisorb 0DS2,jak již bylo popsáno, 8 tím rozdílem, že rychlost průtoku se udržuje na stálé hodnotě 20 ml/min. Faktor D se vymývá mezi 16 a 20 minutami a z každé chromatografie se tato frakce oddělí a všechny frakce se spojí. Materiál se odpaří na pevnou látku. Všechny tři pevné podíly s obsahem faktorů A, C a D se vysuší oxidem fosforečným ve vakuu do stálé hmotnosti, čímž se získá 55, 7,0 a 1,21 g výsledného materiálu z jednotlivých podílů.

čtyři pevné látky, které byly tímto způsobem izolovány, jsou obdobné autentickým vzorkům faktorů A, B,C a D.

CS 26ΘΘΟ3 B2

Příklad 8

Erlenmeyerovy banky o objemu 250 ml β obsahem 50 ml prostředí В se naočkují vždy 0,5 ml suspenze spor Streptomyces thennoarcheensis NCIB 12111, 12112, 12113 a 12114, připravené způsobem, uvedeným v příkladu 1.

Banky, obsahující Streptomyces thermoerchaensis NCIB 12111, 12112 a 12113 se inkubují při teplotě 31 °C na rotační třepačce. Banka 8 obsahem kmene Streptomyces thermoarchaenais NCIB 12114 se inkubuje 2 dny při teplotě 28 °C, pak se 1 ml prostředí přenese do další Erlenmeyerovy baňky o objemu 250 ml 8 obsahem 50 ml prostředí B. Tato baňka se pak inkubuje při teplotě 31 °C na rotační třepačce. Všechny baňky se třepají při frekvenci otáčení 250 min“^ a při výkyvu 50 mm.

Po 4 dnech inkubace byly vzorky každého fermentačního prostředí odstředěny při frekvenci otáčení 1250 min“^ 45 min a zpracovány následujícím způsobem. Supernatant byl odložen a peleta znovu uvedena do suspenze v 10 ml methanolu. Pak byla suspenze energicky míchána a nechána stát hodinu za občasného míchání. Pak byla výsledná buspenze odstředěna při frekvenci otáčení 10 000 min“^ 5 minut a supernatant byl analyzován vysokotlakou kapalinovou chromatografií na prostředku S5 ODS-2, při použití· sloupce o rozměrech 10 cm x 4,6 mm a 70% methylkyanidu v O,1M dihydrogenfosforečnanu amonném. Eluát byl sledován při 246 nm.

Analýza vysokotlakou kapalinovou chromatografií prokázala v příslušných případech přítomnosti jednotlivých faktorů А, В, C a D.

Příklad 9

Faktory А, В, C, D, E a F mají následující vlastnosti:

i) obsahují pouze uhlík, vodík a kyslík ii) v elektronové hmotové spektroskopii (E.I.) faktorů А, В, C, D, E a F byly získány

následující výsledky: faktor molekulární iont	odpovídá molekulovému vzorci
A	612,37	^C36^H52°8
В	598,35	^C35^H5O°8
c	584,34	^C34^H48°8
D	598,35
E	612,3638	^C36^H52°8
F	626,3807	^C37^H54°8

Při hmotové spektroskopii (bombardování rychlými atomy - FAB) byly získány následující výsledky:

faktor +ve FAB -ve FAB molekulová hmotnost

A	M/Z	635	[M+Ná] ⁺	M/Z	611	Lm-h] -	612
	M/Z	613	[M+Hj⁺
В	M/Z	691	[M+H+glycerol]⁺				596
	M/Z	599	[M+H]⁺
	M/Z	581	[MH-H₂oJ⁺
	M/Z	563	[MH-2H₂o]⁺
C	M/Z	607	fM+Na] ⁺	M/Z	583	W'	584
D	M/Z	621	{Й+Na]·*·	M/Z	597	[M-Hj-	598

Při hmotové spektroskopii faktoru E в desorpcí kolon byl získán výsledek

M/Z 612 M*, pro faktor F výsledek M/Z 626 M*· Při E.I. spektru faktoru A při přesném měření hmoty byly získány ionty při

612,37	^C36^H52°8 ·	466,31	^C30^H42°4 ·
448,30	^C3O^H4O°3 ’	425,23	^C26^H33°5 ’
354,22	^C23^H3O°3 ’	297,22	^C21^H29° ’
278,11	^C15^H18°5 ’	247,17	^C16^H23°2 ·
219,18	^C15^H23° ’	95,05	w·

Při E.I. spektru faktoru В 8 přesným měřením byly získány ionty při

598,35	^C35^H5O°8 ’	438,28	^C28^H38°4 ’
420,26	^C28^H36°3 ’	314,19	^C2O^H26°3 ’
248,14	^C15^H2O°3 ’	151,08	^C9^H11°2·
Při	E.I. spektru faktoru C s přesným měřením byly získány ionty při
583,34	. ^C34^H48°8 ’	566,33	^C34^H46°7 ’

438,28 ^C28^H38°4 *

Při E.I. spektru faktoru D в přesným měřením byly získány ionty při

598,35	^C35^H5O°8 ·	452,29	^C29^H4O°4 ·
434,28	^C29^H38°3 *

Při přesném měření faktoru D při E.I. byl získán iont při 452,2908 ^C29^fi4O°4 ^{θ pro} faktor F iont při 466,3067 ^сзо^Ы24°4 ⁹ lil) V infračerveném světle v bromoformu byly získány pro faktory А, В, C,

D, E a F následující vrcholy: faktor A: 3510 (OH), 1712 faktor B: 3510 (OH), 1710 faktor C: 3510 (OH), 1712 faktor D: 3508 (OH), 1711 faktor E: 3500 (OH), 1708 faktor F: 3500 (OH), 1708 (ester) a 998 cm¹ (C-0), (ester) a 996 cm“¹ (C-0), (ester) a 996 cm¹ (C-0), (ester) a 9?6 cm¹ (C-0), (ester) a 994 cm¹ (C-0), (ester) a 997 cm¹ (C-0).

tfplná spektra pro faktory А, В, C, D, E a F jsou znázorněna na přiložených vyobrazeních 1 až 4, 6 a 7·

IV) Faktory А, В, C, D, E a F mají v absorpčním spektru v ultrafialovém záření v methanolu (c = 0,002 %} následující hodnoty (I = inflexe a M = maximum):

faktor	\(nm)	E¹ ^E1	faktor	\(nm)
A		252	(I)	318		D	252	(I)	263
		244,5	(M)	468			244,5	(M)	393
		239	(I)	430		X	239	(I)	362
В		252	(I)	302		E	252	(I)	266
		244,5	(M)	426			244	(M)	402
		239	(I)	394		X	238	(M)	373
c		252	(I)	316		F	252	(I)	285
		244,5	(M)	470			244,5	(M)	421
		239	(I)	432			239	CM)	389
						(x methanol	c = 0,00	1 %)
	Je	nutno se	zmínit o	tom,	že hodnoty Kmax jsou	charakteristické pro	jednotlivé
faktory	, hodnoty	odrážejí čistotu	získaného materiálu. Poměry hodnoty I	jsou však
charakteristické	pro sloučeninu	jako	takovou.
V)	NMR protonové	spektrum při 200 MHz	, provedené pro	roztoky jednotlivých	faktorů

v deuterochloroformu obsahuje signály (hodnoty·^ s opakováním, vazné konstanty /Hz) a integrační hodnoty jsou uvedeny v závorkách) faktor A:

4.1 až 4,4 (m, 2H), 4,61 (široký s, 1H), 4,6 až 4,75 (m, 2H), 4,81 (d,9.1H), 5,05 (m,lH), 5,34 (e, 2H), 5,69 (d, 5, 1H), 6,06 (d, 5, 1H), 6,17 (m, 1H), 6,26 (d, 11, 1H), 6,37 (m, 1H), 6,46 (d, 10, 1H), 6,74 (q, 2, 1H), 7,42 (m, 1H), 7,7 až 7,9 (m, 5H), 8,14 (a, 3H), 8,40 (s, 3H), 8,47 (s, 3H), 8,61 (t, 11, 1H), 8,96 (d, 7, 3H), 9,06 (d, 7, 3H', 9,02 (d, 7, 3H), 9,13 (q, 11, 1H), 9,21 (d, 7, 3H).

faktor B:

4.2 až 4,4 (m, 2H), 4,55 (q, 7, 1H), 4,65 (široký, s, 1H), 4,6 až 4,8 (m, 2H), 5,06 (ш, 1H), 5,3 až 5,5 (и, 2H), 6,01 (d,5.1H), 6,07 (d, 5, 1H), 6,12 (в, 1H), 6,24 (d, 11, 1H), 6,24 (m, 1H), 6,3 až 6,5 (m, 2H), 6,53 (s, 3H), 6,73 (q, 2, 1H), 7,62 (m, 1H),

7,6 - 8,0 (m, 4H), 8,22 β, 3H), 8,35 (d, 7, 3H), 8,41 (s, 3H), 8,49 (a, 3H), 8,62 (t, 11, 1H), 9,03 (d, б, 3H), 9,12 (g, 11, 1H), 9,22. (d, 7, 3H).

faktor C:

4,29 (d, 11, t, 2, 1H), 4,4 až 4,6 (m, 3H), 4,56 (široký β,ΙΗ), 5,14 (d, 15, 10, 1H), 5,23 (m, 1H), 5,65 (široký в, 2H), 5,72 (d, 6, 1H), 5,95 (d,10, 1H), 5,99 Cd, б, 1H), 6,08 (široký s, 1H), 6,1 až 6,4 (m, 3H), 6,62 (q, 3, 1H), 7,7 až 8,1 (m, ca7H), 8,18 (s, 3H), 8,33 (в, 3H), 8,48 (d, 7, 3H), 8,64 (в, 3H), 8,58 (t, 11, 1H), 8,00 (d, 7,

3H), 9,08 (d, 7, 3H), 9,12 (q, 12, 1H).

faktor B:

4,18 až 4,4 (m, 2H), 4,47 až 4,81 (m, 4H), 5,04 (m, 1H), 5,35 (в, 2H), 5,72 (d, 7, 1H), 6,07 (d, 7, 1H), 6,15 až 6,45 (m, 4H), 6,74 (q, 4, 1Я), 7,45 - 8,1 (m, 8H) , 8,16 (s, 3H) , 8,41 (s, 3H), 8,49 (а, 3H), 8,62 (t, 11, 1H), 8,92 - 9,05 (m, 6H), 9,21 (d, 7, 3H). faktor E;

4,1 *ž4,3 (m, 2H), 4,5 až 4,8 (m, 4H t), 5,04 (m, 1H), 5,2 až 5,5 (η, 2H), 6,01 (d, 5, 1H) 16,05 (d, 5, 1H), 6,11 (а, 1H), 6,1 až 6,4 (m, 34), 6,45 Cd, 10, 1H), 6,51 (ε, 3H) , 6,70 (q, 2, 1H), 7,60 (m, 1H), 7,20 (β, 3H), 8,41 (β, 3H), 8,47 (s, 3H), 8,60 (t, 11, 1E), 9,0Q;.(t, 7, 3H), 9,02 (d, 6, 3H), 9,11 (q, 11, 1H), 9,20 (d, 7, 3H).

·

CS 268803 Β2 faktor ?:

4.2 až 4,5 (m, 2H), 4,62 (в, 1H), ca 4,70 (m, 2H) 4,80 (d, 9, 1H), 5,04 (m, 1Л), 5,2 až 5,5 (m, 2H), 5,99 ^X(d, 5, 1H), 6,05 (d, 5, 1H), 6,11 (а, 1H), 6,1 až 6,3 (m, 2H), ca 6,36 (m, 1H), 6,45 (d, 10, 1H), 6,51 (β, 3H), 6,7 (q, 2, 1H), 7,42 (и, 1H), 7,5e (а, 1H), 8,19 (в, 3H), 8,40 (s, 3H), 8,47 (в, 3H), 8,60 (t, 11, 1H), 8,95 (d, 7, 3E), 9,05 (d, 7, 3H), 9,01 (d, 7, 3H), 9,10 (q, 11, 1H), 9,21 (d, 6, 3H).

vl) spektrum při 25,05 MHz, a vazbou rozrušenou šumem při použití roztoku každého z faktorů v deuterochloroformu má následující vrcholy (hodnoty s uvedením mnohočetnosti signálů v závorce):

faktor A:

173.2 (s), 142,6 (d), 139,2 (s), 137,6 (s), 137,1 (s), 137,0 (d), 130,4 (s), 123,1 (D),

120,1 (d), 117,8 ca), 99,5 (a), 80,0 (a), 79,0 (d), 76,5 (d), 69,0 (d), 68,3^X, 67,4 (d),

48.2 (t), 45,5 (d), 40,9 (t), 40,5 (t), 35,8^X, 34,5 (t), 22,1 (q), 34,5 (t), 26,6 (d),

22.6 (q), 22,0 (q), 19,7 (q), 15,3 (q), 13,7 (q), 10,8 (q).

faktor B;

173,4 (a), 142 (d), 139,5 (a), 137,1 (a), 135,7 (a), 133,7 (a), 123,6 (d), 123,3 (d), 120,0 (d), 119,3 (d), 118,2 (d), 99,5 (a), 80,1 (a), 77,3 (d), 76,6 (d), 76,4 (d), 69,0 (d), 68,3 Cd), 67,9^X, 67,6^X, 57,5 (q), 48,2 (t), 45,4 (d), 40,7 (t), 40,5 (t), 35,8 ^x, 34,5 (t), 22,1 (q) 19,6 (q), 15,3 (q), 13,6 (q), 12,9 (q), 10,5 (q).

faktor C;

173,3 (a), 142,2 (d), 140,3 (a), 138,5 (a), 137,0 (a), 134,9 (a), 123,9 (d), 121,1 Cd),

120.6 (d), 118,1 (d), 100,2 (a), 80,6 (a), 80,1 (d), 77,4 (d), 69,2 (d), 69,0 (d), 68,3^X, 68,0 (d>, 67,9 (d), 48,6 (t), 46,3 (d), 41,4 (t), 36,5^X, 36,3^X, 36,1 (d), 35,0 (t), 22,6 (q), 20,0 (q), 15,4 (q), 14,3 (q), 13,1 (q), 10,8 (q).

faktor D;

173.2 (a), 142,5 (d), 139,1 (a), 137,5 (a), 137,1 (a), 132,1 (a), 131,4 (d), 123,1 Cd),

120,1 (d), 117,8 Cd), 99,5 (a), 79,9 (a), 79,2 (d), 76,5 (d), 69,0 (d), 68,3^X, 68,I^х,

67,6^X, 67,4^X, 48,2 (t), 45,5 Cd), 40,8 (t), 40,5 (t), 40,5 (t), 35,7^X, 34,5 (t), 22,0 (q),

20.6 (t), 19,6 (q), 15,3 (q), 13,7 (q), 13,6 (q), 10,7 (q).

^x mnohoSetnoat signálů nebylo možno prokázat, к

vil) Křivky pro cirkulární dichroismue pro faktory А, B, C a D v 0,1¾ roztoku v methanolu jsou znázorněny na obr. 8. Průběh křivek je velmi blízký v oblasti 230 až 260 nm, což je možno vysvětlit adsorpcí dienovým chromoforem. Tento průběh křivek prokazuje, že absolutní konfigurace na uhlíkových atomech v poloze 2,7, 17 a 19 jsou stejné v případě všech Čtyř faktorů.

Dále následují příklady zpracování sloučenin, vyrobených podle vynálezu na prostředku, určeném к přímému použití. Pod po jmem účinná složka se rozumí jakákoliv ze sloučenin vyrobených způsobem podle vynálezu, například některých faktorů А, В, C, D, E nebo F.

CS 266803 B2

Aerosolový sprej

	% hmot.	rozmezí
účinná složka	0,1	0,1 až 0,50
trichlorethan	29,9
tr i c h lo r f luorm e th an	35,0
dichlordifluormethan	35,0

Účinná složka se smísí в trichlorethanem a získaná směs se plní do aerosolových nádobek. Prostor nad roztokem se vymyje hnacím plynem a pak se uvede ventil do eprévné polohy. Pak se ventilem pod tlakem nádobka naplní požadovaným hmotnostním množstvím kapalného hnacího prostředku. Nakonec se naplněná nádobka opatří prostředkem pro uvolnění ventilu a protiprachovým uzávěrem.

Emulgovatelný koncentrát

hmot. %
účinná složka	50 g
aniontový emulgátor	40 g
(například fenylsulfonát CALX)
neiontový emulgátor	60 g
(například Syperonic NP13)
aromatické rozpouštědlo
(například Solvesso 100)	do 1 litru
Složky se smísí a míchají do	rozpuštění.
Granule
	hmot. %
(a) účinná složka	50 g
pryskyřice	40 g
sádra (0,833 až 0,246 um)	do 1 kg
(například Agsorb 100A)
(b) účinná složka	50 g
Syperonic NP13	40 g
sádra (0,833 až 0,246 >m)	do 1 kg.

Všechny složky se rozpustí v těkavém rozpouštědle, například methylenchloridu e granulují se v bubnu. Pak se suší к odstranění rozpouštědla.

Účinnost faktorů А, В, C, D, E a F byla stanovena při použití celé řady škůdců e jejich hostitelů včetně následujících:

Tetranychus urticae (fazol a švestka Myrobalan B), Myzus persicae (čínské zelí a ředkvička), Heliothis virescens (bavlník), Chilo portellus (bob), Meloidogyne incognira (fazol), Panonchus ulmi (švestka Myrobalan B), Phorodon humuli (chmel), Aulacorthum circumflexum (brambořík).

Produkt byl užit v kapalné formě rozpuštěním v acetonu. Roztoky byly zředěny vodou s obsahem 0,1 až 1 % hmotnostních smáčedla do požadované koncentrace účinné složky.

Pokusy byly prováděny tak, že určitý počet škůdců byl uložen na prostředí, kterým byla obvykle hostitelská rostlina a toto prostředí bylo ošetřeno prostředkem s účinnou složkou. (Residuální test). V případě Tetranychus urticae byl prostředek nanesen na škůdce i na prostředí (kontaktní test).

Tímto způsobem bylo prokázáno, Že faktory A až F jsou účinné v hmotnostní koncentraci 500 M nebo nižší.

tí č itino в t_proti_ně kterým dalších_škůdcům .

Způsobem, popsaným v ABO75 bylo možno prokázat, že faktory A a C jsou účinné na 80 až 100 % proti Tetranychus urticae (fazol), Myzus persicae (pekinské zelí), Heliothis virescens (bavlník) a Chilo portellus (fazol) do 3 dnů a na 80 až 100 % .proti Meloidogyne incognita (fazol) do sedmi dnů. Faktor В byl v tomto případě účinýna 80 až 100 % proti Tetranychus urticae, Heliothis virescens a Chilo portellus do tří dnů.

Dále bylo antibiotikum, získané způsobem podlé vynálezu užito ve formě pesticidního prostředku proti následujícím organismům. U těch organismů, které jsou označeny x bylo po aplikaci pesticidního prostředku podle vynálezu možno pozorovat uhynutí.

Škůdci x Tetranychus urticae x Panonychus ulmi .

x Fhyllocoptruta oleivora x Myzus persicae x Aphis fabae

Phorodon humuli

Brevicoryne brassicae x Trialeuroides spp. .

x Nilparvata lugens x Nephotettix cincticepe x Chilo partellus x Heliothis spp.

x Spodoptera spp.

x Meloidogyne spp.

x Heterodera spp. x Globodera spp.

Ponagrellus Aphelencoides Anthonomus grandis .

x (Solenopsis geminata)(S. invicta) x (Liriomyza sativae) (L. trifolii) x (Psylla pyricola) x Thrips tabaci x Empoasa abrupta '

Panonychus citri

Sitobion avenae

Diuraphis noxia

Aphin gossypii

Bemisia spp.

Pieris braseicae x Plutella x Tricboplusia x Aedes aegypti x Musea domeatice x Blatella germanica x Periplaneta americana Sitophilus granariue Tribolium caetaneum Phaedon cochlerariae Heptinotarsa decemlinea

Veterinární perorální pasta hmot. % rozmezí účinná složka sacharin Polysorbát 85 distearan hlinitý frakcionovaný kokosový olej

7,5 25,0

3,0

5,0 do 100 až 10

Distearan hlinitý lysorbát 85 za zahřívání, materiálu se disperguje sacharin. Pak se· vmísí účinná složka a výsledná směs se plní do tub z plastické hmoty. ’ · se disperguje ve frakcionovaném kokosovém oleji a prostředku PoPak se disperze zchladí na teplotu místnosti a v olejovitém

Granule pro veterinární účely к míšení 8 krmivém hmot. % rozmezí účinná složka mletý vápenec

2,5 do 100

0,05 až 5

Účinná složka ee smísí s mletým vápencem.

Granule ee připraví za vlhka a pak se suší, načež se směs plní do vhodných obalů.

Emulgovatelný koncentrát účinná složka antiontový emulgátor (například fenylsulfonát CALX) neiontový emulgátor (například Syperonic NP13) aromatické rozpouštědlo (například Solvesso 100) g

g g

do 1 litru

Složky se smísí a míchají do rozpuštění.

Granule

účinná složka	50
pryskyřice	40
sádra (0,833 až 0,246
mm)	do
(například Agsorb 100A)
účinná složka	50
Syperonic NP13	40
sádra (0,833 až 0,246
mm)	do

Všechny složky se rozpustí v těkavém rozpouštědle, například methylenchloricu e granulují se v bubnu. Pak se suší к odstranění rozpouštědla.

Účinnost faktorů А, В, C, D, E a F byla stanovena při použití celé řady škůdců a jejich hostitelů včetně následujících:

Tetranychus urticae (fazol a švestka Myrobalan B), Myzue persicae (Čínské zelí a ředkvička), Heliothis virescens (bavlník), Chilo portellus (bob), Meloidogyne incognita (fazol), Panonchus ulmi (švestka Myrobalan B), Phorodon humuli (chmel), Aulecorthum circumflexum (brambořík).

Produkt byl užit v kapalné formě rozpuštěním v acetonu. Roztoky byly zředěny vodou s obsahem 0,1 až 0,1 % hmotnostních smáčedla do požadované koncentrace účinné složky.

Pokusy byly prováděny tak, Že určitý počet škůdců byl uložen na prostředí, kterým byla obvykle hostitelská rostlina a toto prostředí bylo ošetřeno prostředkem s účinnou složkou (residuální test). V případě Tetranychus urticae byl prostředek nanesen na škůdce i na prostředí (kontaktní test).

Claims

1. Pesticidní prostředek, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje

0,01 až 99 % hmotnostních antibiotika obecného vzorce III

OH kde

R^ znamená methyl, ethyl nebo isopropyl a

R znamená atom vodíku nebo methyl·

2. Způsob výroby antibiotika obecného vzorce III

OH kde

R^x znamená methyl, ethyl nebo isopropyl a

R znamená atom vodíku nebo methyl, jako účinné složky podle bodu 1, vyznačující se tím, že se pěstuje mikroorganismus z čeledi Streptomyces thermoarchaensis, a to Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015, 12111, 12112, 12113 nebo 12114 za aerobních podmínek za přítomnosti využitelných zdrojů uhlíku, dusíku, a anorganických solí, při teplotě 20 až 50 °C, při pH 5,5 až 8,5» po dobu alespoň 2 dny do nahromadění antibiotika, načež se popřípadě ze živného prostředí izoluje alespoň jedna sloučenina obecného vzorce III.

3. Způsob podle bodu 2 pro výrobu sloučenin, v nichž R¹ znamená isopropyl a ?/

1 2 1 2 znamená atom vodíku, nebo R znamená methyl a R methyl, nebo R znamená methyl a R

2 2 atom vodíku nebo R znamená ethyl a R atom vodíku, vyznačující se tím, že se pěstuje Streptomyces theromarchaensis NCIB 12015»

1 2

4. Způsob podle bodu 2 pro výrobu sloučenin, v nichž R znamená ethyl a R nechyl

1 2 nebo v nichž R znamená isopropyl a R methyl, vyznačující se tím, že se pěstuje Screptomyces thermoarchaensis NCIB 12015·

5. Způsob podle bodu 3, vyznačující se tím, že se mycelium mikroorganismu smísí s rozpouštědlem, mísitelným в vodou к extrakci jedné nebo většího počtu sloučenin obecného vzorce III.

6. Způsob podle bodu 3, vyznačující se tím, že produktem je celé fermentační prostředí, pevný podíl tohoto prostředí v neporušeném stavu nebo po rozrušení mycelis se pak od fermentačního prostředí oddělí nebo se získá pevný podíl po oddělení neporušeného, inyce li a nebo jde o prostředí po oddělení mycelia.

CS 268803 В 2

7. Způsob podle bodu 4, vyznačující se tím, že se mycelium mikroorganismu smísí s rozpouštědlem, mísitelným s vodou к extrakci jedné nebo většího počtu sloučenin obecného vzorce III. , .

8. Způsob podle bodu 4, vyznačující se tím, že se mycelium mikroorganismu zpracuje na sloučeninu obecného vzorce III získanou v čisté formě.