DE3750495T2 - Milbemycin-Derivate mit parasitenabtötender Aktivität, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und die sie enthaltenden Zusammensetzungen. - Google Patents

Milbemycin-Derivate mit parasitenabtötender Aktivität, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und die sie enthaltenden Zusammensetzungen.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue anthelminthisch wirksame Substanzen, die aus einem Mikroorganismus gewonnen werden können, Verfahren für ihre Herstellung, pharmazeutische Formulierungen, die sie enthalten, und ihre Verwendung in der Human- oder Veterinärmedizin.
  • Sehr viele Mikroorganismen sind isoliert worden, insbesondere aus Bodenproben, und es ist festgestellt worden, daß einige dieser Mikroorganismen verschiedene Metabolite produzieren, die isoliert werden können und einige davon eine nützliche biologische Aktivität besitzen. Eine Gruppe solcher Metabolite sind die Milbemycine, die durch Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces hergestellt worden sind und die u. a. in GB-A-1,390,336, in J. Antibiotics 29(3), 76-14 bis 76-16 sowie 29(6),76-35 bis 76-42, in US-A-4,144,352 und in GB-A-2 056 986 beschrieben sind.
  • Die α-Gruppe der Milbemycine umfaßt Verbindungen der Formel A:
  • in der Ra eine Methyl-, Ethyl- oder Isopropylgruppe bedeutet. In US-A -4,144,352 ist offenbart, daß diese und verwandte Verbindungen anthelminthische Aktivität besitzen.
  • Verschiedene Milbemycinderivate sind in US-A-4,093,629 und US-A-4,134,973 offenbart.
  • EP-A-0 170 006 und GB-A-2 166 436 offenbaren sechs weitere Verbindungen der Formel B:
  • in der Rb eine Hydroxy- oder Methoxygruppe bedeutet und Rc eine Methyl-, Ethyl- oder Isopropylgruppe darstellt. Diese Verbindungen werden auch durch Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces hergestellt. Es wird angegeben, daß sie anthelminthische Aktivität besitzen.
  • Eine neue Gruppe von Verbindungen, die durch Züchtung eines Mikroorganismus der Gattung Streptomyces gewonnenen werden können, ist entdeckt worden. Diese Verbindungen besitzen anthelminthische Eigenschaften und sind daher zur Verwendung in der Behandlung von Helminthiasis (Wurmleiden) bei Menschen und Tieren geeignet.
  • Die vorliegende Erfindung stellt dementsprechend Verbindungen der Formel (I) bereit:
  • Verbindungen der Formel (I) sind in nachstehender Tabelle I dargestellt: Tabelle I
  • Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt VM 44867, eine Verbindung der Formel (II), bereit:
  • Charakteristische Daten der erfindungsgemäßen Verbindungen sind nachstehend in den Beispielen angegeben.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch Züchtung eines die Verbindung erzeugenden Mikroorganismus und anschließende Isolierung der Verbindung aus der Kultur, z. B. durch Chromatographie, gewonnen werden.
  • Der hier verwendete Begriff "Züchtung" (und davon abgeleitete Begriffe) bedeutet das gezielt hervorgerufene aerobe Wachstum eines Organismus in Gegenwart von assimilierbaren Kohlenstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Mineralsalzquellen. Ein solches aerobes Wachstum kann in einem festen oder halbfesten Nährmedium oder in einem Flüssigmedium erfolgen, in dem die Nährstoffe gelöst oder suspendiert sind. Die Züchtung kann auf einer aeroben Oberfläche oder in Submerskultur erfolgen. Das Nährmedium kann aus komplexen Nährstoffen bestehen oder chemisch definiert sein.
  • Es ist festgestellt worden, daß Mikroorganismen, die sich zur Herstellung erfindungsgemäßer Verbindungen eignen, zu der Gattung Streptomyces gehörende Bakterienstämme umfassen, welche zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Verbindungen fähig sind. Es ist weiter festgestellt worden, daß Streptomyces E225 der aus dem Boden isoliert worden ist, und Mutanten und natürliche Varianten davon, wie z. B. Streptomyces E225B, Beispiele solcher Stämme sind.
  • Der Begriff "Mutante", wie hier verwendet, umfaßt jeden beliebigen mutierten Stamm, der spontan oder durch die Wirkung eines äußeren Mittels entsteht, gleichgültig, ob dieses Mittel gezielt oder nicht gezielt angewendet wird. Geeignete Verfahren zur Erzeugung von mutierten Stämmen umfassen die, die von H. I. Adler in "Techniques for the Development of Microorganisms" in "Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms", Proceedings of a Symposium, Wien (1973), Seite 241, International Atomic Energy Authority, dargestellt sind. Diese umfassen:
  • (i) Ionisierende Strahlung (z. B. Röntgenstrahlen und γ-Strahlen), UV- Licht, UV-Licht plus ein die Lichtempfindlichkeit steigerndes Mittel (z. B. 8-Methoxypsoralen), salpetrige Säure, Hydroxylamin, Pyrimidinbasenanaloga (z. B. 5-Bromuracil), Acridine, Alkylierungsmittel (z. B. Senfgas, Ethylmethansulfonat), Wasserstoffperoxid, Phenole, Formaldehyd, Nitrosoguanidin, Wärme, und
  • (ii) genetische Verfahren, umfassend z. B. die Rekombination, Transformation, Transduktion, Lysogenisierung, lysogene Konversion, Protoplastenfusion und Selektionsverfahren für spontane Mutanten.
  • Man nimmt an, daß Streptomyces E225 und Streptomyces E225B einen Stamm der Gattung Streptomyces umfassen, über den noch nichts veröffentlicht ist.
  • Deshalb bilden sie einen Teil der vorliegenden Erfindung, insbesondere in biologisch reiner Form. Sie sind in der National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Schottland, hinterlegt worden, wobei die Hinterlegungen (NCIB 12310 und 12509; Daten der Einreichung: 23. Juli 1986 und 20. Juli 1987) gemäß den Bedingungen des "Budapester Vertrages über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren" erfolgte.
  • Die charakteristischen Merkmale von Streptomyces E225 waren wie folgt:
  • Nach 7 bis 14 Tagen Wachstum bei 27ºC auf Stärke-Casein-Agarmedium hatte Streptomyces E225 ein gelbbraunes vegetatives Mycelium gebildet, bei dem die Hyphen nicht in kugelartige oder stäbchenförmige Elemente zerbrachen, sowie ein gelbes oder weißes Luftmycelium, das mit der Alterung der Kultur grau wurde. Die Kultur erzeugte auch ein gelbes lösliches Pigment und bei einigen Kolonien wurde die Ausscheidung gelb er Tröpfchen beobachtet. Die Sporophoren waren einzeln oder paarweise entlang gerader oder gebogener Hauptlufthyphen angeordnet, wobei es keine Beweise für echte verticillate (quirlige) Verzweigung gab, und endeten in Spiralen mit 4 bis 6 Drehungen. Einige Sporophoren zeigten ein warzenähnliches Aussehen, während ältere Kulturen feuchte schwarze Bereiche entwickelten, in denen sich Sporen zusammengeballt hatten.
  • Streptomyces E225 bildete keine Sporen auf einem Hefe-Malz-Agarmedium.
  • Das Fermentationsmedium zur Züchtung des die Verbindung bildenden Mikroorganismus enthält assimilierbare Kohlenstoff- und assimilierbare Stickstoffquellen zusammen mit anorganischen Salzen. Geeignete Stickstoffquellen umfassen Hefeextrakt, Sojamehl, Fleischextrakt, Baumwollsamenmehl, Malz, getrocknete lösliche Brennereiabfälle, Aminosäuren, Proteinhydrolysate sowie Ammonium- und Nitratstickstoff. Geeignete Kohlenstoffquellen umfassen Glucose, Lactose, Maltose, Stärke und Glycerin. Zweckmäßigerweise kann das Kulturmedium auch Alkalimetallionen (z. B. Natrium), Erdalkalimetallionen (z. B. Calcium und Magnesium), Halogenionen (z. B. Chlorid) und Spurenelemente (z. B. Eisen, Zink, Kupfer, Mangan und Kobalt) umfassen.
  • Die Züchtung kann bei einer Temperatur von etwa 20ºC bis 35ºC, vorteilhafterweise bei 27ºC bis 28ºC, erfolgen. Die Kultur kann zweckmäßigerweise 2 bis 35 Tage, vorteilhafterweise 5 bis 20 Tage, nach Beginn der Fermentation zur Erzielung einer optimalen Ausbeute der gewünschten erfindungsgemäßen Verbindung geerntet werden.
  • Die gewünschte Verbindung kann dann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren aus dem Kulturmedium isoliert, aufgearbeitet und gereinigt werden.
  • Das gewünschte Produkt kann entweder aus den Mycelfäden oder aus dem Kulturfiltrat gewonnen werden. Es kann daher günstig sein, wenn im ersten Isolierungsschritt eine Trennung des festen Materials von der Fermentationsnährlösung beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation erfolgt, was zu einem geklärten Kulturfiltrat und festem Material führt. In einer anderen Ausführungsform kann die Fermentationsnährlösung direkt extrahiert werden.
  • Es kann günstig sein, einen Extraktionsschritt mit organischen Lösungsmitteln in das Isolierungs- oder Reinigungsverfahren einzubeziehen, wobei die Verwendung eines Lösungsmittels, wie z. B. Aceton oder Hexan, geeignet ist.
  • Eine weitere Isolierung der gewünschten Verbindung kann vorteilhafterweise durch Chromatographieverfahren erreicht werden. Der Extrakt kann zusätzliche Stoffe enthalten und deshalb kann eine chromatographische Trennung zu vielen Fraktionen führen, von denen die gewünschte(n) Fraktion(en) die Fraktion(en) ist/sind, die aus der gewünschten Verbindung oder aus einem Derivat davon besteht/bestehen.
  • Die gewünschte(n) Fraktion(en) kann/können routinemäßig leicht identifiziert werden, indem man ihre anthelminthische Aktivität untersucht und/oder jede Fraktion chromatographisch untersucht. Die gewünschte(n) Fraktion(en) ist/sind diejenige(n), bei der/denen durch solche Verfahren bestimmt wurde, daß sie die gewünschte Verbindung oder ein Derivat davon enthält/enthalten.
  • Im Bedarfsfall kann eine wiederholte chromatographische Trennung routinemäßig durchgeführt werden. In jeder Phase des Reinigungsverfahrens können die die gewünschte Verbindung enthaltenden Fraktionen vereinigt und dann weiteren Reinigungsschritten unterworfen werden. Bei den ersten Reinigungsschritten kann es günstig sein, die gewünschten Fraktionen lediglich als Fraktionen mit anthelminthischer Aktivität zu bestimmen und alle derartigen Fraktionen zu vereinigen. In späteren Phasen der Reinigung kann es notwendig sein, die gewünschte(n) Fraktion(en) genauer zu bestimmen, um die gewünschte Verbindung von allen anderen möglicherweise vorhandenen Stoffen zu trennen. Es kann von Vorteil sein, die Trennung fortzusetzen, um eine oder mehrere, im wesentlichen aus der gewünschten Verbindung bestehende Fraktionen zu erhalten.
  • Der Ausdruck "im wesentlichen aus der gewünschten Verbindung bestehende Fraktion" bedeutet eine Fraktion, die die gewünschte Verbindung als den in dieser Fraktion vorhandenen einzigen Bestandteil oder als den in dieser Fraktion vorhandenen Hauptbestandteil enthält (gleichgültig, ob andere Bestandteile wirksame oder unwirksame Bestandteile sind). Der Ausdruck "Hauptbestandteil" bedeutet den Bestandteil, der verglichen mit anderen Einzelbestandteilen in der größten Menge vorhanden ist (ausschließlich des Lösungsmittels). Zweckmäßigerweise ist der Hauptbestandteil in einer Menge vorhanden, die größer als die Summe der Mengen aller anderen Bestandteile ist (ausschließlich des Lösungsmittels). Besonders zweckmäßig ist es, wenn der Hauptbestandteil in einer Menge von mindestens 60 Gew.-%, vorteilhafterweise mindestens 70 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 80 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 90 Gew.-% bis 100 Gew.-%, vorhanden ist, bezogen auf die Gesamtmenge des wirksamen Materials oder bezogen auf die Gesamtmenge des in der Fraktion vorhandenen Materials (ausschließlich des Lösungsmittels), gleichgültig, ob dieses Material wirksam oder unwirksam ist. Typischerweise werden die erfindungsgemäßen Verbindungen als Stoffe produziert, die im Gemisch miteinander vorliegen, so daß Fraktionen erhalten werden können, die im wesentlichen aus einem Gemisch von zwei oder mehr erfindungsgemäßen Verbindungen bestehen.
  • Es hat sich als günstig herausgestellt, die chromatographische Trennung auf Kieselgel durchzuführen (unter Verwendung von beispielsweise einer Silica 60-Säule). Zwei oder mehr chromatographische Trennungsschritte können nacheinander durchgeführt werden. Die Elution der Chromatographiesäulen wird zweckmäßigerweise mit organischen Lösungsmitteln, die entweder allein oder als Gemisch verwendet werden, z. B. Hexan/Aceton, Diethylether/Petroleumether oder Methanol/Chloroform, durchgeführt.
  • Die erfindungsgemäße Verbindung oder ein Gemisch erfindungsgemäßer Verbindungen wird zweckmäßigerweise in im wesentlichen reiner Form bereitgestellt, z. B. in einer Reinheit von mindestens 50%, zweckmäßigerweise mindestens 60%, vorteilhafterweise mindestens 75%, vorzugsweise mindestens 85%, insbesondere mindestens 95%, besonderes bevorzugt ist eine Reinheit von mindestens 98%, wobei alle Prozentangaben auf Gewicht/Gewichtsbasis berechnet sind. Eine unreine oder weniger reine Form einer erfindungsgemäßen Verbindung kann beispielsweise für die Herstellung einer reineren Form der gleichen Verbindung oder einer zur pharmazeutischen Verwendung geeigneten verwandten Verbindung (z. B. ein entsprechendes Derivat) verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen parasitizide Eigenschaften. Sie sind z. B. gegen Nematoden, wie z. B. Trichostrongylus colubriformis, wirksam und lassen sich zur Behandlung von Helminthiasis bei Tieren verwenden, wie z. B. bei Säugern einschließlich des Menschen und domestizierter Tiere (einschließlich landwirtschaftlicher Nutztiere).
  • Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung auch eine erfindungsgemäße Verbindung zur Verwendung in der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers bereit, besonders für die Behandlung von endo- und ektoparasitischem Befall und insbesondere für die Behandlung von Helminthiasis bei domestizierten Tieren und bei landwirtschaftlichen Nutztieren.
  • Der Begriff "Helminthiasis" umfaßt diejenigen Krankheiten bei Menschen und bei Tieren, die durch Befall mit parasitären Würmern, wie z. B. Fadenwürmern, Spulwürmern, Hakenwürmern, Lungenwürmern, Filarienwürmern und Peitschenwürmern, verursacht werden. Die Verbindung kann auch gegen Nematoden verwendet werden, die im Boden vorkommen oder Pflanzenparasiten sind.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch gegen Arthropoden wirksam. Der Stamm Arthropoda umfaßt Insekten - wie z. B. Stechfliegen, Läuse, Wanzen, Käfer und Flöhe - und Arachnidae - wie z. B. Milben und Zecken.
  • Eine allgemeine erfindungsgemäße Ausführungsform stellt daher ein Verfahren zur Beseitigung von Arthropoden- oder Nematodenbefall bereit, wobei das Verfahren die Anwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung auf die Arthropoden oder Nematoden oder ihre Umgebung umfaßt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Pestizid bereit, umfassend eine erfindungsgemäße Verbindung oder ein Derivat davon zusammen mit einem geeigneten Trägermittel oder Excipienten, wie z. B. einer Aerosolformulierung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Arzneimittel oder tiermedizinisches Medikament bereit, umfassend eine erfindungsgemäße Verbindung zusammen mit einem pharmazeutisch oder tiermedizinisch verträglichen Trägermittel oder Excipienten.
  • Das erfindungsgemäße Mittel kann entsprechend anderen Anthelminthika in jeder Darreichungsform formuliert werden, die sich zur Verwendung in der Human- oder Veterinärmedizin eignet.
  • In geeigneten Formulierungen kann das Arzneimittel an Tiere oral (als Paste, Flüssigkeit zum Einflößen, Bolus, Kapsel oder Tablette), parenteral, perkutan oder als Futterzusatz (z. B. Granulat, Pellets oder Pulver) verabreicht werden oder kann als Aerosolspray hergestellt werden.
  • In den Formulierungen können die erfindungsgemäßen Verbindungen im Gemisch miteinander und/oder mit anderen Anthelminthika, Insektiziden, Akariziden oder anderen pharmazeutischen Wirkstoffen vorliegen.
  • Zweckmäßigerweise enthält das Mittel die Wirksubstanz in ausreichender Menge, um eine Dosis von 0,01 bis 100 mg Wirkstoff pro kg Tierkörpergewicht pro Dosis, vorzugsweise 0,1 bis 10 mg/kg pro Dosis, bereitzustellen.
  • Ein erfindungsgemäßes Mittel kann zweckmäßigerweise 0,1 Gew.-%, vorzugsweise 1.0 Gew.-% bis 60 Gew.-% der erfindungsgemäßen Verbindung enthalten (bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels), je nach Verabreichungsart.
  • Unter bestimmten Umständen kann die ungereinigte Fermentationsnährlösung verabreicht werden, z. B. indem die gefriergetrocknete Fermentationsnährlösung dem Tierfutter zugesetzt wird.
  • Bekanntlich ist es in einigen Fällen ratsam, die erfindungsgemäße Verbindung infizierten oder möglicherweise infizierten Menschen oder Tieren nach herkömmlichen, bei Anthelminthika verwendeten Dosierungsvorschriften wiederholt zu verabreichen.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
    • Beispiel 1 Herstellung und Isolierung von VM 44857 a) Fermentation
  • Streptomyces E225 wurde bei 27ºC auf einer Festagarplatte aus Stärke-Casein gezüchtet. Ein der Agarplatte entnommener Teil des Mycels wurde zur Beimpfung des in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben enthaltenen Anzuchtmediums (50 ml) verwendet.
  • Der Anzuchtansatz wurde bei 27ºC auf einem Kreiselschüttler mit 240 Upm 48 Stunden bebrütet. Das Anzuchtmedium hatte die folgende Zusammensetzung:
    • Bestandteil Menge (g/l)
  • Sojamehl 10,0
  • Glycerin 20,0
  • Maltose 2,0
  • Spurenelementegemisch 10 ml Stammlösung/Liter
  • Deionisiertes Wasser auf 1 Liter
  • (Das Sojamehl war "Arkasoy 50", geliefert von British Arkady Co. Ltd., Old Trafford, Manchester, Großbritannien.)
  • Das Spurenelementegemisch umfaßte:
    • Bestandteil Menge (g/l)
  • CaCl&sub2; · 2H&sub2;O 10,0
  • MgCl&sub2; · 6H&sub2;O 10,0
  • NaCl 10,0
  • FeCl&sub3; 3,0
  • ZnCl&sub2; 0,5
  • CuCl&sub2; · 2H&sub2;O 0,5
  • MnSO&sub4; · 4H&sub2;O 0,5
  • CoCl2 · 6H&sub2;O 0,5
  • Das Medium wurde vor dem Sterilisieren auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt.
  • Teile (2 ml) des Anzuchtansatzes wurden zur Beimpfung des in 250 ml- Erlenmeyerkolben enthaltenen Fermentationsmediums (50 ml) verwendet. Das Fermentationsmedium enthielt:
    • Bestandteil Menge (g/l)
  • Lösliche Stärke 10
  • Casein (Sigma C5890) 1,0
  • Dikaliumhydrogenphosphat 0,5
  • Magnesiumsulfat 0,5
  • (Sigma C5890 wurde von Sigma Chemical Co. Ltd., Poole, Dorset, England geliefert. "Sigma" ist ein Warenzeichen.)
  • Das Medium wurde vor dem Sterilisieren auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt.
  • Die Fermentationskultur wurde bei 27ºC auf einem Kreiselschüttler mit 240 Upm 19 Tage bebrütet.
  • Fermentationsproben wurden durch einen Test auf anthelminthische in vitro- Aktivität, z. B. ihre Wirksamkeit gegen Haemonchus contortus L&sub3;-Larven, analysiert.
  • Nach 19 Tagen wurde die Gesamtnährlösung aus 100 Fermentationskolben vereinigt und zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen.
    • b) Isolierung eines im wesentlichen reinen VM 44857
  • Das unter (a) gewonnene Zellpellet wurde mit Wasser (0,75 l) zu einem Brei gerührt, mit Aceton gemischt (1,5 l) und 48 Stunden bei 4ºC stehen gelassen. Der Brei wurde dann gefiltert (Hyflo supercel, BDH Chemicals Ltd., Eastleigh, Hampshire, England. "Hyflo" ist ein Warenzeichen), der Rest wurde mit Aceton gewaschen (3 · 250 ml) und die vereinigten Filtrate wurden zur Acetonentfernung eingedampft.
  • Der wäßrige Rest (600 ml) wurde mit Methanol (500 ml) gemischt und das Ganze wurde mit Hexan (3 · 500 ml) extrahiert. Die vereinigten Hexanextrakte wurden eingedampft, der Rest (412 mg) wurde in Methanol (41,2 ml) gelöst und bei -20ºC über Nacht stehen gelassen. Nach einer Filtration zur Entfernung des Präzipitats, das sich gebildet hatte, wurde das Filtrat eingedampft und der Rückstand (295 mg) wurde auf Kieselerde (75 g) chromatographiert, wobei mit 0 bis 20% Aceton in Hexan eluiert wurde. Fraktionen, die durch Dünnschicht- Chromatographie nachgewiesenes VM 44857, VM 44864 und VM 44866 enthielten, wurden gesammelt. Die vereinigten VM 44857-Fraktionen wurden eingedampft, wodurch sich das Produkt (25 mg) in Form eines Öls ergab. Die letzte Reinigung wurde durch präparative Dünnschicht-Chromatographie unter Verwendung keilförmiger Kieselgelplatten (von Analtech, Anachem House, Luton, Bedfordshire, England) erreicht, wobei mit 70 : 30 Diethylether/Petroleumether eluiert wurde, wodurch VM 44857 (6 mg) erhalten wurde. R-Wert bei Dünnschicht-Chromatographie auf einem Kieselgelträger unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Diethylether/Petroleumether (70 : 30) = 0,3.
    • Charakteristische Daten
  • λmax (CH&sub3;OH) 244 nm; m/z (FAB Na&spplus;/Noba) (relative Intensität) 591 (100%) [MNa]&spplus;; δC (CD&sub2;Cl&sub2;) 173,2, 142,2, 139,5, 137,5, 136,6, 134,6, 123,3, 123,0 120,8 119,7, 117,7, 97,4, 82,0, 79,8, 79,0, 68,4, 68,1, 67,3, 48,1, 45,4, 40,8, 36,1, 35,7, 35,3, 34,3, 31,2, 27,2 21,8 19,2, 17,1, 14,9, 12,5 und 10,4 ppm.
  • Die Verweilzeit beträgt 17,4 Minuten bei Anwendung einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter den folgenden Bedingungen: eine Ultrasphere ODS 5 um-Säule (Altex 250 · 4,6 mm) wird mit Methanol/Wasser (90 : 10) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/Minute eluiert und durch UV-Absorption bei 246 nm kontrolliert. [α]D25 (Aceton) + 111º (C = 0,25).
    • Beispiel 2 Herstellung und Isolierung von VM 44864
  • Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren lieferte zusätzlich VM 44864 (4 mg). Rf-Wert bei Dünnschicht-Chromatographie auf einem Kieselgelträger unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Diethylether/Petroleumether (80 : 20) = 0,4.
    • Charakteristische Daten
  • λmax (CH&sub3;OH) 244 nm und 237 nm; m/z (FAB Na&spplus;/Noba) (relative Intensität) 621 (100%) [MNa]&spplus;; [α]D25 (Aceton) + 96,8 (c = 0,25); δC (CDCl&sub3;) 173,8, 142,3, 139,8, 137,2, 135,9, 134,1, 123,6, 123,5, 120,5, 119,5, 118,5, 98,6, 81,9, 80,3, 77,5, 76,9, 71,5, 68,6, 68,2 68,0, 57,7, 48,5, 45,6, 36,6, 36,4, 36,3, 35,9, 34,6, 32,1, 22,3, 19,9, 17,5, 15,6, 13,1 und 10,9 ppm. Die Verweilzeit beträgt 7,0 Minuten bei Anwendung einer HPLC unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen.
    • Beispiel 3 Herstellung und Isolierung von VM 44866
  • Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren lieferte zusätzlich VM 44866 (3 mg). R-Wert bei Dünnschicht-Chromatographie auf einem Kieselgelträger unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Diethylether/Petroleumether (80 : 20) = 0,25.
    • Charakteristische Daten
  • λmax (CH&sub3;OH) 244 nm und 236 nm; m/z (FAB Na&spplus;/Noba) (relative Intensität) 607 (100%) [MNa]&spplus;; [α]D25 (Aceton) + 81,9 (c = 0,16); δ¹³C (CDCl&sub3;) 173 7 142,7 139,5, 137,8, 137,2, 134,1, 123,6, 123,4, 120,6, 120,2, 118,0, 98,8, 81,9, 80,1, 79,1, 71,6, 68,6, 68,4, 68,0, 67,7, 48,5, 45,7, 36,9, 36,5, 36,4, 36,0, 34,6, 32,1, 22,3, 19,9, 17,5, 15,5, 13,1, 10,9 ppm. Die Verweilzeit beträgt 5,8 Minuten bei Anwendung einer HPLC unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen.
    • Beispiel 4 Herstellung und Isolierung von VM 44865
  • Teile (2 ml) des Anzuchtansatzes, der gewonnen wurde wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden zur Beimpfung des in 250 ml-Erlenmeyerkolben enthaltenen Fermentationsmediums (50 ml) verwendet. Das Fermentationsmedium enthielt:
    • Bestandteil Menge (g/l)
  • Caseinhydrolysat 2,0
  • Glucose 20,0
  • Lösliche Stärke 20,0
  • Casein (Sigma C5890) 2,0
  • Dikaliumhydrogenphosphat 0,5
  • Magnesiumsulfat 0,5
  • Calciumcarbonat 5,0
  • Spurenelementegemisch wie in Beispiel 1 10 ml Stammlösung/Liter
  • (Sigma C5890 wurde von Sigma Chemical Co. Ltd., Poole, Dorset, England geliefert. "Sigma" ist ein Warenzeichen.)
  • Das Medium wurde vor dem Sterilisieren auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt.
  • Die Fermentationskultur wurde bei 27ºC auf einem Kreiselschüttler bei 240 Upm 13 Tage bebrütet.
  • Fermentationsproben wurden durch einen Test auf anthelminthische in vitro- Aktivität, z. B. ihre Wirksamkeit gegen Haemonchus contortus L&sub3;-Larven, analysiert.
  • Nach 13 Tagen wurde die Gesamtnährlösung aus 100 Fermentationskolben vereinigt und zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen.
    • b) Isolierung von im wesentlichen reinem VM 44865
  • Das unter a) gewonnene Zellpellet wurde mit Wasser (0,75 l) zu einem Brei gerührt, mit Aceton (1,0 l) gemischt, 30 Minuten gerührt und gefiltert. Die Acetonextraktion wurde dreimal wiederholt und die vereinigten Filtrate wurden zur Acetonentfernung eingedampft.
  • Der wäßrige Rückstand (600 ml) wurde mit Chloroform extrahiert (4 · 500 ml). Die vereinigten Chloroformextrakte wurden getrocknet (MgSO&sub4;) und eingedampft. Der Rückstand (6 g) wurde auf Kieselerde (100 g) chromatographiert und mit einem Gradienten von 0 bis 100% Ether in Hexan eluiert. Fraktionen, die durch Dünnschicht-Chromatographie nachgewiesenes VM 44865 enthielten, wurden vereinigt und eingedampft, wodurch sich ein Rohprodukt (520 mg) in Form eines Öls ergab. Eine letzte Reinigung wurde durch eine weitere Säulenchromatographie unter Verwendung von Kieselerde (75 g) erreicht, wobei mit 0 bis 100% Ether in Hexan eluiert wurde, wodurch VM 44865 (11 mg) erhalten wurde. R-Wert bei Dünnschicht-Chromatographie auf einem Kieselgelträger unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Dichlormethan/Methanol (95 : 5) = 0,4.
    • Charakteristische Daten
  • λmax (CH&sub3;OH) 244 nm; m/z (FAB Na&spplus;/Noba) (relative Intensität) 719 (100%) [MNa]&spplus;; δ¹³C (CDCl&sub3;) 173,3,167,5, 142,6,139,4,137,6, 137,2, 134,9, 134,1, 128,4, 123,6, 123,4 121,0, 120,5, 119,8, 98,8, 81,9, 80,4, 77,3, 74,2, 71,5, 68,9, 68,3, 68,0, 64,3, 57,8, 48,5, 45,5, 36,9, 36,4, 36,3, 35,9, 34,6, 32,1, 22,3, 17,5, 15,6, 14,4, 13,1 12,1 11,0 ppm. Die Verweilzeit beträgt 8,0 Minuten bei Anwendung einer HPLC unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen.
    • Beispiel 5 Herstellung und Isolierung von VM 44867 a) Fermentation
  • Streptomyces E225 wurde bei 27ºC auf einer Agarplatte mit einem Stärke-Casein- Medium gezüchtet. Ein Teil der Kultur wurde zur Beimpfung von sechs Erlenmeyerkolben, jeweils 100 ml sterilisiertes Anzuchtmedium enthaltend, verwendet. Die Kolben wurden bei 27ºC auf einem Kreiselschüttler mit 240 Upm 48 Stunden bebrütet.
  • Das Anzuchtmedium wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
  • Die Kolbenfüllungen wurden zur Beimpfung von 15 l in einem rostfreien 20 l- Stahlfermentor enthaltenem Anzuchtmedium verwendet. Das Medium hatte die gleiche Zusammensetzung, außer daß Leitungswasser statt deionisiertem Wasser verwendet wurde. Vor dem Sterilisieren hatte das Medium einen pH-Wert von 6,3. Der pH-Wert wurde nicht eingestellt. Der Kulturansatz wurde mit 200 Upm gerührt und die Luftzufuhr betrug 15 l/min. Die Temperatur wurde bei 28ºC gehalten. Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Polypropylenglykol P2000 (geliefert von KWR Chemicals Ltd., Eleanor House, 33-35 Eleanor Cross, Waltham Cross, Herts.) automatisch zugesetzt. Die Inkubation wurde 48 Stunden fortgesetzt und danach wurden 4 l der Kultur zur Beimpfung von 100 Produktionsmedium, enthalten in einem rostfreien Stahlfermentor, verwendet. Das Produktionsmedium wies folgende Zusammensetzung auf:
    • Bestandteil Menge (g/l)
  • Kartoffelstärke 20
  • Casein 2
  • Glucose 20
  • Caseinhydrolysat 2
  • K&sub2;HPO&sub4; 0,5
  • MgSO&sub4; 0,5
  • CaCO&sub3; 0,5
  • Spurenelementegemisch wie in Beispiel 1 10 ml/Liter
  • Leitungswasser auf 1 Liter
  • Vor dem Sterilisieren wies das Medium einen pH-Wert von 7,0 auf.
  • Kartoffelstärke und Casein wurden von British Drug Houses Ltd., Broom Road, Parkstone, Poole, Dorset, Großbritannien, geliefert.
  • Caseinhydrolysat wurde von Oxoid Ltd., Wade Road, Basingstoke, Hampshire, Großbritannien, geliefert.
  • Die Produktionskultur wurde mit 160 Upm gerührt und die Luftzufuhr betrug 50 l/min. Die Temperatur wurde bei 28ºC gehalten. Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Polypropylenglykol P2000 automatisch zugesetzt. Das Fermentationsprodukt wurde nach 15 Tagen geerntet und zur Gewinnung der Mycelmasse zentrifugiert.
    • b) Isolierung von VM 44867
  • Die unter a) gewonnene Mycelmasse wurde mit Aceton (2 · 40 l) extrahiert und zur Acetonentfernung konzentriert. Der Rückstand (14 l) wurde dann mit Dichlormethan (2 · 6 l) extrahiert, die vereinigten Extrakte wurden getrocknet (MgSO&sub4;) und eingedampft, bis ein Öl vorlag (40 g). Der Rückstand wurde auf Kieselerde chromatographiert und nacheinander mit 0 bis 60% Diethylether/Hexan eluiert. Fraktionen, die VM 44867 enthielten, wie mit HPLC nachgewiesen, wurden vereinigt und eingedampft, wodurch sich ein halbgereinigtes Produkt in Form eines Öls ergab (66 mg). Die letzte Reinigung wurde durch präparative Dünnschicht-Chromatographie - unter Verwendung keilförmiger Kieselgelplatten (von Analtech, Anachem House, Luton, Bedfordshire, England) erreicht, wobei mit Methanol/Dichlormethan (3 : 97) eluiert wurde. Dadurch wurde ein im wesentlichen reines VM 44867 (4,7 mg) erhalten. Rf-Wert bei Dünnschicht-Chromatographie auf einem Kieselgelträger unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Methanol/Dichlormethan (3 : 97) = 0,3.
    • Charakteristische Daten
  • λmax (CH&sub3;OH) 244 nm; m/z (FAB Na&spplus;/Noba) (relative Intensität) 623 (100%) [MNa]&spplus;. Mit E.I. festgestellte Masse 600,3659, C&sub3;&sub5;H&sub5;&sub2;O&sub8; erfordert 600,3662. δ¹³C (CDCl&sub3;) 174,7, 140,4, 137,4, 136,1, 134,7, 134,0, 125,5, 124,7, 123,7, 120,6, 118,8, 98,8, 81,8, 79,8, 77*, 71,6, 69,5, 68,1, 68,0, 57,4, 48,6, 44,4, 36,9, 36,2, 35,5, 34,5, 32,1, 21,4, 19,3, 17,5, 16,1, 13,8, 13,1 und 10,9 ppm. Die Verweilzeit beträgt 9,5 Minuten bei Anwendung einer HPLC unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen. [α]D25= +51º (Aceton c=0,21).
  • * dieses Signal wurde durch Lösungsmittelsignale verdeckt.
    • Beispiel 6 Biologische Aktivität von VM 44864
  • Fünfzehn 4 Wochen alte mongolische Wüstenspringmäuse beiderlei Geschlechts wurden jeweils mit 750 infektiösen Trichostrongylus colubriformis-Larven (Schafstamm) über Sonden infiziert. Zwanzig Tage nach Infektion wurden diese Tiere willkürlich in drei Gruppen zu jeweils fünf Tieren eingeteilt. Zur Bestätigung, daß sich die Infektion entwickelt hatte, wurden am gleichen Tag Wurmeierzahlungen in zusammengefaßten Kotproben jeder Gruppe durchgeführt.
  • Am 21. Tag nach Infektion wurden die Tiere wie folgt behandelt:
  • Gruppe 1 : 1 mg/kg VM 44864
  • Gruppe 2 : 0,1 mg/kg Ivermectin
  • Gruppe 3 : 0,5 ml/Springmaus eines 50 : 50-Gemisches aus DMSO/PEG 400
  • Alle Behandlungen wurden oral über Sonden ausgeführt.
  • VM 44864 wurde als 0,01%-ige Lösung in einem 50 : 50-Gemisch aus DMSO und PEG 400 hergestellt. Diese Lösung wurde dann zur Bereitstellung der geeigneten Dosis verdünnt. Das verwendete Ivermectin war eine Verdünnung des unter Warenzeichenschutz stehenden Ivomec (Merck).
  • Drei Tage nach Behandlung wurden Wurmeierzählungen in Kotproben aus jeder Gruppe zur Bestimmung der Behandlungswirkung durchgeführt. Zur Gewinnung und Auszählung der Würmer, wie in Beispiel 7 beschrieben, wurden dann die Leichen aller Tiere seziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt. Tabelle III Behandlung Anzahl der gewonnenen Würmer Mittelwert Aktivität Ivermectin Kontrollen

Claims (9)

1. Verbindung der Formel (I):
in der R¹ ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe bedeutet und R² ein Wasserstoffatom oder eine E-2-Methyl- 2-butenoyloxygruppe darstellt, mit der Maßgabe, daß, wenn R² eine E-2-Methyl-2-butenoylaxygruppe bedeutet, R¹ eine Methylgruppe ist; oder eine Verbindung der Formel (II):
2. Verbindung nach Anspruch 1, die erhältlich ist durch Fermentation von Streptomyces E225 NC1B 12310 oder Streptomyces E225B NC1B 12509.
3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, in im wesentlichen reiner Form.
4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend die Züchtung von Streptomyces E225 NC1B 12310 oder Streptomyces E225B NC1B 12509 oder einer Mutante davon.
5. Streptomyces E225 NC1B 12310 oder Streptomyces E225B NC1B 12509 oder eine Mutante davon.
6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung in der Behandlung oder Prophylaxe von endo- und ektoparasitischem Befall des menschlichen oder tierischen Körpers.
7. Verfahren zur Beseitigung von Arthropoden- oder Nematodenbefall, umfassend die Anwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 auf die Arthropoden oder Nematoden oder ihre Umgebung, mit der Maßgabe, daß das Verfahren nicht am menschlichen oder tierischen Körper durchgeführt wird.
8. Pestizid, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zusammen mit einem inerten Träger oder Excipienten.
9. Arznei- oder Tierarzneimittel, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zusammen mit einem pharmazeutisch oder tiermedizinisch verträglichen Träger oder Excipienten.
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