-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Phenalenon-Derivate, Verfahren zu
deren Herstellung, und deren Verwendung als Arzneimittel.
-
Krebs
ist eine zumeist tödlich
verlaufende Erkrankung von Mensch und Tier, die durch das unkontrollierte
Wachsen von körpereigenen
Zellen verursacht wird. Krebs ist die Bezeichnung für die Bildung
von bösartigen
Geschwülsten
(Malignome), von Neoplasmen (Tumoren bzw. Carcinoma) oder für die maligne
Entartung sowie Reifungsstörung
weißer
Blutzellen (Leukämie,
Blutkrebs). Krebs- oder Tumorzellen entstehen durch Umwandlung körpereigener
Zellen. Die Bösartigkeit
der Krebszelle drückt
sich in der Autonomie des Wachstums aus, das heißt in ihrer Fähigkeit,
ungehemmt und ohne Einordnung in den Bauplan der Organe und unter
Gewebszerstörung
infiltrierend zu wachsen. Ein sicheres Zeichen der Malignität ist die
Bildung tumorferner Absiedlungen (Metastasen) nach hämatogener
oder lymphogener Ausbreitung von Tumorzellen. Krebs gehört zu den
häufigsten
Todesursachen des Menschen und deshalb besteht ein großer Bedarf
an Methoden und Mitteln zur Heilung oder Behandlung von malignen
Entartungen.
-
Die
Möglichkeit
einer Therapie maligner Tumoren umfaßt neben der – wenn möglich radikalen – operativen
Entfernung des Tumors, die radiologische Therapie mit Röntgenstrahlen, α-, β-, γ-Strahlen,
die Immuntherapie und die Chemotherapie. Die Immuntherapie ist derzeit
nur in eingeschränktem
Maß anwendbar.
Unter der Chemotherapie von Tumoren versteht man die Gabe von Zellgiften
(Cytostatika) zur Behandlung von Tumoren und von verbliebenen Tumorzellen
nach lokaler chirurgischer Behandlung oder Bestrahlung. Diese Stoffe
greifen spezifisch in bestimmte Vorgänge der Zellteilung ein, so
daß Gewebe
mit hohem Anteil an sich teilenden Zellen, wie das rasch wachsende
Tumorgewebe, empfindlicher reagieren. Zum Einsatz kommen alkylierende
Verbindungen, wie z. B. das Cyclophosphamid (The Merck Index, 12.
Ed. Seite 463), Antimetabolite, wie das Methotrexat (The Merck Index,
12. Ed. Seite 1025), Alkaloide, wie das Vincristin (The Merck Index, 12.
Ed. Seite 1704) und Antibiotika, wie das Daunomycin (The Merck Index,
12. Ed. Seite 479) sowie das Adriamycin (The Merck Index, 12. Ed.
Seite 581-582). All diese Agenzien haben aber aufgrund von massiven
Nebenwirkungen große
Nachteile, so daß der
Tod der Erkrankten nur hinausgezögert,
nicht jedoch abgewendet wird. Zudem treten bei entarteten (Krebs-)
Zellen Resistenzen gegen die angewandten Mittel auf, die derzeitigen
Medikamente wirken dann nicht mehr cytostatisch, wohl aber toxisch
infolge der Nebenwirkungen. Zudem hat sich gezeigt, daß eine kombinierte
bzw. sequentielle Anwendung von Cytostatika die Wirksamkeit eines einzelnen
Cytostatikums (Monotherapie) übertrifft
und dadurch möglich
ist, daß sich
die erheblichen Nebeneffekte bei der Polychemotherapie nicht addieren.
Aus all diesen Gründen
werden neue Chemotherapeutika dringend benötigt und deshalb weltweit gesucht.
-
Es
sind bereits Naturstoffe mit Phenalenon-Grundstruktur beschrieben
worden. Phenalen ist ein kondensiertes, nicht vollständig aromatisches
Ringsystem, welches sich an der Luft zersetzt. Phenalenon ist dessen
Oxidationsprodukt mit einer Carbonyl-Gruppe in 1-Position.
-
Die
Patentanmeldung WO 99/60992 beschreibt generisch Phenalenone, die
in allen Positionen außer C1
mit Wasserstoff oder C1-C4-Alkyl,
bevorzugt Methyl, oder C1-C4-Alkoxy,
vorzugsweise Methoxy substituiert sein können, zur Verwendung als Haarfärbemittel.
-
Die
japanische Patentanmeldung
JP
60199849 beschreibt das Phenalenon-Derivat 2,7,8,9-Tetrahydroxy-4-methoxy-5-methyl-phenalen-1-on,
das als PDE-Inhibitor wirksam ist und zur Behandlung von Arteriosklerose,
Bronchialasthma, Diabetes und Krebserkrankungen verwendet werden
kann.
-
D.
A. Frost & G.
A. Morrison; J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 20, 2388-2396, 1973
beschreiben die Isolierung von Norxanthoherquein (2,3,4,7,8,9-Hexahydroxy-5-methyl-phenalen-1-on)
aus Penicillium herquei Bainer & Sartory.
-
D.
H. R. Barton et al. (Tetrahedron, 6, 48, 1959) beschreiben die Isolierung
von Atrovenetin aus Penicillium atrovenetum sowie aus Penicillium
herquei Bainer & Sartory.
Atroventin wird in Y. Ishikawa et al. (J. Am. Oil Chem. Soc. 68.
666-668, 1991) als Antioxidant, und in WO 00/45165 als anti-neoplastisch
wirksames Cytostatikum beschrieben.
-
N.
Narasimhachi et al. (J. Antibiotics, 25, 155, 1972) und J. Simpson
(Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1233-1238) beschreiben tautomeren
Formen der Verbindung Desoxyherqueinon (2-O-Methyl-Atrovenetin),
die aus Penicillium herquei isolierbar sind und antibiotische Wirksamkeit
gegen Gram-positive Organismen zeigen.
-
Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, alternative Phenalenon-Derivate
bereitzustellen, die in der Tumortherapie verwendet werden können.
-
Die
Erfindung betrifft eine Verbindung der Formel (I-A)
oder eine Verbindung der
Formel (I-B)
wobei X entweder eine Gruppe
der Formel (I-C)
oder der Formel (I-D) bedeutet,
und R
1 und
falls vorhanden R
2 gleichzeitig
- 1.0 H, oder
- 2.0 C1-C6-Alkyl,
C2-C6-Alkenyl oder
C2-C6-Alkinyl bedeuten,
worin Alkyl, Alkenyl und Alkinyl gerade oder verzweigt sind und
gegebenenfalls ein- oder zweifach substituiert sind durch:
2.1
-OH,
2.2 =O,
2.3 -O-C1-C6-Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt
ist,
2.4 -O-C2-C6-Alkenyl,
worin Alkenyl gerade oder verzweigt ist,
2.5 -Aryl,
2.6
-NH-C1-C6-Alkyl,
worin Alkyl gerade oder verzweigt ist,
2.7 -NH-C2-C6-Alkenyl, worin Alkenyl gerade oder verzweigt
ist,
2.8 -NH2 oder
2.9 Halogen,
worin
die Substituenten 2.1 bis 2.9 auch noch weiter substituiert sein
können
durch -CN, -Amid oder -Oxim-Funktionen,
und/oder eine stereoisomere
Form der Verbindung der Formel (I-A) oder der Formel (I-B) und/oder
Gemische diese Form in jedem Verhältnis, und/oder ein physiologisch
verträgliche
Salz der Verbindung der Formel (I-A) oder (I-B).
-
Vorzugsweise
ist R1 und R2 H
oder C1-C6-Alkyl.
-
Chiralitätszentren
können,
wenn nicht anders angegeben, in der R- oder in der S-Konfiguration vorliegen.
Die Erfindung betrifft sowohl die optisch reinen Verbindungen als
auch Stereoisomerengemische, wie Enantiomerengemische und Diasteromerengemische,
in jedem Verhältnis.
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
unterscheiden sich von literaturbekannten Substanzen durch die Polarität, die chemische
Struktur, die biologische Wirksamkeit oder durch weitere physikalischen
Eigenschaften.
-
Der
Stamm Penicillium herquei Bainer & Sartory,
DSM 14142, bildet auf Glukose-, Stärke-, Haferflocken- oder Glycerinhaltigen
Nährlösungen die
Penilenon genannte Verbindung der Formel (II-A) und (II-B), die nachfolgend
zusammenfassend als Verbindungen der Formel (II) bezeichnet werden,
sowie
Atrovenetin der Formel (III-A) und (III-B), die nachfolgend zusammenfassend
als Verbindungen der Formel (III) bezeichnet werden,
-
Verbindungen
der Formeln (I-A) und (I-B), für
die R1 ungleich H ist, sind isomere Formen,
die getrennt voneinander isolierbar sind, und die ineinander überführt werden
können,
beispielsweise indem der Rest R1 abgespalten
wird, wonach R1 gleich H ist, und anschliessend
ausgehend vom jeweils anderen Tautomer zum anderen Isomer der Verbindung
der Formeln (I-A) oder (I-B) mit R1 ungleich
H derivatisiert wird. Nachfolgend werden die Verbindungen der Formeln
(I-A) und (I-B) zusammenfassend als Verbindung der Formel (I) bezeichnet.
-
Die
Verbindungen der Formeln (II-A) und (II-B) sind Tautomere und können unter üblichen
Bedingungen (z. B. Raumtemperatur) nicht getrennt voneinander isoliert
werden. Verbindungen der Formeln (II-A) und (II-B) werden nachfolgend
zusammenfassend als Verbindung der Formel (II) bezeichnet.
-
Die
Verbindungen der Formeln (III-A) und (III-B) sind ebenfalls Tautomere
und können
unter üblichen Bedingungen
(z. B. Raumtemperatur) nicht getrennt voneinander isoliert werden.
Verbindungen der Formeln (III-A) und (III-B) werden nachfolgend
zusammenfassend als Verbindung der Formel (III) bezeichnet.
-
Verbindungen
der Formeln (I-A) und (I-B), für
die R1 gleich H ist, können gemäß der vorliegenden Erfindung
selektiv derivatisiert werden, indem die Hydroxygruppen mit alkylierenden
Agentien in an sich bekannter Weise zur Reaktion gebracht werden,
wie sie beispielsweise von Jerry March im Buch Advanced Organic Chemistry,
John Wiley & Sons,
4th Edition, 1992, beschrieben. Alkylierende
Agentien sind beispielsweise Diazomethan-Derivate, vorzugsweise
Trimethylsilyldiazomethan. Um Umsetzungen selektiv durchzuführen, kann es
vorteilhaft sein vor der Reaktion geeignete, in an sich bekannter
Weise, Schutzgruppen einzuführen.
Die Schutzgruppen werden nach der Reaktion abgespalten und anschließend wird
das Reaktionsprodukt gereinigt.
-
Bisher
wurde keine selektive Alkylierung von Phenalenonen zu den erfindungsgemäßen Verbindungen
beschrieben. Beispielsweise führt
die Reaktion von Desoxyherqueinon mit Diazomethan laut Suga et al. (Bull.
Chem Soc. Jpn., 56, 3661-3666, 1983) zum Desoxyherqueinon-dimethylether
bzw. zur isomeren Verbindung ent-Atrovenetin-trimethylether.
-
Verbindungen
der Formeln (I-A) und (I-B), für
die R1 gleich H ist, können beispielsweise durch Etherspaltung
von Verbindungen der Formeln (I-A) und (I-B), für die R1 ungleich
H ist, hergestellt werden. Etherspaltungen können nach ansich bekannten
Methoden durchgeführt
werden, wie beispielsweise von Jerry March im Buch Advanced Organic
Chemistry, John Wiley & Sons,
4th Edition, 1992, beschrieben.
-
Die
Erfindung betrifft daher ferner ein Verbindung der Formel (1), dadurch
gekennzeichnet, daß sie
die Formel (II) hat, oder ein pharmakologisch verträgliches
Salz der Verbindung der Formel (II).
-
Die
Erfindung betrifft daher weiterhin ein Verfahren zur Herstellung
einer Verbindung der Formel (II), dadurch gekennzeichnet, daß
- 1. der Mikroorganismus Penicillium herquei
Bainer & Sartory,
DSM 14142, bzw. einer ihrer Varianten oder Mutanten in einem wäßrigen Nährmedium
kultiviert wird,
- 2. eine Verbindung der Formel (II) isoliert und gereinigt wird,
und
- 3. die Verbindung der Formel (II) gegebenenfalls in ein pharmakologisch
verträgliches
Salz überführt wird.
-
Ferner
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung
der Formel (I), dadurch gekennzeichnet, daß
- 1. der
Mikroorganismus Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM 14142, bzw. einer ihrer
Varianten oder Mutanten in einem wäßrigen Nährmedium kultiviert wird,
- 2. a) eine Verbindung der Formel (II) isoliert und gereinigt
wird, oder
b) die Verbindung der Formel (III) isoliert und
gereinigt wird,
- 3. a) die Verbindung der Formel (II) zu einer Verbindung der
Formel (I) derivatisiert wird, oder
b) oder die Verbindung
der Formel (III) zu einer Verbindung der Formel (I) derivatisiert
wird, und
- 4. die Verbindung der Formel (I) gegebenenfalls in ein pharmakologisch
verträgliches
Salz überführt wird.
-
Der
Stamm Penicillium herquei Bainer & Sartory,
DSM 14142, bildet auf Glukose-, Stärke- Haferflocken- oder Glycerinhaltigen
Nährlösungen das
Penilenon sowie die Nebenprodukte.
-
Ein
Isolat von Penicillium herquei Bainer & Sartory wurde bei der Deutschen
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder
Weg 1B, 38124 Braunschweig, Deutschland nach den Regeln des Budapester
Vertrages am 6. März,
2001 unter der folgenden Nummer hinterlegt: DSM 14142.
-
Der
Pilz Penicillium herquei Bainer & Sartory,
DSM 14142 besitzt ein grau bis leuchtend grünes Substratmycel und ganz
wenig Luftmycel. Exudate werden auf Malz-Medium nicht gebildet und
Farben werden nicht ins Medium ausgeschieden. Der Stamm bildet in
Kultur die für
Penicillium charakteristischen kompakten Sporangien, 200-400 × 3.5-4.0 μm, die rauh
sind auf der Oberfläche.
Die „Metulae" sind relativ kurz,
meist 4-6 10-12 × 3.0-5.0 μm und keulenförmig. Die
Phialiden sind in 6-10 „verticilli" angeordnet, 7-10 × 3.0 μm, ampullenförmig. Die
Konidien sind elliptisch bis „apiculate", 3.5-5.0 × 3.0-3.5 μm, mit einer
glatten Zellwand. Die Konidien werden in parallelen Ketten, bis
100 μm lang,
gebildet.
-
Das
besagte Verfahren umfasst die Kultivierung von Penicillium herquei
Bainer & Sartory,
DSM 14142, seiner Mutanten und/oder Varianten unter aeroben Bedingungen
in einem mindestens jeweils eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle,
anorganischen Salze und gegebenenfalls Spurenelemente enthaltenden
Kulturmedien.
-
Vorzugsweise
wird die Kultivierung bei einer Temperatur zwischen 20° und 35°C und bei
einem pH zwischen 2 und 9 durchgeführt.
-
Anstelle
des Stammes DSM 14142 können
auch deren Mutanten und Varianten eingesetzt werden, soweit sie
die erfindungsgemäßen Verbindungen
herstellen. Solche Mutanten können
in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispielsweise
Bestrahlung, wie mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen, oder chemische
Mutagene, wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS); 2-Hydroxy-4- methoxy-benzophenon (MOB)
oder N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
(MNNG) erzeugt werden.
-
Als
bevorzugte Kohlenstoffquellen für
die Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole,
wie Glukose, Laktose, Saccharose oder D-Mannit sowie kohlenhydrathaltige
Naturprodukte, wie z.B. Malzextrakt oder Hefextrakt. Als stickstoffhaltige
Nährstoffe
kommen in Betracht: Aminosäuren,
Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Casein, Peptone
oder Tryptone, ferner Fleischextrakte, Hefeextrakte, gemahlene Samen,
beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja, Reis oder der Baumwollpflanze,
Destillationsrückstände der
Alkoholherstellung, Fleischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze
und Nitrate, insbesondere aber auch synthetisch bzw. biosynthetisch
gewonnene Peptide. An anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise
Chloride, Carbonate, Sulfate oder Phosphate der Alkali- oder Erdalkalimetalle,
Eisen, Zink, Kobalt und Mangan enthalten.
-
Die
Bildung der erfindungsgemäßen Verbindungen
verläuft
besonders gut z.B. in einer Nährlösung, die
etwa 0,05 bis 5 %, bevorzugt 1 bis 2 % Malzextrakt, die etwa 0,05
bis 3 %, bevorzugt 0.05 bis 1 % Hefeextrakt und 0,2 bis 5 %, bevorzugt
0,5 bis 2 % Glucose, 0,5 bis 3 %, bevorzugt 1.5% bis 3 % Haferflocken
enthält.
Die Angaben in Prozent sind jeweils bezogen auf das Gewicht der
gesamten Nährlösung.
-
In
dieser Nährlösung bildet
Penicillium herquei Bainer & Sartory,
DSM 14142, ein Gemisch der erfindungsgemäßen Verbindungen. Je nach Zusammensetzung
der Nährlösung kann
der mengenmäßige Anteil eines
oder mehrerer der erfindungsgemäßen Verbindungen
variieren. Außerdem
kann durch die Medienzusammensetzung die Synthese einzelner Verbindungen
gesteuert werden, so daß ein
Verbindung gar nicht bzw. in einer Menge unterhalb der Nachweisgrenze
vom Mikroorganismus hergestellt wird.
-
Die
Kultivierung des Mikroorganismus erfolgt aerob, also beispielsweise
submers unter Schütteln
oder Rühren
in Schüttelkolben
oder Fermentern oder auf Festmedium, gegebenenfalls unter Einführen von
Luft oder Sauerstoff. Sie kann in einem Temperaturbereich von etwa
15 bis 30°C,
vorzugsweise bei etwa 20 bis 30°C,
insbesonders bei 25 bis 30°C
durchgeführt
werden. Der pH-Bereich sollte zwischen 4 und 10 liegen, vorzugsweise
zwischen 6.5 und 7.5. Man kultiviert den Mikroorganismus unter diesen
Bedingungen im allgemeinen über
einen Zeitraum von 48 bis 720 Stunden, vorzugsweise 72 bis 350 Stunden.
Vorteilhaft kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. man stellt
zunächst
eine oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium her, die dann in das
eigentliche Produktions-medium, die Hauptkultur, beispielsweise
im Volumenverhältnis 1:10-1:100, überimpft
werden. Die Vorkultur erhält
man z. B., indem man das Mycel in eine Nährlösung überimpft und etwa 20 bis 120
Stunden, bevorzugt 48 bis 72 Stunden, wachsen läßt. Das Mycel kann beispielsweise
erhalten werden, indem man den Stamm etwa 1 bis 42 Tage, bevorzugt
21 bis 35 Tage, auf einem festen oder flüssigen Nährboden, beispielsweise Hefe-Malz-Agar,
Haferflocken-Agar oder Kartoffeldextrose-Agar, wachsen läßt.
-
Der
Fermentationsverlauf und das Screening nach Mutanten und Varianten,
die die erfindungsgemäßen Verbindungen
produzieren, kann entsprechend dem Fachmann bekannten Methoden,
wie z. B. durch Austestung der biologischen Aktivität in Bioassays
oder durch chromatographische Methoden wie Dünnschichtchromatographie (DC)
oder Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie
(HPLC) verfolgt werden.
-
Der
Pilz Penicillium herquei Bainer & Sartory,
DSM 14142, kann die erfindungsgemäßen Verbindungen durch eine
Oberflächen-
oder Standkultur auf festen Nährböden bilden.
Feste Nährböden werden
durch Zugabe zum Beispiel von Agar oder Gelatine zu wäßrigen Nährmedien
hergestellt. Darüber
hinaus ist es möglich,
die erfindungsgemäßen Verbindungen
durch Fermentation des Pilzes Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM
14142, im Submersverfahren, d. h. in wäßriger Aufschlämmung zu
gewinnen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen
können
sowohl im Mycel als auch im Kulturfiltrat vorkommen, gewöhnlich befindet
sich die Hauptmenge in der Zellmasse. Es ist deshalb zweckmäßig, die
Fermentationslösung
durch Filtration oder Zentrifugation zu trennen. Das Filtrat wird
mit einem Adsorptionsharz als feste Phase extrahiert. Das Mycel,
aber auch die Oberflächenkultur
wird zweckmäßiger Weise
mit einem organischen Lösungsmittel,
beispielsweise Methanol oder Propanol-2 extrahiert.
-
Die
Extraktionen können
in einem weiten pH-Bereich durchgeführt werden, es ist jedoch zweckmäßig, im
neutralen oder schwach sauren Milieu, vorzugsweise zwischen pH 3
und pH 7 zu arbeiten. Die Extrakte können z. B. im Vakuum konzentriert
und getrocknet werden.
-
Die
Verbindungen der Formel (II) und der Formel (III) sind Substanzen,
die unbeständig
sind, wenn nicht besondere Maßnahmen
während
des Isolierungs- und Reinigungsprozesses ergriffen werden. Es wurde gefunden,
daß die
Penilenone in sehr guten Ausbeuten aus den Kulturen des Stammes
DSM 14142 gewonnen werden können,
wenn 1) während
des Isolierungs- und Reinigungsprozesses unter reduzierenden Bedingungen
gearbeitet wird, z. B. stets in Gegenwart von Ascorbinsäure, 2)
die Isolierung in saurem Milieu bei einem pH-Wert kleiner als 7,
vorzugsweise im pH-Bereich von 2 bis 5, erfolgt, 3) während des
Reinigungsschrittes nur milde Agentien verwendet werden, wie zum
Beispiel Adsortionsharze als chromatographische Träger, und 4)
die Gegenwart von Aminen während
des gesamten Verfahrens ausgeschlossen wird.
-
Eine
geeignete Methode der Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindungen
ist die Lösungsverteilung
in an sich bekannter Weise. Eine andere Methode der Reinigung ist
die Chromatographie an Adsorptionsharzen wie z. B. an Diaion® HP-20
(Mitsubishi Casei Corp., Tokyo), an Amberlite® XAD
7 (Rohm and Haas, USA), an Amberchrom® CG,
(Toso Haas, Philadelphia, USA) oder an ähnlichen. Geeignet sind darüber hinaus unter
den angegebenen Umständen
zahlreiche Reverse-, Phase Träger,
z. B. RP8 und RP18,
wie sie z. B. im Rahmen der Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (HPLC)
allgemein bekannt geworden sind. Eine weitere Reinigungsmöglichkeit
besteht unter den angegebenen Umständen in der Verwendung von
sog. Normal-Phasen-Chromatographie-Trägern, wie z. B. Kieselgel oder
Al2O3 oder anderen
in an sich bekannter Weise. Ein alternatives Isolierungsverfahren
ist die Verwendung von Molekularsieben, wie z. B. Fractogel® TSK
HW-40, Sephadex® G-25
und andere, in an sich bekannter Weise.
-
Es
ist darüber
hinaus möglich,
die erfindungsgemäßen Verbindungen
der Formel (I) nach Anreicherung durch Kristallisation zu gewinnen,
wobei beispielsweise organische Lösungsmittel und ihre Gemische, wasserfrei
oder mit Wasserzusatz benutzt werden können.
-
Ein
zusätzliches
Verfahren zur Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen
besteht in der Verwendung von Anionenaustauschern, vorzugsweise
im pH-Bereich von 4 bis 7, und Kationenaustauschern, vorzugsweise
im pH-Bereich von 2 bis 5. Besonders geeignet ist hierfür die Verwendung
von Pufferlösungen,
denen man Anteile von organischen Lösungsmitteln hinzugefügt hat.
-
Es
ist aber auch möglich,
die erfindungsgemäßen Verbindungen
durch Sublimieren zu isolieren und/oder zu reinigen.
-
Eine
besonders vorteilhafte Reinigungsmethode zur Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist
die Kristallisation, die in an sich bekannter Weise durchgeführt wird.
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
der Formel (I) können
nach dem Fachmann bekannten Methoden in die entsprechenden pharmakologisch
verträglichen
Salze übergeführt werden.
Unter pharmakologisch verträglichen
Salzen der erfindungsgemäßen Verbindungen
versteht man sowohl anorganische als auch organische Salze, wie
sie in Remingtons Pharmaceutical Sciences (17. Auflage, Seite 1418
[1985]) beschrieben sind. Als Salze kommen insbesondere Alkali-,
Ammonium-, Erdalkalisalze, Salze mit physiologisch verträglichen
Aminen und Salze mit anorganischen oder organischen Säuren wie
z. B. HCl, HBr, H2SO4,
Maleinsäure, Fumarsäure in Frage.
Es kommen aber auch Komplexe mit Metall-Ionen, wie zum Beispiel
mit Calcium, Magnesium, Zink, Eisen oder anderen in Frage, die Verbindungen
der Formel (I) haben eine ausgeprägte Neigung, Ionen, vorzugsweise
Kationen, komplex zu binden.
-
Es
wurde überraschend
gefunden, daß die
erfindungsgemäße Verbindungen
der Formel (I) starke cytostatische Wirkungen aufweisen, sie eignet
sich daher zur Therapie und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, die
durch unkontrolliertes Wachstum von Gewebe oder Zellen verursacht
werden, oder Tumorerkrankungen. Es ist besonders bemerkenswert,
daß die
erfindungsgemäße Verbindungen
keinerlei Kreutzresistenz mit herkömmlichen Cytostatika aufweisen.
-
Es
ist gefunden worden, daß die
Verbindungen der Formel (I) Protein-Kinasen hemmen. Die Kinasen gehören zu den
Transferasen, die Phosphat-Reste von Adenosin-triphophat auf andere
Substrate übertragen. Proteine
und Enzyme werden durch die Proteinkinasen meist an Serin-, Threonin-
oder Tyrosin-Seitenketten phosphoryliert und in ihrer Aktivität modifiziert,
was als verbreitetes Regulationsprinzip im Stoffwechsel und der Signaltransduktion
erkannt worden ist. Im Fall der Krebserkrankungen vermehrt sich
das kranke Gewebe unkontrolliert; ein Eingriff in die Regulation
der Kinasegesteuerten Proliferation ist daher wünschenswert. In der Kaskade
der Zellvermehrung sind eine Anzahl von Kinasen beteiligt. Mehrere
dieser Kinasen werden durch die erfindungsgemäßen Verbindungen gehemmt.
-
Hervorzuheben
ist darüber
hinaus eine antimikrobielle Hemmwirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen
der Formel (I) auf Bakterien, wie beispielsweise Staphylococcus
aureus, Streptomyces murinus und gegen Pilze, wie Aspergillus niger,
die hartnäckige,
lebensbedrohende Infektionskrankheiten verursachen können. Die
antimikrobielle Wirksamkeit kann zum Beispiel durch sogenannte Agardiffusionsteste
nachgewiesen werden. So bewirkt Penilenon auf einer Agarplatte mit
Streptomyces murinus – Kultur
in einer Lösung
von 1 mg pro mL einen Hemmhof von 11 mm und in einer Lösung von
0.1 mg pro mL einen Hemmhof von 8 mm. Die erfindungsgemäßen Verbindungen
der Formel (I) eignen sich daher ebenfalls zur Therapie und/oder
Prophylaxe von bakteriellen Infektionen und/oder Pilzerkrankungen.
-
Die
Verbindungen der Formel (I) können
auch als Antioxidantien benutzt werden. Antioxidantien (Oxidationsinhibitoren)
sind organische Verbindungen, die unerwünschte, durch Sauerstoff-Einwirkungen
bedingte Veränderungen
in den zu schützenden
Stoffen hemmen oder verhindern. Antioxidantien werden zum Beispiel benötigt in
Kunststoffen zum Schutz gegen Alterung, in Fetten zum Schutz gegen
Ranzigkeit, in Ölen
gegen Verharzung, in Aromastoffen gegen Geruchsverschlechterung,
in Lebensmitteln, und in Arzneimitteln. Die Wirkung der Antioxidantien
besteht meist darin, daß sie
als Radikalfänger
für die
bei der Oxidation auftretenden freien Radikale wirken. Die antioxidative
Wirkung von Atrovenetin (Verbindung der Formel (III)) wurde bereits beschrieben
von Y. Ishikawa et al. J. Am. Oil Chem. Soc. 68, 666-668, 1991.
Mikrobielle Antioxantien sind aber in ihrer Wirkung häufig zu
schwach oder nicht gut verträglich.
Es besteht daher ein großer
Bedarf an neuen, wirksamen und verträglichen Antioxidantien. Die
Verbindungen der Formel (I) sind hoch aktive Antioxidantien sind,
die das Atrovenetin in seiner Wirkung erheblich übertrifft: Während das
Atrovenetin in Lösung
und in fester Form mit Luftsauerstoff nur langsam reagiert (zum
Beispiel in Stunden), verbindet sich beispielsweise das Penilenon
der Formel (II) mit Sauerstoff innerhalb von Sekunden oder in wenigen
Minuten. Diese erhöhte
Affinität
des Penilenons zu Sauerstoff ist aber für sehr oxidationsempfindliche
Stoffe von entscheidendem Vorteil.
-
Eine
andere chemische Eigenart der erfindungsgemäßen Verbindungen ist die Fähigkeit
zur Komplexbildung mit mehrwertigen, vorzugsweise 2- und 3-wertigen
Kationen, wie zum Beispiel mit Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe3+. Die Komplexbildungs-Fähigkeit
kann für
die Herstellung von Arzneimitteln von Vorteil sein, so sind zum Beispiel
Inhibitoren der Matrix-Metallo-Proteasen (MMP's) bekannt geworden, die in der Lage
sind, das Zink dieser Enzyme zu binden. Es sind aber auch andere
Einsatzmöglichkeiten
bei Erkrankungen denkbar, deren Ausprägung sich in einer abnormalen
Metallionen-Konzentration im Organismus manifestieren. Auch ist
es möglich,
die Komplexbildungsfähigkeit
der erfindungsgemäßen Verbindungen
außerhalb
der Medizin nutzbar zu machen, beispielsweise in der Wassertechnik,
in Körperpflegemitteln,
und in der Polymerisationstechnik (Ullmans Enzyklopädie der
Technischen Chemie, 5. Auflage, A 10, 95-100, 1985-1995).
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
der Formel (I) können
ebenfalls in der Behandlung von rheumatischen Erkrankungen, beispielsweise
rheumatischer Arthritis wirken. Das Wirkprinzip der Verminderung von
oxidativem Stress in rheumatischer Arthritis durch Radikalfänger oder
Antioxidanzien wurde beispielsweise beschrieben von Ostrakhovitch
und Afanas (Biochemical Pharmacology, 2001, 743-746).
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft demzufolge auch die Verwendung der
erfindungsgemäßen Verbindungen
der Formel (I) als Arzneimittel, inbesondere zur Behandlung und/oder
Prophylaxe von Tumorerkrankungen, bakteriellen Infektionen, Mycosen,
rheumatischen Erkrankungen und von Erkrankungen, die sich die Hemmung
von Matrix-Metallo-Proteasen behandeln lassen.
-
Des
Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel mit
einem Gehalt an mindestens einer der erfindungsgemäßen Verbindungen.
-
Das
besagte Arzneimittel wird durch Mischung von mindestens einer Verbindung
der Formel (I) mit einem oder mehreren physiologisch annehmbaren
Hilfsstoff hergestellt und in eine geeignete Darreichungsform gebracht.
-
Die
erfindungsgemäßen Arzneimittel
können
enteral (oral), parenteral (intramuskulär oder intravenös), rektal
oder lokal (topisch) angewendet werden. Sie können in Form von Lösungen,
Pulvern (Tabletten, Kapseln einschließlich Mikrokapseln), Salben
(Cremes oder Gel), oder Suppositorien verabreicht werden. Als physiologisch
annehmbare Hilfsstoffe für
derartige Formulierungen kommen die pharmazeutisch üblichen
flüssigen oder
festen Füllstoffe
und Streckmittel, Lösemittel,
Emulgatoren, Gleitstoffe, Geschmackskorrigentien, Farbstoffe und/oder
Puffersubstanzen in Frage. Als zweckmäßige Dosierung werden 0.1 – 1000,
vorzugsweise 0.2 – 100
mg/kg Körpergewicht
verabreicht. Sie werden zweckmäßig in Dosierungseinheiten
verabreicht, die mindestens die wirksame Tagesmenge der erfindungsgemäßen Verbindungen,
z. B. 30 – 3000,
vorzugsweise 50 – 1000
mg enthalten.
-
Die
folgenden Beispiele sollen der näheren
Erläuterung
der Erfindung dienen, ohne die Breite der Erfindung in irgendeiner
Weise begrenzen zu wollen.
-
Beispiel 1 Herstellung
einer Glycerinkultur von Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM
14142
-
30
ml Nährlösung (Malzextrakt
2,0%, Hefeextrakt 0,2 %, Glucose 1,0 % (NH4)2HPO4 0,05 %, pH
6,0) in einem sterilen 100 ml Erlenmeyerkolben werden mit dem Stamm Penicillium
herquei Bainer & Sartory,
DSM 14142, beimpft und 6 Tage bei 25°C und 140 UpM auf einer rotierenden
Schüttelmaschine
inkubiert. 1,5 ml dieser Kultur werden anschließend mit 2,5 ml 80 %igem Glycerin
verdünnt
und bei –135°C gelagert.
-
Beispiel 2 Herstellung
einer Vorkultur im Erlenmeyerkolben von Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM 14142
-
100
ml Nährlösung (Malzextrakt
2,0%, Hefeextract 0,2 %, Glucose 1,0 % (NH4)2 HPO4 0,05 %, pH
6,0) in einem sterilen 300 ml Erlenmeyerkolben werden mit dem Stamm
Penicillium herquei Bainer & Sartory,
DSM 14142, beimpft und 4 Tage bei 25°C und 140 UpM auf einer rotierenden
Schüttelmaschine
inkubiert. 2 ml dieser Vorkultur werden anschließend für die Herstellung der Hauptkulturen
beimpft.
-
Beispiel 3 Herstellung
einer Hauptkulturultur von Penicillium herquei Bainer & Sartory, DSM
14142.
-
Ein
steriler 300 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml der folgende Nährlösung Malzextrakt
2,0%, Hefeextrakt 0,2 %, Glucose 1,0 % (NH4)2 HPO4 0,05 %, pH
6 wird mit einer auf einem Schrägröhrchen (gleiche
Nährlösung, jedoch
mit 2 % Agar) gewachsenen Kultur oder mit 2 ml einer Vorkultur (s.
Beispiel 2) beimpft und auf einer Schüttelmaschine bei 140 UpM und
25 C inkubiert. Die maximale Produktion einer oder mehrerer Verbindungen
der erfindungsgemäßen Penilenons
ist nach ca. 144 Stunden erreicht. Zum Animpfen von 10 bis 200 l
Fermentern genügt
eine 96 bis 144 Std. alte Submerskultur (Animpfmenge ca. 10 %) aus
der gleichen Nährlösung. Die
Bedingungen für
diese Fermenter sind:
Temperatur 25°C
Rührergeschwindigkeit: 200 UpM
Belüftung 15
l Min–1
-
Durch
wiederholte Zugabe von ethanolischer Polyollösung kann die Schaumbildung
unterdrückt
werden. Das Produktionsmaximum wird nach ca. 96 bis 144 Stunden
erreicht.
-
Beispiel 4: Isolierung
der Verbindungen (II) und (III)
-
5
Liter Kulturlösung,
gewonnen nach Beispiel 3, wurden zentrifugiert und die Zellmasse
(0.5 Liter) mit 2 Liter Methanol, dem 0.1 % Ascorbinsäure hinzugefügt worden
ist, extrahiert. Die klare filtrierte methanolische Phase wurde
im Vakuum auf 1 L eingeengt und auf eine 1 Liter fassende, mit Adsorptionsharz
MCl Gel
® CHP20P
gefüllte
Säule aufgetragen.
Säulenmaße: Breite × Höhe: 7 cm × 27 cm.
Eluiert wurde mit einem Lösungsmittel-Gradienten
von 10 % Propanol-2 bis 90 % Propanol-2 in 0.1 % wässriger
Ascorbinsäure-Lösung. Der
Säulenausfluß (140 mL/Minute)
ist in Fraktionen je 250 mL aufgefangen worden. Die Penilenon-haltigen Fraktionen
23 bis 26 (Gemisch der Verbindungen der Formeln (II-A) und (II-B),
zusammenfassend Verbindungen der Formeln (II) genannt) und die Atrovenetin
beinhaltenten Fraktionen 43 bis 51 (Gemisch der Verbindungen der
Formeln (III-A) und (III-B), zusammenfassend Verbindungen der Formeln
(III) genannt), die durch HPLC-Analysen überprüft wurden,
sind gesammelt und im Vakuum konzentriert worden. Die zusammengefassten
Fraktionen wurden jeweils im Vakuum eingeengt und kalt gelagert.
Aus den Fraktionen 23 bis 26 kristallisierte das Penilenon (260
mg Verbindung der Formel (II)), die Fraktionen 43 bis 51 ergaben
1.2 g Atrovenetin (Verbindung der Formel (III)). Unter Argon-Schutzgasatmosphäre wurden
die Kristallisate abfiltriert und unter Sauerstoff-Ausschluß in der
Kälte gelagert. Beispiel
5: Isolierung bzw. Reinigung durch HPLC.
Säule: | Superspher
100 RP-18e®,
250-4, mit Vorsäule, |
Mobile
Phase: | 2
Minuten: 5 % Acetonitril in 0.1 % Phosphorsäure, |
| 18
Minuten: Gradient von 5% bis 100% Acetonitril in 0.1 |
| Phosphorsäure, anschließend |
| 100%
Acetonitril gleichbleibend. |
Flußgeschwindigkeit: | 1
mL pro Minute, |
Detektion
durch UV-Absorption bei 210 nm. | |
-
Es
werden für
die Verbindung der Formel (II) die Retentionszeit von 13.5 Minuten,
und für
die Verbindung der Formel (III) 20.5 Minuten gefunden.
-
Beispiel 6: Charakterisierung
der Verbindung der Formel (II).
-
Die
physikalisch-chemischen sowie spektroskopischen Eigenschaften von
Penilenon lassen sich wie folgt zusammenfassen:
-
Aussehen:
-
Gelbe,
in mittelpolaren und polaren organischen Lösungsmitteln lösliche,
in Wasser wenig lösliche kristalline
Substanz. Der Schmelzpunkt ist wegen der Zersetzung nicht bestimmbar.
Stabil in mild saurem Milieu unter reduzierenden Bedingungen. Unter
Einfluß von
Sauerstoff, in neutralem Milieu oder in Gegenwart von Aminen verfärbt sich
Penilenon grün.
Summenformel: | C14H10O6 |
Molekulargewicht: | 274.23 |
-
Durch
ESI+ Massenspektrometrie wurde ein Molekül-Ion 275.2 [M + H]+ gefunden, unter ESI (negativ)-Bedingungen
273 [M – H]– bzw.
271 [M – 3H]– gemessen.
UV-Maxima:
215 nm, 248 (Sh) nm, 275 (Sh), 389nm.
-
Tabelle
1: NMR-Daten –
1H- und
13C-chemische
Verschiebungen von Penilenon der Formel (II) in DMSO-d
6 bei 300K
(in ppm; Nummerierung zum Zwecke der NMR-Auswertung entspricht nicht der IUPAC-Nomenklatur).
-
-
Beispiel 7: Gewinnung
der Penilenon-monomethylether-Derivate der Formel (IV-A) und (IV-B).
-
40
mg Verbindung der Formel (II) (Penilenon, isoliert entsprechend
Beispiel 4 wurden in 30 mL Tetrahydrofuran gelöst und mit 0.5 mL 2.0 M (Trimethylsilyl)-diazomethan, gelöst in Hexan
[Aldrich, Kat.-Nr. 36,283-2], versetzt. Nach einer Stunde wurde
die Reaktion durch Wasserzugabe beendet und das Lösungsmittel
im Vakuum abdestilliert. Das Reaktionsprodukt ist dann auf einer
Nucleosil HD®-Säule (21
mm × 250 mm)
aufgetrennt. Als Elutionsmittel diente ein Gradient von 10% bis
99% Acetonitril in 0.1 % Essigsäure.
Der Säulendurchfluß, 20 mL
pro Minute, wurde fraktioniert aufgefangen. Die Fraktionen, die
das Methylierungsprodukt enthielten, wurden jeweils zusammengefaßt, im Vakuum
eingeengt und kristallisiert.
-
Gewonnen
wurden 6 mg des Penilenon-dimethylethers der Formel (IV-A), Summenformel:
C16H14O6, Molekulargewicht:
302.29, und 1 mg des Penilenon-dimethylethers
der Formel (IV-B), Summenformel: C16H14O6, Molekulargewicht:
302.29.
-
Penilenon-dimethylether
der Formel (IV-A):
-
- UV-Maxima: 216 nm, 242 nm, 280 nm (Sh), 387 nm.
-
Tabelle
2: NMR-Daten –
1H- und
13C-chemische
Verschiebungen δ des
Penilenon-dimethylethers
der Formel (IV-A) in DMSO-d
6 bei 300K (in
ppm; Nummerierung zum Zwecke der NMR-Auswertung entspricht nicht
der IUPAC-Nomenklatur).
-
-
Penilenon-dimethylethers
der Formel (IV-B):
-
- UV-Maxima: 213 nm, 241 nm und 390 nm.
-
Tabelle
2: NMR-Daten –
1H- und
13C-chemische
Verschiebungen δ des
Penilenon-dimethylethers
der Formel (IV-B) in DMSO-d
6 bei 300K (in
ppm; Nummerierung zum Zwecke der NMR-Auswertung entspricht nicht
der IUPAC-Nomenklatur).
-
-
Beispiel 8: Gewinnung
der Atrovenetin-Derivate (V-A) und (V-B).
-
100
mg Verbindung der Formel (III) (Atrovenetin, hergestellt gemäß Beispiel
4 wurden in 5 mL Tetrahydrofuran gelöst und mit 1 mL 2.0 M (Trimethylsilyl)-diazomethan, gelöst in Hexan
[Aldrich, Kat.-Nr. 36,283-2], versetzt. Nach 15 Minuten wurde die
Reaktion durch Wasserzugabe beendet und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert.
Das Reaktionsprodukt ist dann auf einer Nucleosil AB®-Säule (21
mm × 250
mm) aufgetrennt. Als Elutionsmittel diente ein Gradient von 10%
bis 99% Acetonitril in 0.02% Trifluoressigsäure, welche mit Ammoniumhydroxyd
auf pH 4.5 gestellt worden ist. Der Säulendurchfluß, 15 mL
pro Minute, wurde fraktioniert aufgefangen. Die Fraktionen, die
die Methylierungsprodukte enthielten, wurden jeweils zusammengefaßt, im Vakuum
eingeengt und kristallisiert.
-
Gewonnen
wurden 24 mg Atrovenetin-monomethylether (V-A), Summenformel: C20H20O6,
Molekulargewicht: 356.38, und 10 mg Atrovenetin-monomethylether
(V-B), Summenformel
C20H20O6,
Molekulargewicht: 356.38.
-
Atrovenetin-monomethylether
(V-A):
-
- UV-Maxima: 218 nm, 260 nm (Sh), 394 nm.
-
Tabelle
3: NMR-Daten –
1H- und
13C-chemische
Verschiebungen δ des
Atrovenetin-monomethylethers
(V-A) in DMSO-d
6 bei 300K (in ppm; Nummerierung
zum Zwecke der NMR-Auswertung entspricht nicht der IUPAC-Nomenklatur).
-
Atrovenetin-monomethylether
(V-B):
-
- UV-Maxima: 222 nm, 282 nm, 385 nm.
-
Tabelle
4: NMR-Daten –
1H- und
13C-chemische
Verschiebungen δ des
Atrovenetin-monomethylethers
(V-B) in DMSO-d
6 bei 300K (in ppm; Nummerierung
zum Zwecke der NMR-Auswertung entspricht nicht der IUPAC-Nomenklatur).
-