DE4303512A1 - Aspinonen, ein Metabolit aus Aspergillus sp., und chemische Derivate mit pharmakologischer Wirkung, ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben - Google Patents

Aspinonen, ein Metabolit aus Aspergillus sp., und chemische Derivate mit pharmakologischer Wirkung, ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben

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Description

Die Erfindung betrifft den Naturstoff Aspinonen, welcher von dem Pilz Aspergillus sp. während der Fermentation synthetisiert und in den Kulturüberstand abgegeben wird, sowie die auf Basis von Aspinonen hergestellten, chemischen Derivate, ein Herstellungsverfahren, die Verwendung von Aspinonen und Aspinonen-Derivaten als pharmakologische Wirkstoffe und den Mikroorganismus Aspergillus sp. DSM 7428.
Sekundärmetabolite aus Mikroorganismen werden erfolgreich zur Behandlung von Infektionskrankheiten eingesetzt. Bei Sekundärmetaboliten handelt es sich um niedermolekulare Verbindungen, deren Bildung in "biosynthetischen Einbahnstraßen", die vom Primärmetabolismus abzweigen, erfolgt und deren Funktion für den jeweiligen Produzenten ungeklärt ist. Bis heute sind ca. 8000 aus Kulturen verschiedener Mikroorganismen (vor allem Pilze und Bakterien der Gattung Streptomyces) isolierte Sekundärmetabolite bekannt.
Das Indikationsgebiet mikrobieller Wirkstoffe hat sich zwischenzeitlich auf Krankheiten, die nicht zu den Infektionskrankheiten zählen (z. B. Tumortherapie, Immunmodulation oder zur Regulation des Fettstoffwechsels) und auf den Pflanzenschutz (Herbizide und Insektizide) ausgeweitet. Die eingesetzten Wirkstoffe sind allerdings oft noch mit Mängeln behaftet, gekennzeichnet durch unbefriedigende Wirkhöhen, eine zu hohe Toxizität und/oder unerwünschte Nebenwirkungen.
Aufgabe der Erfindung ist es, nach mikrobiellen Wirkstoffen mit verbesserten Eigenschaften und neuen Wirkmechanismen zu suchen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Fermentation von Aspergillus sp. in einer Nährlösung mit Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie den üblichen anorganischen Salzen, bis sich Aspinonen in dem Kulturüberstand anhäuft, anschließender Isolierung von Aspinonen aus dem Kulturüberstand und gegebenenfalls einer chemischen Derivatisierung von Aspinonen. Der Metabolit Aspinonen und seine chemischen Derivate besitzen pharmakologische und damit therapeutische Wirksamkeit und können vorteilhaft als Verbindungen mit lipidregulatorischen Eigenschaften eingesetzt werden, wobei insbesondere die Biosynthese von Cholesterin beeinflußt wird.
Die Erfindung
  • 1. Eine Verbindung der Formel in der unabhängig voneinander
    R1 Wasserstoff oder Acetyl,
    R2 Wasserstoff oder Acetyl bedeutet oder R2 und R5 eine gemeinsame Bindung zu einem Tetrahydrofuranring bilden,
    R3 Wasserstoff oder Acetyl,
    R4 und R5 Hydroxyl bedeuten oder gemeinsam eine Etherbrücke bilden,
    R1, R2 und R3, die gleich oder verschieden sein können, einen gesättigten oder ungesättigten, verzweigten oder unverzweigten oder cyclischen C1-C20 Alkylester, einen substituierten oder unsubstituierten aromatischen Ester, einen Heteroarylester oder einen Alkyl- oder Arylsulfonsäureester bedeuten.
  • 2. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel l, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Aspergillus sp. in einem Nährmedium kultiviert wird, bis sich eine Verbindung der Formel I in der Kultur anhäuft und aus dem Nährmedium isoliert wird.
  • 3. Eine Verwendung einer Verbindung der Formel I als pharmakologisch wirksamen Stoff.
  • 4. Aspergillus sp. DSM 7428.
Im folgenden wird die Erfindung detailliert beschrieben, insbesondere in ihren bevorzugten Ausführungsformen. Ferner wird die Erfindung durch den Inhalt der Patentansprüche bestimmt.
Die Verbindung, in der R1 = R2 = R3 = Wasserstoff und R4 mit R6 eine Etherbrücke bilden, ist der aus Aspergillus sp. und insbesondere aus Aspergillus sp. DSM 7428 isolierte Naturstoff Aspinonen. Diese Verbindung ist eine bevorzugte Verbindung. Die weiteren Verbindungen der Formel I werden durch chemische Derivatisierung von Aspinonen hergestellt.
Aspergillus sp. wird aus einer Erdprobe isoliert.
Für die Aufreinigung des Pilzes aus der Erde wird diese unter Herstellung einer Verdünnungsreihe mit einer physiologischen NaCl-Lösung (0,9%) aufgeschwemmt. Die verschiedenen Verdünnungen (10°-106) werden anschließend auf einen Pilznährboden (z. B. einem Malzextrakt- Glucosenährboden) ausplattiert. Nach einer Bebrütung der Kulturen bei 25°C für die Dauer von 3-15 Tagen entstehen Pilzkolonien, die vereinzelt und durch mehrere, aufeinanderfolgende Aufreinigungsschritte isoliert werden können.
Die Bestimmung der Pilzgattung Aspergillus sp. wird anhand von morphologischen und taxonomischen Kriterien nach dem Fachmann bekannten Methoden vorgenommen. Charakteristisch sind folgende per Mikroskop zu analysierende Kriterien:
  • - Aspergillus sp. besitzt Konidiophoren mit je 1 Vesikel;
  • - Vesikel besitzen Konidien und Phialiden.
Aufgrund von aufeinanderfolgenden Isolierungs- und Aufreinigungsschritten kann man von Aspergillus sp. eine Pilzkolonie isolieren, die Aspinonen sehr effizient in den Kulturüberstand abgibt und als Hauptproduzent bezeichnet wird.
Als Hauptproduzent wird ein Pilzisolat bezeichnet, das eine Verbindung der Formel I in einer 10- bis 100-fach erhöhten Menge im Vergleich zu Isolaten der gleichen Pilzart produziert bzw. in den Kulturüberstand abgibt.
Die stark produzierende Pilzkolonie wird vermehrt und bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, 3300 Braunschweig, Deutschland, nach den Regeln des Budapester Vertrages am 26. Januar 1993 unter der folgenden Bezeichnung hinterlegt:
Aspergillus sp. DSM 7428.
Die für Aspergillus sp. o.g. morphologischen und taxonomischen Kriterien gelten auch für den hinterlegten Stamm. Außerdem kann Aspergillus sp. DSM 7428 wie folgt beschrieben werden:
  • - Koloniefarbe: braun;
  • - Konidienfarbe: rosa-beige;
[Die Bestimmung der Koloniefarbe und Konidienfarbe erfolgt nach Anzucht des Pilzes auf MEA (Malzextraktagar) gemäß dem Standard von "Raper and Thom, Manual of the Aspergilli (1945, The William and Wilkins Company, Baltimore, USA)].
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Verbindung erfolgt bevorzugt mit Aspergillus sp. DSM 7428.
Anstelle des Stammes DSM 7428 können auch dessen Mutanten und Varianten eingesetzt werden, soweit sie eine Verbindung der Formel I synthetisieren. Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung, wie mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder chemische Mutagene, wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS), 2-Hydroxy-4-methoxy-benzophenon (MOB) oder N-Methyl-N′-nitro-N- nitrosoguanidin (MNNG) erzeugt werden.
Das Screening nach Mutanten und Varianten, die eine Verbindung der Formel synthetisieren, erfolgt nach folgendem Schema:
  • - Abtrennung des Mycels nach der Fermentation;
  • - Adsorption des Kulturfiltrates an ein Polystyroladsorberharz;
  • - Elution mit 50%igem Methanol;
  • - Aufkonzentrierung und Analytik mittels Dünnschichtchromatographie auf Kieselgelplatten; als Laufmittel wird ein Chloroform-Methanol-Gemisch (Verhältnis 9 : 1) verwendet;
  • - Detektion mittels Ansprühen mit einer Mischung aus Anisaldehyd und Schwefelsäure.
Die im folgenden beschriebenen Fermentationsbedingungen gelten für Aspergillus sp., das hinterlegte Isolat sowie Mutanten und Varianten.
In einer Nährlösung, die eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle sowie die üblichen anorganischen Salze enthält, produziert Aspergillus sp. und insbesondere Aspergillus sp. DSM 7428 Aspinonen.
Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie Glukose, Laktose oder D-Mannit sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie z. B. Malzextrakt. Als stickstoffhaltige Nährstoffe kommen in Betracht: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Peptone oder Tryptone, ferner Fleischextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Fleischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. An anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate oder Phosphate der Alkali- oder Erdalkalimetalle, Eisen, Zink, Kobalt und Mangan enthalten.
Die Bildung von Aspinonen mit Aspergillus sp., bevorzugt DSM 7428, verläuft besonders gut in einer Nährlösung, die etwa 0,2 bis 5%, bevorzugt 1 bis 4% Malzextrakt und 0,02 bis 0,5%, bevorzugt 0, 1 bis 0,4% Hefeextrakt enthält, sowie 0,2 bis 0,5%, bevorzugt 0,5 bis 2% Glucose und 0,01 bis 0,1%, bevorzugt 0,04 bis 0,06% (NH4)2HPO4, jeweils bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung.
Die Kultivierung erfolgt aerob, also beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder Fermentern, gegebenenfalls unter Einführen von Luft oder Wasserstoff. Sie können in einem Temperaturbereich von etwa 15 bis 30 °C, vorzugsweise bei etwa 20 bis 30 °C, insbesondere bei 23 bis 28 °C, durchgeführt werden. Der pH-Wert liegt zwischen pH 1 und 8, vorteilhaft zwischen pH 2,5 und 4,5. Man kultiviert den Pilz unter diesen Bedingungen im allgemeinen über einen Zeitraum von 24 bis 300 Stunden, bevorzugt 36 bis 140 Stunden.
Vorteilhaft kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Volumenverhältnis 1 : 10, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man, z. B., indem man ein versportes Mycel in eine Nährlösung überimpft und etwa 36 bis 120 Stunden, bevorzugt 48 bis 72 Stunden, wachsen läßt. Das versporte Mycel kann beispielsweise erhalten werden, indem man den Stamm etwa 3 bis 40 Tage, bevorzugt 4 bis 10 Tage, auf einem festen oder flüssigen Nährboden, beispielsweise Hefe-Malz-Agar oder Kartoffel-Dextrose-Agar, wachsen läßt.
Der Fermentationsverlauf kann jeweils anhand der pH-Werte der Kulturen oder der Mycelvolumina sowie durch chromatographische Methoden, wie z. B. Dünnschichtchromatographie oder High Pressure Liquid Chromatography, überwacht werden. Die Verbindungen der allgemeinen Formel I sind überwiegend im Kulturfiltrat enthalten.
Die Isolierung von Aspinonen aus dem jeweiligen Kulturmedium erfolgt nach bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Produkte. Es können z. B. das Adsorptions-, Ionenaustausch- oder Gelfiltrationsverfahren angewendet werden.
Ethylacetat/Methanol/Wasser-Mischungen werden als Laufmittel in dem Fachmann bekannten Konzentration, angewandt. Die Detektion bei der dünnschichtchromatographischen Auftrennung kann beispielsweise durch UV- Lösung und Färbereagentien wie Anisaldehyd, Tetrazolblau oder Orcin erfolgen, wobei die Menge der gebildeten Substanz zweckmäßig mit einer Eichlösung verglichen wird.
Zur Isolierung von Aspinonen werden Kulturbrühe und Mycel der einzelnen Fermentationen zuerst z. B. durch Filtration oder Zentrifugation getrennt. Das Kulturfiltrat wird über ein Adsorberharz, wie z. B. XAD® Adsorber der Fa. Amberlite gegeben, an dem Aspinonen bindet und mit einem Lösungsmittel/Wasser-Gemisch, z. B. Methanol/Wasser 4 : 1, eluiert werden kann.
Die Reinisolierung von Aspinonen erfolgt durch Chromatographie an geeigneten Materialien, vorzugsweise an Kieselgel, Aluminiumoxid, Ionenaustauschern oder Adsorberharzen, durch anschließende Elution mit organischen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, wie z. B. Essigsäurealkylester, Gemische aus Essigsäurealkylester mit einem niederen Alkanol, Chloroform oder Methylenchlorid bzw. Gemischen dieser Lösungsmittel mit niederen Alkanolen, gegebenenfalls auch mit Wasser, bzw. einem für Ionenaustauscher-Harzen geeigneten pH- bzw. Salzgradienten, wie beispielsweise Kochsalz oder Tris- (hydroxymethyl)-aminomethan-HCl(Tris-Puffer) und Vereinigung der biologisch aktiven Fraktionen. Eine Reinigung ist aber auch durch extraktive Methoden wie flüssig/flüssig-Extraktion oder fest/flüssig-Extraktion möglich.
Aspinonen ist im festen Zustand und in Lösungen im pH-Bereich 2 bis 8, insbesondere 3 bis 7, stabil und läßt sich damit in übliche galenische Zubereitungen einarbeiten.
Aspinonen eignet sich aufgrund seiner wertvollen pharmakologischen Eigenschaft sehr gut zur Anwendung als Arzneimittel.
Das von Aspergillus sp. und insbesondere von Aspergillus sp. DSM 7428 synthetisierte, dann teilisolierte oder isolierte Aspinonen kann für die chemische Modifikation an den Substituenten R1-R5 eingesetzt werden. Die Substitutionen erfolgen gemäß dem in der Fachliteratur beschriebenen und dem Fachmann bekannten Verfahren. Diese Verfahren sind z. B. Hydrierung von Doppelbindungen und Veresterungen von Hydroxygruppen mit Säuren, Säurechloriden oder Säureanhydriden. Als Arylsulfonsäureester werden Phenylreste definiert, gegebenenfalls substituiert mit 3 Resten aus der Gruppe C1-C3-Alkyl, Halogen, C1-C3-Alkoxy.
Die Umsetzung von Aspinonen mit Säurechloriden in CH2Cl2 liefert Aspinonen- Mono- und Diester in guten Ausbeuten (z. B. liefert die Umsetzung von Aspinonen mit p-Brombenzoylchlorid Di-O-p-bromobenzoyl-aspinonen.
Außerdem kann man die Stereoisomerengemische eines cyclischen Aspinonen- Derivates durch Umsetzung von Aspinonen in Aceton mit katalytischen Mengen p-Toluol-sulfonsäure erhalten.
Auch die Derivate von Aspinonen zeigen pharmakologische Wirksamkeit, insbesondere besitzen sie lipidregulatorische Eigenschaften. Sie eignen sich somit sehr gut als Arzneimittel.
Eine Verbindung der allgemeinen Formel I kann zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die insbesondere auf einem erhöhten Cholesterinspiegel beruhen, insbesondere koronare Herzkrankheiten, Arteriosklerose und ähnlicher Krankheiten. Die Anwendung betrifft auch pharmazeutische Zubereitungen einer Verbindung der Formel I.
Eine Verbindung der allgemeinen Formel I kann grundsätzlich als solche in Substanz verabreicht werden. Bevorzugt ist die Verwendung in Mischung mit geeigneten Hilfsstoffen oder Trägermaterial. Als Trägermaterial können bei Tierarzneimitteln die üblichen Futtermittelmischungen bzw. beim Menschen alle pharmakologisch verträglichen Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffe verwendet werden.
Die Anwendung betrifft auch pharmazeutische Zubereitungen einer Verbindung der Formel I.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden im allgemeinen oral oder parenteral verabreicht, aber auch eine rektale Anwendung ist prinzipiell möglich. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Tabletten, Dragees, (Mikro-)Kapseln, Zäpfchen, Sirupe, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole, Tropfen oder injizierbare Lösungen in Ampullenform sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung üblicherweise Trägerstoffe und Zusätze und/oder Hilfsmittel wie Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel oder Lösungsvermittler Verwendung finden. Als häufig verwendete Träger- oder Hilfsstoffe seien z. B. Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Laktose, Mannit und andere Zucker, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Vitamine, Cellulose und ihre Derivate, tierische pflanzliche Öle, Polyethylenglykole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser, Alkohole, Glycerin und mehrwertige Alkohole genannt.
Gegebenenfalls können die Dosierungseinheiten für die orale Verabreichung mikroverkapselt werden, um die Abgabe zu verzögern oder über einen längeren Zeitraum auszudehnen, wie beispielsweise durch Überziehen oder Einbetten des Wirkstoffs in Teilchenform in geeignete Polymere, Wachse oder dergleichen.
Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Präparate in Dosierungseinheiten hergestellt und verabreicht, wobei jede Einheit als aktiven Bestandteil eine bestimmte Dosis einer Verbindung der Formel I enthält. Bei festen Dosierungseinheiten wie Tabletten, Kapseln und Suppositorien kann diese Dosis bis zu etwa 200 mg, bevorzugt jedoch etwa 0,1 bis 100 mg, und bei Injektionslösungen in Ampullenform bis zu etwa 200 mg, vorzugsweise aber etwa 0,5 bis 100 mg, pro Tag betragen.
Die zu verabreichende Tagesdosis ist abhängig vom Körpergewicht, Alter, Geschlecht und Zustand des Säugers. Unter Umständen können jedoch auch höhere oder niedrigere Tagesdosen angebracht sein. Die Verabreichung der Tagesdosis kann sowohl durch Einmalgabe in Form einer einzelnen Dosierungseinheit oder aber in mehreren kleineren Dosierungseinheiten als auch durch Mehrfachgabe unterteilter Dosen in bestimmten Intervallen erfolgen.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden dadurch hergestellt, daß man eine oder mehrere Verbindungen der Formel I mit üblichen Träger- sowie gegebenenfalls Zusatz- und/oder Hilfstoffe in die bzw. eine geeignete Darreichungsform bringt.
In den sich anschließenden Beispielen wird die Erfindung weiter erläutert. Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht. Mischungsverhältnisse bei Flüssigkeiten beziehen sich auf das Volumen, wenn keine anderen Angaben gemacht wurden.
Beispiele 1. a) Herstellung einer Sporensuspension des Produzentenstammes Aspergillus sp. DSM 7428
100 ml Nährlösung [20 g Malzextrakt, 2 g Hefeextrakt, 10 g Glucose, 0,5 g (NH4)2HPO4 in 1 l Leitungswasser, pH-Wert vor der Sterilisation 6,0] in einem 500 ml sterilen Erlenmeyerkolben werden mit dem Stamm DSM 7428 beimpft und 72 Stunden bei 25 °C und 140 UpM auf einer rotierenden Schüttelmaschine inkubiert. Anschließend werden 20 ml Kulturflüssigkeit in einem sterilen 500 ml Erlenmeyerkolben mit dem Nährboden [Kartoffelinfus 4,0 g/l (Infus aus 200 g Kartoffeln in 1000 ml H2O), 20,0 g D-Glucose, pH vor der Sterilisation 5,6], dem zusätzlich 15 g Agar/I zur Verfestigung zugegeben wurde, gleichmäßig verteilt und dekantiert. Die Kulturen werden 10 bis 14 Tage bei 25 °C inkubiert. Die nach dieser Zeit entstandenen Sporen eines Kolbens werden mit 500 ml entionisiertem Wasser, das einen Tropfen eines handelsüblichen nichtionischen Tensids (z. B. ®Triton X 100, Fa. Serva) enthält, abgeschwemmt, sofort weiterverwendet oder bei -22°C in 50% Glycerin aufbewahrt.
b) Herstellung einer Kultur bzw. einer Vorkultur des Produzentenstammes im Erlenmeyerkolben
Ein steriler 500 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml der unter a) beschriebenen Nährlösung wird mit einer auf einem Schrägröhrchen gewachsenen Kultur oder mit 0,2 ml Sporensuspension angeimpft und auf einer Schüttelmaschine bei 140 UpM und 25 °C inkubiert. Die maximale Produktion einer Verbindung der Formel I ist nach ca. 96 bis 120 Stunden erreicht. Zum Animpfen von 10 und 100 l Fermenten genügt eine 72 Stunden alte Submerskultur (Animpfmenge ca. 5%) aus der gleichen Nährlösung.
2. Herstellung von Aspinonen
Ein 10 l Fermenter wird unter folgenden Bedingungen betrieben:
20 g/l Malzextrakt
10 g/l Glucose
2 g/l Hefeextrakt
0,5 g/l (NH₄)₂HPO₄
pH 6,0 (vor der Sterilisation)
Der pH-Wert wird mit wäßriger 2 N NaOH oder HCl eingestellt.
Inkubationszeit: 120 Stunden
Inkubationstemperatur: 25°C
Rührergeschwindigkeit: 200 UpM
Belüftung: 5 l Luft/min
Durch wiederholte Zugabe weniger Tropfen ethanolischer Polyollösung kann die Schaumbildung unterdrückt werden. Das Produktionsmaximum des Stammes wird nach ca. 96 bis 120 Stunden erreicht. Der pH-Wert beträgt bei der Ernte ca. pH 3,5 bis 4,0.
3. Aufarbeitung
Die Aufarbeitung der Kulturlösung des Stammes Aspergillus sp. DSM 7428 erfolgt nach folgendem Aufarbeitungsschema:
Schema 1
Aufarbeitungsschema des Stammes
4. Reindarstellung und Charakterisierung von Verbindungen der Formel I a) Aspinonen (2,5-Dihydroxy-6,7-epoxy-5-hydroxymethyl-3-octen)- C₉H₁₆O₄
(Molekulargewicht = 188.2 g/mol)
DCl-MS (200 eV): m/e = 206 (100%, M⁺+NH3
+H⁺)
EI-MS (70 eV): m/z 157 (8%, Hochauflösung berechnet für C8
H13
O3
und gefunden 157.0864, M-CH3
O), 99 (90%, M-CH3
O-C3
H5
O), 81(11%, M-CH3
O-C3
H5
O-H2
O), 43 (100%, C2
H3
O)
IR: 3380, 2970, 2930, 2880, 1650, 1060, 970, 945, 870 cm-1
UV:
(MeOH)λmaxnm(ε): 203 (3480)
(MeOH+HCl)λmaxnm(ε): 203 (3140)
(MeOH+NaOH)λmaxnm(ε): 213 (13 800)
CD (MeOH): λextr.nm([R]²²) = 201 (+ 37 300)
[α] = -78 (c = 0.3, Methanol)
¹H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.28 d (J=6.5, 1-CH3), 1.32 d (J=5.5, 8- CH3), 2.10 breit, (3×OH), 2.85 d (J=2.5, 6-H), 3.06 dq (J=2.5 und 5.5, 7-H), 3.58 d (J=11, 9-Ha), 3.70 d (J=11, 9-Hb), 4.35 mc (2-H), 5.68 dd (J=16 und 1, 4-H), 5.93 dd (J=16 und 6, 3-H) ppm
¹³C-NMR (50.3 MHz, CDCl3): δ = 17.2 (q, C-8), 23.1 (q, C-1), 50.0 (d, C-7), 61.9 (d, C-6), 67.5 (t, C-9), 68.1 (d, C-2), 72.3 (s, C-5), 128.5 (d, C-4), 136.2 (d, C-3) ppm
b) p-Brombenzoylierung von Aspinonen - C₂₃H₂₂O₆Br₂
30 mg Aspinonen werden in 10 ml CH2Cl2 gelöst und mit 150 mg p- Brombenzoylchlorid versetzt. Zu der auf 0°C gekühlten Lösung gibt man 15 mg N-Dimethylaminopyridin und rührt bei dieser Temperatur 6 Std. Das Reaktionsgemisch wird auf Eis gegossen und 30 Min. gerührt. Anschließend extrahiert man die wäßrige Phase mit Essigsäure/Ethylester (3×15 ml) und trocknet die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4. Durch Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum erhält man das Rohprodukt (118 mg), welches an Kieselgel (Säule 3×40, CHCl3/MeOH = 100 : 1) aufgereinigt wird. Man erhält 46 mg weißes, amorphes 2,9-Di-O-p-brombenzoyl-aspinonen.
Schmelzpunkt 112°C
(Molekulargewicht = 554.2 g/mol)
EI-MS (70 eV): m/e 554 (5%, M), 497 (20% M-C3H5O), 183 (100%, C7H4O2Br), 43 (16%, C2H3O)
IR: 3430, 3020, 1720, 1590, 1290, 1120, 1030, 850, 765 cm-1
CD (MeOH): λextr.nm([R]²²) = 210 (+67 300), 246 (+209 500)
UV:
(MeOH)λmaxnm(ε): 203 (33 700), 244 (38 340)
(MeOH+HCl)λmaxnm(ε): 203 (32 700), 244 (36 020)
(MeOH+NaOH)λmaxnm(ε): 201 (9170), 212 (22 540), 243 (40 460)
¹H-NMR (200 MHz, CDCl3): 6 = 1.34 (d, J=5.5, 8-CH3), 1.45 (d, J=6.5, 1-CH3), 2.65 breit (OH), 2.93 (d, J=2.5, 6-H), 3.05 (dq, J=2.5 und 5.5, 7-H), 3.90 (s, 1′-CH2Br), 4.32 (d, J=11, 9Ha), 4.48 (d, J=11, 9-Hb), 5.64 (m, 2- H), 5.85 (dd, J=16 und 1, 4-H), 6.06 (dd, J=16 und 6, 3-H), 7.56 (m, Benzoyl-H), 7.88 (m, Benzoyl-H) ppm
c) Acetylierung von Aspinonen mit Bromessigsäure (2, 5-Dihydroxy-6,7- epoxy-5-(2-bromacetoxy)methyl-3-octen) - C11H17O5Br
Eine Lösung von 40 mg Aspinonen in 8 ml CHCl3 wird mit 10 mg DMAP versetzt. Man rührt 2 Std. bei Raumtemperatur. Anschließend gibt man 10 mg DCC sowie 100 mg Bromessigsäure hinzu und rührt 65 Std. bei Raumtemperatur. Das Reaktionsgemisch wird mit Wasser gewaschen (3×10 ml) und über Na2SO4 getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum erhält man ein dünnschichtchromatographisch uneinheitliches Öl (60 mg), das an Kieselgel (Säule 1×25 cm, Essigsäureethylester/Petrolether = 1 : 1) chromatographiert wird. Es ergeben sich zwei Acetylierungsprodukte im Verhältnis 3 : 1, die beide mit Vanillin-Schwefelsäure dunkelbraun anfärbbar sind. Man erhält 34.8 mg 2,5-Dihydroxy-6,7-epoxy-5-(2-bromacetoxy)methanol-3- octen und 13.6 mg 2-(2-Bromacetyl)-5-hydroxy-6,7-epoxy-S-(2- bromacetoxy)methyl-3-octen, was einer Gesamtausbeute von 68% entspricht.
Schmelzpunkt: 175°C
(Molekulargewicht = 309.2 g/mol)
EI-MS (70 eV): m/e = 636 (22%, 2M+NH3+H⁺), 556 (11%), 2M+NH3+H⁺-Br), 327 (97%, M+NH3+H⁺)
IR: 3420, 2930, 1740br, 1630, 1290 cm-1
UV:
(MeOH)λmaxnm(ε): 201 (3570)
(MeOH+HCl)λmaxnm(ε): 201 (3100), 230 (1210)
(MeOH+NaOH)λmaxnm(ε): 204 (4940), 213 (9040)
¹H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.28 d (J=6.5, 1-CH3), 1.32 d (J=5.5, 8-CH3), 1.93 breit (OH), 2.53 breit (OH), 2.88 d (J=2.5, 6-H), 3.02 dq (J=2.5 und 5.5, 7-H), 3.905 (1′-CH2Br), 4.13 d (J=11, 9Ha), 4.37 d (J=11, 9-Hb), 4.37 m (2-H), 5.68 dd (J=16 und 1, 4-H), 5.97 dd (J=16 und 6, 3-H) ppm
¹³C-NMR (50.3 MHz, CDCl3): δ = 16.9 (q, C-8), 23.4 (o, C-1), 25.5 (t, C-2′), 50.3 (d, C-7), 61.3 (d, C-6), 68.0 (d, C-2), 70.3 (t, C-9), 70.6 (s, C-5), 125.9 (d, C-4), 136.8 (d, C-3), 167.0 (s, C-1′) ppm
d) 2-(2-Bromacetoxy)-5-hydroxy-6,7-epoxy-5-(2-bromacetoxy)methyl-3- octen - C₁₃H₁₉O₆Br₂
Schmelzpunkt: 164°C
(Molekulargewicht = 417.8 g/mol)
IR: 3440, 1730 (br), 1275 cm-1
¹H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.28 d (J=6.5, 1-CH3), 1.32 d (J=5.5, 8-CH3), 1.93 breit (OH), 2.53 breit (OH), 2.88 d (J=2.5, 6-H), 3.02 dq (J=2.5 und 5.5, 7-H), 3.825 (2′-CH2Br), 3.905 (1′-CH2Br), 4.13 d (J=11, 9-Ha), 4.37 d (J=11, 9-Hb), 4.37 mc (2-H), 5.68 dd (J=16 und 1, 4-H), 5.97 dd (J=16 und 6, 3-H) ppm
¹³C-NMR (50.3 MHz, CDCl3): δ = 16.9 (q, C-8), 20.1 (q, C-1), 25.5 (t, C-2′), 26.1 (t, C-2′′), 50.4 (d, C-7), 61.1 (d C-6), 70.3 (t, C-9), 70.6 (s, C-5), 72.1 (d, C-2), 129.0 (d, C-4), 131.4 (d, C-3), 166.5 (s, C-1′′), 167.0 (s, C-1′) ppm
e) Tetrahydrofuranbildung durch saure Acetylierung - C₁₃H₂₀O₆
Es werden 50 mg Aspinonen bei Raumtemperatur in 4 ml Acetanhydrid gelöst und mit 0.5 ml Pyridin versetzt. Man rührt diese Mischung 5 Std. und stellt sie dann auf Eis. Nach 1 Std. extrahiert man die wäßrige Phase dreimal mit Essigsäureethylester und trocknet dann die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4. Man erhält 245 mg eines öligen Rohproduktes, das an Kieselgel (Säule 1×30, CHCl3/MeOH = 10 : 1) und anschließend an Sephadex (Säule 1×20, MeOH) gereinigt wird. Es werden 49 mg farbloses, öliges 3-Acetoxy-4-(but-1- enyl-3-acetoxy)-2-methyl-tetrahydrofuran-4-ol isoliert (77% Ausbeute).
(Molekulargewicht = 272.3 g/mol)
EI-MS (70 eV): m/e = 272 (0.1%, M⁺), 212 (9%, M-C2H3O2-H⁺), 155 (52%, M-2 × C2H3O2+H⁺)
IR: 3420 (br), 2980, 1730, 1370, 1240, 1040, 860 cm-1
UV:
(MeOH)λmaxnm(ε): 201 (3900)
(MeOH+HCl)λmaxnm(ε): 201 (3530)
(MeOH+NaOH)λmaxnm(ε): 206 (3790), 213 (5880)
¹H-NMR (200 MHz, CDCl3) (Abweichend von der IUPAC-Nomenklatur wird die Bezifferung der Kohlenstoffatome von Aspinonen der Übersichtlichkeit beibehalten): δ = 1.28 d (J=6, 1-CH3), 1.30 d (J=6.5, 8-CH3), 2.02 und 2.11 s (2 × Ac-CH3), 3.76 d (J=10, 9Ha), 3.90 (J= 10, 9-Hb), 4.04 dq (J=6.0 und 6.5, 7-H), 4.73 d (J= 6.5, 6-H), 5.35 m (2-H), 5.73 dd (J=16 und 1, 4-H), 5.87 dd (J=16 und 5, 3-H) ppm
¹³C-NMR (50.3 MHz, CDCl3) (Abweichend von der IUPAC-Nomenklatur wird die Bezifferung der Kohlenstoffatome von Aspinonen der Übersichtlichkeit beibehalten): 6 = 18.6 (q, C-8), 20.1 (q, C-1), 20.9 und 21.3 (q, 2 × C-Ac), 69.8 (d, C-2), 76.0 (t, C-9), 77.3 (d, C-7), 78.7 (s, C-5), 81.5 (d,C-6), 130.7 (d, C-3), 131.6 (d, C-4), 169.8 und 170.2 (s, 2×C=O) ppm
5. Biologische Testung als Cholesterinbiosynthese-Inhibitor
Monolayer von HEP-G2-Zellen in lipoproteinfreiem Nährmedium werden mit entsprechenden Konzentrationen der zu prüfenden Substanzen der allgemeinen Formel I eine Stunde vorinkubiert. Nach Zugabe der 14C-markierten Biosynthesevorstufe [14C]-Natriumacetat wird die Inkubation für 3 Stunden fortgesetzt. Danach wird ein Teil der Zellen alkalisch verseift, bei vorheriger Zugabe eines internen Standards von 3H-Cholesterin. Die Lipide der verseiften Zellen werden mit einem Gemisch aus Chloroform-Methanol extrahiert. Dieses Lipidgemisch wird nach Zusatz von Trägercholesterin präparativ dünnschichtchromatographisch aufgetrennt, die Cholesterinbande nach Anfärbung isoliert und die aus dem 14C-Precusor gebildete Menge 14C- Cholesterin szintigraphisch bestimmt. In einem aliquoten Teil der Zellen wird Zellprotein bestimmt, so daß die in der Zelleinheit pro mg Zellprotein aus 14C- Vorläufer gebildete Menge 14C-Cholesterins berechnet werden kann. Zum Vergleich für die Hemmwirkung eines zugesetzten Prüfpräparates dient die Kontrolle, so daß direkt die Hemmung der Cholesterinbiosynthese bei einer bestimmten molaren Konzentration des Prüfpräparates im Medium angegeben werden kann. In aliquoten Anteilen der Zellkultur wird die Intaktheit der Zellkultur und die fehlende Zellschädigung durch Präparateeinwirkung morphologisch (Lichtmikroskopie) beurteilt und biochemisch durch Bestimmung der Laktat-Dehydrogenase Ausschüttung in das Inkubationsmedium gemessen. Als Standardpräparat wurde Lovastatin benutzt. Die Verbindung der Formel I in der R1 = R2 = R3 Wasserstoff bedeuten und R4 mit R5 eine Etherbrücke bildet (= Aspinonen) hemmt die Cholesterin-Biosynthese in einer Konzentration von
10-6 mol/l zu 80%
10-8 mol/l zu 31%.

Claims (10)

1. Verbindung der allgemeinen Formel in der unabhängig voneinander
R1 Wasserstoff oder Acetyl,
R2 Wasserstoff oder Acetyl bedeutet oder R2 und R5 eine gemeinsame Bindung zu einem Tetrahydrofuranring bilden,
R3 Wasserstoff oder Acetyl,
R4 und R5 Hydroxyl bedeuten oder gemeinsam eine Etherbrücke bilden,
R1, R2 und R3, die gleich oder verschieden sein können, einen gesättigten oder ungesättigten, verzweigten oder unverzweigten oder cyclischen C1-C20 Alkylester, einen substituierten oder unsubstituierten aromatischen Ester, einen Heteroarylester oder einen Alkyl- oder Arylsulfonsäureester bedeuten.
2. Verbindung der Formel I zur Verwendung als Arzneimittel.
3. Arzneimittel, enthaltend Verbindung der Formel I und einen oder mehrere pharmazeutische Träger.
4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß Aspergillus sp. in einem Nährmedium kultiviert wird, bis sich eine Verbindung der Formel I in der Kultur anhäuft und aus dem Nährmedium isoliert wird.
5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Aspergillus sp. DSM 7428 in einem Nährmedium kultiviert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium 0,2 bis 5% Malzextrakt, 0,1 bis 0,5% Hefeextrakt, 0,5 bis 2% Glucose und 0,01 bis 0,1% (NH4)2HPO4 enthält, jeweils bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei 15°C bis 30°C und in dem pH-Bereich zwischen 1 und 8 erfolgt.
8. Verwendung einer Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 als pharmakologisch wirksamen Stoff.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der Formel I als lipidregulatorischer Wirkstoff eingesetzt wird.
10. Aspergillus sp. DSM 7428 sowie Varianten und Mutanten, soweit diese eine Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 herstellen.
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