DE4231451A1 - Waraterpole, neue terpenanaloge Metabolite aus Penicillium sp. mit pharmakologischer Wirkung, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents

Waraterpole, neue terpenanaloge Metabolite aus Penicillium sp. mit pharmakologischer Wirkung, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

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Susanne Dr Grabley
Joachim Dr Wink
Klaus Dr Huetter
Ralf Dr Thiericke
Heinz Dr Haenel
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Description

Waraterpole, neue terpenanaloge Metabolite aus Penicillium sp. mit pharmakologischer Wirkung, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.
Sekundärmetabolite aus Mikroorganismen werden erfolgreich zur Behandlung von Infektionskrankheiten eingesetzt. Bei Sekundärmetaboliten handelt es sich um niedermolekulare Verbindungen, deren Bildung in "biosynthetischen Einbahnstraßen", die vom Primärmetabolismus abzweigen, erfolgt und deren Funktion für den jeweiligen Produzenten ungeklärt ist. Bis heute sind ca. 8000 aus Kulturen verschiedener Mikroorganismen (vor allem Pilze und Bakterien der Gattung Streptomyces) isolierte Sekundärmetabolite bekannt.
Das Indikationsgebiet mikrobieller Wirkstoffe hat sich zwischenzeitlich auf Krankheiten, die nicht zu den Infektionskrankheiten zählen (z. B. Tumortherapie, Immunmodulation oder zur Regulation des Fettstoffwechsels) und auf den Pflanzenschutz (Herbizide und Insektizide) ausgeweitet. Die eingesetzten Wirkstoffe sind allerdings oft noch mit Mängeln behaftet, gekennzeichnet durch unbefriedigende Wirkhöhen, eine zu hohe Toxizität und/oder unerwünschte Nebenwirkungen. Daher ist die Motivation vorhanden, nach neuen mikrobiellen Wirkstoffen mit verbesserten Eigenschaften und neuen Wirkmechanismen zu suchen.
Sekundärmetabolite aus Pilzen sind schon seit langer Zeit bekannt und werden im großen Maßstab in verschiedenen Anwendungsgebieten, so z. B. als Cholesterinsenker, Anthelminthika oder als Antitumormittel benutzt.
Es ist außerdem bekannt, daß Fungi imperfecti unter herkömmlichen Kulturbedingungen terpenanaloge Metabolite produzieren, wie z. B. Sydon- und Hydroxysydonsäure (T. Hamasaki, K. Nagayama und Y. Hatsuda, Agric. Biol.
Chem. 42, (1), 37 (1978)) oder Sordariol (M.L. Bouillant. J. Favre-Bonvin, N. Salin und J. Bernillon, Phytochemistry, 27, 1517 (1988)). Über eine biologische Wirkung bzw. eine pharmakologische Anwendbarkeit dieser Verbindungen ist nichts bekannt.
Die Erfindung betrifft:
  • 1. Eine Verbindung der Formel I in der unabhängig voneinander
    R1 Wasserstoff oder Acetyl,
    R2 Wasserstoff bedeutet oder R2 und R3 gemeinsam eine Doppelbindung bilden,
    R3 Hydroxyl bedeutet oder R2 und R3 gemeinsam eine Doppelbindung bilden und/oder R3 und R4 gemeinsam eine Doppelbindung bilden oder R1 mit R3 eine Etherbrücke bildet,
    R4 Wasserstoff bedeutet oder R3 und R4 gemeinsam eine Doppelbindung bilden,
    R5 Wasserstoff oder Acetyl bedeuten,
    R6 Wasserstoff,
    R7 Wasserstoff oder Hydroxyl bedeutet oder
    R1, R3, R5 und R6, die gleich oder verschieden sein können, einen gesättigten oder ungesättigten, verzweigten oder unverzweigten oder cyclischen C1-C20 Alkylester, einen substituierten oder unsubstituierten aromatischen Ester, einen Heteroarylester oder einen Alkyl- oder Arylsulfonsäureester bedeuten.
  • 2. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Penicillium sp. DSM 7219 in einem Nährmedium kultiviert wird, bis sich eine Verbindung der Formel I in der Kultur anhäuft.
  • 3. Eine Verwendung einer Verbindung der Formel I als pharmakologisch wirksame Substanz, insbesondere als Antimykotikum oder Antibiotikum.
  • 4. Penicillium sp. DSM 7219.
In folgenden wird die Erfindung detailliert beschrieben, insbesondere in ihren bevorzugten Ausführungsformen. Ferner wird die Erfindung durch den Inhalt der Patentansprüche bestimmt.
Die Verbindungen der Formel I werden Waraterpole genannt.
Die Bestimmung der Pilzgattung Penicillium sp. wurde anhand von morphologischen, taxonomischen und biochemischen Kriterien nach dem Fachmann bekannten Methoden vorgenommen. Die Koloniefarbe ist grün, die Conidien sind biverticillat und besitzen eine weiße Oberfläche.
Der ursprüngliche Stamm Penicillium sp. wurde aus einer Erdprobe aus Warakei (Neuseeland) isoliert. Die Isolierung und Aufreinigung erfolgte nach dem Fachmann bekannten Verfahren durch Kulturverdünnung und Ausplattieren auf dem jeweiligen Selektivagar.
Aufgrund von mehreren, aufeinanderfolgenden Isolierungs- und Aufreinigungs­ schritten wurde von Penicillium sp. eine Pilzkolonie isoliert, die eine Verbindung der Formel I sehr effizient in den Kulturüberstand abgibt und somit als Hauptproduzent bezeichnet wird.
Als Hauptproduzent wird ein Pilzisolat bezeichnet, das eine Verbindung der Formel I in einer 10- bis 100-fach erhöhten Menge im Vergleich zu Isolaten der gleichen Pilzart produziert bzw. in den Kulturüberstand abgibt.
Die stark produzierende Pilzkolonie wurde vermehrt und ein Isolat von Penicillium sp. bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, 3300 Braunschweig, Deutschland, nach den Regeln des Budapester Vertrages am 14.08.92 unter der folgenden Nummer hinterlegt:
Penicillium sp. DSM 7219.
Anstelle des Stammes DSM 7219 können auch dessen Mutanten und Varianten eingesetzt werden, soweit sie eine Verbindung der Formel I synthetisieren. Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung, wie mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder chemische Mutagene, wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS), 2- Hydroxy-4-methoxy-benzophenon (MOB) oder N-Methyl-N′-nitro-N- nitrosoguanidin (MNNG) erzeugt werden.
Das Screening nach Mutanten und Varianten, die eine Verbindung der Formel I synthetisieren, erfolgt nach folgendem Schema:
  • - Abtrennung des Mycels nach der Fermentation;
  • - Adsorption des Kulturfiltrates an ein Polystyroladsorberharz;
  • - Elution mit 50%igem Methanol;
  • - Aufkonzentrierung und Analytik mittels Dünnschichtchromatographie auf Kieselgelplatten; als Laufmittel wird ein Chloroform-Methanol-Gemisch (Verhältnis 9 : 1) verwendet;
  • - Detektion mittels Ansprühen mit einer Mischung aus Anisaldehyd und Schwefelsäure.
Die im folgenden beschriebenen Fermentationsbedingungen gelten für Penicillium sp. und das hinterlegte Isolat.
In einer Nährlösung, die eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle sowie die üblichen anorganischen Salze enthält, produziert Penicillium sp. eine Verbindung der allgemeinen Formel I,
in der unabhängig voneinander
R1 Wasser oder Acetyl,
R2 Wasserstoff bedeutet oder R2 und R3 gemeinsam eine Doppelbindung bilden,
R3 Hydroxyl bedeutet oder R2 und R3 gemeinsam eine Doppelbindung bilden, und/oder R3 und R4 gemeinsam eine Doppelbindung bilden,
R4 Wasserstoff bedeutet oder R3 und R4 gemeinsam eine Doppelbindung bilden,
R5 Wasserstoff oder Acetyl,
R6 und R7 Wasserstoff bedeuten.
Diese natürlicherweise hergestellten Verbindungen sind bevorzugte Verbindungen.
Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie Glukose, Laktose oder D-Mannit sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie z. B. Malzextrakt. Als stickstoffhaltige Nährstoffe kommen in Betracht: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Peptone oder Tryptone, ferner Fleischextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Fleischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. An anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate oder Phosphate der Alkali- oder Erdalkalimetalle, Eisen, Zink, Kobalt und Mangan enthalten.
Die Bildung einer Verbindung der Formel I mit Penicillium sp. bevorzugt DSM 7219 verläuft besonders gut in einer Nährlösung, die etwa 0,2 bis 5%, bevorzugt 1 bis 4% Malzextrakt und 0,02 bis 0,5%, bevorzugt 0, 1 bis 0,4 Hefeextrakt enthält, sowie 0,2 bis 0,5%, bevorzugt 0,5 bis 2% Glucose und 0,01 bis 0,1%, bevorzugt 0,04 bis 0,06% (NH4)2HPO4, jeweils bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung.
Die Kultivierung erfolgt aerob, also beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder Fermentern, gegebenenfalls unter Einführen von Luft oder Wasserstoff. Sie können in einem Temperaturbereich von etwa 15 bis 30°C, vorzugsweise bei etwa 20 bis 30°C, insbesondere bei 23 bis 28°C, durchgeführt werden. Der pH-Wert liegt zwischen pH 1 und 7, vorteilhaft zwischen pH 2,5 und 4,5. Man kultiviert den Pilz unter diesen Bedingungen im allgemeinen über einen Zeitraum von 24 bis 300 Stunden, bevorzugt 36 bis 140 Stunden.
Vorteilhaft kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Volumenverhältnis 1 : 10, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man, z. B., indem man ein versportes Mycel in eine Nährlösung überimpft und etwa 36 bis 120 Stunden, bevorzugt 48 bis 72 Stunden, wachsen läßt. Das versporte Mycel kann beispielsweise erhalten werden, indem man den Stamm etwa 3 bis 40 Tage, bevorzugt 4 bis 10 Tage, auf einem festen oder flüssigen Nährboden, beispielsweise Hefe-Malz-Agar oder Kartoffel-Dextrose-Agar, wachsen läßt.
Der Fermentationsverlauf kann jeweils anhand der pH-Werte der Kulturen oder der Mycelvolumina sowie durch chromatographische Methoden, wie z. B. Dünnschichtchromatographie oder High Pressure Liquid Chromatography, überwacht werden. Die Verbindungen der allgemeinen Formel I sind überwiegend im Kulturfiltrat enthalten.
Die Isolierung der genannten Verbindungen der Formel I aus dem jeweiligen Kulturmedium erfolgt nach bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Produkte. Es können z. B. das Adsorptions-, Ionenaustausch- oder Gelfiltrationsverfahren angewendet werden.
Ethylacetat/Methanol/Wasser-Mischungen werden als Laufmittel in der dem Fachmann bekannten Konzentration, angewandt. Die Detektion bei der dünnschichtchromatographischen Auftrennung kann beispielsweise durch UV- Löschung und Färbereagentien wie Anisaldehyd, Tetrazolblau oder Orcin erfolgen, wobei die Menge der gebildeten Substanz zweckmäßig mit einer Eichlösung verglichen wird.
Zur Isolierung einer Verbindung der Formel I werden Kulturbrühe und Mycel der einzelnen Fermentationen zuerst z. B. durch Filtration oder Zentrifugation getrennt. Das Kulturfiltrat wird über ein Adsorberharz, wie z. B. XAD® Adsorber der Fa. Amberlite gegeben, an dem die Verbindungen der Formel I binden und mit einem Lösungsmittel/Wasser-Gemisch, z. B. Methanol/Wasser 4 : 1, eluiert werden können.
Die Reinisolierung einer Verbindung der Formel I erfolgt durch Chromatographie an geeigneten Materialien, vorzugsweise an Kieselgel, Aluminiumoxid, Ionenaustauschern oder Adsorberharzen, durch anschließende Elution mit organischen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, wie z. B. Essigsäurealkylester, Gemische aus Essigsäurealkylester mit einem niederen Alkanol, Chloroform oder Methylenchlorid bzw. Gemischen dieser Lösungsmittel mit niederen Alkanolen, gegebenenfalls auch mit Wasser, bzw. einem für Ionenaustauscher-Harzen geeigneten pH- bzw. Salzgradienten, wie beispielsweise Kochsalz oder Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl(Tris-Puffer) und Vereinigung der biologisch aktiven Fraktionen. Eine Reinigung ist aber auch durch extraktive Methoden wie flüssig/flüssig-Extraktion oder fest/flüssig- Extraktion möglich.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen pharmakologische Wirksamkeit, insbesondere gegen bakterielle Keime sowie humanpathogene, phytopathogene und lebensmittelverderbende Pilze.
Die von Penicillium sp. und insbesondere von Penicillium sp. DSM 7219. synthetisierten, dann teilisolierten oder isolierten Verbindungen der Formel I können für die chemische Modifikation an den Substituenten R1-R7 eingesetzt werden.
Vorzugsweise werden die Verbindungen der Formel I hergestellt, in welchen R1, R3, R5 und R6, die gleich oder verschieden sein können, einen gesättigten oder ungesättigten, verzweigten oder unverzweigten oder cyclischen C1-C10- Alkylester, einen substituierten oder unsubstituierten aromatischen Ester oder einen Alkylsulfonsäureester bedeuten.
Besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formel I, in welchen R1, R3, R5 und R6, die gleich oder verschieden sein können, einen gesättigten oder ungesättigten, verzweigten oder unverzweigten oder cyclischen C1-C5- Alkylester, einen substituierten oder unsubstituierten aromatischen Ester oder einen Alkylsulfonsäureester bedeuten.
Die Überführung einer von Penicillium sp. synthetisierten Verbindung der Formel I in eines der chemisch hergestellten Derivate erfolgt in an sich bekannter Weise. So kann man die Stereoisomerengemische der Cyclowaraterpole durch Umsetzung von Waraterpol in Aceton mit katalytischen Mengen p-Toluol­ sulfonsäure erhalten.
Die Umsetzung von Waraterpol mit Säurechloriden in Pyridin/CH2Cl2 liefert die diacylierten Waraterpole in guten Ausbeuten (z. B. liefert die Umsetzung von Waraterpol mit o-Bromobenzoylchlorid Tetra-O-O-bromobenzoyl-waraterpol).
Auch mit den Säureanhydriden lassen sich die jeweiligen Ester herstellen (z. B. Tetra-O-acetylwaraterpol durch Umsetzung von Acetanhydrid mit Waraterpol in Pyridin, Ausbeute 57%). Mit Oxidationsmitteln wie dem Fermy-Salz (Kaliumnitrosodisulfonat) erhält man die entsprechenden Waraterpol-Chinone (z. B. Waraterpol-1,4-Chinon, Ausbeute 62%).
Auch die Derivate der Waraterpole zeigen pharmakologische Wirksamkeit, insbesondere gegen bakterielle Keime, sowie humanpathogene, phytopathogene und lebensmittelverderbende Pilze. Grundsätzlich kann die Verbindung der Formel I gegen Hefen, Schimmelpilze, Dermatophyten und dimorphe Pilze eingesetzt werden.
Die Verbindungen der Formel I sind im festen Zustand und in Lösungen im pH- Bereich zwischen pH 3 und 8, insbesondere pH 5 und 7, stabil und lassen sich damit in übliche galenische Zubereitungen einarbeiten.
Die Verbindungen der Formel I eignen sich aufgrund ihrer wertvollen pharmakologischen Eigenschaften sehr gut zur Anwendung als Arzneimittel.
Die Arzneimittel eignen sich vorzugsweise zur Prophylaxe und/oder Therapie von bakteriellen und mykotischen Infektionen bei Tieren, insbesondere Säugetieren und damit auch zur Behandlung des Menschen. Sie können außerdem als Lebensmittelkonservierungsstoffe sowie zur Bekämpfung phytopathogener Pilze im Pflanzenanbau eingesetzt werden.
Eine Verbindung der allgemeinen Formel I kann grundsätzlich als solche in Substanz verabreicht werden. Bevorzugt ist die Verwendung in Mischung mit geeigneten Hilfsstoffen oder Trägermaterial. Als Trägermaterial können bei Tierarzneimitteln die üblichen Futtermittelmischungen bzw. beim Menschen alle pharmakologisch verträglichen Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffe verwendet werden.
Die Anwendung betrifft auch pharmazeutische Zubereitungen einer Verbindung der Formel I.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden im allgemeinen oral oder parenteral verabreicht, aber auch eine rektale Anwendung ist prinzipiell möglich. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Tabletten, Dragees, (Mikro-)Kapseln, Zäpfchen, Sirupe, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole, Tropfen oder injizierbare Lösungen in Ampullenform sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung üblicherweise Trägerstoffe und Zusätze und/oder Hilfsmittel wie Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel oder Lösungsvermittler Verwendung finden. Als häufig verwendete Träger- oder Hilfsstoffe seien z. B. Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Laktose, Mannit und andere Zucker, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Vitamine, Cellulose und ihre Derivate, tierische pflanzliche Öle, Polyethylenglykole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser, Alkohole, Glycerin und mehrwertige Alkohole genannt.
Gegebenenfalls können die Dosierungseinheiten für die orale Verabreichung mikroverkapselt werden, um die Abgabe zu verzögern oder über einen längeren Zeitraum auszudehnen, wie beispielsweise durch Überziehen oder Einbetten des Wirkstoffs in Teilchenform in geeignete Polymere, Wachse oder dergleichen.
Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Präparate in Dosierungseinheiten hergestellt und verabreicht, wobei jede Einheit als aktiven Bestandteil eine bestimmte Dosis einer Verbindung der Formel I enthält. Bei festen Dosierungseinheiten wie Tabletten, Kapseln und Suppositorien kann diese Dosis bis zu etwa 200 mg, bevorzugt jedoch etwa 0,1 bis 100 mg, und bei Injektionslösungen in Ampullenform bis zu etwa 200 mg, vorzugsweise aber etwa 0,5 bis 100 mg, pro Tag betragen.
Die zu verabreichende Tagesdosis ist abhängig vom Körpergewicht, Alter, Geschlecht und Zustand des Säugers. Unter Umständen können jedoch auch höhere oder niedrigere Tagesdosen angebracht sein. Die Verabreichung der Tagesdosis kann sowohl durch Einmalgabe in Form einer einzelnen Dosierungseinheit oder aber in mehreren kleineren Dosierungseinheiten als auch durch Mehrfachgabe unterteilter Dosen in bestimmten Intervallen erfolgen.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden dadurch hergestellt, daß man eine oder mehrere Verbindungen der Formel I mit üblichen Träger- sowie gegebenenfalls Zusatz- und/oder Hilfstoffe in die bzw. eine geeignete Darreichungsform bringt.
In den sich anschließenden Beispielen wird die Erfindung weiter erläutert. Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht. Mischungsverhältnisse bei Flüssigkeiten beziehen sich auf das Volumen, wenn keine anderen Angaben gemacht wurden.
Beispiele 1. a) Herstellung einer Sporensuspension des Produzentenstammes Penicillium sp. DSM 7219
100 ml Nährlösung (20 g Malzextrakt, 2 g Hefeextrakt, 10 g Glucose, 0,5 g (NH4)2HPO4 in 1 l Leitungswasser, pH-Wert vor der Sterilisation 6,0) in einem 500 ml sterilen Erlenmeyerkolben werden mit dem Stamm DSM 7219 beimpft und 72 Stunden bei 25°C und 140 UpM auf einer rotierenden Schüttelmaschine inkubiert. Anschließend werden 20 ml Kulturflüssigkeit in einem sterilen 500 ml Erlenmeyerkolben mit dem Nährboden [Kartoffelinfus 4,0 g/l (Infus aus 200 g Kartoffeln in 1000 ml H2O), 20,0 g D-Glucose, pH vor der Sterilisation 5,6], dem zusätzlich 15 g Agar/l zur Verfestigung zugegeben wurde, gleichmäßig verteilt und dekantiert. Die Kulturen werden 10 bis 14 Tage bei 25°C inkubiert. Die nach dieser Zeit entstandenen Sporen eines Kolbens werden mit 500 ml entionisiertem Wasser, das einen Tropfen eines handelsüblichen nichtionischen Tensids (z. B. ®Triton X 100, Fa. Serva) enthält, abgeschwemmt, sofort weiterverwendet oder bei -22°C in 50% Glycerin aufbewahrt.
b) Herstellung einer Kultur bzw. einer Vorkultur des Produzentenstammes im Erlenmeyerkolben
Ein steriler 500 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml der unter a) beschriebenen Nährlösung wird mit einer auf einem Schrägröhrchen gewachsenen Kultur oder mit 0,2 ml Sporensuspension angeimpft und auf einer Schüttelmaschine bei 140 UpM und 25°C inkubiert. Die maximale Produktion einer Verbindung der Formel I ist nach ca. 120 Stunden erreicht. Zum Animpfen von 10 und 100 l Fermenten genügt eine 72 Stunden alte Submerskultur (Animpfmenge ca. 5%) aus der gleichen Nährlösung.
2. Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I
Ein 10 l Fermenter wird unter folgenden Bedingungen betrieben:
20 g/l Malzextrakt
10 g/l Glucose
2 g/l Hefeextrakt
0,5 g/l (NH4)2HPO4
pH 6,0 (vor der Sterilisation).
Der pH-Wert wird mit wäßriger 2 N NaOH oder HCl eingestellt.
Inkubationszeit: 120 Stunden
Inkubationstemperatur: 35°C
Rührergeschwindigkeit: 200 UpM
Belüftung: 5 l Luft/min.
Durch wiederholte Zugabe weniger Tropfen ethanolischer Polyollösung kann die Schaumbildung unterdrückt werden. Das Produktionsmaximum beider Stämme wird nach ca. 96 Stunden erreicht. Der pH-Wert beträgt bei der Ernte ca. pH 3,5 bis 4,0.
3. Aufarbeitung
Die Aufarbeitung der Kulturlösung des Stammes Penicillium sp. DSM 7219 erfolgt nach folgendem Aufarbeitungsschema:
Schema 1
Aufarbeitungsschema des Stammes
4. Reindarstellung und Charakterisierung von Verbindungen der Formel I a) Waraterpol = (6-(2-Hydroxy-4-hydroxymethyI-phenyl)-2-methylheptan- 1,6-diol)
1,35 g Rohprodukt Ib wird durch Flashchromatographie an Kieselgel (Säule 60×3 cm) im Laufmittelsystem CHCl3/MeOH (9 : 1) gereinigt. Man erhält 1,123 g DC-einheitliches Waraterpol, dessen Nachreinigung in Mengen zwischen 50 und 70 mg an Sephadex LH-20 in Aceton erfolgt. Waraterpol ist ein farbloses, hochviskoses Öl, das sich gut in Aceton, Methanol, Eisessig oder Pyridin, jedoch schlecht in Trichlormethan und nicht in PE löst. Auf DC-Platten erhält man eine UV-löschende Zone (254 nm), die mit Vanillinschwefelsäure-Reagenz und Anis braun und mit Molybdatoschwefelsäure-Reagenz schwarz anfärbt.
Rf-Werte: siehe Tabelle 1
EI-MS (70 eV): m/e = 268 (3%, M⁺); 250 (2%, M⁺-H2O); 232 (14%, M⁺-2H2O); 217 (4%, M⁺-2H2O - CH3); 167 (59%, C9H11O3); 164 (24%); 151 (30%); 43 (100%).
Hochauflösung: Gef. wie ber. 268, 1674 entsprechend C₁₅H₂₄O₄; 167.0708 entsprechend C₉H₁₁O₃.
IR (KBr): = 3500 (br); 2940; 2880 (sh); 1630, 1580, 1400, 1040, 940; 820 cm-1.
UV (MeOH, Abb. 4): λmax(ε) = 205 (12850); 219 (sh) (7150); 278 (2850) nm.
UV (MeOH/HCl): λmax(ε) = 205 (13600); 219 (sh) (6550); 278 (2550) nm.
UV (MeOH/NaOH): λmax(ε) = 216 (9250); 244 (5800); 294 (3650) nm.
CD (MeOH) λextr([R]²⁰) = 277 (+464); 227 (+318) nm.
[α] = +6,7 (c = in MeOH),
¹H-NMR (200 MHz, Aceton-d₆): siehe Tabelle 2.
¹H-NMR (200 MHz, Pyridin-d6): δ = 1.02 (d, J = 6.5 Hz, 3H, 13-H3); 1.24- 1.38 u. 1.54-1.84 (m, 5H, 9-H2, 10-H2, 11-H); 1.88 (s, 3H, 14-H3); 2.02-2.38 (m, 2H, 8-H2); 3.64 (2dd, J = 10.5 Hz, J = 6.5 Hz, J = 6 Hz, 2H, 12-H2); 4.98 (s, 2H, 15-H2); 5.92 (br, 1H, OH); 6.90 (br, 1H, OH); 7.20 (dd, J = 8 Hz, J = 2 Hz, 1H, 4-H); 7.425 (d, J = 8 Hz, 1H, 3-H); 7.47 (d, J = 2 Hz, 1H, 6-H); 11.20 (br, 1H, 1-OH) ppm.
¹³C-NMR (50.3 MHz, Pyridin-d₅, 70°C)*: δ = 17.32/17.26 (o, C-13); 22.2 (u, C-9); 29.25/29.67 (o, C-14); 34,5 (u, C-10); 36.6 (o, C-11); 44,3 (u, C-8); 64.3 (u, C-15); 67.72/67.77 (u, C-12); 116.02 (o, C-6); 117.78 (o, C-4); 126.9 (o, C- 3); 130.99/130.95 (u, C-2); 143.8 (u, C-5); 157.6 (u, C-1) ppm.
*: Doppelsignale zeigen ein Diastereomerengemisch an (Verhältnis 1.3 : 1). Die Signale der Hauptkomponente sind zuerst genannt.
Summenformel: C₁₅H₂₄O₄ (MG = 268.36).
Waraterpol
Tabelle 1
Rf-Werte der Waraterpole
Tabelle 2
¹H-NMR-Daten von Waraterpol
Tabelle 3
¹³C-NMR-Daten von Waraterpol, 12-O-Acetyl-Waraterpol und 15-O- Acetylwaraterpol
Weitere Signale:
  • a) 171.0 (C, C-16), 20.7 (CH₃, C-17),
  • b) 170.8 (C, C-16), 20.8 (CH₃, C-17),
  • c) 171.2, 170.8, 169.4, 169.2 (4 C, C-16), 21.9, 21.3, 20.98, 20.96 (4 CH₃, C-17).
Doppelsignale zeigen ein Diastereomerengemisch (Verhältnis 1 : 3 : 1) an. Die Signale der Hauptkomponente werden zuerst genannt.
b) Reinigung von 12-O-Acetylwaraterpol und 15-O-Acetylwaraterpol
75,2 mg des als vorgereinigtes Rohprodukt IIb erhaltenen Substanzgemisches wird durch Flashchromatographie an Kieselgel, Säule 40×2,5 cm, in CHCl3/MeOH (95 : 5) in zwei Fraktionen getrennt. Es werden 43,9 mg eines Gemisches aus 12-O-Acetylwaraterpol und 15-O-Acetylwaraterpol sowie 19,5 mg reines 12-O-Acetylwaraterpol erhalten. Die Mischfraktion trennt man ebenfalls durch Flashchromatographie, Säule 50×1,5 cm, im Laufmittelsystem EE/PE/THF (10 : 15 : 1) an Kieselgel (Korngröße < 0.063 mm). Man erhielt 16.1 mg 12-O-Acetylwaraterpol und 18.6 mg 15-O-Acetylwaraterpol sowie 3.0 mg Mischfraktion. Beide Verbindungen färben mit Vanillinschwefelsäure-Reagenz braungrau und Anis braun an.
Rf-Werte (EE/PE/THF 10 : 15 : 1): 12-O-Acetylwaraterpol 0.20;
15-O-Acetylwaraterpol 0.16.
c) 12-O-Acetylwaraterpol = 1-Acetoxy-6-(2-hydroxy-4-hydroxymethyl­ phenyl)-2-methylheptan-6-ol
Rf-Werte: siehe Tabelle 1.
EI-MS (70 eV): m/e = 310 (8%, M⁺); 292 (4%, M⁺-H2O); 274 (10% M⁺-2 H₂O); 332 (6%); 214 (16%); 167 (100% C₉H₁₁O₃); 43 (C₂H₃O).
Hochauflösung: Gef. wie ber. 310.1780 entsprechend C₁₇H₂₆O₅.
IR (KBr): = 3400 (br); 2940; 2870 (sh); 1715; 1620; 1460 (sh), 1370; 1250; 1045; 945; 880; 815 cm-1.
UV (MeOH): λmax(ε) = 208 (sh) (11700); 220 (13450); 278 (5100) nm.
UV (MeOH/HCl): λmax(ε) = 208 (sh) (12000); 220 (13150); 277 (4850) nm.
UV (MeOH/NaOH): λmax(ε) = 220 (11950); 247 (sh) (5200); 283 (4000); 299 (sh) (2700) nm.[α] = +1.9 (c=1.3 in CHCl₃).
¹H-NMR (200 MHz, Aceton-d₆): siehe Tabelle 2.
¹³C-NMR (50.3 MHz, Aceton-d₆): siehe Tabelle 3.
Summenformel: C₁₇H₂₆O₅ (MG=310.39).
d) 15-O-Acetylwaraterpol = 4-Acetoxymethyl-1-(1,6-dihydroxy-1,5- dimethylhexyl)-2-hydroxybenzol
Rf-Werte: siehe Tabelle 1.
EI-MS (70 eV): m/e = 310 (18%, M⁺); 292 (6%, M⁺-H2O); 232 (60%); 209 (100%, C11H13O4); 43 (44%, C2H3O).
Hochauflösung: Gef. wie ber. 310.1780 entsprechend C₁₇H₂₆O₅.
Gef. wie ber. 209.0814 entsprechend C₁₁H₁₃O₄.
IR (KBr): = 3420; 2940; 2880 (sh); 1740; 1720 sh); 1630; 1580; 1510; 1370; 1270 (sh), 1230; 1030 cm-1.
UV (MeOH): λmax(ε) = 207 (13350); 219 (sh) (9200); 278 (3350) nm.
UV (MeOH/HCl): λmax(ε) = 207 (13350); 219 (sh) (9150); 278 (3300) nm.
UV (MeOH/NaOH): λmax(ε) = 220 (8400); 245 (sh) (5200); 285 (3100); 297 (3000) nm.
[α] = +14.5 (c=0.31 in CHCl₃).
¹H-NMR (200 MHz, Aceton-d₆): siehe Tabelle 2.
¹³C-NMR (50.3 MHz, Aceton-d₆): siehe Tabelle 3.
Summenformel: C₁₇H₂₆O₅ (MG=310.39).
e) Charakterisierung von Anhydrowaraterpol B und C = 6-(2-Hydroxy-4-(hydroxymethyl)phenyl)-2-methylhept-5-en-1-ol) und (6-(2-Hydroxy-4-(hydroxymethyl)-phenyl)-2-methylhept-6-en-1-ol
Anhydrowaraterpol B und C liegen jeweils im Gemisch in verschiedenen Mengenverhältnissen vor (1H- und 13C-NMR-Spektren). Das viskose Öl löst sich gut in Aceton, CHCl3 und MeOH. Es ist UV-löschend auf der DC-Platte (254 nm) und färbt mit Anis ockerfarben, mit Vanillinschwefelsäure-Reagenz braungrau und mit Molybdatoschwefelsäure-Reagenz schwarz an.
Rf-Werte: siehe Tabelle 1.
EI-MS (70 eV): m/e = 250 (4%, M⁺); 232 (22%, M⁺-H2O); 217 (4%, M⁺- H2O-CH3); 214 (3%, M⁺-2H2O); 164 (29%); 151 (21%); 147 (22%); 59 (39 %); 43 (100%).
Hochauflösung: Gef. wie ber. 250.1569 entsprechend C15H22O3.
IR (KBR): v = 3400; 2960 (sh); 2920; 2880 (sh); 1620; 1430; 1290; 1030; 880; 820 cm-1.
UV (MeOH): λmax(ε) = 205 (20600); 278 (2400) nm.
UV (MeOH/HCl): λmax(ε) = 204 (20000); 282 (1700) nm.
UV (MeOH/NaOH): λmax(ε) = 218 (11200); 298 (1900) nm.[α] = +4.2 (c=0.5 in CHCl₃).
¹H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 0.80 (d, J = 6.5 Hz, 3H, 13-H3, B); 0.86 (d, J = 6.5 Hz, 3H, 13-H3 C); 0.90-1.94 (m, je 5H, 9-H2, 10-H2, 11-H, B, 9-H2, 10-H2, 11-H, C); 1.98 (d, J = 1.7 Hz, 3H, 14-H3, B); 2.41 (dt, J = 1.5 Hz, J = 6 Hz, 2H, 8-H2, C); 3.35 (2dd, J = 10.5 Hz, J = 6.5 Hz, J = 6 Hz, 2H, 12- H2, B); 3.41 (2dd, J = 10.5 Hz, J = 6.5 Hz, J = 6 Hz, 2H, 12-H2, C);. 4.64 (2s, je 2H, 15-H2, B, C); 5.11 (d, J = 1.5 Hz, 1H, 14-HA, C); 5.20 (br, je 1H, OH, B, C); 5.36 (dt, J = 1.5 Hz, J = 1.5 Hz, J = 1.5 Hz, 1H, 14-HB, C); 5.69 (tq, J = 7 Hz, J = 1.7 Hz, 1H, 8-H, B); 6.87 (dd, J = 8 Hz, J = 1.5 Hz, 1H, 4-H, C); 6.90 (dd, J = 8 Hz, J = 1.5 Hz, 1H, 4-H, B); 6.93 (2d, J = 1.5 Hz, je 1H, 6-H, B, C); 7.01 (d, J = 8 Hz, 1H, 3-H, B); 7.07 (d, J = 8 Hz, 1H, 3-H, C) ppm.
Verhältnis der Isomere zum Aufnahmezeitpunkt dieses Spektrums: B:C = 2 : 1 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): siehe Tabelle 4.
Summenformel: C15H22O3 (MG = 250.34).
Anhydrowaraterpol B
Anhydrowaraterpol C
f) Isolierung von Anhydrowaraterpol A, B und C
54 mg des Rohprodukts IIIb (s. Schema I) wurden durch Flashchromatographie an Kieselgel, Säule 60×2 cm, im Laufmittelgemisch EE/PE (1.5 : 1) aufgetrennt.
Es gelang die Mischfraktion durch Flashchromatographie, Säule 60×2 cm, im Laufmittelsystem EE/PE/Et2O (4 : 4 : 1) wiederum in eine Mischfraktion (A, B und C) sowie eine DC-einheitliche Fraktion (B und C) zu separieren. In reiner Form erhält man 16.7 mg Anhydrowaraterpol A und 12.0 mg Anhydrowaraterpol B und C.
g) Charakterisierung von Anhydrowaraterpol A = 6-(2-Hydroxy-4- (hydroxymethyl)phenyl)-2-methylhept-5-en-1-ol
Es handelt sich um einen gut in Aceton, Chloroform, Methanol, Ethanol oder Isopropanol löslichen kristallinen Feststoff. Auf der DC-Platte bildet Anhydrowaraterpol A eine UV-löschende Zone (254 nm), die mit Vanillinschwefelsäure-Reagenz graubraun, mit Anis ockerfarben und mit Molybdatoschwefelsäure-Reagenz schwarz auf hellgrünen Grund anfärbt.
Schmelzpunkt: 82 °C
Rf-Werte: siehe Tabelle 1.
EI-MS (70 eV): m/e = 232 (100%, M⁺-H2O); 217 (20%, M⁺-H2O-CH3); 214 (10%, M⁺-2H2O); 164 (36%); 159 (44%); 151(64%); 147 (76%); 134 (50%); 43 (88%).
Hochauflösung: Gef. wie ber. 232.1463 entsprechend C15H20O2.
IR (KBr): = 3400; 2960 (sh); 2920; 2880 (sh); 1620; 1430; 1290; 1030; 880; 820 cm-1.
UV (MeOH): λmax(ε) = 203 (26600); 242 (sh) (7650); 284 (2050) nm.
UV (MeOH/HCl): λmax(ε) = 204 (29050); 242 (sh) (8950); 284 (2650) nm.
UV (MeOH/NaOH): λmax(ε) = 219 (24100); 248 (sh) (7500); 302 (3600) nm.[α] = +3.6 (c=0.42 in CHCl₃).
¹H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 0.96 (d, J = 6.5 Hz, 3H, 13-H3); 1.20-1.40 (m, 2H, 10-H2); 1.50-1.76 (m, 1H, 11-H); 1.98 (d, J = 1.5 Hz, 3H, 14-H3); 2.10-2.40 (m, 2H, 9-H2); 3.48 (d, J = 6 Hz, 2H, 12-H2); 4.58 (s, 2H, 15-H2); 5.54 (tq, J = 6.5 Hz, J = 1.5 Hz, 1H, 8-H); 6.18 (sbr, 1H, OH); 6.84 (dd, J = 7.5 Hz, J = 1.5 Hz, 1H, 4-H); 6.89 (d, J = 1.5 Hz, 1H, 6-H); 7.05 (d, J = 7.5 Hz, 1H, 3-H) ppm.
13C-NMR (50.3 MHz, CDCl3): siehe Tabelle 4.
Summenformel: C15H22O3 (MG = 250.34).
Tabelle 4
¹³C-Daten von Anhydrowaraterpol A, B und C
h) Charakterisierung von Anhydrowaraterpol B = [6-(2-Hydroxy-4- (hydroxymethyl)phenyl)-2-methylhept-5-en-1-ol)] und C = [(6-(2-Hydroxy- 4(hydroxymethyl)-phenyl)-2-methylhept-6-en-1-ol)]
Anhydrowaraterpol B und C liegen jeweils im Gemisch in verschiedenen Mengenverhältnissen vor (1H- und 13C-NMR-Spektren). Das viskose Öl läßt sich gut in Aceton, CHCl3 und MeOH. Es ist UV-löschend auf der DC-Platte (254 nm) und färbt mit Anis ockerfarben, mit Vanillinschwefelsäure braungrau und Molybdatoschwefelsäure schwarz an.
Rf-Werte: siehe Tabelle 1.
EI-MS (70 eV): m/e = 250 (4%, M⁺); 232 (22%, M⁺-H2O); 217 (4%, M⁺- H2O-CH3); 214 (3%, M⁺-2H2O; 164 (29%); 151(21%); 147 (22%); 59 (39 %); 43 (100%).
Hochauflösung: Gef. wie ber. 250.1569 entsprechend C₁₅H₂₂O₃.
IR (KBr): = 3400; 2960 (sh); 2920; 2880 (sh); 1620; 1430; 1290; 1030; 880; 820 cm-1.
UV (MeOH): λmax(ε) = 205 (20600); 278 (2400) nm.
UV (MeOH/HCl): λmax(ε) = 204 (20000); 282 (1700) nm.
UV (MeOH/NaOH): λmax(ε) = 218 (11200); 298 (1900) nm.[α] = +4.2 (c=0.5 in CHCl₃).
¹H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 0.80 (d, J = 6.5 Hz, 3H, 13-H3, B); 0.86 (d, J = 6.5 Hz, 3H, 13-H3, C); 0.90-1.94 (m, je 5H, 9-H2, 10-H2, 11-H, B, 9-H2, 10-H2, 11-H, C); 1.98 (d, J = 1.7 Hz, 3H, 14-H3, B); 2.41 (dt, J = 1.5 Hz, J = 6 Hz, 2H, 8-H2, C); 3.35 (2dd, J = 10.5 Hz, J = 6.5 Hz, J = 6 Hz, 2H, 12- H2, B); 3.41 (2dd, J = 10.5 Hz, J = 6.5, J = 6 Hz, 2H, 12-H2, C); 4.64 (2s, je 2H, 15-H2, B, C); 5.11 (d, J = 1.5 Hz, 1H, 14HA, C); 5.20 (br, je 1H, OH, B, C); 5.36 (dt, J = 1.5 Hz, 1H, 14HB, C); 5.69 (tq, J = 7 Hz, J = 1.7 Hz, 1H, 8-H, B); 6.87 (dd, J = 8 Hz, J = 1.5 Hz, 1H, 4-H, C); 6.90 (dd, J = 8 Hz, J = 1.5 Hz, 1H, 4-H, B); 6.93 (2d, J = 1.5 Hz, je 1H, 6-H, B, C); 7.01 (d, J = 8 Hz, 1 H, 3-H, B); 7.07 (d, J = 8 Hz, 1H, 3-H, C) ppm.
Verhältnis der Isomere zum Aufnahmezeitpunkt dieses Spektrums: B:C = 2 : 1.
¹³C-NMR (125 MHz, CDCl3): siehe Tabelle 4.
Summenformel: C₁₅H₂₂O₃ (MG = 250.34).
i) Umsetzungen von Waraterpol mit Säurechloriden
Zwischen 10 und 24 mg (0.04 und 0.09 mmol) Waraterpol werden in 2 ml Pyridin gelöst und das jeweilige Säurechlorid (siehe Tab. 5), gelöst in wasserfreiem Dichlormethan, tropft man bei den in der Tabelle angegebenen Temperaturen zu. Man läßt die Reaktionsmischung unter Rühren auf Raumtemperatur erwärmen. Die Aufarbeitung erfolgt nach Variante A oder B.
Variante A: Man hydrolysiert das Reaktionsgemisch mit 10-20 ml Eiswasser und extrahiert nach 30 Min. viermal mit je 10 ml Chloroform. Das restliche Pyridin entfernt man durch Verdampfen im Hochvakuum. Anschließend erfolgt die Auftrennung des Reaktionsgemisches durch Flashchromatographie an Kieselgel.
Variante B: Das Lösungsmittel wird durch Verdampfen im Hochvakuum entfernt. Die weitere Aufarbeitung erfolgt durch Auftrennung des Reaktionsgemisches an Kieselgel.
j) Tetra-O-O-Brombenzoylwaraterpol = 1,6-Bis-(2-brombenzoyloxy)6-(2-(2- brombenzoyloxy)-4-((2-brombenzoyloxy)-methyl)-phenyl)-2-methylheptan-
Rf-Werte: siehe Tabelle 1.
IR (KBr): = 2960; 2860 (sh); 1740 (sh); 1730; 1590; 1470; 1430; 1290; 1250; 1030; 740 cm-1.
UV (MeOH): λmax(ε) = 208 (42250); 278 (1850) nm.
UV (MeOH/HCl): λmax(ε) = 207 (43250); 278 (1900) nm.
UV (MeOH/NaOH): λmax(ε) = 219 (17200); 278 (1000) nm.[α] = +2.3 (c=1.6 in CHCl₃).
¹H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 0.95 (d, J = 7 Hz, 3H, 13-H3); 1.12-1.69 (m, 4H, aliph. H); 1.90 (m, 1H, aliph. H); 2.02 (s, 3H, 14-H3); 2.20 (m, 2H, aliph. H); 4.13 (m, 2H, 12-H2); 5.40 (s, 2H; 15-H2); 7.10-7.88 (m, 19H, 3-H, 4-H, 6-H, alle aus o-Br-Benzoat) ppm.
¹³C-NMR (50.3 MHz, CDCl3)*: δ = 16.9 /17.0 (o, C-13); 21.3 (u, C-9); 24.6 (o, C-14); 32.4 (o, C-11); 33.4 (u, C-10); 40.7 (u, C-8); 66.2 (u, C-15); 70.4/70.3 (u, C-12); 84.7 (u, C-7); 121.4, 121.5; 121.9 u. 122.3 (u, C-2′); 123.9 (o, C-6); 125.9 (o, C-4); 127.01, 127.08, 127.1 u. 127.2 (o, C-5′); 127.8 (o, C-3); 130.8; 131,8 u. 132.8 (u, C-7′); 131.3, 131.6 u. 131.7 (o, C- 3′) ; 132.2, 132.4,132.7 und 133.0 (o, C-6′) ; 134.1, 134.3, 134.4 und134.5 (o, C-4′); 135.4 (u, C-2); 136.2 (u, C-5); 147.3 (u, C-1); 164.2, 164.5,165.8 und 166.3 (u, C-1′) ppm.
*: Doppelsignale zeigen ein Diastereomerengemisch (Verhältnis 1 : 3 : 1) an. Die Signale der Hauptkomponenten sind zuerst genannt.
: Die Zuordnung ist austauschbar.
Summenformel: C₄₃H₂₆O₈Br₄ (MG = 990.32).
k) Cyclisierung von Waraterpol
80 mg (0.30 mmol) löst man in 5 ml Aceton und setzte 10 mg (20 mol%) p- Toluolsulfonsäure, gelöst in 1 ml Aceton, zu und rührt 15 Stunden bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft und der Rückstand sofort durch Flashchromatographie an Kieselgel, Säule 60×2 cm, im Laufmittelgemisch CHCl3/MeOH (97 : 3) aufgetrennt.
Man isoliert 51 mg DC-einheitliches Gemisch von Cyclo-Waraterpol A und B als farbloses Öl, die UV-löschend sind und mit Vanillin /H2SO4-Reagenz grün anfärben.
l) Cyclo-Waraterpol A = 2,6-Dimethyl-2-(2-hydroxy-4-(hydroxymethyl)- phenyl)-oxepan
Rf-Werte: siehe Tabelle 1.
EI-MS (70 eV): m/e = 250 (40%, M⁺); 232 (31%, M⁺-H2O); 217 (10.5%); 164 (82%, C10H12O2); 151 (100%, C8H7O3); 147 (42%); 134 (40%).
Hochauflösung: Gef. wie ber. 250.1569 entsprechend C15H22O3.
IR (KBr): = 3400; 3280; 2940 (sh); 2920, 1630; 1580; 1510; 1040 cm-1.
UV (MeOH): λmax(ε) = 207 (17400); 219 (sh) (12500); 277 (4700) nm.
UV (MeOH/HCl): λmax(ε) = 207 (17700); 219 (sh) (12500); 277 (4450) nm.
UV (MeOH/NaOH): λmax(ε) = 222 (8500); 247 (sh) (4850); 283 (3800); 297 (sh) (2700) nm.
CD (MeOH) λextr([R]²⁰) = 277 (+1450); 229 (-1033) nm.[α] = -5.5 (c=2.3 in Methanol).
¹H-NMR (200 MHz, CDCl3, referenziert auf CHCl3 = 7.24 ppm; δ = 0.76 (d, J = 7 Hz, 3H, 13-H3); 0.82-1.30 (m, 1H, 10-HA); 1.44 (s, 3H, 14-H3); 1.62-2.00 (m, 4H, 9-H2, 10-HB, 11-H); 2.00-2.38 (m, 2H, 8-H2); 3.14 (dd, J = 12.5 Hz, J = 10 Hz, 1H, 12HA); 3.54 (dd, J = 12.5 Hz, J = 3 Hz, J = 2 Hz, 1H, 12-HB); 4.60 (s, 2H, 15-H2); 6.82 (d u. dd, J = 2 Hz, J = 8 Hz u. J = 2 Hz, 2H, 4-H, 6-H); 7.00 (d, J = 8 Hz, 1H, 3-H); 9.32 (s, 1H; 1-OH) ppm.
¹³C-NMR (50.3 MHz, CDCl₃): siehe Tabelle 6.
Summenformel C₁₅H₂₂O₃ (MG = 250.34).
m) Cyclo-Waraterpol B = 2,6-Dimethyl-2-(2-hydroxy-4-(hydroxymethyl)- phenyl)-oxepan
Rf-Werte: siehe Tabelle 1.
EI-MS (70 eV): m/e = 250 (92%, M⁺); 235 (20%, M⁺-CH3); 232 (40%, M⁺- H2O); 217 (14%); 164 (88%, C10H12O2); 151 (100%, C8H7O3); 147 (40%); 134 (40%).
Hochauflösung: Gef. wie ber. 250.1569 entsprechend C₁₅H₂₂O₃.
IR (KBr): = 3400; 3280; 2940 (sh); 2920; 1630; 1580; 1510; 1040 cm-1.
UV (MeOH): λmax(ε) = 204 (17350); 218 (11650); 278 (4450) nm.
UV (MeOH/HCl): λmax(ε) = 209 (12700); 219 (10350); 277 (4300) nm.
UV (MeOH/NaOH): λmax(ε) = 221 (8450); 245 (4650); 284 (2500); 299 (sh) (2350) nm.
CD (MeOH) λextr([R]²⁰) = 274 (-990); 229 (+165) nm.
[α] = +5.3 (c=0.6 in CHCl₃).
¹H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 0.96 (d, J = 7 Hz, 3H, 13-H); 1.20-1.40 (m, 1H, 10-HA) 1.50 (s, 3H, 14-H3); 1.52-1.78 (m, 3H, 9-HB); 1.78-1.98 (m, 1H, 11-H); 2.00-2.30 (m, 2H, 8-H2); 3.56 (2dd, J = 12.5 Hz, J = 3 Hz, 2H, 12-H2); 4.60 (s, 2H, 15-H2); 6.82 (d und dd, J = 2 Hz, J = 8 Hz und J = 2 Hz, 2H, 4-H, 6-H); 6.99 (d, J = 8 Hz, 1H, 3-H); 9.71 (s, 1H, 1-OH) ppm. 13C-NMR (50.3 MHz, CDCl3): siehe Tabelle 6.
Summenformel C₁₅H₂₂O₃ (MG = 250.34).
Tabelle 6
¹³C-NMR von Cyclowaraterpol A und B (50.3 Mhz, CDCl₃)
n) Tetra-O-acetylwaraterpol = 6-(2-Acetoxy-4-(acetoxymethyl)-phenyl)-1,6- diacetoxy-2-methylheptan
25 mg (0.09 mmol) Waraterpol löst man in 3 ml Pyridin, kühlt die Mischung in einem Eis/Kochsalz-Bad und setzt 3 ml Acetanhydrid zu. Nach dem Erwärmen auf Raumtemperatur wird 24 Stunden gerührt. Man hydrolysiert das Reaktionsgemisch mit 30 ml Eiswasser und extrahierte die wäßrige Phase viermal mit CHCl3. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum entfernt man das restliche Pyridin im Hochvakuum. Die Reinigung erfolgt durch Flashchromatographie an Kieselgel, Säule 50×2 cm, im Laufmittelgemisch Eisessig/Petrolether (1 : 4). Es werden 23 mg (0.053 mmol, 57%) Tetra-O- acetyl-waraterpol erhalten.
Rf-Werte: siehe Tabelle 1.
EI-MS (70 eV): m/e = 436 (0.04%; M⁺); 376 (5%; M⁺-CH3COOH); 334 (12%, M⁺CH3COOH-C2H2O⁺); 274 (100%, M⁺-2 CH3COOH-C2H2O⁺); 214 (45%); 157 (50%): 43 (85%. C2H3O).
Hochauflösung: Gef. wie ber. 376.1886 entsprechend C₂₁H₂₈O₆.
IR (KBr): = 2960; 2920 (sh); 2840 (sh); 1770; 1745; 1640; 1370; 1270;1240; 1205; 1100; 805 cm-1.
UV (MeOH): λmax(ε) = 206 (10800); 231 (sh) (5100) nm.
UV (MeOH/HCl): λmax(ε) = 205 (10600); 232 (4950) nm.
UV (MeOH/NaOH): λmax(ε) = 218 (123400); 250 (sh) (4100); 302 (2300) nm.
[α] = 0.9 (c=1.3 in CHCl₃).
¹H-NMR (200 MHz, Aceton-d6): δ = 0.86 (d, J = 7 Hz, 3H, 13-H3); 1.04-1.46 u. 1.60-1.80 (m, 7H, aliphat. CH2 u. 11-H); 1.84 (s, 3H, 14-H3); 1.96 (s, 3H, 17-H3); 1.98 (s, 3H, 17-H3); 2.02 (s, 3H; 17-H3); 2.30 (s, 3H, 17′-H3); 3.82 (2dd, J = 11 Hz, J = 7 Hz, 2H, 12-H2); 5.06 (s, 2H; 15-H2); 7.04 (d, J = 2 Hz, 1H, 6-H); 7.215 (dd, J = 8 Hz, J = 2Hz, 1H, 4-H); 7.42 (d, J = 8 Hz, 1H, 3-H) ppm.
¹³C-NMR (50.3 MHz, CDCl3; Abb. 23): siehe Tabelle 3.
Summenformel: C₂₃H₃₂O₈ (MG = 436.51).
o) Waraterpol-1,4-chinon = 2-(1,6-Dihydroxy-1,5-dimethylhexyl)-5- hydroxymethyl-1,4-benzochinon
140 mg (0.53 mmol) Waraterpol löst man in 2 ml Aceton. Insgesamt werden ca. 840 mg (3.14 mmol) Fremys Salz zugesetzt. Nach der ersten Reagenzzugabe zeigt sich im DC neben dem Edukt eine gelbe Zone, die intensive UV-Löschung hervorruft. Nach weiterer Reagenzzugabe und einer Stunde Reaktionszeit sind hauptsächlich das gelbe Produkt und etwas Zersetzungsprodukt vorhanden. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum reinigt man das Rohprodukt durch Flashchromatograhie an Kieselgel, Säule 30×3 cm, im Laufmittelsystem CHCl3/MeOH (92 : 8). Man erhält 90.6 mg Waraterpol-1,4-chinon (0.321 mmol) (62%) als dunkelgelbes viskoses Öl. Die Substanz färbt mit Vanillinschwefelsäure-Reagenz braunviolett und mit Anis hellbraun an.
Rf-Werte siehe Tabelle 1.
EI-MS (70 eV): m/e = 264 (2%, M⁺-H2O); 249 (2%, M⁺-H2O-CH3); 164 (33%); 43 (100%).
Hochauflösung: Gef. wie ber. 264.1362 entsprechend C₁₅H₂₀O₄.
IR (KBr): = 3420 (br); 2940 (sh); 2920; 2860 (sh); 1645; 1600 (sh); 1450; 1330; 1230; 1030; 910 cm-1.
UV (MeOH): λmax(ε) = 201 (15850); 260 (38800) nm.
UV (MeOH/HCl): λmax(ε) = 200 (14100); 259 (35150) nm.
UV (MeOH/NaOH): λmax(ε) = 215 (42100); 267 (48300) nm.
[α] = +5.2 (c = 1.5 in Aceton).
¹H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 0.89/0.88* (2d, J = 6.5 Hz, 3H, 13-H3); 1.00-2.00 (m, 7H, 8-H2, 9-H2, 10-H2, 11-H); 1.48 (s. 3H, 14-H3); 2.32 (br, 1H, OH); 3.06 (br, 1H, OH); 3.44 (2dd, J = 10.5 Hz, J = 6.5 Hz, J = 6 Hz; 2H, 12-H2); 4.54 (d, J = 2 Hz, 2H, 15-CH2); 6.74 (t, J = 2 Hz, 1H, 6-H); 6.76 und 6.77 (2s, 1H, 3-H) ppm.
¹H-NMR (200 MHz, Aceton-d₆): δ = 0.82/0.83* (2d, J = 6.5 Hz, 3H, 13-H₃); 0.92-2.00 (m, 7H, 8-H₂, 9-H₂, 11-H); 1.48 (s, 3H, 14-H₃); 3.31 (2dd , J = 10.5 Hz, J = 6.5, J = 6 Hz, 2H, 12-H₂); 3.45 (br, 1H, 12-OH); 4.19 (s, 1H, OH); 4.44$ (d , J = 2 Hz, 2H, 15-H₂); 6.70 (t, J = 2 Hz, 1H, 6-H); 6.93 (s, 1H, 3-H) ppm.
: Multiplizität nach H/D-Austausch (Wasserstoff/Deuterium-Austausch).
$: vor H/D-Tausch (sbr, 3H, 15-H₂ und OH).
¹³C-NMR (50.3 MHz, Aceton-d6)*: δ = 17.18/17.00 (o, C-13); 22.1 (u, C-9); 29.0 (o, C-14); 34.3 (u, C-10); 36.50 (o, C-11); 42.2 (u, C-8); 58.2 (u, C-15); 67.75/ 67.93 (u, C-12); 73.4 (u, C-7); 132.2 (o, C-6); 133.0 (o, C-3); 149.1 (u, C-5); 154.42/154.40 (u, C-2); 188.6 (u, C-1 und C-4) ppm.
*: Doppelsignale zeigen ein Diastereomerengemisch (Verhältnis 1 : 3 : 1) an. Die Signale der Hauptkomponenten sind zuerst genannt.
Summenformel: C₁₅H₂₂O₅ (MG = 282.34).
p) Waraterpol-1,4-hydrochinon = 4-Hydroxy-waraterpol = 1,4-Dihydroxy-2- (1,6-dihydroxy-1,5-dimethylhexyl)-5-hydroxymethyl-benzol
40 mg (0.14 mmol) Waraterpol-1,4-chinon werden in 4 ml Ethanol gelöst. Man setzt zweimal innerhalb von 15 Minuten 3 mg (0.047 mmol) Natriumcyanoborhydrid zu. Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum verdampft und das Reaktionsgemisch durch Flashchromatograhie an Kieselgel, Säule 30×3 cm, im Laufmittelsystem CHCl3/MeOH (95 : 5) aufgetrennt. Man erhält 140.0 mg 4-Hydroxy-waraterpol (35%).
Rf-Werte: siehe Tabelle 1.
EI-MS (70 eV): m/e = 284 (M⁺, 14%); 266 (30%, M⁺-H2O); 248 (24%, M⁺- 2H2O); 230 (10% M⁺-3H2O); 175 (26%); 150 (54%); 43 (100%).
Hochauflösung: Gef. wie ber. 284.1624 entsprechend C₁₅H₂₄O₅.
IR (KBr): = 3350 (br); 2940; 2880 (sh); 1510; 1430; 1390 (sh); 1190; 1040; 1000 (sh); 880; 820 cm-1.
UV (MeOH): λmax(ε) = 206 (30750); 298 (8950) nm.
UV (MeOH/HCl): λmax(ε) = 206 (31550); 298 (8850) nm.
UV (MeOH/NaOH): λmax(ε) = 228 (9450); 264 (8600) nm.
[α] = +7.9 (c=1.4 in CHCl₃).
¹H-NMR (200 MHz, Aceton-d6; δ = 2.04 ppm): δ = 0.84 (d, J = 7 Hz, 3H, 13- H3); 0.92-2.00 (m, 7H, 8-H2, 9-H2, 10-H2, 11-H); 1.58 (s, 3H, 14-H3); 3.32 (m, 2H, 12-H2); 3.44 (br, 1H; OH); 4.35 (br, 1H, OH); 4.65 (s, 2H, 15-CH2); 5.12 (br, 1H, OH); 6.58 (s, 1H, 6-H); 6.62 (s, 1H, 3-H); 7.70 (br, 1H, OH); 9.08 (br, 1H, OH) ppm.
¹³C-NMR (50.3 MHz, Aceton-d6)*: δ = 17.10 /17.13 (o, C-13); 22.2 (u, C-9); 30.06/29.99 (o, C-14); 34.3 (u, C-10); 36.6 (o, C-11); 44.0 (u, C-8); 61.7 (u, C-15); 67.83/67.87 (u, C-12); 77.9 (u, C-7); 114.0 (o, C-6); 116.4 (o, C-3); 127.7 (u, C-2); 130.64/130.59 (u, C-5); 148.3 (u, C-1 ); 150.0 (u, C-4 ) ppm.
*: Das Auftreten von Doppelsignalen ist auf das Vorliegen von Diastereomeren zurückzuführen (Diastereomerenverhältnis 1:1.3).
: Nicht eindeutig zuzuordnen.
Summenformel: C₁₅H₂₄O₅ (MG = 284.36).
5. Antibakterielle Aktivität von Waraterpol bzw. Analoga oder Derivaten
Die Waraterpole sowie die Derivate werden in Plattendiffusionstests gegen Bacillus subtilis, Escherichia coli, Mucar hiemalis (siehe Tabelle 7) getestet. Dem Agar (Nutrient Broth 0.3%; Pepton S 0.5%; NaCl 0.25% und 1.8% Agar) werden zuvor in noch flüssigem Zustand je Petrischale (10 ml Agar, 90 mm Durchmesser) 0,5 ml Suspensionskultur des Testorganismus (ca. 10⁵-10⁶ Kondidien/ 1 ml) zugegeben und die behandelten Agarplatten anschließend bei 25°C bebrütet. Nach 3- bis 4-tägiger Inkubation wird die Inhibitionszone als Maß der Hemmung gemessen und in mm angegeben (siehe Tabelle 7).
6. Test der antimykotischen Wirkung von Waraterpol und Analoga bzw. Derivaten in vitro gegen Dermatophyten
Die Dermatophyten (Trichophyton, Microsporon, Epidermophyton) werden auf einem handelsüblichen, zuckerhaltigen Medium bei 37°C für 5-10 Tage angezüchtet.
Wenn sich die wollig aussehenden Oberflächenkulturen gebildet haben, gibt man 10, 50 oder 100 µg der Verbindung der Formel I, welche zuvor in 10%igem DSMO ml gelöst wurde, hinzu.
Es wurden alle Verbindungen der Formel I auf ihre antimykotische Wirkung getestet, die von Penicillium sp. bzw. Penisillium sp. DSM natürlicherweise synthetisiert werden.
Nach 24-48 Stunden ist mikroskopisch eine Zerstörung der wolligen Oberflächenkulturen sichtbar. Nach weiteren 48 Stunden ist die Zellteilung komplett eingestellt.

Claims (13)

1. Verbindung der allgemeinen Formel I in der unabhängig voneinander
R1 Wasserstoff oder Acetyl,
R2 Wasserstoff bedeutet oder R2 und R3 gemeinsam eine Doppelbindung bilden,
R3 Hydroxyl bedeutet oder R2 und R3 gemeinsam eine Doppelbindung bilden und/oder R3 und R4 gemeinsam eine Doppelbindung bilden oder R1 mit R3 eine Etherbrücke bildet,
R4 Wasserstoff bedeutet oder R3 und R4 gemeinsam eine Doppelbindung bilden,
R5 Wasserstoff oder Acetyl bedeuten,
R6 Wasserstoff,
R7 Wasserstoff oder Hydroxyl bedeutet oder
R1, R3, R5 und R6, die gleich oder verschieden sein können, einen gesättigten oder ungesättigten, verzweigten oder unverzweigten oder cyclischen C1-C20- Alkylester, einen substituierten oder unsubstituierten aromatischen Ester, einen Heteroarylester oder einen Alkyl- oder Arylsulfonsäureester bedeuten.
2. Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, in welchem R1, R3, R5 und R6, die gleich oder verschieden sein können, einen gesättigten oder ungesättigten, verzweigten oder unverzweigten oder cyclischen C1-C10-Alkylester, einen substituierten oder unsubstituierten aromatischen Ester oder einen Alkylsulfonsäureester bedeuten.
3. Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, in welchem R1, R3, R5 und R6, die gleich oder verschieden sein können, einen gesättigten oder ungesättigten, verzweigten oder unverzweigten oder cyclischen C1-C5-Alkylester, einen substituierten oder unsubstituierten aromatischen Ester oder einen Alkylsulfonsäureester bedeuten.
4. Verbindung der Formel I zur Verwendung als Arzneimittel.
5. Arzneimittel, enthaltend Verbindung der Formel I und pharmazeutische Träger.
6. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der allgemeinen Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß Penicillium sp. in einem Nährmedium kultiviert wird, bis sich eine Verbindung der Formel I in der Kultur anhäuft.
7. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Penicillium sp. DSM 7219 in einem Nährmedium kultiviert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium 0,2 bis 5% Malzextrakt, 0,1 bis 0,5% Hefeextrakt, 0,5 bis 2% Glucose und 0,01 bis 0,1% (NH4)2HPO4 enthält, jeweils bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung.
9. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei 18 bis 30°C und in dem pH-Bereich zwischen 1 und 7 erfolgt.
10. Verwendung einer Verbindung der Formel I als pharmakologische wirksame Substanz.
11. Verwendung einer Verbindung der Formel I nach Anspruch 10 zur Herstellung eines antibakteriellen Arzneimittels.
12. Verwendung einer Verbindung der Formel I nach Anspruch 10 zur Herstellung eines antimykotischen Arzneimittels.
13. Penicillium sp. DSM 7219 sowie Varianten und Mutanten, soweit diese Varianten und Mutanten eine Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 herstellen.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US5736747A (en) * 1993-10-27 1998-04-07 Minnesota Mining And Manufacturing Company Organic compounds suitable as reactive diluents, and binder precursor compositions including same
CN112679355A (zh) * 2020-12-23 2021-04-20 华南农业大学 一种7-醛基-9-异丁酰氧基-8-羟基百里酚其在制备抗菌剂或抗菌药物中的应用

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