DE4225284A1 - Clonostachydiol und Helmidiol, neue Makrodiolide mit pharmakologischer Wirkung, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents

Description

Sekundärstoffe aus Pilzen sind schon seit langer Zeit bekannt und werden im großen Maßstab in verschiedenen Anwendungsgebieten, so z. B. als Cholesterinsenker oder als Antitumormittel benutzt. Es ist außerdem bekannt, daß Fungi imperfecti unter herkömmlichen Kulturbedingungen Makrodiolide produzieren wie z. B. Colletodiol [Amstrutz, R.; E. Hungerbühler & D. Seebach: 168. Revidierte Struktur des Makrodiolids Colletodiol. Helv. Chim. Acta 64: 1796-1799, 1981] oder Grahamimycin [Ronald, R. C. & S. Gurusidaiah: Grahamimycin A₁: A novel dilactone antibiotic from Cytospora. Tetrahedron Lett. 21: 681-684, 1980]. Über eine biologische Wirkungen bzw. eine pharmakologische Anwendbarkeit ist nichts bekannt.

Die Erfindung betrifft:

• 1. Eine Verbindung der Formel I und
  R² und R³, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, einen gesättigten oder ungesättigten, verzweigten oder unverzweigten, einen cyclischen oder offenkettigen C₁-C₂₀-Alkylester, einen substituierten oder unsubstituierten aromatischen Ester oder einen Heteroarylester bedeuten.
• 2. Ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Clonostachys cylindrospora und/oder Alternaria sp. in einem Nährmedium kultiviert werden, bis sich die Verbindungen der Formel I in der Kultur anhäufen.
• 3. Eine Verwendung der Verbindungen der Formel I als pharmakologisch wirksame Substanzen, insbesondere als Anthelminthika.

Im folgenden wird die Erfindung detailliert beschrieben, insbesondere in ihren bevorzugten Ausführungsformen. Ferner wird die Erfindung durch den Inhalt der Patentansprüche bestimmt.

Die teilaufgereinigten, isolierten und als Einzelkultur vermehrten Pilze Clonostachys cylindrospora und/oder Alternaria sp., bevorzugt Clonostachys cylindrospora DSM 7149 und/oder Alternaria sp. DSM 7150, synthestisieren die Verbindungen der Formel I, in welcher R¹ die oben genannten Bedeutungen hat und R² sowie R³ immer Wasserstoff bedeuten.

Betreffend Clonostachydiol wird vorzugsweise die Verbindung der Formel I synthetisiert, bei welcher die freie CH₂-Gruppe des Substituenten R¹ mit dem Ringsauerstoff verbunden ist.

Die Bestimmung der Pilzart bzw. -gattung wird anhand von morphologischen, taxonomischen und biochemischen Kriterien nach dem Fachmann bekannten Methoden vorgenommen. Diese Bestimmungskriterien sind z. B. in Carmichel, J. W.; W. B. Kendrick; I. L. Conners & L. Sigler Eds.: Genera of the Hyphomycetes; University Alberta Press, 1980, für Clonostachys cylindrospora bzw. in Von Arx, J. A. (Ed.): The genera of Fungi sporulating in pure culture; Gantner Verlag, Vaduz, 1981, für Alternaria publiziert.

Der Stamm Clonostachys cyclindrospora wird aus einer Erdprobe aus Rantepao, Sulawesi (Indonesien), der Stamm Alternaria sp. aus einer Pflanzenprobe aus Argentinien isoliert. Die Isolierung und Aufreinigung erfolgt nach dem Fachmann bekannten Verfahren durch Kulturverdünnung und Ausplattieren auf dem jeweiligen Selektivagar.

Aufgrund von mehreren, aufeinderfolgenden Isolierungs- und Aufreinigungsschritten kann sowohl von Clonostachys cylindrospora wie auch von Alternaria sp. je eine Pilzkolonie isoliert werden, die die Verbindungen der Formel I sehr effizient in den Kulturüberstand abgeben und somit als Hauptproduzenten bezeichnet werden.
Als Hauptproduzenten werden die Pilzisolate bezeichnet, die die Verbindungen der Formel I in einer 10- bis 100fach erhöhten Menge (als Hauptmetabolit) im Vergleich zu Isolaten der gleichen Pilzart produzieren bzw. in den Kulturüberstand abgeben.

Diese stark produzierenden Pilzkolonien werden vermehrt und jeweils ein Isolat von Clonostachys cylindrospora und Alternaria sp. bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, 3300 Braunschweig, Deutschland, nach den Regeln des Budapester Vertrages am 03. 07. 1992 unter den folgenden Nummern hinterlegt:

• 1. Clonostachys cylindrospora DSM 7149;
• 2. Alternaria sp. DSM 7150.

Anstelle der Stämme DSM 7149 und DSM 7150 können natürlich auch deren Mutanten und Varianten eingesetzt werden, soweit sie die Verbindungen der Formel I synthetisieren. Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung, wie mit Ultraviolett oder Röntgenstrahlen oder chemische Mutagene, wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS), 2-Hydroxy-4-methoxy-benzophenon (MOB) oder N- Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) erzeugt werden.

Das Screening nach Mutanten und Varianten, die die Verbindungen der Formel I synthetisieren erfolgt nach folgendem Schema:

• - Abtrennung des Mycels nach der Fermentation;
• - Adsorption des Kulturfiltrates an ein Polystyroladsorberharz;
• - Elution mit 80%igem Methanol;
• - Aufkonzentrierung und Analytik mittels Dünnschichtchromatographie auf Kieselgelplatten; als Laufmittel wird ein Chloroform-Methanol-Gemisch (Verhältnis 9 : 1) verwendet;
• - Detektion mittels Ansprühen mit einer Mischung aus Anisaldehyd und Schwefelsäure.

Clonostachys cylindrospora und damit auch das Isolat DSM 7149 besitzt ein braun bis gelb gefärbtes Mycel. Die typischen Conidiophoren sind in gewundenen, langen Reihen angeordnet.

Alternaria sp. bzw. das Isolat DSM 7150 besitzt ein weißes Luftmycel und graubraune Conidiophoren. Der Pilz bildet die für Alternaria charakteristischen Conidiophoren.

Die im folgenden beschriebenen Fermentationsbedingungen gelten sowohl für Clonostachys cylindrospora bzw. Alterneria sp. und die jeweils hinterlegten Isolate.

In einer Nährlösung, die eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle sowie die üblichen anorganischen Salze enthält, produzieren die o. g. Pilze die Verbindungen der allgemeinen Formel I.

Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie Glukose, Laktose oder D- Mannit sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie z. B. Malzextrakt. Als stickstoffhaltige Nährstoffe kommen in Betracht: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Peptone oder Tryptone, ferner Fleischextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Fleischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. An anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate oder Phosphate der Alkali- oder Erdalkalimetalle, Eisen, Zink, Kobalt und Mangan enthalten.

Die Pilze Clonostachys cylindrospora und Alternaria sp. können gemeinsam oder auch einzeln fermentiert werden.

Die Bildung der Verbindungen der Formel l mit Clonostachys cylindrospora bzw. DSM 7149 verläuft besonders gut in einer Nährlösung, die etwa 0,2 bis 5%, bevorzugt 1 bis 4% Malzextrakt und 0,02 bis 0,5%, bevorzugt 0,1 bis 0,4 Hefeextrakt enthält, sowie 0,2 bis 5,0%, bevorzugt 0,5 bis 2% Glucose und 0,01 bis 0,1%, bevorzugt 0,04 bis 0,06% (NH₄)₂HPO₄, jeweils bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung.

Die Bildung der Verbindungen der Formel I mit Alternaria sp. bzw. DSM 7150 verläuft besonders gut in einer Nährlösung, die etwa 0,2 bis 5%, bevorzugt 1 bis 4% Stärke (löslich) und 0,2 bis 5%, bevorzugt 1 bis 4 Maisstärke enthält, sowie 0,2 bis 5,0%, bevorzugt 0,5 bis 2% Glucose, 0,2 bis 5, bevorzugt 1 bis 4% Hefeextrakt, 0,2 bis 5%, bevorzugt 1 bis 4% Cornsteep (z. B. von der Fa. Sigma) und 0,001 bis 5%, bevorzugt 0,01 bis 1% CaCO₃, jeweils bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung.

Die Kultivierungen erfolgen aerob, also beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder Fermentern, gegebenenfalls unter Einführen von Luft oder Sauerstoff. Sie können in einem Temperaturbereich von etwa 15 bis 30°C, vorzugsweise bei etwa 20 bis 30°C, insbesondere bei 23 bis 28°C, durchgeführt werden. Der pH-Bereich sollte zwischen 1 und 7 liegen, vorteilhaft zwischen 2,5 und 4,5. Man kultiviert die Pilze unter diesen Bedingungen im allgemeinen über einen Zeitraum von 24 bis 300 Stunden, bevorzugt 36 bis 140 Stunden.

Vorteilhaft kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. man stellt je Stamm zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Volumenverhältnis 1 : 10, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man z. B., indem man ein versportes Mycel in eine Nährlösung überimpft und etwa 36 bis 120 Stunden, bevorzugt 48 bis 72 Stunden, wachsen läßt. Das versporte Mycel kann beispielsweise erhalten werden, indem man den Stamm etwa 3 bis 40 Tage, bevorzugt 4 bis 10 Tage, auf einem festen oder flüssigen Nährboden, beispielsweise Hefe-Malz-Agar oder Kartoffel-Dextrose-Agar, wachsen läßt.

Der Fermentationsverlauf kann jeweils anhand der pH-Werte der Kulturen oder der Mycelvolumina sowie durch chromatographische Methoden, wie z. B. Dünnschichtchromatographie oder High Pressure Liquid Chromatography, überwacht werden. Die Verbindungen der allgemeinen Formel I sind sowohl im Mycel als auch im Kulturfiltrat enthalten.

Die Isolierung der genannten Verbindungen der Formel I aus dem jeweiligen Kulturmedium erfolgt nach bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Produkte. Es können z. B. das Adsorptions-, Ionenaustausch- oder Gelfiltrationsverfahren angewandt werden.

Zum Testen der Metabolit-Konzentration im Kulturmedium oder in den einzelnen Isolierungsstufen wird das Verfahren der Dünnschichtchromatographie, beispielsweise an Kieselgel mit Butanol/Eisessig/Wasser oder Ethylacetat/Methanol/Wasser Mischungen als Laufmittel in dem Fachmann bekannten Konzentration, angewandt. Die Detektion bei der dünnschichtchromatographischen Auftrennung kann beispielsweise durch UV- Lösung und Färbereagentien wie Anisaldehyd oder Tetrazolblau erfolgen, wobei die Menge der gebildeten Substanz zweckmäßig mit einer Eichlösung verglichen wird.

Zur Isolierung der Verbindungen der Formel I werden Kulturbrühe und Mycel der einzelnen Fermentationen zuerst z. B. durch Filtration oder Zentrifugation getrennt. Das Kulturfiltrat wird über ein Adsoberharz, wie z. B. XAD® Adsorber der Fa. Amberlite gegeben, an dem die Verbindungen der Formel l binden und mit einem Lösungsmittel/Wasser-Gemisch, z. B. Methanol Wasser 4 : 1, eluiert werden können.

Die Reinisolierung der Verbindungen der Formel I erfolgt durch Chromatographie an geeigneten Materialien, vorzugsweise z. B. an Kieselgel, Aluminiumoxid, Ionenaustauschern oder Adsorberharzen, durch anschließende Elution mit organischen, polaren Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, wie z. B. Essigsäurealkylester, Gemische aus Essigsäurealkylester mit einem niederen Alkanol, Chloroform oder Methylenchlorid bzw. Gemischen dieser Lösungsmittel mit niederen Alkanolen, gegebenenfalls auch mit Wasser, bzw. einem für Ionenaustauscher-Harzen geeigneten pH- bzw. Salzgradienten, wie beispielsweise Kochsalz oder Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl (Tris- Puffer), und Vereinigung der biologisch aktiven Fraktionen. Eine Reinigung ist aber auch durch extraktive Methoden wie flüssig/flüssig-Extraktion oder fest/flüssig-Extraktion oder durch Kristallisation möglich.

Die von den Pilzen hergestellten, dann teilisolierten oder isolierten und aufgereinigten Verbindungen der Formel I können für die Veresterungsreaktion eingesetzt werden.

Die Veresterungsreaktion wird am R² und/oder R³ Substituenten durchgeführt werden.

Die Ester werden nach dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt (Organicum, VEB, Deutscher Verlag der Wissenschaften, Berlin 1984). Chemisch synthetisiert werden:
Gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder unverzweigte, cyclische oder offenkettige C₁-C₂₀-Alkylester, substituierte oder unsubstituierte aromatische Ester oder Heteroarylester.
Vorzugsweise werden gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder unverzweigte, cyclische oder offenkettige C₁-C₁₀-Alkylester, hydroxy-, amino-, C₁-C₁₀-alkylamino-, oxialkyl-, sulforyl-, C₁-C₁₀-alkylsulfonyl-, halogen- oder thiosubsituierte aromatische Ester, wobei die Substituenten am aromatischen Ring gleich oder verschieden sein können und der Aromat vorzugsweise ein Benzoyl- oder Aminobenzoylderivat ist, synthetisiert.

Die Verbindungen der Formel I sind im festen Zustand und in Lösungen im pH- Bereich zwischen 3 und 8, insbesondere 5 und 7, stabil und lassen sich damit in übliche galenische Zubereitungen einarbeiten.

Die Verbindungen der Formel I eignen sich aufgrund ihrer wertvollen pharmakologischen Eigenschaften sehr gut zur Anwendung als Heilmittel.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen biologische Aktivität, indem sie eine anthelminthische Wirkung gegen Plathelminthes (Plattwürmer) und Nemathelminthes (Rundwürmer) zeigen. Innerhalb dieser Stämme sind die Verbindungen insbesondere wirksam gegen Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Cooperia, Chabertia, Strongyloides, Oesophagostomum, Hyostrongylus, Ancylostoma, Ascaris und Heterakis.

Die Arzneimittel eignen sich vorzugsweise zur Prophylaxe und/oder Therapie von Wurmbefall. Therapiert werden vorzugsweise Säuger, ganz vorzugsweise Nutztiere, wie z. B. Schafe, Ziegen, Kühe, Pferde und Schweine.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können grundsätzlich als solche in Substanz verabreicht werden. Bevorzugt ist die Verwendung in Mischung mit geeignetem Trägermaterial. Als Trägermaterial können die üblichen Futtermittelmischungen verwendet werden.

Die Anwendung betrifft auch pharmazeutische Zubereitungen der Verbindungen der Formel I.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden im allgemeinen oral oder parenteral verabreicht, aber auch eine rektale Anwendung ist prinzipiell möglich. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Tabletten, Dragees, (Mikro-)Kapseln, Zäpfchen, Sirup, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole, Tropfen oder injizierbare Lösungen in Ampullenform sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung üblicherweise Trägerstoffe und Zusätze und/oder Hilfsmittel wie Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel oder Lösungsvermittler Verwendung finden. Als häufig verwendete Träger- oder Hilfsstoffe seien z. B. Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Laktose, Mannit und andere Zucker, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Vitamine, Cellulose und ihre Derivate, tierische pflanzliche Öle, Polyethylenglykole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser, Alkohole, Dimethylsulfoxid, Glycerin und mehrwertige Alkohole genannt.

Gegebenenfalls können die Dosierungseinheiten für die orale Verabreichung mikroverkapselt, um die Abgabe zu verzögern, oder über einen längeren Zeitraum ausgedehnt werden, wie beispielsweise durch Überziehen oder Einbetten des Wirkstoffs in Teilchenform in geeignete Polymere, Wachse oder dergleichen.

Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Präparate in Dosierungseinheiten hergestellt und verabreicht, wobei jede Einheit als aktiven Bestandteil eine bestimmte Dosis der Verbindungen der Formel I enthält. Bei festen Dosierungseinheiten wie Tabletten, Kapseln und Suppositorien kann diese Dosis bis zu etwa 800 mg, bevorzugt jedoch etwa 10 bis 400 mg, und bei Injektionslösungen in Ampullenform bis zu etwa 2 g, vorzugsweise aber etwa 10 mg bis 1 g, pro Tag betragen. Die Dosierung variiert je nach der zu therapierenden Säugerspezies.

Die zu verabreichende Tagesdosis ist abhängig vom Körpergewicht, Alter, Geschlecht und Zustand des Säugers. Unter Umständen können jedoch auch höhere oder niedrigere Tagesdosen angebracht sein. Die Verabreichung der Tagesdosis kann sowohl durch Einmalgabe in Form einer einzelnen Dosierungseinheit oder aber in mehreren kleineren Dosierungseinheiten als auch durch Mehrfachgabe unterteilter Dosen in bestimmten Intervallen erfolgen.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden dadurch hergestellt, daß man die Verbindungen der Formel I mit üblichen Träger- sowie gegebenenfalls Zusatz- und/oder Hilfsstoffen in die bzw. eine geeignete Darreichungsform bringt.

In den sich anschließenden Beispielen wird die Erfindung weiter erläutert. Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht und Mischungsverhältnisse bei Flüssigkeiten beziehen sich auf das Volumen, wenn keine anderen Angaben gemacht wurden.

Beispiele 1a) Herstellung einer Sporensuspension der Produzentenstämme Clonostachys cylindrospora DSM 7149 und Alternaria sp. DSM 7150

100 ml Nährlösung (20 g Malzextrakt, 2 g Hefeextrakt, 10 g Glucose, 0,5 g (NH₄)₂HPO₄ in 1 l Leitungswasser, pH-Wert vor der Sterilisation 6,0) in einem 500 ml sterilen Erlenmeyerkolben werden mit dem Stamm DSM 7149 bzw. DSM 7150 beimpft und 72 Stunden bei 25°C und 140 UpM auf einer rotierenden Schüttelmaschine inkubiert. Anschließend werden 20 ml Kulturflüssigkeit in einem sterilen 500 ml Erlenmeyerkolben mit dem Nährboden (Kartoffelinfus 4,0 g/l [Infus aus 200 g Kartoffeln in 1000 ml H₂O], 20,0 g/l D- Glucose, pH vor der Sterilisation 5,6), dem zusätzlich 15 g Agar/l zur Verfestigung zugegeben wurde, gleichmäßig verteilt und dekantiert. Die Kulturen werden 10 bis 14 Tage bei 25°C inkubiert. Die nach dieser Zeit entstandenen Sporen eines Kolbens werden mit 500 ml entionisiertem Wasser, das einen Tropfen eines handelsüblichen nichtionischen Tensids (z. B. ®Triton X 100, Fa. Serva) enthält, abgeschwemmt, sofort weiterverwendet oder bei -22°C in 50% Glycerin aufbewahrt.

b) Herstellung einer Kultur bzw. einer Vorkultur der Produzentenstämme im Erlenmeyerkolben

Ein steriler 500 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml der unter a) beschriebenen Nährlösung wird mit einer auf einem Schrägröhrchen gewachsenen Kultur oder mit 0,2 ml Sporensuspension angeimpft und auf einer Schüttelmaschine bei 140 UpM und 25°C inkubiert. Die maximale Produktion der Verbindung der Formel I ist nach ca. 120 Stunden erreicht. Zum Animpfen von 10 und 100 l Fermentern genügt eine 72 Stunden alte Submerskultur (Animpfmenge ca. 5%) aus der gleichen Nährlösung.

2. Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I

Ein 10 l Fermenter wird unter folgenden Bedingungen betrieben:

• a) Nährmedium zur Fermentation von Clonostachys cylindrospora DSM 7149: 20 g/l Malzextrakt
  10 g/I Glucose
  2 g/l Hefeextrakt
  0,5 g/l (NH₄)₂HPO₄
  pH 6,0 (vor der Sterilisation).Der pH-Wert wird mit wäßriger 2 N NaOH oder HCl eingestellt.
• b) Nährmedium zur Fermentation von Alternaria sp. DSM 7150: 10 g/l Glucose
  5 g/l Stärke (löslich)
  5 g/l Maisstärke
  5 g/l Hefeextrakt
  5 g/l Cornsteep
  2 g/l CaCO₃
  pH 5.5 (vor der Sterilisation).

  Inkubationszeit:
  120 Stunden
  Inkubationstemperatur:	35°C
  Rührergeschwindigkeit:	200 UpM
  Belüftung:	5 l Luft/min

Durch wiederholte Zugabe weniger Tropfen ethanolischer Polyollösung kann die Schaumbildung unterdrückt werden. Das Produktionsmaximum beider Stämme wird nach ca. 96 Stunden erreicht. Der pH-Wert beträgt bei der Ernte ca. pH 3,5 bis 4,0. Die Ausbeuten liegen bei ca. 40 mg/l für Clonostachydiol und 30 mg/l für Helmidiol.

3. Isolierung von Clonostachydiol

a) Die Kulturlösung (ca. 10 l) des Clonostachydiol-Produzenten Clonostachys cylindrospora DSM 7149 aus einer Fermentation wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben, wird filtriert. Das Kulturfiltrat (ca. 9 l) wird dreimal mit je 3 l Essigester extrahiert, die organischen Phasen vereinigt und zur Trockene eingedampft. Anschließend wird das Mycel zweifach mit Aceton (je ca. 1 l) extrahiert, das organische Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und der verbleibende wäßrige Rückstand lyophylisiert. Die Rohprodukte aus dem Kulturfiltrat und dem Mycel werden vereinigt und an Kieselgel (Säule: 20×4,5 cm; Laufmittel: Essigester/n-Hexan (1 : 1)) chromatographiert. Die Clonostachydiol-enthaltenen Fraktionen werden im Vakuum eingeengt und an Sephadex LH-20® (Säule: 100×2,5 cm, Laufmittel: MeOH) chromatographiert. Es werden 32,7 mg/l farbloses, kristallines Clonostachydiol erhalten. Die Substanz kann zur weiteren Reinigung unter Verwendung von geeigneten organischen Lösungsmitteln bzw. Lösungsmittelgemischen (wie z. B. Isopropanol, Ethanol, Essigester, Chloroform oder n-Hexan) umkristallisiert werden.

b) Isolierung von Helmidiol

Die Kulturlösung (ca. 10 l) des Helmidiol-Produzenten Alternaria sp. DSM 7150 aus einer Fermentation wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben wird filtriert. Das Kulturfiltrat (ca. 9 l) wird dreimal mit je 3 l Essigester extrahiert, die organischen Phasen vereinigt und zur Trockene eingedampft. Anschließend wird das Mycel zweifach mit Aceton (je ca. 1 l) extrahiert, das organische Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und der verbleibende wäßrige Rückstand lyophylisiert. Die Rohprodukte aus dem Kulturfiltrat und Mycel werden vereinigt und an Kieselgel (Säule: 38×8 cm; Laufmittel: CHCl₃-MeOH (9 : 1)) chromatographiert. Die Helmidiol-enthaltenen Fraktionen werden im Vakuum eingeengt und an Sephadex LH-20® (Säule: 100×0,5 cm, Laufmittel: MeOH) chromatographiert. Eine weitere Reinigung erfolgt durch Chromatographie an Kieselgel (Säule: 40×4 cm; Laufmittel: Aceton/n-Hexan (1 : 2)). Es werden 59 mg/l reines farbloses, kristallines Helmidiol erhalten. Die Substanz kann zur weiteren Reinigung unter Verwendung von geeigneten organischen Lösungsmitteln bzw. Lösungsmittelgemischen (wie z. B. Isopropanol, Ethanol, Essigester, Chloroform oder n-Hexan) umkristallisiert werden.

4. Charakterisierung der Verbindungen der Formel I

• a) Clonostachydiol wird als amorpher Feststoff isoliert. Die Substanz ist z. B. löslich in CH₂Cl₂, CHCl₃, Essigsäureethylester, Aceton, Dimethylsulfoxid, Ethanol und Isopropanol. Schmelzpunkt 164°C
  R_f=0,58 (CHCl₃/MeOH, 9 : 1)
  R_f=0,30 (Ethylacetat/n-Hexan, 1 : 1)
  R_f=0,95 (n-Butanol/Eisessig/Wasser, 4 : 1:5, ohne Phase)
  Summenformel=C₁₄H₂₀O₆ (284 g/Mol)
  HR-FAB-MS (M⁺, 284.1260, C₁₄H₂₀O₆).Elementaranalyse:
  Berechnet für C₁₄H₂₀O₆:
  C 5913; H 7,09;
  Gefunden:
  C 59,24; H 6,99.[α]_D²⁰ (c=1,0 in MeOH: +103°
  UVλ_max. ^MeOH (ε): 209 nm (16 400)
  IR (KBr): 1690, 1652, 1641 cm^-1
  CD λ_max. ([R]²⁰): 221 nm (+85 000)
  ¹H-NMR und ¹³C NMR: siehe Tabelle 1 Tabelle 1
• b) Helmidiol wird als amorpher farbloser Feststoff isoliert und ist z. B. löslich in CH₂Cl₂, CHCl₃₁ Essigsäureethylester, Aceton, Dimethylsulfoxid, Ethanol und Isopropanol.

Schmelzpunkt: 131 °C.
R_f=0,92 (Ethylacetat/Methanol/H₂O, 6 : 2 : 1)
R_f=0,68 (CHCl₃/Methanol, 9 : 1)
R_f=0,29 (Ethylacetat/n-Hexan, 4 : 1)
R_f=0,73 (n-Butanol/Eisessig/H₂O, 4 : 1:5, obere Phase).
Summenformel:
C₁₆H₂₄O₆ (312 g/Mol).
El-MS (70 eV) m/e (%) = 156 (M⁺/2; 70), 139 (100), 114 (30), 111 (50), 93 (43), 84 (45), 55 (72), 43 (44).
[α]_D ²² (c=1,01 in CHCl₃): -14,9°
[α]_D ²² (c=1,0 in MeOH): + 3,8°
IR (cm^-1): 2980; 2940; 2865; 1724; 1655; 1458; 1355; 1300; 1280; 1270; 1170
UV (MeOH): λ_max(ε)nm 207 (17850)
UV (MeOH+HCl): +λ_max(ε)nm: 206 (18650)
UV (MeOH+NaOH): λ_max(ε)nm: 215 (16040)
CD (MeOH): λ_extremnm ([R]10⁵): 220,1 (-2,932)

Sprühreagentien und Anfärbung
Vanillin-H₂SO₄-Reagenz
rotbraun
Molybdatophosphorsäure-Reagenz	hellblau
Orcin-Reagenz	grau
Anis-Reagenz	blau

¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃): Es liegt ein symmetrisches Molekül vor; Signalsatz für eine Molekülhälfte:
δ = 1,28 (d, 3H, 7-CH₃, J=6,5 Hz); 1,69 (m, 2H, 6-CH₂); 1,90 (m, 2H, 5- CH₂); 4,31 (m, 1H, 4-H); 5,14 (m, 1H, 7-H); 5,98 (dd, 1H, 2-H, J=15,7 und 1,7 Hz); 6,91 (dd, 1H, 3-H, J=15,7 und 5,5 Hz) ppm.
¹³C-NMR (50,3 MHz, CDCl₃):
δ = 18,6 q, 7-CH₃; 28,9 t, C-6 oder C-5; 30,6 t, C-5 oder C-6; 70,1 d, C-4 oder C-7, 70,3 d, C-7 oder C-4; 122,0 d, C-2; 194,3 d, C-3; 165,6 s, C-1 ppm.

5. Darstellung von Helmidiol-2-S-Phenylbutyrat (S-PBA) und Helmidiol-2-R- Phenylbutyrat (R-PBA)

In getrennten Ansätzen werden jeweils 10 mg Helmidiol in CH₂Cl₂ unter Zugabe von einer Spatelspitze 4-DimethyIaminopyridin (DMAP) sowie Dicyclohexylcarbodiimid gelöst und je 2 Tropfen 2-S-Phenylbuttersäure bzw. 2- R-Phenylbuttersäure zugegeben. Die Lösungen werden bei Raumtemperatur 14 Stunden gerührt. Erneute Zugabe einer Spatelspitze Dicyclohexylcarbodiimid sowie ein Tropfen der jeweiligen chiralen Säuren führt nach weiteren 40 Stunden bei Raumtemperatur zu guten Umsätzen. Die Reaktionsmischungen wurden auf 10%ige wäßrige NaHCO₃-Lösungen gegeben, mehrmals mit Chloroform extrahiert, unter Na₂SO₄ getrocknet und an Sephadex LH-20 (Säule: 2,5×100 cm; Laufmittel: MeOH) chromatographiert. Man erhält 40 mg Helmidiol-2-S-Phenylbutyrat (S-PBA) sowie 42, 1 mg Helmidiol-2-R-Phenylbutyrat (R-PBA).

6. Herstellung von Helmidiol-Diacetat

16 mg Helmidiol werden mit 1 ml Acetanhydrid in 5 ml Pyridin gelöst und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Aufarbeitung erfolgt durch wäßrige Hydrolyse (Eiswasser), Extraktion mit Chloroform und Chromatographie an Kieselgel (Säule: 1,5×20 cm; Laufmittel: CHCl₃/MeOH, 9 : 1). Die Ausbeute beträgt 19 mg reines amorphes Helmidiol-Diacetat.

El-MS (70 eV) m/e (%) = 396 (M⁺, 0,2); 354 (0,85); 337 (2,6), 294 (8); 199 (4,6); 155 (16,6); 139 (73); 93 (22); 55 (19); 43 (100).
MS-Hochauflösung: gefunden wie berechnet 396,1784 entsprechend C₂₀H₂₈O₈
Summenformel: C₂₀H₂₈O₈
¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃): siehe Tabelle 2.

Tabelle 2: Vergleich der NMR-Daten der Derivate von Helmidiol zum nativen Metaboliten.
Helmidiol; Acl = Helmidiol-Diacetat; S-PBA = 2-S-Phenylbutyrat*; R-PBA = 2-R-Phenylbutyrat*; 200 MHz; * = mit DCC oder dem Harnstoffanalogen verunreinigt.

7. Anthelminthische Wirkung von Clonostachydiol und Helmidiol

Die anthelmintische Wirkung von Clonostachydiol und Helmidiol wird an Lämmern mit 30 bis 40 kg Körpergewicht untersucht. Dazu werden die Lämmer artifiziell mit Infektionsstadien von Labmagennematoden (Haemunchus contortus) infiziert. Nach Abschluß der Entwicklungszeit (Präpatenzperiode) der Nematoden erfolgte die Applikation von Clonostachydiol und Helmidiol.

Durch koproskopische Untersuchungen vor und bis zu 14 Tagen nach der Applikation und anschließender Sektion mit helminthologischer Aufarbeitung wurde die prozentuale Reduktion der Schaf-Nematoden ermittelt (s. Tabelle 2).

Tabelle 2

Claims (12)

1. Verbindung der allgemeinen Formel I und
R² und R³, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, einen gesättigten oder ungesättigten, verzweigten oder unverzweigten, einen cyclischen oder offenkettigen C₁-C₂₀-Alkylester, einen substituierten oder unsubstituierten aromatischen Ester oder einen Heteroarylester bedeuten.

2. Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1, in welchen R² und R³, die gleich oder verschieden sein können, einen gesättigten oder ungesättigten, verzweigten oder unverzweigten, einen cyclischen oder offenkettigen C₁-C₁₀-Alkylester, einen hydroxyl-, amino-, C₁-C₁₀- alkylamino-, oxialkyl-, sulforyl-, C₁-C₁₀-alkylsulfonyl-, halogen- oder thiosubstituierte aromatische Ester, wobei die Substituenten am aromatischen Ring gleich oder verschieden sein können, und der aromatische Ester ein Benzoyl- oder Aminobenzoylderivat ist, bedeuten.

3. Verbindungen der Formel I zur Verwendung als Arzneimittel.

4. Arzneimittel, enthaltend Verbindungen der Formel l und pharmazeutische Träger.

5. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Clonostachys cylindrospora und/oder Alternaria sp. in einem Nährmedium kultiviert werden, bis sich die Verbindungen der Formel I in der Kultur anhäufen.

6. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Clonostachys cylindrospora DSM 7149 und/oder Alternaria sp. DSM 7150 in einem Nährmedium kultiviert werden.

7. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium 0,2 bis 5% Malzextrakt, 0,1 bis 0,5% Hefeextrakt, 0,5 bis 2% Glucose und 0,01 bis 0,1% (NH₄)₂HPO₄ enthält, jeweils bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung.

8. Verfahren nach den Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium 0,2 bis 5% lösliche Stärke, 0,2 bis 5% Maisstärke, 0,2 bis 5,0% Glucose und 0,2 bis 5% Hefeextrakt, 0,2 bis 5% Cornsteep und 0,01 bis 1% CaCO₃ enthält, jeweils bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung.

9. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei 18 bis 30°C und in dem pH- Bereich zwischen 1 und 7 erfolgt.

10. Verwendung der Verbindungen der Formel I zur Herstellung eines anthelminthischen Arzneimittels.

11. Clonostachys cylindrospora DSM 7149 sowie Varianten und Mutanten, soweit sie die Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 herstellen.

12. Alternaria sp. DSM 7150 sowie Varianten und Mutanten, soweit sie die Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 herstellen.