DE69214737T2

DE69214737T2 - Antibiotika NK374186A, NK374186B, NK374186B3 und NK374186C3, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE69214737T2
Application number: DE69214737T
Authority: DE
Inventors: Eiji Kawano; Akira Masuda; Tomio Morino; Mit Uyuki Nishide; Takaaki Nishikiori; Masakazu Nishimoto; Seiichi Saito; Masatoshi Yamada
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1991-07-10
Filing date: 1992-06-16
Publication date: 1997-02-20
Anticipated expiration: 2012-06-17
Also published as: DE69214737D1; EP0525361B1; EP0525361A1; US5306496A

Description

Beispiele für bekannte Antineoplastika schließen Adriamycin, Bleomycin, Cisplatin und Etoposid ein.
Diese sind jedoch hoch toxisch, was sie unzulänglich macht. Andererseits zeigen die existierenden Immunmodulatoren oder Behandlungsmittel für hepatische Erkrankungen keine zufriedenstellende Effekte. Es war daher dringend notwendig, neue Verbindungen zu erfinden, die für diese Zwecke geeignet sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Unter diesen Umständen haben die gegenwärtigen Erfinder eine Anzahl mikrobieller Metaboliten untersucht und als Ergebnis gefunden, daß ein Schimmelstamm Antibiotika NK374186A, NK374186B, NK374186B3 und NK374186C3 produzieren kann, die jeweils eine schwache wachstumsunterdrückende Aktivität bei Säugerzellen zeigen.
Die vorliegende Erfindung wurde basierend auf dem oben genannten Befund vervollständigt.
Dementspechend betrifft die vorliegende Erfindung neue Antibiotika NK374186A, NK374186B, NK374186B3 und NK374186C3.
Jede der erfindungsgemäßen Verbindungen besitzt eine antibakterielle Aktivität und ist daher als Bakterizid einsetzbar. Zusätzlich wird erwartet, daß sie als Antineoplatika einsetzbar sind, da sie eine das Krebszellwachstum unterdrückende Wirkung aufweisen. Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Bakterizid oder ein Antineoplastikum, das mindestens ein Antibiotikum umfaßt, welches aus der aus NK374186A, NK374186B, NK374186B3 und NK374186C3 bestehenden Gruppe als aktiver Bestandteil ausgewählt wird.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen, insbesondere NK374186A und NK374186B, haben immunomodulatorische Effekte, und die Gabe einer wirksamen Dosis dieser Verbindungen an warmblütige Tiere, einschließlich Menschen, kann Immunmodulation bewirken, insbesondere Immunpotenzierungseffekte bei diesen Tieren. Daher sind diese Verbindungen einsetzbar als Immunmodulator, insbesondere Immunpotentiator.
Wenn eine wirksame Dosis der erfindungsgemäßen Verbindung, insbesondere NK374186A, warmblütigen Tieren einschließlich Menschen gegeben wird, bewirkt sie einen Leber-regenierungsfördernden Effekt, so daß die Regeneration geschädigter Leber gefördert wird, die beispielsweise unter teilweiser Exzision leidet. Dementsprechend wird erwartet, daß diese Verbindung als Lebergenerationspromotor einsetzbar ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein UV-Absorptionsspektrum von NK374186A.
Fig. 2 ist ein IR-Absorptionsspektrum von NK374186A, bestimmt unter Verwendung einer Kaliumbromidtablette.
Fig. 3 ist ein Protonen-NMR-Spektrum von NK374186A, bestimmt in schwerem Dimethylsulfoxid.
Fig. 4 ist ein Kohlenstoff-NMR-Spektrum von NK374186A, bestimmt in schwerem Dimethylsulfoxid.
Fig. 5 ist ein UV-Absorptions-Spektrum von NK374186B.
Fig. 6 ist ein IR-Absorptions-Spektrum von NK374186B, bestimmt unter Verwendung einer Kaliumbromidtablette.
Fig. 7 ist ein Protonen-NMR-Spektrum von NK374186B, bestimmt in schwerem Dimethylsulfoxid.
Fig. 8 ist ein Kohlenstoff-NMR-Spektrum von NK374186B, bestimmt in schwerem Dimethylsulfoxid.
Fig. 9 ist ein UV-Absorptions-Spektrum von NK374186B3.
Fig. 10 ist ein IR-Absorptions-Spektrum von NK374186B3, bestimmt unter Verwendung einer Kaliumbromidtablette.
Fig. II ist ein Protonen-NMR-Spektrum von NK374186B3, bestimmt in schwerem Dimethylsulfoxid.
Fig. 12 ist ein Kohlenstoff-NMR-Spektrum von NK374186B3, bestimmt in schwerem Dimethylsulfoxid.
Fig. 13 ist ein UV-Absorptions-Spektrum von NK374186C3.
Fig. 14 ist ein IR-Absorptions-Spektrum von NK374186C3, bestimmt unter Verwendung einer Kaliumbromidtablette.
Fig. 15 ist ein Protonen-NMR-Spektrum von NK374186C3, bestimmt in schwerem Dimethylsulfoxid.
Fig. 16 ist ein Kohlenstoff-NMR-Spektrum von NK374186C3, bestimmt in schwerem Dimethylsulfoxid.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die oben genannten neuen Antibiotika NK374186A, NK374186B, NK374186B3 und NK374186C3 können erhalten werden durch Kultivieren von NK374186A-, NK374186B-, NK374186B3- und NK374186C3-produzierenden Stämmen, die zur Gattung Penicillium gehören, und durch Isolieren der akkumulierten Antibiotika NK374186A, NK374186B, NK374186B3 und NK374186C3 aus dem Kulturmedium.
Als typische Beispiele für die Stämme, die zur Produktion von NK374186A, NK374186B, NK374186B3 und NK374186C3 in der Lage sind, kann ein Stamm NK347816 genannt werden, der im April 1989 aus Boden in einem Dickicht in Yahiko, Niigata isoliert wurde, und der beim Fermentation Research Institute unter der Zugangsnummer FERMP-12285 unterlegt wurde (im folgenden einfach als NK374186-Stamm bezeichnet) (FERM-8P3870).
Die mykologischen Eigenschaften des NK374186-Stamms sind wie folgt.
Er wächst gut auf einem Malzextrakt-Agarmedium bei 27ºC. Der Durchmesser einer Kolonie erreicht 54,3 mm nach Kultivieren des Stamms während 10 Tagen. Lufthyphen bilden sich auf der Oberfläche der Kolonie. Wenn die Kultur fortschreitet, wechselt das Zentrum der Kolonie von gelb zu pink und dann graugrün. Andererseits wechselt die Rückseite der Kolonie von blaßgelb zu gelb, pink und dann rot.
Er wächst gut in einem Kartoffel/Glukose-Agarmedium bei 27ºC, und der Durchmesser einer Kolonie erreicht 53,0 mm nach Kultivieren während 10 Tagen. Gleiche Farbänderungen wie die im Fall der Kultur im Malzextraktmedium beobachteten werden beobachtet.
In Czapeks Medium bei 27ºC wächst der Stamm nicht gut, und der Durchmesser einer Kolonie erreicht 22,3 mm nach Kultivieren während 10 Tagen. Wenn die Kultur fortschreitet, ändern sich sowohl die Oberfläche als auch die Rückseite im Zentrum der Kolonie von pink zu rot. Im Unterscheid zu den oben genannten beiden Medien wird die Oberfläche jedoch nicht graugrün.
Er wächst gut in einem YpSs-Agarmedium bei 27ºC, und der Durchmesser einer Kolonie erreicht 43,6 mm nach Kultivieren während 10 Tagen.
Auf dem YpSs-Agramedium bildet dieser NK374186-Stamm eine Anzahl verbundener ellipsoidaler oder subsphärischer (etwa 2µm) Konidiosporen mit rauhen Oberflächen. Einige (3 bis 5) Phialiden (etwa 1,5 µm x 8 µm) einer spitzen Form, wie eine Bleistiftspitze, bilden einen Ring. Einige (4 bis 8) Metulae (etwa 2 µm x 8 µm) wachsen in Anhäufungen. Die für das Wachstum dieses Stamms geeignete Temperatur reicht von 10 bis 37ºC, und die optimale Temperatur beträgt etwa 28&sup8;C. Der für das Wachstum geeignete pH-Wert reicht von 2 bis 11, und der optimale pH-Wert beträgt von 4 bis 8.
Basierend auf den oben genannten mykologischen Eigenschaften ergibt sich, daß dieser Stamm zur Gattung Penicillium des Phialo-Typs, Hyphomycetes, Deuteromycotina, Eumypetes gehört, in Übereinstimmung mit Genus Penicillium und Its Teleomorphic States; Eupenicillium & Talaromyces (John I. Pitt, Academic Press, 1979). Daher wird dieser Stamm Penicillium sp. NK374186-Stamm genannt.
Genauso wie andere Stämme der Gattung Penicillium ist der erfindungsgemäß zu verwendende zur Gattung Penicillium gehörende Stamm sehr labil. Daher kann er leicht durch künstliche mutagene Verfahren unter Verwendung von beispielsweise UV-Licht, Röntgenstrahlen oder Chemikalien mutiert werden. Jede Mutante ist in der vorliegenden Erfindung verwendbar, solange sie die physiologisch aktive Substanz NK374186A, NK374186B, NK374186B3 oder NK374186C3, nämlich den Gegenstand der vorliegenden Erfindung, produzieren kann. Diese Substanzen werden im folgenden einfach als NK374186 bezeichnet.
Um NK374186 in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zu produzieren, wird der oben genannte Stamm in einem Medium unter aeroben Bedingungen kultiviert, das für Pilze verwendbare Nährstoffe enthält. Als Nährstoffquellen sind üblicherweise zur Kultur von Schimmel verwendete verfügbar. Beispielsweise kann eine Kohlenstoffquelle ausgewählt werden aus Glucose, Fructose, Glycerol, Sucrose, Dextrin, Galactose, organischen Säuren und deren Mischungen.
Anorganische und organische Stickstoffquellen können ausgewählt werden aus Ammoniumchlorid, Ammuniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, Pepton, Fleischextrakt, Hefextrakt, Trockenhefe, Maisquellflüssigkeit, Sojamehl, Baumwollsaatölkuchen, Kasaminosäuren, Baktosoyton, löslichem Pflanzenprotein, Hafermehl und Mischungen davon.
Zusätzlich kann das Medium anorganische Salze wie gewöhnliches Salz, Calciumkarbonat, Magnesiumsulfat, Kupfersulfat, Eisensulfat, Zinksulfat, Manganchlorid oder Phosphate enthalten, falls notwendig. Darüber hinaus können gegebenenfalls organische Substanzen wie Aminosäuren, Vitamine oder Nucleinsäuren und anorganische Substanzen zugesetzt werden.
Der Stamm kann durch Flüssigkultur kultiviert werden, insbesondere Tauchdrehkultur (submerged spinner culture). Die Kultur kann bevorzugt bei einer Temperatur von 15 - 35ºC und einem neutralen oder leicht sauren pH-Wert durchgeführt werden.
Im Fall der Flüssigkultur werden die Produkte NK374186A, B, B&sub3; und C&sub3; im Kulturmedium üblicherweise während 3 bis 5 Tagen gebildet und angesammelt. Wenn die Menge des Produkts in den Zellen den Maximalspiegel erreicht, wird die Kultur gestoppt, und die Zellen durch Filtrieren vom Kulturmedium abgetrennt, gefolgt von Isolierung und Reinigung jedes Produkts.
Jedes Produkt aus NK374186A, B, B&sub3; und C&sub3; kann aus den Zellen isoliert und gereinigt werden mit einem Verfahren, das üblicherweise zur Isolierung eines mikrobiellen Metaboliten aus kultivierten Zellen eingesetzt wird.
Genauer gesagt wird das Kulturmedium durch eine übliche Futrationsprozedur in ein Filtrat und die.Zellen ausgetrennt. Als nächstes werden die Zellen mit Methanol extrahiert, und die gleiche Menge Wasser wird zu dem so erhaltenen Extrakt gegeben. Dann wird die Zielsubstanz an einem Harz HP-20 adsorbiert. Nach dem Waschen wird das Harz mit 60% Aceton und Methanol eluiert, um Fraktionen 1 und 2 zu erhalten. Die Fraktion 1 wird dann zu Trockne konzentriert und anschließend schrittweise Kieselgelsäulenchromatographie und LH-20- Säulenchromatographie unterworfen, wie im folgenden Beispiel beschrieben wird. Aktive Fraktionen werden kombiniert und unter reduziertem Druck konzentriert. So wird NK374186A als farbloses Produkt erhalten.
Andererseits wird die Fraktion 2 zu Trockne konzentriert und Kieselgelchromotographie unterworfen, wie im folgenden Beispiel beschrieben. So werden drei aktive Fraktionen 2a, 2b und 2c erhalten. Die Fraktionen 2a und 2b werden LH-20-Chromatographie unterworfen, und so werden jeweils die farblosen Produkte NK374186B und NK374186B3 erhalten. Die Fraktion 2c wird schrittweise
Kieselgelsäulenchromatographie und LH-20-Säulenchromatographie unterworfen, um NK374186C3 zu erhalten.
Die physikochemischen Eigenschaften der Antibiotika NK374186A, NK374186B, NK374186B3 und NK374186C3, die so erhalten wurden, oder ihrer Salze sind wie folgt:

a) NK374196A

1) Aussehen: farbloses Pulver,
2) Molekulargewicht: FD-MS m/z (M + 735).
3) Verhältnisformel: C&sub3;&sub4;H&sub6;&sub1;N&sub3;O&sub1;&sub2;S,
4) Löslichkeit: löslich in niedrigen Alkoholen, Chloroform und und Ethylacetat,
5) Rf-Wert in Kieselgel-Dünnschichtchromatographie (Art. 5715, Produkt von Merck): 0,12 unter Verwendung einer Chlorform/Methanol-Mischung (20 : 1) als Entwickler,
6) UV-Absorptionsspektrum: Siehe Fig. 1,
7) IR-Absorptionsspektrum: Siehe Fig. 2 (bestimmt unter Verwendung einer Kaliumbromidtablette),
8) Protonen-NMR-Spektrum: Siehe Fig. 3 (bestimmt in schwerem DMSO),
9) Kohlenstoff-NMR-Spektrum: Siehe Fig. 4 (bestimmt in schwerem DMSO), und
10) Farbreaktion: positiv in Phosphomolybdänsäure/Schwefelsäure-Reaktion und Tolidin-Chlor-Reaktion und negative in Ninhydrin-Reaktion;

b) NK3741868

1) Aussehen: farbloses Pulver,
2) Molekulargewicht: FD-MS m/z (M + 655),
3) Verhältnisformel: C&sub3;&sub4;H&sub6;&sub1;N&sub3;O&sub9;,
4) Löslichkeit: löslich in niedrigen Alkoholen, Chloroform und Ethylacetat,
5) Rf-Wert in Kieselgel-Dünnschichtchromatographie (Art. 5715, Produkt von Merck): 0,35 unter Verwendung eines Chloroform/Methanol-Gemisches (20 : 1) als Entwickler,
6) UV-Absorptionsspektrum: Siehe Fig. 5,
7) IR-Absorptionsspektrum: Siehe Fig. 5 (bestimmt unter Verwendung einer Kaliumbromidtablette),
8) Protonen-NMR-Spektrum: Siehe Fig. 7 (bestimmt in schwerem DMSO),
9) Kohlenstoff-NMR-Spektrum: Siehe Fig. 8 (bestimmt in schwerem DMSO), und
10) Farbreaktion: positive in Phosphormolybdänsäure/Schwefelsäure-Reaktion und Tolidin-Chlor-Reaktion und negativ in Ninhydrin-Reaktion;

c) NK374186B3

1) Aussehen: farbloses Pulver,
2) Molekulargewicht: FD-MS m/z (M + 655),
3) Verhältnisformel: C&sub3;&sub4;H&sub6;&sub1;N&sub3;O&sub9;,
4) Löslichkeit: löslich in niedrigen Alkoholen, Chloroform und Ethylacetat,
5) Rf-Wert in Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: 0,49 unter Verwendung eines Chloroform/Methanol-Gemisches (20 : 1) als Entwickler,
6) UV-Absorptions-Spektrum: Siehe Fig. 9,
7) IR-Absorptions-Spektrum: Siehe Fig. 10 (bestimmt unter Verwendung einer Kaliumbromidtablette),
8) Protonen-NMR-Spektrum: Siehe Fig. 11 (bestimmt in schwerem DMSO),
9) Kohlenstoff-NMR-Spektrum: Siehe Fig. 12 (bestimmt in schweren DMSO), und
10) Farbreaktion: positive in Phosphomolybdänsäure/Schwefelsäure-Reaktion und Tolidin-Chlor-Reaktion und negative in Ninhydrin-Reaktion; und

d) NK374186C3

1) Aussehen: farbloses Pulver
2) Molekurlargewicht: FD-MS m/z (M + 597),
3) Verhältnisformel: C&sub3;&sub4;H&sub5;&sub9;N&sub3;O&sub7;,
4) Löslichkeit: löslich in niedrigen Alkoholen, Chloroform und Ethylacetat,
5) Rf-Wert in Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: 0,33 unter Verwendung einer Chloroform/Methanol-Mischung (20 : 1) als Entwickler,
6) UV-Absorptionsspektrum: Siehe Fig. 13,
7) IR-Absorptionsspektrum: Siehe Fig. 14,
8) Protonen-NMR-Spektrum : Siehe Fig. 15 (bestimmt in schwerem DMSO),
9) Kohlenstoff-NMR-Spektrum: Siehe Fig. 16 (bestimmt in schwerem DMSO), und
10) Farbreaktion: positiv in Phosphormolybdänsäure/Schwefelsäure-Reaktion und Tolidin-Chlor-Reaktion und negative in Ninhydrin-Reaktion.
Wie im folgenden beschrieben wird, wird erwartet, daß das NK374186 der vorliegenden Erfindung einsetzbar ist als Arzneimittel wie antibakterielles Mittel, Antineoplastikum, Immunmodulator oder Leberregenerationspromotor.
Wenn die erfindungsgemäße Verbindung als Arzneimittel verwendet werden soll, kann sie nach verschiedenen üblicherweise im Stand der Technik bekannten Methoden formuliert und verabreicht werden. Sie kann nämlich beispielsweise durch Injektion, orale Gabe oder reaktale Gabe verabreicht werden. Sie kann beispielsweise zur Injektionen, Stäuben, Granulat, Tabletten oder Suppositorien formuliert werden.
Beider Formulierung von NK374186A, B, B&sub3; oder C&sub3; können üblicherweise im Stand der Technik verwendete pharmakologische Hilfsstoffe wie beispielsweise Träger und andere Hilfsstoffe wie Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Weichmacher oder Emulgatoren verwendet werden, falls notwendig, solange die Effekte von NK374186 dadurch nicht verschlechtert werden.
Der Gehalt an NK374186A, B, B&sub3; oder C&sub3; in einem pharmazeutischen Präparat kann in Abhängigkeit von beispielsweise dem Formulierungszustand in weiten Grenzen variiert werden. Im allgemeinen umfaßt ein Präparat von 0,01 bis 100 Gew.-%, bevorzugt von 0,1 bis 70 Gew.-% an NK374186A, B, B&sub3; oder C&sub3;, und den Rest andere Komponenten wie Träger und andere Hilfsstoffe, die üblicherweise in Medikamenten verwendet werden.
Die Dosis von NK374186A, B, B&sub3; oder C&sub3; kann in Abhängigkeit von beispiel&weise dem Zustand eines Patienten variieren. Sie kann im allgemeinen einem Erwachsenen in einer Dosis von etwa 0,01 bis 800 mg pro. Tag gegeben werden. Wenn die Verbindung wiederholt gegeben werden soll, ist es wünschenswert, die täglich Dosis auf einem niedrigeren Spiegel zu kontrollieren.

Wirkung:

1. Antibakterielle Aktivität

Die antibakterielle und antifungische Aktivität jedes Antibiotikums werden als minimale Hemmkonzentration (MIC) angegeben, bestimmt durch die Agar-Verdünnungs-Methode. Im Test auf antibakterielle Aktivität wird jeder Test-Mikrorganismus in ein Müller/Hinton Medium angeimpft und darin bei 37ºC über Nacht kultiviert, um das Wachstum des Mikroorganismus zu beobachten. Beim Test auf antifungische Aktivität wird jeder Test- Mikroorganismus in ein Czapek-Medium angeimpft und darauf bei 27ºC während 2 bis 3 Tagen kultiviert, gefolgt von Beobachtung des Wachstums des Mikroorganismus. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 1: Antibakterielle Aktivität von NK374186 A, B, B&sub3; und C&sub3;
Wie die obige Tabelle 1 klar zeigt, weist NK374186A der vorliegenden Erfindung offensichtlich eine antibakterielle Aktivität gegen Micrococcus und Mycrobacterium auf. Andererseits zeigen NK347186B, B&sub3; und C&sub3; der vorliegenden Erfindung eine potente antibakterielle Aktivität auf Bacilli, Staphylococcus und Micrococcus.

2. Zellwachstumsunterdrückende Aktivität

Zellen werden in einem 10% fötales Kälberserum enthaltendem RPMI 1640-Medium bei 37ºC unter 5% CO&sub2; inkubiert. Dann werden diese Zellen in einer 96-Vertiefungs-Platte gesät und während eines Tages präinkubiert, gefolgt von Zugabe jeder Testverbindung. Die Behandlung mit der Testverbindung wurde während 2 Tagen durchgeführt, und die Aktivität hinsichtlich der Unterdrückung von Zellwachstum wurde durch dit MTT-Methode beurteilt. Tabelle 2 zeigt die Aktivitäten von NK374186 bei der Unterdrückung des Wachstums eines Krebszellenstamms Li-7, der aus Human-Leberkrebs gewonnen wurde, eines Zellstamms A2780, der aus Human- Ovarienkrebs gewonnen wurde und eines Adriamycin-resistenten Stamms 2790AD, der aus dem Stamm A2780 gewonnen wurde. Tabelle 2: Zellwachstumsunterdrückende Aktivität von NK374186A, B, B&sub3; und C&sub3;
Wie die obige Tabelle 2 klar zeigt, unterdrücken die Antibiotika NK374186A, NK374186B, NK374186B3 und NK374186C3 das Wachstum jeder Zellinie.

3. Immunmodulierende Aktivität von NK374186A und B bei der Lymphoblastenbildung

21 % fötales Kälberserum, 25 mM Hepes-Puffer, 100 µg/ml Streptomycin und 100 U/ml Pennicillin G enhaltendes RPMI 1640- Medium wird verwendet. Die Inkubation wird in einer 96- Vertiefungs-Flachboden-Mikroplatte durchgeführt (COSTAR). Als Mitogen werden jeweils Lipopolysaccharide (LPS) und Concanavalin A (Con A) bei Endkonzentrationen von jeweils 100 µg/ml und 5 µg/ml eingesetzt.
Die Milz einer BALB/C Maus (weiblich, Alter > 20 Wochen) wird entnommen, und eine Einzelzellensuspension wird hergestellt. Nach Entfernen der Erythrocyten durch Hyperschock wird die Suspension als solche für die Behandlung mit LPS eingesetzt. Für die Behandlung mit Con A wird die Suspension andererseits durch Nylonfaser (ein Produkt von Wako Pure Chemicals, Inc.) zur Abtrennung von T-Zellen geleitet. 2 x 10&sup5;/Vertiefung der Milzzellen und jede Testverbindung in der oben angegebenen Konzentration werden zugesetzt, so daß sich ein Gesamtvolumen von 0,2 milvertiefung ergibt, gefolgt von Inkubation während 72 Stunden. 8 Stunden vor der Vervollständigung der Inkubation wird 37 KBq/Vertiefung [³HJ-Thymidin zugegeben, und die Thymidinaufnahme in den Zellen gemessen. Der Effekt wird beurteilt bezogen auf das Verhältnis der [³H/]-Thymidin-Aufnahme einer Testgruppe verglichen mit einer Kontrollgruppe ["Meneki Jikken Sosa-ho (Procedures of Immunological Tests)", herausgegeben von Japan Assoc. of Immunol., Seiten 2267 - 2276). Die folgende Tabelle 3 zeigt die Effekte von NK374186 auf die Lymphoblasten-Bildung bei Mäusen. Tabelle 3: Wirkungen von NK374186A und B auf Lymphoblasten-Bildung bei Mäusen mit LPS und Con A
NK374186A und NK374186B fördern die Lymphoblastenbildung mit LPS und Con A bei einer niedrigeren Konzentration und unterdrücken andererseits sehr wirksam die Lymphoblastenbildung bei einer Konzentration von 10 µg/ml oder darüber.

4. Immunmodulierungs-Funktion von NK374186A und B in der Reaktion transplantierter Abschnitt/Wirt (GVH)

Dieser Test wird in Übereinstimmung mit der Muzwiegemethode von Ford et.a. [Ford, W.L., et.al., Handbook of Experimental Immunology 30 (herausgegeben von Weir, D.M.), Blackwell Scientific Publications, (1978), Seite 1] durchgeführt. 5 x 10&sup6; aus einer Donor-C57BL/6-Maus (männlich, 8 Wochen alt) erhaltene Milzzellen werden in die Peritonealhöhle einer BDF-Maus (männlich, Alter 7 Wochen) transplantiert, die der F1-Hybrid- Rezeptor ist. Gleichzeitig werden NK374186 und ein Kontrollwirkstoff in einem Lösungsmittel gelöst (0,25% Gummiarabikum) und subkutan in den Rücken der Rezeptormaus injiziert. Als Kontrolle wird das Lösungsmittel allein ebenfalls subkutan in den Rücken der Maus injiziert. Dieselbe Verabreichung wird am nächsten Tag und am folgenden Tag durchgeführt. Am 7. Tag nach der Transplantation wird die Milz des Tiers gewogen. Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 4: Wirkung von NK374186 auf Reaktion transplantierter Abschnitt/Wirt
Wie die obige Tabelle 4 klar zeigt, erhöht sich das Milz/Gesamtkörpergewicht-Verhältnis der NK374186A- oder NK374186B-Testgruppe in Abhängigkeit von der Dosis, und die GVH-Reaktion wird signifikant verstärkt. Daraus wird gefolgert, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen Immunpotenzierungs-effekte aufweisen

5. Wirkung von NK374186 bei Förderung der Regeneration von Mäuse leber.

In Übereinstimmung mit der Methode von Higgins und Anderson [Higgins, G.M., et al., Arch. Pathol, 12, 186 - 202 (1931)] werden der rechte Diaphragmalappen und der linke Diaphragmalappen einer ICR-Maus (männlich, Alter 6 Wochen) unter Äthernarkose entnommen, wodurch eine 70 %ige Leberexzision bewirkt wird. Beim Ausführen der Naht werden 100 mg/kg NK374186A und NK374186B intraperitoneal gegeben. Auf gleiche Weise wird eine Mischung (3,5% DMSO + 6,5% Tween 80 + 90% physiologische Kochsalzlösung) als Lösungsmittelkontrolle gegeben. 3 Tage nach der Operation wird die regenerierte Leber entnommen und gewogen. Basierend auf dem so erhaltenen Ergebnis wird das Leberregenerationsverhältnis entsprechend der folgenden Gleichung berechnet:
Leberregenerationsverhältnis (%) = A - [BxC] - D]/D x 100
wobei A das Gewicht der regenerierten Leber ist,
B das Körpergewicht vor der Exzision ist,
C das Verhältnis von Lebergewicht zu Körpergewicht ist, und das Gewicht der exzidierten Leber ist. Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 5: Wirkung von NK384186A auf die Leberregeneration
Die obigen Ergebnisse zeigen klar, daß NK374186A bei der Förderung der Leberregeneration wirksam ist.

6. Toxizität

100 mg/kg NK374186A und NK374186B werden CDF-1-Mäusen (männlich, Alter 8 Wochen) wiederholt einmal täglich während 10 Tagen intraperitoneal gegeben. Jede Testverbindung wird in Form einer Lösung in 3,5% DSMO + 6,6% Tween + 90% physiologischer Kochsalzlösung gegeben. Als Ergebnis verursacht keine dieser Verbindungen den Tod von Mäusen. Der klinische Zustand der Mäuse der Testgruppen zeigt keinen Unterschied zu denen der Lösungsmittelkontrollgruppe. Diese Ergebnisse zeigen, daß NK374186A und NK374186B jeweils eine niedrige Toxizität aufweisen.
Wie die oben genannten Ergebnisse klar zeigen, kann erwartet werden, daß die Verbindungen NK374186A, NK374186B, NK374186B3 und NK374186C3 entsprechend der vorliegenden Erfindung als neues antibakterielles Mittel, als neues Antineoplastikum, neuer Immunomodulator und neues Heilmittel für hepatische Erkrankungen einsetzbar sind.
Um die vorliegende Erfindung weiter zu illustrieren, werden die folgenden Beispiele gegeben. Es versteht sich jedoch, daß die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist, sondern daß verschiedene Veränderungen durchgeführt werden können.

Beispiel 1

(1) Fermentation

100 ml eines Impfkulturmediums der folgenden Zusammensetzung wurde in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben pipettiert und in einem Autoklaven bei 120ºC während 20 Minuten sterilisiert. Als nächstes wurde eine Platinschlaufe NK374186 Stamm (FERM P-12285) (FERM-BP3870) darin angeimpft und bei 27 ºC bei 200 Upm während 2 Tagen kultiviert, um dadurch das primäre Impfmaterial zu erzeugen.
In der sekundären Impfkultur werden 20 Liter desselben Mediums wie das bei der primären Impfkultur verwendete in einen 30-Liter Gefäßfermenter gegeben und sterilisiert. Als nächstes wurden 200 ml der oben erhaltenen Primärimpfkultur steril hinein transplantiert und bei 25 ºC bei 250 Upm kultiviert, wobei während 3 Tagen 20 l/min Luft zugeführt wurden zur Herstellung der sekundären Impfkultur.
In der Hauptkultur wurden 150 l eines Produktionsmediums mit derselben Zusammensetzung wie der des Impfkulturmediums mit der Ausnahme, daß die Glycerol-Konzentration auf 1,0 % erhöht wurde, in einen 200-Liter Gefäßfermenter gegeben und sterilisiert. Als nächstes wurden 2 l des oben erhaltenen sekundären Impfmaterials steril hinein transplantiert und bei 25ºC bei 250 Upm kultiviert, wobei während 4 Tagen 150/min Luft zugeführt wurden. Aus 4 Gefäßfermentern erhaltene Kulturmedien wurden unter Verwendung einer Filterpresse filtiert, um dadurch die Zellen vom Filtrat abzutrennen. (2) Reinigung 200 l Methanol wurden zu den so erhaltenen Zellen gegeben, und die Extraktion wurde unter Rühren während 3 Stunden durchgeführt. Dann wurden die Zellen durch Futration unter reduziertem Druck vom Extrakt abgetrennt. Der so erhaltene Extrakt wurde mit derselben Menge Wasser gemischt. Die Mischung wurde dann durch eine 10-Liter-HP-20-Säule gegeben. Nach Waschen mit 50%igem Methanol wurde die Säule mit 20 l 60%igem Aceton eluiert, wobei eine Fraktion 1 erhalten wurde. Als nächstes wurde sie mit 30l 100%igem Methanol eluiert, wobei eine Fraktion 2 erhalten wurde.
Die Fraktion 1 wurde unter reduziertem Druck auf 4 1 konzentriert, und der pH-Wert wurde auf 5,0 eingestellt, gefolgt von Extraktion mit Ethylacetat. Der Extrakt wurde unter reduziertem Druck zur Trockne konzentriert. 41 g des so erhaltenen Trockenprodukts wurden in Ethylacetat gelöst und Kieselgelsäulenchromatographie unterworfen. Nach schrittweisem Eluieren mit Ethylacetat, einer Chlorform/Methanol-Mischung (50 : 1) und einer Chloroform/Methanol-Mischung (10 : 1) wurde eine aktive Fraktion 1a erhalten.
Diese aktive Fraktion 1a wurde erneut Kieselgelsäulenchromatographie unterworfen und mit einer Ethylacetat-Methanol-Mischung (10 : 1) eluiert, wordurch eine aktive Fraktion 1b erhalten wurde. Diese aktive Fraktion 1b wurde LH-20-Säulen-chromatographie unter Verwendung von Methanol als Eluens unterworfen. So wurden 800 mg NK374186A erhalten.
Andererseits wurde die Fraktion 2 unter reduziertem Druck konzentriert und ergab 28 g eines trockenen Produkts. Dieses Produkt wurde dann in Chloroform gelöst und Kieselgelsäulenchromatographie unterworfen. Nach schrittweisem Eluieren mit Chloroform, einer Chloroform/Methanol-Mischung (100 : 1) und einer Chloroform/Methalnol-Mischung (20 : 1) wurden aktive Fraktionen 2a, 2b und 2c erhalten. Die aktiven Fraktionen 2a und Zb wurden LH-20 Säulenchromatographie unter Verwendung von Methanol als Eluens unterworfen und ergaben jeweils 2,0 g NK374186B und 1,0 g NK374186B3. Die aktive Fraktion 2c wurde Kieselgelsäulenchromatographie unterworfen. Nach schrittweisem Eluieren mit einer Chloroform/Methanol-Mischung (100 1) und einer Chloroform/Methanol-Mischung (20 : 1) wurde die erhaltene aktive Fraktion LH-20 Säulen-chromatographie unterworfen, wobei 430 mg NK374186C3 erhalten wurden.

Claims

1. Neue Antibiotika (a) NK374186A, (b) NK374186B, (c) NK374186B3 und (d) NK374186C3 oder deren Salze mit den folgenden physikochemischen Eigenschaften:

(a) Antibiotikum NK374186A

1) Aussehen: farbloses Pulver,

2) Molekulargewicht: FD-MS m/z (M + 735).

3) Verhältnisformel: C&sub3;&sub4;K&sub6;&sub1;N&sub3;O&sub1;&sub2;S,

4) Löslichkeit: löslich in niedrigen Alkoholen, Chloroform und und Ethylacetat,

5) Rf-Wert in Kieselgel-Dünnschichtchromatographie (Art. 5715, Produkt von Merck): 0,12 unter Verwendung einer Chlorform/Methanol-Mischung (20 : 1) als Entwickler,

6) UV-Absorptionsspektrum: Siehe Fig. 1,

7) IR-Absorptionsspektrum: Siehe Fig. 2 (bestimmt unter Verwendung einer Kaliumbromidtablette),

8) Protonen-NMR-Spektrum: Siehe Fig. 3 (bestimmt in schwerem DMSO),

9) Kohlenstoff-NMR-Spektrum: Siehe Fig. 4 (bestimmt in schwerem DMSO), und

10) Farbreaktion: positiv in Phosphomolybdänsäure/Schwefelsäure-Reaktion und Tolidin-Chlor-Reaktion und negative in Ninhydrin-Reaktion;

(b) Antibiotikum NK374186B

1) Aussehen: farbloses Pulver,

2) Molekulargewicht: FD-MS m/z (M + 655),

3) Verhältnisformel: C&sub3;&sub4;H&sub6;&sub1;N&sub3;O&sub9;,

4) Löslichkeit: löslich in niedrigen Alkoholen, Chloroform und Ethylacetat,

5) Rf-Wert in Kieselgel-Dünnschichtchromatographie (Art. 5715, Produkt von Merck): 0,35 unter Verwendung eines Chloroform/Methanaol-Gemisches (20 : 1) als Entwickler,

6) UV-Absorptionsspektrum: Siehe Fig. 5,

7) IR-Absorptionsspektrum: Siehe Fig. 5 (bestimmt unter Verwendung einer Kaliumbromidtablette),

8) Protonen-NMR-Spektrum: Siehe Fig. 7 (bestimmt in schwerem DMSO),

9) Kohlenstoff-NMR-Spektrum: Siehe Fig. 8 (bestimmt in schwerem DMSO), und

10) Farbreaktion: positiv in Phosphormolybdänsäure/Schwefelsäure-Reaktion und Tolidin-Chlor-Reaktion und negativ in Ninhydrin-Reaktion;

(c) Antibiotikum NK374186B3

1) Aussehen: farbloses Pulver,

2) Molekulargewicht: FD-MS m/z (M + 655),

3) Verhältnisformel: C&sub3;&sub4;H&sub6;&sub1;N&sub3;O&sub9;,

4) Löslichkeit: löslich in niedrigen Alkoholen, Chloroform und Ethylacetat,

5) Rf-Wert in Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: 0,49 unter Verwendung eines Chloroform/Methanol-Gemisches (20 : 1) als Entwickler,

6) UV-Absorptions-Spektrum: Siehe Fig. 9,

7) IR-Absorptions-Spektrum: Siehe Fig. 10 (bestimmt unter Verwendung einer Kaliumbromidtablette),

8) Protonen-NMR-Spektrum: Siehe Fig. 11 (bestimmt in schwerem DMSO),

9) Kohlenstoff-NMR-Spektrum: Siehe Fig. 12 (bestimmt in schweren DMSO), und

10) Farbreaktion: positiv in Phosphomolybdänsäure/Schwefelsäure-Reaktion und Tolidin-Chlor-Reaktion und negativ in Ninhydrin-Reaktion; und

(d) Antibiotikum NK374186C3

1) Aussehen: farbloses Pulver

2) Molekurlargewicht: FD-MS m/z (M + 597),

3) Verhältnisformel: C&sub3;&sub4;H&sub5;&sub9;N&sub3;O&sub7;,

4) Löslichkeit: löslich in niedrigen Alkoholen, Chloroform und Ethylacetat,

5) Rf-Wert in Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: 0,33 unter Verwendung einer Chloroform/Methanol-Mischung (20 : 1) als Entwickler,

6) UV-Absorptionsspektrum: Siehe Fig. 13,

7) IR-Absorptionsspektrum: Siehe Fig. 14,

8) Protonen-NMR-Spektrum : Siehe Fig. 15 (bestimmt in schwerem DMSO),

9) Kohlenstoff-NMR-Spektrum: Siehe Fig. 16 (bestimmt in schwerem DMSO), und

10) Farbreaktion: positiv in Phosphormolybdänsäure/Schwefelsäure-Reaktion und Tolidin-Chlor-Reaktion und negative in Ninhydrin-Reaktion.

2. Verfahren zur Herstellung der Antibiotika NK374186A, NK374186B, NK374186B3 und NK374186C3 und deren Salzen, welches Kultivieren eines Penicillium sp. NK374186-Stamms (FERM BP3870), der die Antibiotika NK374186A, N.K374186B, NK374186B3 und NK374186C3 produzieren kann und zur Gattung Penicillium gehört, in einem angereicherten Medium zur Bildung dieser Antibiotika und Isolieren der so akkumulierten Antibiotika aus dem Kulturmedium umfaßt.

3. Pharmakologische Zusammensetzung, die mindestens ein Antibiotikum umfaßt, ausgewählt aus der aus den Antibiotika NK374186A, NK374186B, NK374186B3 und NK374186C3 bestehenden Gruppe, gemeinsam mit pharmakologischen Additiven.

4. Pharmakologische Zusammensetzung wie in Anspruch 3 beansprucht, die ein antibakterielles Mittel, ein Antineoplastikum, ein Immunmodulator oder ein Leberregenerationspromotor ist.

5. Verwendung des Antibiotikums NK374186A oder des Antibiotikums NK344186B oder eines Salzes davon für die Herstellung eines immunpotenzierenden Medikaments für warmblütige Tiere einschließlich Menschen.

6. Verwendung des Antibiotikums NK347186A oder eines Salzes davon für die Herstellung eines Medikaments zur Förderung des Wachstums von hepatischen Zellen eines warmblütigen Tiers einschließlich Menschen mit geschädigter Leber.

7. Penicillium sp. NK374186-Stamm (FERM-BP3870) und dessen Mutanten.