DE69526452T2

DE69526452T2 - Indolditerpen alkaloide

Info

Publication number: DE69526452T2
Application number: DE69526452T
Authority: DE
Inventors: L. Garcia; A. Giacobbe; D. Hensens; H. Lee; B. Mcmanus; L. Zink
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1994-01-24
Filing date: 1995-01-20
Publication date: 2002-11-14
Anticipated expiration: 2015-01-21
Also published as: JPH09508271A; DK0804186T3; EP0804186A4; ES2173177T3; DE69526452D1; PT804186E; ATE216233T1; JP3689108B2; AU1605895A; WO1995019771A1; AU689207B2; EP0804186A1; CA2181371A1; US5541208A; EP0804186B1

Description

Diese Erfindung betrifft neue Indolditerpenalkaloide, die Kaliumkanalantagonisten sind, und Verfahren zur Herstellung dieser Antagonisten und zur Behandlung der Erkrankungen oder Störungen, die mit der Funktionsstörung von zellulären Kaliumkanälen zusammenhängen. Die Erfindung betrifft auch chemische Zwischenprodukte, die sich bei der Synthese von Kaliumkanalantagonisten eignen.
Die vorliegende Erfindung betrifft im wesentlichen gereinigte neue Indolditerpenalkaloide, die aus der Fermentationsbrühe von Nalanthamala sp. gewonnen werden. Sie betrifft ferner synthetische Derivate der gereinigten isolierten Alkaloide, die Kaliumkanalantagonisten sind.
Der Stand der Technik offenbart, daß ein Diterpenalkaloid der Formel:
das als Paxillin bekannt ist, von einer Reihe von Mikroorganismen erzeugt wird. Paxillin und die verwandten Verbindungen Paspalitrem und Aflatrem sind Pilzmetaboliten, von denen bekannt ist, daß sie Tremorgene sind.
Kaliumkanalantagonisten eignen sich für eine Reihe von physiologischen Störungen bei Säugetieren, einschließlich Menschen. Ionenkanäle, einschließlich Kaliumkanäle, finden sich in allen Säugetierzellen und sind bei der Modulierung verschiedener physiologischer Verfahren und normaler zellulärer Homeostase beteiligt. Kaliumionen steuern allgemein das Ruhemembranpotential, und der Abfluß von Kaliumionen verursacht eine Umpolarisierung der Plasmamembran nach der Zelldepolarisation. Kaliumkanalantagonisten verhindern die Umpolarisation und ermöglichen es der Zelle, im depolarisierten angeregten Zustand zu bleiben.
Es gibt eine Reihe verschiedener Kaliumkanal-Unterarten. Physiologisch gesehen ist eine der wichtigsten Kaliumkanal-Unterarten der Maxi-K- Kanal, welcher im Nervengewebe und in der glatten Muskulatur vorhanden ist. Die intrazelluläre Calciumkonzentration (Ca²&spplus;i) und das Membranpotential öffnen und schließen diese Kanäle. Zum Beispiel werden Maxi-K-Kanäle geöffnet, um den Abfluß von Kaliumionen durch eine Erhöhung der intrazellulären Ca²&spplus;-Konzentration oder durch Membrandipolarisierung (Potentialänderung) zu ermöglichen. Die Anhebung der intrazellulären Calciumkonzentration ist für eine Neurotransmitterfreisetzung notwendig. Die Modulation der Maxi-K-Kanal-Aktivität beeinflußt daher die Transmitterfreisetzung vom Nervenende durch Steuerung des Membranpotentials, welches wiederum den Zufluß von extrazellulärem Ca²&spplus; durch Calciumkanäle, die durch Spannung geöffnet und geschlossen werden, beeinflußt. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind daher zur Behandlung von neurologischen Störungen, bei denen die Neurotransmitterfreisetzung beeinträchtigt ist, geeignet.
Eine Reihe von Arzneistoffen auf dem Markt wirken als Kaliumkanalantagonisten. Die wichtigsten davon sind u. a. die Verbindungen Glyburid, Glipizid und Tolbutamid. Diese Kaliumkanalantagonisten eignen sich als Antidiabetika. Kaliumkanalantagonisten werden auch als Klasse-3-Antiarrhythmika und zur Behandlung von akuten Infarkten bei Menschen verwendet. Es ist bekannt, daß eine Reihe von natürlich vorkommenden Toxinen, einschließlich Apamin, Iberiatoxin, Charybdotoxin, Noxiustoxin, Kaliotoxin, Dendrotoxin(e), mastzellendegranulierendes (MCD) Peptid und β- Bungarotoxin (β-BTX), Kaliumkanäle blockieren.
Depression steht in Zusammenhang mit einer Verringerung der Neurotransmitterfreisetzung. Die derzeitigen Behandlungen von Depression umfassen Neurotransmitteraufnahmeblocker und Inhibitoren von Enzymen, die beim Neurotransmitterabbau beteiligt sind, welche eine Verlängerung der Neurotransmitterlebensdauer bewirken.
Alzheimer-Krankheit ist ebenfalls durch eine verringerte Neurotransmitterfreisetzung gekennzeichnet. Alzheimer-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung des Hirns, die zu stark beeinträchtigter Kognition und Funktionalität führt. Diese Erkrankung führt zu einer progressiven Regression des Gedächtnisses und der erlernten Funktionen. Alzheimer- Krankheit ist eine komplexe Erkrankung, die cholinerge Neuronen sowie serotonerge, noradrenerge und andere zentrale Neurotransmittersysteme betrifft. Die Manifestionen von Alzheimer-Krankheit reichen über den Gedächtnisverlust hinaus und umfassen Persönlichkeitsänderungen, neuromuskuläre Änderungen, Anfälle und gelegentlich psychotische Merkmale.
Alzheimer-Krankheit ist die häufigste Form von Demenz in den Vereinigten Staaten. Manche Schätzungen gehen davon aus, daß bis zu 47% der über 85 jährigen Alzheimer-Krankheit haben. Da das Durchschnittsalter der Bevölkerung sich im steigen befindet, nimmt die Häufigkeit von Alzheimer-Krankheit zu und erfordert dringend Aufmerksamkeit. Alzheimer ist ein schwieriges medizinisches Problem, da derzeit keine adäquaten Verfahren für dessen Prävention oder Behandlung zur Verfügung stehen.
Drei Arzneistoffklassen werden zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit untersucht. Die erste Klasse besteht aus Verbindungen, die die Acetylcholin-Neurotransmitterfunktion erhöhen. Derzeit werden cholinerge Potentiatoren, wie z. B. die Anticholinesterase-Arzneistoffe, zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit verwendet. Insbesondere Physostigmin (Eserin), ein Acetylcholinesterase-Inhibitor, ist für deren Behandlung verwendet worden. Die Verabreichung von Physostigmin hat den Nachteil, daß sie durch dessen kurze Wirkungs-Halbwertszeit, schlechte orale Bioverfügbarkeit und schwere dosislimitierende Nebenwirkungen, insbesondere hinsichtlich des Verdauungssystems, stark eingeschränkt ist. Tacrin (Tetrahydroaminocridin) ist ein weiterer Cholinesterase-Inhibitor, der verwendet worden ist; diese Verbindung kann jedoch Hepatotoxizität hervorrufen.
Eine zweite Klasse von Arzneistoffen, welche zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit untersucht werden, ist die der Nootropika, welche sich auf den Neuronen-Metabolismus mit wenig Wirkungen anderswo auswirken. Diese Arzneistoffe verbessern die Nervenzellenfunktion durch Steigerung der metabolischen Aktivität der Neuronen. Piracetam ist ein Nootrop, das für die Kombination mit Acetylcholin-Vorläufern geeignet sein kann und für Alzheimer-Patienten nützlich sein kann, die eine gewisse Menge an funktioneller Acetylcholinfreisetzung in Neuronen beibehalten. Oxiracetam ist ein weiterer verwandter Arzneistoff, der zur Alzheimer-Behandlung untersucht worden ist.
Eine dritte Arzneistoffklasse bilden die Arzneistoffe, die sich auf das Hirngefäßsystem auswirken. Eine Mischung aus Ergoloidmesylaten wird für die Behandlung von Demenz verwendet. Ergoloidmesylate verringern den Gefäßwiderstand und erhöhen dadurch den zerebralen Blutfluß. Ebenso verwendet werden calciumkanalblockierende Arzneistoffe, einschließlich Nimodipin, welches ein selektiver Calciumkanalblocker ist, der sich hauptsächlich auf das Hirngefäßsystem auswirkt.
Verschiedene andere Arzneistoffe werden anvisiert, um andere Defekte, die bei Alzheimer-Krankheit gefunden werden, zu modifizieren. Es wurde berichtet, daß Selegilin, ein Monoaminoxidase-B-Inhibitor, welcher Dopamin und Norepinephrin im Gehirn erhöht, zu einer leichten Verbesserung bei manchen Alzheimer-Patienten führte. Aluminiumchelatoren sind für diejenigen von Interesse, die glauben, daß Alzheimer-Krankheit aufgrund einer Aluminiumtoxizität entsteht. Arzneistoffe, die sich auf das Verhalten auswirken, einschließlich Neuroleptika, und Anxiolytika sind verwendet worden. Die Nebenwirkungen von Neuroleptika reichen von Somnolenz und anticholinergen Wirkungen bis zu extrapyramidalen Nebenwirkungen; andere Nebenwirkungen dieser Arzneistoffe sind u. a. Anfälle, unangemessene Sekretion von antidiuretischem Hormon, Gelbsucht, Gewichtszunahme und verstärkte Verwirrung. Anxiolytika, welche milde Beruhigungsmittel sind, sind weniger wirksam als Neuroleptika, haben jedoch auch geringfügigere Nebenwirkungen. Die Verwendung dieser verhaltensbeeinflussenden Arzneistoffe bleibt jedoch kontrovers. Die vorliegende Erfindung betrifft neue Indolditerpenalkaloide, die als Kaliumkanalantagonisten geeignet sind. Es wird angenommen, daß bestimmte Erkrankungen, wie z. B. Depression, Gedächtnisstörungen und Alzheimer-Krankheit, die Folge einer Störung der Neurotransmitterfreisetzung sind. Die Kaliumkanalantagonisten der vorliegenden Erfindung können daher als Zellanregungsmittel verwendet werden, welche eine unspezifische Freisetzung von Neurotransmittern, wie z. B. Acetylcholin, Serotonin und Dopamin, stimulieren sollten. Eine verstärkte Neurotransmitterfreisetzung sollte die mit Depression und Alzheimer- Krankheit verbundenen Symptome umkehren.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, ausgewählt aus:
die als Kaliumkanalantagonisten, insbesondere Maxi-K-Kanal-Antagonisten, geeignet sind und sich daher zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit und anderen kognitiven Störungen eignen. Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der oben gezeigten Verbindungen A bis G.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Diterpenalkaloide, die Kaliumkanalantagonisten sind und sich daher zur Prävention und Behandlung von Störungen eignen, welche mit funktionsgestörten Kaliumkanälen in Säugetierorganismen, einschließlich Menschen, in Verbindung stehen. Insbesondere betrifft die Erfindung Maxi-K-Kanal-Antagonisten. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner mikrobiologische Verfahren zur Herstellung der neuen Diterpenalkaloide durch Verwendung der Kultur Nalanthalama sp. (MF 5785). Diese Kultur ist bei der American Type Culture Collection, die sich in 12301 Parklawn Drive in Rockville, MD 20852, befindet, gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags als ATCC 74192 hinterlegt worden. Die Erfindung betrifft ferner die synthetische Herstellung von Kaliumkanalantagonisten, wobei ein neues Verfahren verwendet wird, um neue Isoxazoline zu erzeugen, und die synthetische Derivatisierung von Pilzisolaten, um synthetische Alkylester zu erzeugen.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, ausgewählt aus:
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können Asymmetriezenten besitzen und als Racemate, racemische Mischungen und als einzelne Enantiomere oder Diastereomere vorkommen, wobei alle isomeren Formen und Mischungen davon vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfaßt sind.
Ebenfalls vom Umfang dieser Erfindung umfaßt sind pharmazeutisch annehmbare Salze oder Ester, wenn eine basische oder saure Gruppe in einer der oben gezeigten Verbindungen A bis 6 vorhanden ist. Wenn ein saurer Substituent vorhanden ist, z. B. -COOH, kann das Ammonium-, Natrium-, Calciumsalz und dergleichen gebildet werden, um als die Dosisform verwendet zu werden. Wenn die -COOH-Gruppe vorhanden ist, können auch pharmazeutisch annehmbare Ester, z. B. Acetat, Maleat, Pivaloyloxymethyl und dergleichen, und diejenigen Ester, die im Stand der Technik zur Modifizierung der Löslichkeits- und Hydrolyseeigenschaften bekannt sind, zur Verwendung als Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder Prodrug- Formulierungen eingesetzt werden.
Wenn eine basische Gruppe vorhanden ist, wie z. B. Amino, können saure Salze, wie z. B. Hydrochlorid, Hydrobromid, Acetat, Pamoat und dergleichen, als die Dosisform verwendet werden.
Die Verbindungen A, B, C, D und G und die verwandten Verbindungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung weisen eine Kaliumkanalantagonistenwirkung auf und eignen sich daher bei Störungen, die mit einer Kaliumkanalfunktionsstörung verbunden sind. Eine Reihe von kognitiven Störungen, wie z. B. Alzheimer-Krankheit, Gedächtnisverlust oder Depression können von der verstärkten Freisetzung von Neurotransmittern, wie z. B. Serotonin, Dopamin oder Acetylcholin und dergleichen, profitieren. Die Blockierung der Maxi-K-Kanäle erhält die Zelldepolarisation und verstärkt daher die Sekretion dieser lebenswichtigen Neurotransmitter.
Die beanspruchten Verbindungen sind als Kaliumkanalantagonisten wirksam oder bei der Herstellung von Kaliumkanalantagonisten geeignet. Elemente der Isoxazolinklasse werden durch ein neues Verfahren hergestellt, bei dem das Ausgangsmaterial Paxillin ist. Paxillin kann mit Hydroxylamin in einem geeigneten Lösungsmittel unter geeigneten Bedingungen umgesetzt werden, um das Oxim zu bilden, welches weiter mit Tributylphosphin und Diphenyldisulfid umgesetzt wird, um ein Isoxazolin, wie z. B. Paxizolin, zu erzeugen. Das nachstehende Schema zeigt die notwendige Funktionalität und beschreibt das allgemeine Verfahren:
Wie oben gezeigt, betrifft das beanspruchte Verfahren allgemein die anfängliche Bildung eines Oxims, das anschließend mit Tributylphosphin und Diphenyldisulfid reagiert, um den Isoxazolin-Heterocyclus zu bilden.
Die Freie-Säure-Gruppe an der Verbindung D, die durch das mikrobiologische Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt wird, kann auch leicht zum Alkylesterderivat modifiziert werden, um wirksame Kaliumkanalantagonisten zu erzeugen. Zum Beispiel wird Trimethylsilyldiazomethan, das zu einer methanolischen Lösung hinzugegeben wird, die einen Freie-Säure- Rest enthält, leicht in die Methylesterverbindung E umgewandelt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fermentationsverfahren zur Herstellung von Kaliumkanalantagonisten, umfassend:
(a) die Beimpfung eines Impfmediums (Tabelle 1) mit Myzelien von Nalanthalama sp. MF5785 (ATCC 74192),
(b) die Inkubation der beimpften Myzelien bei Raumtemperatur (20- 30ºC) unter feuchten Bedingungen bei fortwährendem Fluoreszenzlicht, vorzugsweise unter Schütteln, besonders bevorzugt auf einer Umlaufschüttelmaschine mit einem 5-cm-Ausschlag bei 220 U/Minute,
(c) die Verwendung der in Schritt (b) erzeugten Kultur zur Beimpfung eines flüssigen Produktionsmediums und die weitere Inkubation unter den in Schritt (b) definierten Bedingungen, um die Verbindungen A, B, C, D und G zu erzeugen.
Die maximale Anreicherung der Verbindungen A, B, C, D und G in der Fermentationsbrühe tritt zwischen dem 7. und dem 11. Tag auf. Die Erfindung umfaßt ferner einen Schritt (d), bei dem die in der Fermentationsbrühe erzeugten Verbindungen unter geeigneten definierten und kontrollierten Bedingungen gereinigt und aus der Brühe isoliert werden. Geeignete Isolierverfahren sind u. a. zum Beispiel die Extraktion des Kulturmediums mit einem alkoholischen oder sauerstoffhaltigen Lösungsmittel, wie z. B. einem Ether oder Keton, vorzugsweise Methylethylketon.
Der Stamm MF 5785 ist als ein Nalanthaloma identifiziert worden. Der Pilz wurde aus nichtidentifizierten Zweigen isoliert, die in der Provinz von Nuevo Leon, Mexiko, gesammelt wurden. Die generische Disposition basiert auf undifferenzierten, unverzweigten, solitären, entereoblastischen, phialidischen, konidiogenen Zellen, die zu Konidien führen, welche klein, subglobos, hyalin und glatt sind. Bei der Gattung Acremonium konnte dieses Isolat der Reihe Terricola zugeordnet werden, da die Konidien an die konidogenen Zellen in trockenen Ketten haften. Das Isolat gleicht jedoch keiner der Taxa in dieser Reihe, die von Gams in seiner Monographie über die Gattung Acremonium angegeben sind (W. Grams. 1971. Cephalosporium-artige Schimmelpilze (Hyphomycetes). Dieser Organismus wächst gut und bildet in den meisten mykologischen Medien reichlich Sporen. In der Agar-Kultur zeigte der Stamm die folgenden morphologischen Merkmale:
Die Kolonien wachsen mittelgut auf Hafermehlagar (Difco Laboratories) bei 25ºC und einer 12-Stunden-Photoperiode, nach 21 Tagen erreichen sie einen Durchmesser von 34-36 mm, sie sind leicht erhöht, samtartig, feinflaumig, in der Mitte werden sie kleinkörnig, matt, trocken, mit leicht zoniertem Rand, glatt und submers, am Rand weiß, wobei sie mattweinrot bis grauweinrot, blaßweinrotrehbraun (Pale Vinaceous-Fawn), weinrotlederfarben (Vinaceous-Buff), hellweinrotrehbraun (Light Vinaceous- Fawn) bis weinrotrehbraun (Vinaceous-Fawn) werden (die großgeschriebenen Farbbezeichnungen stammen aus Ridgway, R. 1912. Color Standards and Nomenclature, Washington, D. C). Gerüche und Exsudate fehlen.
Die Kolonien wachsen mittelschnell auf Amerson-YpSs-Agar (Difco Laboratories) bei 25ºC und einer 12-Stunden-Photoperiode, nach 21 Tagen erreichen sie einen Durchmesser von 30 mm, sie sind flachgedrückt bis leicht erhöht, schwach kreisförmig gefurcht, schwach zoniert, samtartig, mit winzigen Tropfen wäßrigem Exsudat zur Mitte hin, trocken, matt, mit submersem Rand, klein befranst bis wellenförmig, transluzent, weiß bis blaßweinrot, blaßweinrotrehbraun (Pale Vinaceous-Fawn), hellweinrotrehbraun (Light Vinaceous-Fawn), transluzent bis blaßgelb in der entgegengesetzten Richtung. Gerüche und Exsudate fehlen.
Die Kolonien wachsen mittelschnell auf Barnett-Oak-Wilt-Agar (Barnett, H. L. 1953. Isolation and identification of the oak wilt fungus. West Virginia Agricultural Experiment Station Bulletin 359T: 1-15) bei 25ºC und einer 12-Stunden-Photoperiode, nach 21 Tagen erreichen sie einen Durchmesser von 25 mm, sie sind flachgedrückt, pruinös bis flaumig, zur Mitte hin mehlig, mit kreisförmigigen unregelmäßigigen gewundenen Furchen, schwach zoniert, mit glattem Rand und submers, weiß bis blaßweinrot, mit blaßweinrotgrauen mehligen Körnern. Die körnige Struktur wird von der Aggregation der Konidiophoren zu kleinen Pusteln und den Ansammlungen von trockenen Konidien verursacht. Gerüche und Exsudate fehlen.
Auf Emerson-YpSs-Agar fand nach 21 Tagen kein Wachstum statt.
Die Konidiophoren sind mikronematös, gelegentlich halbmikronematös, ganzheitlich, bis zu 30 um groß, üblicherweise jedoch 6-12 um groß, verzweigt oder nicht, septiert oder nicht, oft nur eine einfache rechtwinklige Verzweigung von der Hyphen-Hauptachse, üblicherweise mit einem einzigen endständigen konidiogenen Locus, gelegentlich jedoch sind die konidiogenen Loci lateral oder interkalar. Die konidiogenen Zellen sind endständig oder interkalar, erscheinen enteroblastisch und phialidisch, gelegentlich an der Basis aufgeschwollen. Die Konidien sind hyalin, dünnwandig, breit ellipsenförmig oder oboval, mit einer leicht abgeflachten Basis, 2-5 · 15,2,2 um, sie sammeln sich in trockenen Ketten an, wobei manchmal schwache Verbindungsstellen erkennbar sind.
Die Hyphen sind septiert, verzweigt, in reifen Bereichen der Kolonien fein verkrustet.
Im allgemeinen können die Verbindungen A, B, C, D und G durch Kultivieren (Fermentieren) des Stamms MF5785, ATCC 74192, in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, vorzugsweise unter submersen aeroben Bedingungen und Schütteln der Kultur unter Dauerfluoreszenzlicht, vorzugsweise 450 bis 700 nm, bis eine beträchtliche Menge der Verbindungen A, B, C, D und G in der Fermentationsbrühe nachgewiesen wird, hergestellt werden. Die Kultur wird in einem wäßrigen Medium bei einer Temperatur zwischen 20ºC und 37ºC, vorzugsweise 25ºC, für einen Zeitraum, der für eine vollständige Bildung der Verbindungen A, B, C, D und G notwendig ist, üblicherweise für einen Zeitraum zwischen 3 bis 28 Tagen, vorzugsweise zwischen 7 bis 11 Tagen, vorzugsweise auf einem Schüttelmittel, besonders bevorzugt auf einer Umlaufschüttelmaschine mit 220 U/Minute und einem 5-cm-Ausschlag, inkubiert. Das wäßrige Produktionsmedium wird bei der Initiierung und der Beendigung (Ernte) des Fermentationsverfahrens bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8, vorzugsweise bei etwa 6,0, gehalten. Der erwünschte pH-Wert kann durch die Verwendung eines Puffers, wie z. B. [2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure]monohydrat (MES), 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS), Phosphatpuffer oder irgendein anderer, im pH-Bereich von 5 bis 8 wirksamer Puffer, oder durch Auswahl der Nährmaterialien, die inhärente Puffereigenschaften besitzen, wie z. B. die hier nachstehend beschriebenen Produktionsmedien, aufrechterhalten werden. Die Wirkverbindung wird aus dem Myzelwuchs der Kultur mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. einem alkoholischen oder sauerstoffhaltigen Lösungsmittel, wie z. B. einem Ester oder Keton, extrahiert. Das bevorzugte Lösungsmittel für die Extraktion ist Methylethylketon (MEK). Die Lösung, die die erwünschte Verbindung enthält, wird eingeengt und dann der chromatographischen Trennung unterworfen, um die Verbindungen A, B, C, D und G aus dem Kulturmedium zu isolieren.
Die bevorzugten Kohlenstoffquellen in dem Nährmedium sind u. a. Saccharose, Glucose, Fructose, Mannit, Glycerin, Xylose, Galactose, Lactose, Sorbit, Stärke, Dextrin, andere Zucker und Zuckeralkohole, Stärken und andere Kohlenhydrate oder Kohlenhydratderivate und dergleichen. Andere Quellen, die enthalten sein können, sind Maltose, Rhamnose, Raffinose, Arabinose, Mannose, Salicin, Natriumsuccinat, Acetat und dergleichen sowie komplexe Nährstoffe, wie z. B. gelbes Maismehl, Hafermehl, Hirse, Reis, Bruchmais und dergleichen. Die exakte Menge der Kohlenstoffquelle, die in dem Medium verwendet wird, wird zum Teil von den anderen Bestandteilen in dem Medium abhängen, üblicherweise wird jedoch gefunden, daß eine Kohlenhydratmenge zwischen 0,5 und 15 Gew.-% des Mediums ausreichend ist. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden, oder mehrere solcher Kohlenstoffquellen können in demselben Medium kombiniert werden.
Die bevorzugten Stickstoffquellen sind Hefeextrakt, gelbes Maismehl, Fleischextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsamenmehl, Sojabohnenmehl und andere Gemüsemehle (teilweise oder vollständig entfettet), Kaseinhydrolysate, Sojabohnenhydrolysate und Hefehydrolysate, Maisquellwasser, Trockenhefe, Weizenkeim, Federmehl, Erdnußpulver, lösliche Schlempeanteile usw. sowie anorganische und organische Stickstoffverbindungen, wie z. B. Ammoniumsalze (z. B. Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat usw.), Harnstoff, Aminosäuren, wie z. B. Methionin, Phenylalanin, Serin, Alanin, Prolin, Glycin, Arginin oder Threonin und dergleichen. Die verschiedenen Stickstoffquellen können alleine oder in Kombination in Mengen, die von 0,2 bis 10 Gew.-% des Mediums reichen, verwendet werden.
Obwohl sie vorteilhafterweise in Kombination verwendet werden, müssen die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen nicht in ihrer reinen Form verwendet werden, da sich weniger reine Materialen, die Spuren von Wachstumsfaktoren und beträchtliche Mengen an Mineralnährstoffen enthalten, ebenfalls für die Verwendung eignen. Wenn erwünscht, können zu dem Medium anorganische Salze, Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Carbonat- und ähnliche Ionen, die in das Kulturmedium als Natrium- oder Calciumcarbonat, Natrium- oder Kaliumphosphat, Natrium- oder Kaliumchlorid, Natrium- oder Kaliumiodid, Magnesiumsalze, Kupfersalze, Kobaltsalze und dergleichen eingebracht werden können, zugegeben werden. Ebenfalls enthalten sind Spurenmetalle, wie z. B. Kobalt, Mangan, Eisen, Molybdän, Zink, Cadmium, Kupfer und dergleichen. Die verschiedenen Quellen an anorganischen Salzen können alleine oder in Kombination in Mengen, die von 0,1 bis 1,0 reichen, verwendet werden, und die Spurenelemente reichen von 0,001 bis 0,1 Gew.-% des Mediums.
Falls notwendig, insbesondere wenn das Kulturmedium stark schäumt, kann ein Schaumverhinderungsmittel, wie z. B. Polypropylenglycol 2000 (PPG- 2000), Flüssigparaffin, Fettöl, Pflanzenöl, Mineralöl oder Silikon, zugegeben werden.
Submerse aerobe Fermentationsbedingungen sind in den Fermentoren zur Herstellung der Verbindungen A, B, C, D und G in großen Mengen bevorzugt. Für die Herstellung kleiner Mengen wird eine Schüttel- oder Oberflächenkultur in einem Kolben oder einer Flasche verwendet. Darüber hinaus ist es, wenn die Kultivierung in großen Tanks durchgeführt wird, bevorzugt, die vegetative Form des Organismus zum Animpfen in den Produktionstanks zu verwenden, um eine Wachstumsverzögerung während des Produktionsverfahrens der Verbindungen A, B, C, D, und G zu vermeiden. Demgemäß ist es wünschenswert, zuerst durch Animpfen einer relativ kleinen Menge des Kulturmediums mit Sporen oder Myzelien des in einem "Schrägröhrchen" erzeugten Organismus oder aus zuvor hergestellten gefrorenen Myzelien und Kultivieren des angeimpften Mediums, das auch das "Animpfmedium" genannt wird, ein vegetatives Inokulum des Organismus herzustellen und anschließend das kultivierte vegetative Inokulum in große Tanks zu überführen. Das Animpfmedium, in dem das Inokulum erzeugt wird, ist in Tabelle 1 zu sehen und wird im allgemeinen im Autoklaven behandelt, um das Medium vor der Inokulation zu sterilisieren. Vor dem Autoklavenschritt wird das Animpfmedium im allgemeinen durch geeignete Zugabe einer Säure oder Base, vorzugsweise in der Form einer verdünnten Lösung von Salzsäure oder Natriumhydroxid, auf einen pH-Wert zwischen 5 und 8, vorzugsweise etwa 6,8, eingestellt. Die gewachsene Kultur in diesem Animpfmedium wird zwischen 26ºC und 37ºC, vorzugsweise bei 25ºC, gehalten. Die Inkubation der Kultur MF5785 (ATCC 74192) in einem Impfmedium, vorzugsweise das in Tabelle 1, wird üblicherweise über einen Zeitraum von etwa 2 bis 6 Tage, vorzugsweise 3 bis 4 Tage, unter Rühren, vorzugsweise auf einer Umlaufschüttelmaschine mit 220 U/Minute und einem 5-cm-Ausschlag, durchgeführt; die Länge der Inkubationszeit kann gemäß den Fermentationsbedingungen und -maßstäben variiert werden. Falls angemessen, kann eine zweite Animpffermentationsstufe in dem Animpfmedium (Tabelle 1) für eine höhere Produktion der Myzelmasse durchgeführt werden, indem frisches Animpfmedium mit einem Teil der gewachsenen Kultur angeimpft und dann unter ähnlichen Bedingungen, jedoch eine kürzere Zeit lang, inkubiert wird. Das resultierende Gewachsene kann dann verwendet werden, um ein Produktionsmedium, vorzugsweise das flüssige Produktionsmedium (Tabelle 2), anzuimpfen. Das flüssige Fermentationsproduktionsmedium, das mit der gewachsenen Animpfkultur angeimpft ist, wird 3 bis 28 Tage lang, üblicherweise 7 bis 11 Tage lang, unter Rühren inkubiert. Das Rühren und die Belüftung der Kultur können auf verschiedene Weisen erreicht werden. Das Rühren kann von einem Propeller oder einer ähnlichen mechanischen Rühreinrichtung, durch Drehen oder Schütteln der Fermentationsmischung innerhalb des Fermentors, durch verschiedene Pumpeinrichtungen oder durch Hindurchleiten von steriler Luft durch das Medium erreicht werden. Die Belüftung kann durch Hindurchleiten von steriler Luft durch die Fermentationsmischung bewirkt werden.
Bevorzugte Animpf- und Produktionsmedien zur Durchführung der Fermentation sind u. a. die folgenden Medien: Tabelle 1 Animpfmedium

Tabelle 2

Flüssiges Produktionsmedium

Komponente pro Liter

Gelbes Maismehl 50,0 g
Hefeextrakt 1,0 g
Saccharose 80,0 g
Destilliertes Wasser 1000,0 ml
Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung angegeben und sollen nicht als den Umfang der Erfindung einschränkend aufgefaßt werden.

BEISPIEL 1

Herstellung der Verbindungen A, B, C, D und G

Schritt A: Fermentationsbedingungen für die Herstellung der Verbindungen A-D und G

Die Fermentationsbedingungen für die Herstellung der Verbindungen A, B, C, D und G durch den Mikroorganismus Nalanthamala sp. waren wie folgt: Vegetative Myzelien einer Kultur des obigen Mikroorganismus wurden durch Animpfen von 54 ml Animpfmedium (Tabelle 1) in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben ohne Schikanen mit gefrorenen Myzelien von MF5785 (ATCC 74192) hergestellt. Die Animpfkolben wurden bei 25ºC und 50% relativer Luftfeuchtigkeit auf einer Umlaufschüttelmaschine mit einem 5-cm-Ausschlag bei 220 U/Minute in einem Raum mit Dauerfluoreszenzlicht, etwa 400 bis 750 nm, inkubiert. Zwei-ml-Portionen der resultierenden 3-Tage-Kultur wurden verwendet, um 50-ml-Portionen von flüssigem Produktionsmedium (Tabelle 2) in 250 ml Erlenmeyerkolben ohne Schikanen anzuimpfen; diese Kulturen wurden bei 25ºC, 220 U/Minute bei 50% relativer Luftfeuchtigkeit in einem Raum mit Dauerfluoreszenzlicht inkubiert. Die Produkte tauchten bei der Fermentation bereits nach 7 Tagen auf, wobei eine maximale Anreicherung am 11. Tag beobachtet wurde. Bei der Ernte wurden die Verbindungen wie nachstehend beschrieben extrahiert.

Schritt B: Isolierung der Verbindungen A, B, C, D und G

Die oben hergestellte Fermentationsbrühe von MF5785 (ATCC 74192) (3 1 WBE, IC&sub5;&sub0; = 10 ul WBE pro ml in [¹²&sup5;I]ChTX-Bindungsassay (in Beispiel 6 beschrieben)) wurde mit Methylethylketon extrahiert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der trockene Rückstand wurde anschließend zwischen CH&sub2;Cl&sub2; und H&sub2;O aufgetrennt, um 4,5 g in der organischen Phase zu ergeben. Die wäßrige Phase wurde mit Methanol behandelt, anschließend wurde das Wasser entfernt, um 1,6 g zu ergeben. Die organischen Phasen wurden der Flashchromatographie auf SiO&sub2; unter Verwendung von CH&sub2;Cl&sub2;-CH&sub3;OH unterworfen, wobei zwei Fraktionen erhalten wurden, I (2,36 g) und II (1,97 g). Der Umkehrphasen-Flashchromatographie auf BAKERBOND C&sub1;&sub8; unter Verwendung von Methanol-Wasser bei jeder Fraktion schloß sich die HPLC auf PARTISIL 10 ODS-3 (22 · 50, Fließrate 10 ml pro Minute) an.
Die Fraktion I ergab bei der Reinigung durch HPLC (70% CH&sub3;CN-H&sub2;O) folgende mehrere Verbindungen in verschiedenen Mengen:
Verbindung A (C&sub3;&sub2;H&sub4;&sub3;NO&sub3;, MG 489,3243 (berechn.), 489,3226 (gefunden)) mit der chemischen Formel:
Verbindung B (C&sub3;&sub7;H&sub5;&sub1;NO&sub5;, MG 589,3767 (berechn.), 589,3749 (gefunden)) mit der chemischen Formel:
Verbindung C (C&sub3;&sub7;H&sub4;&sub7;NO&sub5;, MG 585,3506 (berechn.), 585,3454 (gefunden) mit der chemischen Formel: Verbindung C
Die Fraktion II ergab bei der HPLC (50% CH&sub3;OH-H&sub2;O) Hydroxypaspalinsäure (Verbindung D) und Verbindung G:
Verbindung D (29,2 mg; C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub7;NO&sub5;; MG 467,2672 (berechn.), 467,2641 (gefunden)) mit der chemischen Formel:
Verbindung G (C&sub3;&sub7;H&sub4;&sub9;NO&sub6;; MG 603,3559 (berechn.)) Verbindung G

¹³C-NMR-Daten

Die ¹³C-NMR-Spektren wurden in CD&sub2;Cl&sub2; und CD&sub3;OD bei 125 MHz an einem Varian-Unity-500-NMR-Spektrometer bei 25ºC aufgezeichnet. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm relativ zu Tetramethylsilan (TMS) bei null ppm unter Verwendung des Lösungsmittelpeaks bei 53,8 (CD&sub2;Cl&sub2;) und bei 49,0 (CD&sub3;OD) ppm als interner Standard angegeben.
Verbindung A (CD&sub2;C1&sub2;): 16,0, 17,9, 18,0, 18,7, 19,2, 21,0, 23,7, 25,77, 25,81, 27,5, 27,7, 28,1, 30,8, 34,8, 42,7, 50,4, 51,0, 58,4, 64,9, 67,5, 69,1, 71,8, 75,3, 78,2, 79,5, 111,1, 117,6, 118,4, 120,8, 121,2, 123,7, 124,6, 132,0, 134,6, 137,4, 140,6, 151,8 ppm. Die Kohlenstoffzahl von 37 stimmt mit der durch HR-EIMS hergeleiteten Molekülformel C&sub3;&sub7;H&sub5;&sub1;NO&sub5; überein.
Verbindung B (CD&sub2;Cl&sub2;) 14,6, 16,6, 18,0, 21,3, 22,4, 23,3, 24,5, 25,8, 26,6, 27,5, 29,7, 32,9, 39,8, 41,3, 50,0, 50,7, 56,2, 59,1, 61,8, 73,89, 73,97, 76,0, 111,7, 118,5, 118,6, 119,8, 120,7, 122,9, 125,4, 135,1, 140,3, 150,5 ppm. Die Kohlenstoffzahl von 32 stimmt mit der durch HR-EIMS hergeleiteten Molekülformel C&sub3;&sub2;H&sub4;&sub3;NO&sub3; überein.
Verbindung C (CD&sub2;Cl&sub2;): 16,2, 16,8, 18,0, 18,7, 20,1, 20,8, 25,6, 25,8, 28,1, 29,4, 30,8 (2x), 32,3, 44,1, 50,4, 50,7, 60,7, 65,2, 71,4, 73,9, 75,0, 76,6, 93,2, 106,3, 109,5, 117,2, 119,3, 121,2, 122,2, 124,2, 124,9, 132,1, 133,4, 139,8, 140,2, 144,9, 151,3 ppm. Die Kohlenstoffzahl von 37 stimmt mit der durch HR-EIMS hergeleiteten Molekülformel C&sub3;&sub7;H&sub4;&sub7;NO&sub5; überein.
Verbindung D (CD&sub3;OD): 14,8, 16,9, 24,7, 25,4, 26,1, 26,2, 26,3, 28,3, 32,3, 33,9, 40,8, 41,5, 50,3, 53,5, 53,7, 68,3, 72,6, 77,6, 79,7, 112,6, 118,0, 118,7, 119,7, 120,7, 126,2, 142,1, 152,1, 178,1 ppm. Die Kohlenstoffzahl von 28 stimmt mit der durch HREI-MS hergeleiteten Molekülformel C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub7;NO&sub5; überein.
Verbindung G (CD&sub2;Cl&sub2;): 16,0, 16,8, 18,7, 18,9, 19,1, 20,9, 25,0, 25,6, 27,7, 28,35, 28,44, 29,4, 30,7, 33,1, 42,7, 50,6, 50,7, 58,8, 61,5, 64,6, 68,2, 71,4, 71,7, 72,0, 74,9, 78,5, 93,9, 110,2, 117,0, 119,7, 121,1, 122,6, 125,1, 129,6, 139,3, 140,0, 151,9 ppm. Die NMR-Daten zeigen eine Kohlenstoffzahl von 37 und eine Molekülformel C&sub3;&sub1;H&sub4;&sub7;NO&sub6;.

¹H-NMR-Daten

Die ¹H-NMR-Spektren wurden in CD&sub2;Cl&sub2; bei 500 MHz an einem Varian- XL300 an einem Unity-500-NMR-Spektrometer bei 25ºC und für Verbindung D in CD&sub3;OD bei 300 MHz an einem Varian-XL300-Spektrometer bei Umgebungstemperatur aufgezeichnet. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm relativ zu TMS bei null ppm unter Verwendung des Lösungsmittelpeaks bei δ 5,32 (CD&sub2;Cl&sub2;) und bei 3,30 (CD&sub3;OD) als interner Standard angegeben. Nur die diagnostischen Peaks sind angegeben.
Verbindung A (CD&sub2;Cl&sub2;): δ 1,11 (3H, s), 1,22 (3H, s), 1,25 (3H, s), 1,28 (3H, s), 1,66 (3H, br. s), 1,73 (3H, br. s), 1,74 (6H, br. s), 1,91 (1H, m), 2,03 (1H, m), 2,26 (1H, m), 2,36 (1H, dd, J = 11, 13 Hz), 2,66 (1H, dd, J = 6,5, 13 Hz), 2,79 (1H, m), 3,34 (1H, d, J = 9 Hz), 3,38 (2H, m), 3,56 (1H, br. s), 3,96 (3H, m), 4,17 (1H, t, J = 8,5 Hz), 5,26 (1H, m), 5,35 (1H, m), 6,86 (1H, dd, J = 1,5, 8 Hz), 7,09 (1H, br. s), 7,17 (1H, d, J = 8 Hz), 7,74 (1H, br. s, NH).
Verbindung B (CD&sub2;Cl&sub2;): δ 1,02 (3H, s), 1,08 (3H, s), 1,11 (3H, s), 1,14 (3H, s), 1,64 (3H, br. s), 1,72 (3H, br. s), 1,86 (1H, m), 1,94 (1H, m), 2,09 (1H, m), 2,25 (1H, m), 2,37 (1H, dd, J = 10,5, 13,5 Hz), 2,68 (1H, dd, J = 6,5, 13,5 Hz), 2,79 (1H, m), 3,42 (1H, br. d, J = 3 Hz), 3,66 (1H, dd, J = 2,5, 11 Hz), 3,88 (1H, m), 3,96 (1H, m), 5,25 (1H, m), 5,35 (1H, m), 7,02 (1H, dt, J = 1,5, 7 Hz), 7,05 (1H, dt, J = 1,5, 7), 7,30 (1H, m), 7,39 (1H, m), 7,88 (1H, br. s, NH).
Verbindung C (CD&sub2;Cl&sub2;): δ 1,17 (3H, s), 1,30 (3H, s), 1,31 (3H, s), 1,32 (3H, s), 1,71 (3H, d, J = 1,5 Hz), 1,74 (6H, d, J ~ 1 Hz), 1,76 (3H, d, J ~ 1 Hz), 1,67 (1H, m), 1,88 (1H, dd, J = 7,16 Hz), 1,95 (1H, m), 2,57 (1H, dd, J = 10,5, 13,0 Hz), 2,77 (1H, m), 2,84 (1H, dd, J = 6,5, 13,0 Hz), 3,18 (1H, br. d, J ~ 16 Hz), 3,58 (1H, br. d, J = 7 Hz), 3,86 (1H, s), 3,96 (1H, d, J = 10 Hz), 4,00 (1H, d, J = 10 Hz), 5,21 (1H, m), 5,35 (1H, m), 5,39 (1H, dd, J = 2,7 Hz), 5,47 (1H, d, J = 6,5 Hz), 6,81 (1H, dd, J = 1,7 Hz), 6,96 (1H, dd, J = 7,8 Hz), 7,14 (1H, dd, J = 1,8 Hz), 7,83 (1H, br. s, NH).
Verbindung D (CD&sub3;OD bei 300 MHz): δ 1,01 (3H, s), 1,09 (3H, s), 1,12 (3H, s), 1,20 (3H, s), 2,21 (1H, dd, J = 4,12 Hz), 2,29 (1H, dd, J = 10,5, 13,0 Hz), 2,61 (1H, dd, J = 6,5, 13,0 Hz), ~2,73 (1H, m), 3,64 (1H, dd, J = 3, 11 Hz), 3,67 (1H, dd, J = 4,5, 12 Hz), 4,37 (1H, t, J = ~3 Hz), 6,92 (2H, m), 7,27 (2H, m).
Verbindung G (CD&sub2;Cl&sub2;): δ 1,15 (3H, s), 1,24 (3H, s), 1,27 (3H, s), 1,28 (3H, s), 1,31 (3H, s), 1,40 (3H, s), 1,71 (3H, d, J = 1 Hz), 1,74 (3H, d, J = 1 Hz), 1,81 (1H, m), 1,93 (1H, m), 2,27 (1H, m), 2,59 (1H, dd, J = 13, 15 Hz), 2,69 (1H, dt, J = 5, 13,5 Hz), 2,84 (2H, m), 3,14 (2H, m), 3,16 (1H, m), 3,49 (1H, d, J = 9,5 Hz), 3,59 (1H, s), 3,91 (1H, dd, J = 1, 9,5 Hz), 4,32 (1H, br. t, J ~ 9 Hz), 5, 20 (1H, m), 5,50 (1H, d, J = 6,5 Hz), 6,87 (1H, dd, J = 1, 7,5 Hz), 7,00 (1H, dd, J = 7,5, 8 Hz), 7,19 (1H, dd, J = 1, 8 Hz), 7,93 (1H, br. s, NH).
Abkürzungen: s = Singulett, d = Dublett, q = Quartett, br. = breit, m = Multiplett, J = ¹H-¹H-Kupplungskonstante in Hertz (+0,5 Hz).

BEISPIEL 2

Herstellung von Methylhydroxypaspalinat, Verbindung E

Zu einer methanolischen Lösung der Hydroxypaspalinsäure (Verbindung D, 7,8 mg, 0,016 mM) wurde (Trimethylsilyl)diazomethan ((CH&sub3;)&sub3;SiCHN&sub2;, 2M Lösung in Hexanen) im Überschuß zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur gerührt, bis die schwachgelbe Farbe verschwunden war. Das Lösungsmittel wurde anschließend unter Stickstoff entfernt, um den Methylester zu ergeben (DC 5% CH&sub3;OH-CH&sub2;Cl&sub2;, Rf 0,19 (Säure), 0,39 (Ester)). Er wurde durch HPLC auf PARTISIL 10 ODS-3 (22 · 50) unter Verwendung von 60% CH&sub3;CN-H&sub2;O (Fließrate 10 ml pro Minute) gereinigt, um Methylhydroxypaspalinat (Verbindung E; MG 481) zu ergeben. Es wurde bei 149,6 Minuten eluiert und hat die folgende Formel:
Das ¹³C-NMR-Spektrum wurde in CD&sub3;OD bei 75 MHz an einem Varian-XL300- NMR-Spektrometer bei Umgebungstemperatur aufgezeichnet. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm relativ zu Tetramethylsilan (TMS) bei null ppm unter Verwendung des Lösungsmittelpeaks bei 49,0 (CD&sub3;OD) ppm als interner Standard angegeben. 14,8, 16,6, 24,6, 25,4, 25,9, 26,0, 26,2, 28,3, 32,5, 33,7, 40,6, 41,6, 50,3, 51,5, 53,7, 53,8, 68,1, 72,6, 77,1, 79,4, 112,6, 118,0, 118,7, 119,7, 120,7, 126,2, 142,1, 151,9, 176,2 ppm. Die Kohlenstoffzahl von 29 und die chemischen Verschiebungen stimmen mit der Zuweisung als der Methylester von Verbindung D überein.
Das ¹H-NMR-Spektrum wurde bei 300-MHz in CD&sub3;OD an einem Varian- XL300-Spektrometer bei Umgebungstemperatur aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm relativ zu TMS bei null ppm unter Verwendung des Lösungsmittelpeaks bei δ 3,30 (CD&sub3;OD) als interner Standard angegeben. Nur die diagnostischen Peaks sind angegeben. δ 0,96 (3H, s), 1,00 (3H, s), 1,12 (3H, s), 1,16 (3H, s), 1,42 (1H, ddd, J = 2,5, 12, 14 Hz), 1,91 (2H, m), 2,22 (1H, m), 2,28 (1H, dd, J = 10,5, 13,0 Hz), ~2,59 (1H, m), 2,60 (1H, dd, J = 6,5, 13,0 Hz), ~2,69 (1H, m), 3,62 (1H, dd, J = 2, 12 Hz), 3,65 (3H, s), 3,68 (1H, dd, J = 4,0, 12 Hz), 4,35 (1H, t, J = ~3 Hz), 6,92 (2H, m), 7,26 (2H, m).

BEISPIEL 3

Synthese von Paxizolin, Verbindung F

Kristallines NH&sub2;OH·HCl (32 mg, 0,45 mM) wurde zu einer Lösung von Paxillin (20 mg, 0,045 mM) in C&sub2;H&sub5;OH (2 ml) zugegeben. Die Mischung wurde mit Stickstoff gespült und gerührt, bis die Reaktion, die durch DC (SiO&sub2;, 10% CH&sub3;OH-CH&sub2;Cl&sub2;; Rf 0,67 (Keton) und 0,56 (Oxim)) überwacht wurde, beendet war. Das Lösungsmittel wurde entfernt, dann wurde der Rückstand unter Verwendung von Ether in einen Scheidetrichter überführt. Die organische Schicht wurde der Reihe nach mit Wasser (3 · 1 ml), gesättigtem wäßrigem NaCl (1 · 1 ml) gewaschen, dann mit wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet und durch einen Sinterglastrichter filtriert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Die rohe Mischung wurde durch DC (SiO&sub2; 60 F-254, 5% CH&sub3;OH-CH&sub2;Cl&sub2;) gereinigt, um Paxillinoxim zu ergeben (18,6 mg; C&sub2;&sub7;H&sub3;&sub4;O&sub4;N&sub2;, MG 450,2518 (berechn.), 450,2517 (gefunden)).
Zu einer Mischung aus Paxillinoxim (10 mg, 0,022 mM) und Diphenyldisulfid (4,85 mg, 0,022 mM) in trockenem Tetrahydrofuran (2 ml) wurde Tributylphosphin (9 mg, 0,044 mM) zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht unter Stickstoff gerührt, anschließend wurde das Lösungsmittel entfernt. Das Rohprodukt wurde durch HPLC auf PARTISIL 10 ODS-3 (9,4 · 50) unter Verwendung von 70% CH&sub3;OH-H&sub2;O (Fließrate 3 ml pro Minute) gereinigt, um Verbindung F zu ergeben; 7,5 mg, C&sub2;&sub7;H&sub3;&sub2;N&sub2;O&sub3;, MG 432,2413 (berechn.), 432,2403 (gefunden), UV (CH&sub3;OH) λmax (nm) 234, 263, λmin 252).
¹³C-NMR (CD&sub2;Cl&sub2;) 75 MHz an einem Varian-XL300-NMR-Spektrometer bei Umgebungstemperatur. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm relativ zu Tetramethylsilan (TMS) bei null ppm unter Verwendung des Lösungsmittelpeaks bei 53,8 (CD&sub2;Cl&sub2;) ppm als interner Standard angegeben: 16,3, 19,9, 20,3, 21,3, 25,3, 27,4, 28,5, 28,8, 35,1, 43,3, 50,0, 51,1, 74,9, 78,3, 85,8, 86,2, 109,0, 111,7, 117,5, 118,6, 119,8, 120,7, 125,5, 140,1, 152,4, 154,6, 155,2 ppm. Die NMR-Daten zeigen eine Kohlenstoffzahl von 27, die mit der Molekülformel C&sub2;&sub7;H&sub3;&sub2;N&sub2;O&sub3; übereinstimmt.
Das ¹H-NMR-Spektrum wurde bei 300 MHz in CD&sub2;Cl&sub2; an einem Varian- XL300-Spektrometer bei Umgebungstemperatur aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm relativ zu TMS bei null ppm unter Verwendung des Lösungsmittelpeaks bei δ 5,32 (CD&sub2;Cl&sub2;) als interner Standard angegeben. Nur die diagnostischen Peaks sind angegeben.
δ 1,02 (3H, s), 1,20 (3H, s), 1,33 (3H, s), 1,53 (3H, s), 1,90 (1H, m), 2,24 (1H, m), 2,43 (1H, dd, J = 11, 13 Hz), 2,73 (1H, dd, J = 6,5, 13 Hz), ~2,74 (1H, m), 2,86 (1H, m), 4,54 (1H, s), 4,87 (1H, ddd, J = 2,5, 7, 10 Hz), 6,31 (1H, d, J = 2 Hz), 7,03 (2H, m), 7,30 (1H, m), 7,40 (1H, m), 7,86 (1H, br. s, NH).

BEISPIEL 4

Elektrophysiologische Versuche

Verfahren:

Patch-Clamp-Aufzeichnungen von Strömen, die durch calciumaktivierte Kalium(Maxi-K)-Kanäle mit großer Leitfähigkeit fließen, wurden bei Raumtemperatur unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren (Hamill et al., 1981, Pflügers Archiv. 391, 85-100) an Membranflecken, die von kultivierten Rinderaorta-Glattmuskelzellkulturen exzidiert wurden, durchgeführt. Glaskapillarröhrchen (Garner #7052) wurden in zwei Stufen gezogen, um Mikropipetten mit Spitzendurchmessern von etwa 1-2 Mikrometer zu erhalten. Die Pipetten wurden typischerweise mit Lösungen gefüllt, die enthielten (mM): 150 KCl, 10 Hepes (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure), 1 Mg, 0,01 Ca, und die mit 3,7 mM KOH auf pH 7,20 eingestellt wurden. Nach der Bildung einer Dichtung mit hohem Widerstand (> 10&sup9; Ohm) zwischen der sarkolemmalen Membran und der Pipette wurde die Pipette aus der Zelle herausgezogen, wobei ein exzidierter Inside-Out-Membranfleck gebildet wurde. Der Membranfleck wurde in eine Badlösung exzidiert, die enthielt (mM): 150 KCl, 10 Hepes, 5 EGTA (Ethylenglycolbis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure), ausreichend Ca, um eine freie Ca- Konzentration von 1-5 uM zu ergeben, und der pH-Wert wurde mit 10,5 KOH auf 7,2 eingestellt. Zum Beispiel wurden 4,568 mM Ca zugegeben, um eine freie Konzentration von 2 uM bei 22ºC zu ergeben. Ein AXOPATCH 1C-Verstärker (Axon Instruments, Foster City, CA.) mit einer CV-4-Headstage wurde verwendet, um die Spannung zu steuern und die Ströme zu messen, die durch den Membranfleck fließen. Der Headstage-Eingang wurde mit einem Ag/AgCl-Draht mit der Pipettenlösung verbunden, und die Verstärker-Erdung wurde mit einem Ag/AgCl-Draht, der mit einem Rohr, das mit in 0,2M KCl gelöstem Agar gefüllt war, bedeckt war, mit der Badlösung verbunden. Die Maxi-K-Kanäle wurde durch ihre große Einkanalleitfähigkeit (~250 pS) und der Empfindlichkeit der Kanalöffnungswahrscheinlichkeit auf das Membranpotential und die intrazelluläre Calciumkonzentration identifiziert.
Die Daten wurden auf einem RACAL STORE 4DS FM-Bandaufzeichnungsgerät (Racal Recorders, Vienna, Va.) oder auf digitalem Videoband unter Verwendung eines Videokassettenrekorders nach der Digitalisierung des Signals mit einem VR-10-Videokodierer (Instrutech Corp., Belmont, N. Y.) gespeichert. Das Signal wurde auch auf Registrierpapier mit einem GOULD 2400S- Bandschreiber (Gould Inc., Cleveland OH) aufgezeichnet. Zur quantitativen Analyse wurden die Daten nach der Digitalisierung mit einem DT2782-8D1A- Analog-Digital-Umwandler (Data Translation Inc., Marlboro, Ma.) auf einen DEC 11-73 (Digital Equipment Corp., Maynard, Ma.) überspielt oder nach der Digitalisierung mit einem ITC-16-Interface (Instrutech Corp., Belmont, N. Y.) auf einen Mac IIx- oder Quadra 700-Computer überspielt.

Ergebnisse:

Die Auswirkungen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf die Maxi-K-Kanäle von Rinderaorta-Glattmuskeln wurden in exzidierten Inside- Out-Membranflecken untersucht. Die Zugabe von 10 nM Verbindung C zu dem Bad erzeugte eine schnelle und vollständige Blockierung der Maxi-K-Kanäle, die während eines kurzen (~10 Minuten) Auswaschens nicht umgekehrt wurde. 1 nM Verbindung B führte zu einer nahezu vollständigen Blockierung der Maxi-K-Kanäle, was einen Ki-Wert von weniger als 1 nM für die Kanalblockierung nahelegt. Verbindung D, Verbindung A und Verbindung E waren schwächere Maxi-K-Kanal-Blocker als Verbindung C. 10 nM Verbindung D führten zu einer Verringerung der Kanalöffnungswahrscheinlichkeit von weniger als 50%, und bei 1 uM wurde keine vollständige Blockierung beobachtet. 10 nM Verbindung A blockierten einen kleinen Teil der Kanalaktivität, 100 nM blockierten etwa die Hälfte der Kanalaktivität, und 1 uM blockierten nahezu die gesamte Kanalaktivität. 1 uM Verbindung E hatte keinen wesentlichen Einfluß auf die Kanalöffnungswahrscheinlichkeit, wohingegen 10 uM zu einer unvollständigen Blockierung der Kanalaktivität führte, die langsam innerhalb von 5-10 Minuten zunahm. Verbindung F führte bei 10 nM zu einer etwa 50%igen Abnahme der Kanalaktivität. Verbindung G blockierte bei 0,1 nM 82% der Kanäle, bei 1 nM blockierte sie 98,6%, und bei 10 nm führte sie zu einer Blockierung von > 99%. Die Daten sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt:

VERBINDUNG [50%ige KANALBLOCKIERUNG]

A 100 nm (etwa)
B < 1 nM
C < 10 nM
D 1 uM (etwa)
E > 10uM
F 10 nM (etwa)
G < 0,1 nM (etwa)

BEISPIEL 6

Biochemische Versuche

Verfahren:

Die Wechselwirkung von [¹²&sup5;I]ChTX mit Rinderaorta-Sarkolemmamembranvesikeln wurde unter beschriebenen (Vazquez et al., 1989, J. Biol. Chem. 264, 20902-20909) Bedingungen ermittelt. Kurz gesagt, Sarkolemmamembranvesikel wurden in 12 · 75-Polystyrolröhrchen mit ca. 25 pM [¹²&sup5;I]ChTX (2200 Ci/mmol) in Ab- oder Anwesenheit von Testverbindung in einem Medium, das aus 20 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1% Digitonin bestand, inkubiert. Die Nichtspezifische Bindung wurde in Gegenwart von 10 nM ChTX ermittelt. Die Inkubationen wurde bei Raumtemperatur durchgeführt, bis das Ligandenbindungsgleichgewicht nach ca. 90 Minuten erreicht ist. Am Ende der Inkubationszeit wurden Proben mit 4 ml eiskaltem 100 mM NaCl, 20 mM Hepes-Tris pH 7,4 verdünnt und durch GF/C- Glasfaserfilter filtriert, die zuvor in 0,5% Polyethylenimin getränkt worden waren. Die mit den Filtern verbundene Radioaktivität wurde in einem Gammazähler bestimmt. Die spezifischen Bindungsdaten in Gegenwart einer jeden Verbindung (der Unterschied zwischen vollständiger Bindung und nichtspezifischer Bindung) wurden relativ zu einer unbehandelten Kontrolle aufgenommen.

Ergebnisse:

Verbindung D (Hydroxypaspalinsäure) hatte keinerlei Auswirkung auf die Bindung in dem Konzentrationsbereich von 1 nM bis 100 uM. Verbindung E (Methylhydroxypaspalinat) wirkte sich zwischen 1 nM bis 100 uM nicht auf die [¹²&sup5;I]ChTX-Bindung aus. Verbindung A und Verbindung C inhibierten die Bindung um 2 bzw. 29%, wenn sie bei 10 uM getestet wurden.
Die Auswirkung von Verbindung F, Paxizolin, wurde durch Erhöhen der Konzentration der Verbindung in dem Assay von 1 nM auf 100 uM untersucht. Diese Verbindung erzeugte zwei gegensätzliche Wirkungen auf die Toxinbindung. Im Bereich von 50 nM bis 2 uM kam es zu einem kleinen Anstieg der Menge an Toxin, das an dessen Rezeptor gebunden war. Bei Konzentrationen von über 5 uM führte Verbindung F zu einer konzentrationsabhängigen Bindungsinhibierung. Es scheint, daß der maximale Inhibierungsgrad bei ca. 32% der Kontrolle abgesättigt ist.
Verbindung G inhibierte die Bindung bei 10 uM um 35%.
Die obigen Beispiele veranschaulichen die beanspruchte Erfindung, ohne sie einzuschränken. Jede der oben gezeigten gereinigten Verbindungen, die durch das mikrobiologische Herstellungsverfahren erzeugt wird, und die durch das neue Isoxazolinherstellungsverfahren synthetisch erzeugten Verbindungen sind Kaliumkanalantagonisten und somit bei den Störungen geeignet, bei denen es wünschenswert ist, die Zelle in einem depolarisierten Zustand zu halten, um eine maximale Neurotransmitterfreisetzung zu erreichen. Die bei der vorliegenden Erfindung erzeugten Verbindungen können leicht mit geeigneten und bekannten pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffen kombiniert werden, um Zusammensetzungen zu erzeugen, die an Säugetiere, einschließlich Menschen, verabreicht werden können, um eine wirksame Kaliumkanalblockierung zu erzielen.

Claims

1. Eine Verbindung, ausgewählt aus:

oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

2. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung gemäß Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

3. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Blockierung eines calciumaktivierten Kalium-Maxi-K-Kanals bei einem Säugetier, einschließlich eines Menschen, die eine Verbindung gemäß Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

4. Die Verwendung einer wie in Anspruch 1 beanspruchten Verbindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention der Umpolarisierung oder Hyperpolarisierung einer Säugetier-Zelle, wobei die Zelle einen Kaliumkanal enthält.

5. Die Verwendung einer wie in Anspruch 1 beanspruchten Verbindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Alzheimer-Erkrankung.

6. Die Verwendung einer wie in Anspruch 1 beanspruchten Verbindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Depression.

7. Die Verwendung einer wie in Anspruch 1 beanspruchten Verbindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von kognitiven Störungen.

8. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, umfassend:

(a) die Kultivierung des Pilzorganismus Nalanthamala sp. MF5785 (ATCC 74192), so daß der Pilzorganismus die Verbindung der Formel:

erzeugt,

(b) die Reinigung und Isolierung der in Schritt (a) erzeugten Verbindung bis zu einer im wesentlichen gereinigten Form, und

(c) gegebenenfalls die Umsetzung des im wesentlichen gereinigten Produkts von Schritt (b) mit einer geeigneten Schutzgruppe oder mit einer Alkylierungsgruppe, um Verbindungen gemäß Anspruch 1 zu erzeugen.

9. Das Fermentationsverfahren gemäß Anspruch 5 zur Herstellung von Kaliumkanalantagonisten, das zusätzlich umfaßt:

(d) die Beimpfung eines Impfmediums mit Myzelien aus der in Schritt (a) erhaltenen Kultur von Nalanthamala sp. (ATCC 74192) MF5785, der Organismus Nalanthamala sp.,

(e) die Inkubation der Impfkulturmyzelien bei Raumtemperatur (20- 37ºC) unter feuchten Bedingungen bei fortwährendem Fluoreszenzlicht unter Rühren,

(f) die Beimpfung eines flüssigen Produktionsmediums mit einem Teil der in Schritt (e) erhaltenen Impfkultur und die weitere Inkubation des beimpften flüssigen Produktionsmediums unter den in Schritt (e) definierten Bedingungen bei pH 5-83-28 Tage lang, gefolgt von der Isolierung und der Reinigung der Verbindungen mit einem Teil der Impfkultur.

10. Ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel:

umfassend die Schritte:

(a) Umsetzung von Paxillin mit Hydroxylamin in einem geeigneten Lösungsmittel unter geeigneten Bedingungen, um ein Oxim zu bilden,

(b) Umsetzung des in Schritt (a) erzeugten Oxims mit Tributylphosphin und Diphenyldisulfid, um das Isoxazolin zu erzeugen, und

(c) Reinigung und Isolierung des Produkts.