DE2825618A1 - Neue antibiotika, ihre herstellung und verwendung - Google Patents

Neue antibiotika, ihre herstellung und verwendung

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DE2825618A1 DE19782825618 DE2825618A DE2825618A1 DE 2825618 A1 DE2825618 A1 DE 2825618A1 DE 19782825618 DE19782825618 DE 19782825618 DE 2825618 A DE2825618 A DE 2825618A DE 2825618 A1 DE2825618 A1 DE 2825618A1
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die neuen Antibiotika S 53210/A-I, S 53210/A-II und S 53210/A-III sowie Verfahren zu ihrer Herstellung«
Erfindungsgemäss gelangt man zu den neuen Antibiotika S 53210/A-I und/oder S 53210/A-II und/oder S 53210/A-III, indem man einen S 53210/A-I und/oder S 53210/A-II und/oder S 53210/A-III produzierenden Stamm von Microellobosporia auf oder in einem Nährmedium züchtet und S 53210/A-I und/oder S 53210/A-II und/oder S 53210/A-III isoliert.
Der neue vorzugsweise verwendete Stamm, nachstehend S 53210/A bezeichnet, wurde aus Erde isoliert, die aus einem antiken, etwa 2000 Jahre alten, 1976 in Jama Coaque (Equador) gefundenen Tonkopf herausgekratzt
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•worden war. Eine Probe des Stammes S 53210/A wurde . am 7. Juni 1977 beim United States Department of -Agriculture, Peoria, HL1 USA deponiert und steht der Oeffentlichkeit unter der Kulturnummer KRRL 11,122 zur Verfügung.
Da der Stamm S 53210/A zuerst nur Substratmycel mit seitlichen Einzel- und Doppelsporen bildete, wurde seine Zugehörigkeit zur Gattung Micromonospora vermutet. Auf einigen Kulturmedien bildet der Stamm jedoch nach zweiwöchiger Inkubation Luftmycel und keulenförmige, 2 bis 7 pm lange Sporangien, die ihrerseits ein bis sieben, kugelige bis ellipsoidische, 1,0 - 2,7 pm grosse, unbev?egliche Sporen enthalten. Es scheint, dass die Sporen durch Septierung innerhalb kurzer, keulenförmiger Seiten2weige zu entstehen beginnen; die einzelnen Sporen vergrcssern sich unterschiedlich stark, reifen als kurze Kette im Sporangium und werden durch apikales Aufreissen der Sporangienhülle befreit. Lange, streptomycetenartige
20 Sporenketten wurden keine beobachtet.
Aufgrund der oben gegebenen Beschreibung stimmt der Stamm S 53210/A gut überein mit der von Cross T., Lechevalier M. & Lechevalier H., 1963. A new genus of Actinomycetales: Microellobosporia gen. nov. Journ.
Gen. Microbiology 31, 421 (1963) , errichteten Gattung MICROELLOBOSPORIA. Diese Gattung umfasst bisher nur vier Arten (vergl. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8 Edition, Seiten 843-845), wobei M. cinerea und M. violacea violette Farbtöne im vegetativen Mycel aufweisen und die Sporangien von
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M. grisea mit kristallinen Staehelchen überzogen sind. Der Stamm S 53210/A weist diese auffallenden Merkmale nicht auf. Die vierte bisher beschriebene Art, die keine Antibiotika produzieren, M. flavea, hat aufgrund der Beschreibung weisses Luftmycel und bildet strohgelbe Kolonien ohne lösliche Pigmente, so dass der Stamm S 53210/A mit weissem Luftmycel und beige bis braunen Kolonien ohne lösliche Pigmente jener letzten Art am Nächsten kommt. Zwischen M. flavea und dem
10 neuen Stamm S 53210/A bestehen aber bezüglich der
Kohlenstoffverwertung erhebliche Unterschiede, z.B. gab Stamm S 53210/A eine unsichere Verwertung von L-(+)Arabinose, D(+}Raffinose und D(+)Saccharose, während M. flavea dieselben Zucker gut verwertet hat.
15 Weiter hat der Stamm S 53210/A im Gegensatz zu
M. flavea D(+)Maltose sehr gut assimiliert. Damit kann der Stamm S 53210/A als neue Art der Gattung Microellobosporia aufgefasst und aufgrund des braunen, vegetativen Mycels Microellobosporia brunea, nov. Sp.
20 genannt werden.
Die Wachstumseigenschaften des Stammes S 53210/A auf normalen biologischen Medien und seine Kohlenstoffassimilation sind in den folgenden Tabellen aufgeführt:
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?3?5618
Medium Kultureigenschaften Luftmycel-Form
Malz-Hefe-
exträkt
Agar		 W. : gut, beige bis braun
Substratmycel auf
gerissen
Unt.: beige bis braun
LM. : weiss, nur an den
Kolonierändern, *
weiss
LP. : keine b		 tritt nach 16 Tagen
an den Kolonierän
dern auf, Rectus
flexibilis
Hafermehl
Agar		 W. : mittelmässig bis
gut, farblos
Unt.: beige bis braun
LM. : über ganze Kolonie
oberfläche, weiss
*Wba
LP. : keine		 tritt nach 17 Tager
auf
Rectus flexibilis,
einige Spira a und
keulenförmige
Sporangien
Stärke-Mine
ralsalz
Agar		 W. : schlecht, farblos
Unt.: farblos bis braun
LM. : spärlich, alabaster
weiss, * W13 ba
LP. : keine		 tritt nach 14 .Tagen
auf
Rectus flexibilis
und wenige Spira a
(ein bis drei
Windungen)
Glycerin-As-
paragin
Agar		 W. : mittelmässig, farb
los
Unt.: farblos bis creme
LM. : über ganze Kolonie
oberfläche, Austern-
weiss, * Wb
LP. : keine		 tritt nach 14 Tagen
auf
Rectus flexibilis,
einige Spira a und
keulenförmige
Sporangien
W. : β Wachstum
Unt.: = Unterseite'
LM. :"= Luftmycel
LP. : = Lösliche Pigmente
Referenz mit Bezug auf das "Color-wheels System" Bachus, & Tresner, 1957
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Physiologische Eigenschaften des Stammes S 53210/A
Nitrat-reduktion negativ
Stärke-hydrolyse schv/ach positiv
Celluloseabbau negativ
Tyros in-Reaktion negativ
Milch-koagulation negativ
Milch-peptonisierung negativ
Gelatineverflüssigung positiv
Melaninbildung negativ
Kohlenstof fverv/ertung des Stammes S 53210/A - Kohlens toffquellen
V/ach s turn L(+)Rhairjaose, D(-)Melibiose, D(+)Mannose, D(+)Maltose
+++ D(+)Glucose, D(+)Galactose, D(-)Arabinose, Glycerin,
++ Stärke, D(+)Xylose, D(-)Fructose, D(-)Mannit
D(+)Lactose, D(-)Ribose, D'(-)Sorbit, Dextrin
+ D(-)Salicin, meso-Inosit, L(-)Arabinose, D(+)Melizitose,
+ D(+)Raffinose, D(+)Saccharose
+++ = Wachstum und Verwertung gut
++ = H " mittelmässig
+ = M " schlecht
+ = " " unsicher
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ORJQfNAL INSPECTED
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• Die Züchtung des Stammes S 53210/A und Isolierung der Antibiotika erfolgt durch Anwendung an sich bekannter Methoden, wie z.B. in den nachstehenden Beispielen beschrieben.
Zu Beginn der Züchtung soll der pH-Wert des Fermentationsiuediums zwischen 6,5 und 7,8 liegen. Die zur Züchtung optimale Temperatur kann zwischen 25 und 35 ° C liegen. Die Belüftung der Züchtung kann in weiten Grenzwerten schwanken. Die maximale Ausbeute an Antibiotika S 53210/A-I und/oder S 53210/A-II und/oder S 53210/A-III wird nach A- bis 7-tägiger Züchtung erhalten.
Für die Herstellung der neuen Metabolite S 53210/A-I, S 53210/A-II und S 53210/A-III lassen sich auch Stämme verwenden, wie sie z.B. durch Selektion oder Mutation des Stammes S 53210/A unter Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgen-Strahlen, oder Anwendung anderer Massnahmen, z.B. durch Behandlung von Kulturen des Stammes S 53210/A mit geeigneten Chemikalien, z.B. N-Nitroso-N-methyl-guanidin, gewonnen werden können.
Sobald bei der Züchtung eine maximale Menge der Metabolite S 53210/A-I und/oder S 53210/A-II und/oder S 53210/A-III produziert worden ist, was z.B. durch die Aktivität gegen Staphylococcus aureus festgestellt werden kann, wird in bekannter Weise das Mycel aus der Kulturbrühe abgetrennt und das Mycel und das Kulturfiltrat extrahiert.
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Die neuen Antibiotika S 53210/A-I, S 53210/A-II und S 53210/A-III zeigen folgende Eigenschaften:
S 53210/A-I
Gelbes amorphes Pulver
Smp. ^> 320 ° (Zers.) nach 15 Stunden Trocknen im Hochvakuum (0,01 - 0,1 mm Hg) bei Raumtemperatur; °° = + 104,5 ° {c = 0,637 in Chloroform)
Analyse: Gef. C 48,8 H 4,1 N 12,4 O 19,5 S 13,7 % UV-Spektrum in Acetonitril, vgl. Fig. 1. IR-Spektrum in KBr, vgl. Fig. 2. 1H-NMR-Spektrum in DMSO, 90 MHz mit Tetramethylsilan als interner Standard, vgl. Fig. 3.
Bei der Aminosäureanalyse wurde neben nicht identifizierten Aminosäuren eine Aminosäure gefunden, die die gleiche Retentionszeit wie Threonin aufweist.
Farbreaktionen: Ninhydrin negativ
Cl —Benzidin grün
Löslichkeit: S 53210/A-I ist leicht löslich in Dimethylformamid, Acetonitril, Dioxan, Dimethylsulfoxid, schwerlöslich in Chloroform, Methanol, Aethanol und unlöslich in Wasser und Hexan.
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• S 53210/A-II
Gelbes amorphes Pulver
Smp. ^>320 ° (Zers.) nach 15 Stunden Trocknen im Hochvakuum (0,01 - 0,1 nun Hg) bei Raumtemperatur; [«!ρ0 = + 107,0 ° (c = 0,622 in Chloroform)
Analyse: Gef. C 48,8 H 4,3 N 11,9 O 19,5 S 12,5 % UV-Spektrum in Acetonitril, vgl. Fig. 4. IR-Spektrum in KBr, vgl. Fig. 5.
H-NMR-Spektrum in DMSO, 90 MHz mit Tetramethylsilan als interner Standard, vgl. Fig. 6.
Bei der Aminosäureanalyse wurde neben nicht identifizierten Aminosäuren eine Aminosäure gefunden, die die gleiche Retentionszeit wie Threonin aufweist.
Farbreaktionen: Ninhydrin negativ 15 Cl„-Benzidin grün
Löslichkeit: S 53210/A-II ist leicht löslich in Chloroform, Dimethylformamid, Acetonitril, Dioxan, Dimethylsulfoxid, schwerlöslich in Methanol, Aethanol und unlöslich in Wasser und Hexan.
20 S 53210/A-III
Gelbes amorphes Pulver
Smp. ^> 300 ° (Zers.) nach 15 Stunden Trocknen im Hochvakuum (0,01 - 0,1 mm Hg) bei Raumtemperatur; [α]20 = + 67,2 ° (c= 1,444 in Chloroform)
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Analyse: Gef. C 52,0 H 5,0 N 12,0 O 20,0 S 11,0 %
UV-Spektrum in Acetonitril, vgl. Fig. 7 IR-Spektrum in KBr, vgl. Fig. 8
H-NMR-Spektrura in DMSO, 90 MHz mit Tetramethylsilan als interner Standard, vgl. Fig. 9.
Bei der Amxnosäureanalyse wurde neben nicht identifizierten Aminosäuren eine Aminosäure gefunden, die die gleiche Retentionszeit wie Threonin aufweist.
Farbreaktion: Ninhydrin negativ i0 Cl -Benzidin grün
Löslichkeit: S 53210/A-III ist leicht löslich in Chloroform, Dimethylformamid, Acetonitril, Dioxan, Dimethylsulfoxid, schwerlöslieh in Methanol, Aethanol und unlöslich in Wasser und Hexan.
In der Tabelle 1 sind die Rf-Werte von S 53210/A-I, S 53210/A-II und S 53210/A-III im Dünnschichtchromatogramm angegeben (Laufstrecke 14 cm auf Kieselgel Merck 60-Platten, Schichtdicke 0,25 mm).
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Tabelle Rf-Werte
Fliessmittel: S 53210/A-I S 53210/A-II S 53210/A-III Nosiheptid
(Standard)
Methylenchlorid-Methanol-Wasser (88 : 11 : 1)
0,21
0,35
0,31
Methylenchlorid-Methanol-Wasser 0,32 (80 : 17,5 : 2)
Methylenchlorid-Methanol-Wasser 0,22 (80 s 17,5 ί 2) + 1 % Eisessig 0,40
0,26
0,64
0,36
0,48
0,51
Methylenehlorid-Methanol-Wasser (80 : 17,5 s 2) + 1 % Triäthylamin
0,45
0,73
0,51
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Als Nachweisreagens kann Jod verwendet v/erden. Beim Ansprühen mit einer 0,2 %igen Ce(SO ) -Lösung in 50 %iger Schwefelsäure und Erwärmen auf 130 ° geben S 53210/A-I, S 53210/A-II und S 53210/A-III eine graue . bis braune Anfärbung.
Es sei festgelegt, dass die obigen Zahlenangaben der üblichen Experimentellenfehlergrenze unterworfen sind.
Die Metabolite S 53210/A-I, S 53210/A-II und S 53210/A-III sind antimikrobiell wirksam; insbesondere hemmen sie vorwiegend das Wachstum von grampositiven Bakterien. Beide Metabolite zeigen eine sehr breite Aktivität gegen grampositive Bakterien, aber keine Wirkung gegen Hefen und Pilze.
Die Wirkung erstreckt sich auch auf die pathogenen Vertreter der gram-positiven Bakterien, wie Staphylococcen, Streptokokken, Corynebakterien, Mycobakterien. Auch gegen Mycoplasmen und NeisSerien sind die neuen Antibiotika wirksam.
Im Reihenverdünnungstest wurden folgende Mindesthemmkonzentrationen erhalten (mcg/ml):
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Organismus
Staphylococcus aureus S. aureus res. Penicillin S. aureus res. Tetracyclin S. aureus res. Rifamycin S. aureus 6538 P
Streptococcus faecalis res. Aminoglykoside
Streptococcus pyogenes Streptococcus faecalis Streptococcus haemolyticus Diplococcus pneumoniae Corynebacterium equi Sarcina lutea res. Erythromycin Bacillus subtilis Clostridium sphenoides Clostridium pasteurianum Mycobacterium thamnophesos Mycobacterium smegmatis Mycoplasma laidlawii Mycoplasma gallisepticum Neisseria catharalis Neisseria pharyngis
MIC
S 53210/A-I		 MIC
S 53210/A-II		 MIC
S 53210/A-III
0,01 0,01 0,01
0,01 0,01 0,01
0,01 0,01 0,1
0,01 0,01 0,01
1,0 0,3 0,03
0,01 0,01 0,3
0,01 0,1 0,3
0,1 0,3 0,3
0,01 0,01 0,01
0,1 0,1 0,3
0,03 0,1 0,3
0,01 0,01 0,3
0,3 0,1 1,0
1,0 0,3 i,o·
0,1 0,1 0,03
0,03 0,03 0,3
0,01 0,03 0,3
0,1 0,1 3,2
1,0 1,0 3,0
0,1 0,3 0,3
0,01 0,01 0,1
Medium Brain Heart Infusion Broth, Inoculumdichte 10" Keime/ml Inkubationstemperatur 37 °, Inkubationszeit 24 Stunden.
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Die neuen Antibiotika S 53210/Ä-I, S 53210/A-II und S 53210/A-III können als Heilmittel allein, und zwar in reiner Form oder in den entsprechenden Heilmittelformen für topicale, enterale oder parenterale Verabreichung oder bei Tieren als Futtermittelzusatz verwendet werden.
In den nachfolgenden Beispielen erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich alle Verhältnisse und Prozentangaben auf Volumeneinheiten.
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Beispie 1 1; Züchtung des Stammes S 53210/A" in einer
•Schüttelkultur
a)
Die als Ausgangsmaterial verwendete Agarkultur des Stammes S 53210/A erhält man, indem man ein Kulturmedium (I) folgender Zusammensetzung
g/Liter
Cerelose (Glucose) 4,0
Malz-Extrakt 10,0
Hefe-Extrakt 4,0
Agar (Bacto) 20,0
destilliertes Wasser 1 Liter
mit einer auf an sich bekannte Weise hergestellten Sporensuspension des ursprünglich isolierten
Stammes S 53210/A beimpft. Das Medium wird vor der Sterilisation mit NaOH auf pH 8,3 bis 8,6 eingestellt und beträgt nach der Sterilisation (20 Minuten bei 120 °) 6,9 bis 7,3.
Eine gut sporulierende Agar-Ausgangskultur des
Stammes S 53210/A wird mit 5 ml steriler, 0,9 %iger Kochsalzlösung versetzt, was eine dichte Sporen-
und Mycelsuspension ergibt.
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c) Vorkulturen
Von dieser Sporensuspension wird 1 ml zur Beimpfung eines 200 ml Erlenmeyer-Kolbens verwendet, der 50 ml des folgenden Vorkulturmediums (II) enthält:
g/Liter
Dextrin 10,0
Glucose 10,0
Pepton 5,0
Hefeextrakt 5,0
CaCO3 1/0
destilliertes Wasser 1 Liter
Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,2 eingestellt. Das Vorkulturmedium wird in einem Autoklaven bei 120 ° während 20 Minuten sterilisiert, worauf der
15 pH-Wert 7,0 bis 7,2 beträgt.
Die so angesetzte Vorkultur wird während 3 Tagen bei 27 ° auf einer Rundschüttelmaschine {220 U/Min.) aerob inkubiert und wird zur Beimpfung einer zweiten Vorkultur verwendet, indem 5 ml der ersten Vorkultur in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit 100 ml des folgenden Mediums (III) geimpft werden:
■ g/Liter
Fleischextrakt 3,0
Trypton 5,0
Glucose 1,0
Stärke löslich 24,0
Hefeextrakt 5,0
CaCO3 2,0
destilliertes Wasser 1 Liter
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Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,2 eingestellt und das Medium in einem Autoklaven bei 120 ° während 20 Minuten sterilisiert, worauf der pH-Wert 7,0 bis 7,2 beträgt.
5 d) Haup_tkultur
Die zweite Vorkultur wird während 3 Tagen bei 27 ° auf einer Rundschüttelmaschine (220 U/Min.) aerob inkubiert und wird dann direkt zur Beirapfung einer Hauptkultur verwendet, indem 5 ml der zweiten Vorkultur in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit 100 ml des folgenden Mediums (IV) geimpft werden:
g/Liter
Malzextrakt 30,0
Blutpepton 7,5
destilliertes Wasser 1 Liter
Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,0 eingestellt und das Medium in einem Autoklaven bei 120 ° während 20 Minuten sterilisiert, worauf der pH-Wert 6,8 bis 7,0 beträgt. Die so angesetzte Hauptkultur wird während 5 Tagen bei 27 ° auf einer Rundschüttelmaschine (220 U/Min.) inkubiert.
Beispiel 2; Züchtung des Stammes S 53210/A in einem Fermenter
a) Die Ausgangskultur für die Züchtung eines 500 Liter-Fermentationsansatzes ist eine Schrägagarkultur des ursprünglich isolierten Stammes S 53210/A, welche
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14 Tage bei 27 ° auf einem Kulturmedium (I) bebrütet wird. Mit 60 ml Sporen- und Mycelsuspension aus 3 Schrägagarkulturen werden 6 2-L-Erlenmeyerkolben mit je 1 Liter Kulturmedium (II) angeimpft. Diese Vorkultur wird 7 Tage auf einer Rundschüttelmaschine bei 27 ° mit 180 UPM inkubiert. Die Zwischenkultur im 75-Liter-Stahlfermenter (50 Liter Gärvolumen) wird mit den Kulturen aus den 6 Erlenmeyerkolben angeimpft. Das Medium dieser Kulturstufe enthält Kulturmedium (III) Die Inkubation erfolgt 3 Tage bei 27 ° mit einer Luftrate von 0,7 L V/V/Min. bei 0,5 bar Druck und einer Rührerdrehzahl von 200 UPM.
Die Hauptstufen-Fermentation im 750 Liter-Gärtank (500 Liter Gärvolumen) erfolgt dann wiederum bei 27 ° mit einer Nährlösung folgender Zusammensetzung pro Liter: 30 g Malzextrakt, 7,5 g Blutpepton, 1 mg FeSO . 7H2O, 1 mg MnCl2.4H2O, 1 mg ZnSO4.7 H3O und entmineralisiertes Wasser. Die Inkubation dauert 6 Tage bei einer Rührerdrehzahl von 130 UPM, einer Luftrate von 0,7 L V/V/Min, und bei 0,5 bar Druck. Der pH-Endwert liegt bei 8,7 - 8,9.
(Weiterbearbeitung siehe Beispiel 3).
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b) Die Ausgangskultur für die Züchtung eines 500-Liter-Permentationsansatzes ist eine Standkultur (Erlenmeyerkolben zu 500 ml mit 100 ml Agar) des ursprüng-. . lieh isolierten Stammes S 53210/A. Diese Kultur mit dem Agarmedium, das pro Liter 20 g Agar, 20 g Malzextrakt, 4 g Hefeextrakt und entmineralisiertes VJasser enthält, wird 14 Tage"bei 33 ° bebrütet. Mit 200 ml Sporen- und Mycelsuspension aus 2 Standkulturen wird 1 Glasfermenter mit 10 Liter Nährlösung der folgenden Zusammensetzung angeimpftt 20 g Glukose, 5 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 1 g CaCO und entmineralisiertes V7asser ad 1 Liter. Diese Vorkultur wird 4 Tage bei 30 ° mit einer Luftrate von 0,7 Liter V/V/Min. und einer Rührerdrehzahl von 250 UPM inkubiert.
Die Zwischenkultur im 75-Liter Stahlfermenter (50 Liter Gärvolumen) wird mit 7 Liter aus der Vorkultur angeimpft, das Medium hat die gleiche Zusammensetzung wie die Vorkultur: 20 g Glucose, 5 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 1 g CaCO- und entmineralisiertes Wasser ad 1 Liter. Die Inkubation erfolgt 3 Tage bei 30 ° mit einer Luftrate von 0,7 Liter V/V/Min, bei 0,5 bar Druck und einer Rührerdrehzahl von 200 UPM.
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Die Hauptstufen-Fermentation im 750 Liter-Gärtank (500 Liter Gärvolumen) erfolgt bei 30 ° mit einer Nährlösung folgender Zusammensetzung: pro Liter 30 g Malzextrakt, 7,5g Blutpepton, 1 mg FeSO4.7 H3O, . 1 mg MnCl«.4 H3O, 1 mg ZnSO4.7 HO und entmineralisiertes Wasser. Die Inkubation dauert 4 Tage bei einer Rührerdrehzahl von 130 UPM und einer Luftrate von 0,7 Liter V/V/Min, und bei 0,5 bar Druck. Der pH-Endv/ert liegt bei 7,8. (Weiterbearbeitung siehe
10 Beispiel 4).
. Beispiel 3: Isolierung von S 53210/A-I und S 53210/A-II
Liter Fermentationsbrühe (Bsp. 2a) werden mit 20-proz. Schwefelsäure auf pH 7 gestellt und mit einem Westfalia Klärseparator aufgetrennt, wobei 400 Liter Kulturfiltrat und 15 kg Mycel anfallen. Das Kulturfiltrat wird dreimal mit je 300 Liter n-Butanol extrahiert. Nach dem Waschen der Extrakte mit 100 Liter Wasser wird die organische Phase bei 20 - 50 ° Konzentrattemperatur zur Trockene eingedampft.
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Das Mycel wird dreimal mit je 60 Liter Methanol während 30 Minuten turraxiert. Die methanolischen Extrakte, die man durch Abnutschen des Feststoffes erhielt, werden vereinigt und unter Wasserzugabe am Umlaufverdampfer auf ca. 40 Liter konzentriert. Diese wässrige Phase wird danach viermal mit je 40 Liter n-Butanol extrahiert und die Extrakte mit 20 Liter Wasser gewaschen. Die vereinigten Extrakte werden wie oben zur Trockene eingedampft.
392 g vereinigte Butanol-Extrakte aus Kulturfiltrat und Mycel werden anschliessend mit 500 ml Wasser versetzt und dreimal mit je 1 Liter Methylenchlorid-Isopropanol (7 : 3) extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt und liefern nach Eindampfen bei 40 ° im Vakuum 188 g Material. Dieses wird in Methylenchlorid-Methanol (1 : 1) gelöst mit 400 g Kieselgel vermischt und nach Abdampfen des Lösungsmittels das Pulver auf eine mit Methylenchlorid bereitete Säule von 1 kg Kieselgel (Merck, Korngrösse 0,06 3 - 0,2 mm) aufgebracht. Die Elution erfolgt zuerst mit Methylenchlorid und Methylenchlorid unter Zusatz von 3 bis 5 % Methanol, dann mit Methylenchlorid-Methanol-Wasser (88 : 11 : 1). Zuletzt wird mit Methylenchlorid-Methanol (1:1) ausgewaschen. Man erhält 65,5 g Fraktionen, die die aktiven Metabolite S 53210/A-I und S 53210/A-II als Gemisch mit Nebenprodukten enthalten.
Dieses Material wird in Methanol gelöst und die Lösung auf eine mit Methanol bereitete Säule von 1,5 kg Sephadex LH 20 gebracht. Die Elution mit Methanol
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liefert 6,9 g Fraktionen mit Aktivität gegen Staphylococcus aureus. Die nachfolgende Chromatographie dieses Materials an einer mit Methylenchlorid-Aceton (2 : 1) bereiteten Säule von 50 g Kieselgel 5· und Elution zuerst mit Methylenchlorid-Aceton (2 : 1) , dann mit Methylenchlorid-Methanol (1 : 1) liefert eine angereicherte Fraktion von S 53210/A-I und S 53210/A-II. Die Fraktion wird an einer mit Methylenchlorid-Methanol-Wasser (88 : 11 : 1) bereiteten Säule von 400 g Kieselgel (Merck, Korngrösse 0,040 - 0,063 mm) nochmals chromatographiert. Die durchgehende Elution mit Methylenchlorid-Methanol-Wasser (88 : 11 : 1) liefert 96 3 mg aktives Material, das in 35 ml Methylenchlorid gelöst wird. Nach Zugabe von 35 ml Methanol
15 und Einengen auf ca. 1/2 Volumen tritt eine Fällung
ein, wobei ein Gemisch von S 53210/A-I und S 53210/A-II als amorphes Pulver erhalten wird. Zur Trennung der beiden antibiotisch aktiven Metabolite wird das Gemisch, analog wie oben beschrieben, an 400 g Kieselgel chro-
20 matographiert, wobei zuerst S 53210/A-II, dann S 53210/A-I eluiert wird. Die Fraktionen, welche S 53210/A-II enthalten, werden in Methylenchlorid-Methanol (1:1) gelöst, wonach nach Einengen der Metabolit S 53210/A-II als amorphes gelbes Pulver
ausfällt. Smp. > 320 ° nach 15 Stunden Trocknen im Hochvakuum bei Raumtemperatur. Die Fraktionen mit S 53210/A-I liefern nach analog durchgeführter Fällungsoperation aus Methylenchlorid-Methanol (1:1) S 53210/A-I als gelbes amorphes Pulver. Smp. > 320 ° nach 15 Stunden Trocknen im Hochvakuum bei Raumtemperatur . Die Reinheitsprüfung der Chromatographiefraktionen erfolgt dunnschichtchromatographisch auf
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Kieselgelplatten mit dem Fliessmittel Methylenchlorid-Methanol-Wasser (80 : 17,5 : 2). Die Prüfung auf die aktiven Inhaltstoffe kann gegen Staphylococcus aureus und Streptococcus faecalis erfolgen.
5 ' Beispiel 4: Isolierung von S 53210/A-III
500 Liter Kulturbrühe (Beispiel 2 b)
werden mit 2 N Schwefeisäure auf
pH 7 gestellt, mit 500 Liter Essigester versetzt und 90 Minuten mit einem Dispax-Reaktor homogenisiert.
Die Abtrennung der organischen Phase erfolgt mit einem Westfalia-Trennseparator. Der Extrakt wird nach Waschen mit 100 Liter Wasser im Vakuum bei 20 bis 40 ° Konzentrattemperatur zur Trockene eingeengt (146 g Rohextrakt). Die Wiederholung der Extraktion ergab
15 nochmals 51 g Rohextrakt.
Die 197 g vereinigten Extrakte werden unter Rühren zu
2 Liter Hexan gegeben. Die überstehende Lösung wird abdekantiert und der ölige Rückstand im Vakuum bei 50 ° vom Lösungsmittel befreit, wobei 80,2 g Fällungsprodukt mit Aktivität gegen Staphylococcus aureus anfallen. Dieses Material wird in Chloroform-Methanol (1 : 1) gelöst und die Lösung auf eine mit Chloroform-Methanol (1 : 1) bereitete Säule von 1 kg Sephadex LH2 gebracht. Die Elution mit Chloroform-Methanol (1:1) liefert 14,5 g Fraktionen, die S 53210/A-III enthalten. Diese werden in Methylenchlorid + 3 % Methanol gelöst und die Lösung auf eine mit Methylenchlorid + 3 % Methanol bereitete Säule von 250 g Kieselgel Merck . (Korngrösse 0,063 - 0,2 mm) aufgegeben. Die Elution erfolgt zuerst mit Methylenchlorid unter Zusatz von
3 bis 5 % Methanol, dann mit Methylenchlorid + 10 % Methanol. Man erhält 4,8 g angereicherte Fraktionen von S 53210/A-III. Die Fraktionen werden in
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.25 ml Methylenchlorid gelöst und nach Zugabe von 50 ml Methanol bei Raumtemperatur eingeengt, wobei S 53210/Α-ΙΙΪ ausfällt. Die Substanz wird abfiltriert und mit Methanol und Aether gewaschen. Man erhält S 53210/A-III als amorphes gelbes Pulver. Smp. >300 ° nach 15 Stunden Trocknen im Hochvakuum bei Raumtemperatur .
Die Reinheitsprüfung der gegen Staphylococcus aureus aktiven Chromatographiefraktionen erfolgt dünnschichtchromatographisch auf Kieselgel mit Methylenchlorid-Methanol-Viasser (88 : 11 : 1) und Methylenchlorid-Methanol-Wasser (92 : 7,5 : 0,5) als Fliessmittel.
Beispiel 5:
In analoger Weise kann man aus Beispiel 1 die Antibiotika S 53210/A-I und/oder S 53210/A-II und/oder S 53210/A-III isolieren.
3700/BA/ER
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Claims (6)

" Patentansprüche:
1. Die neuen Antibiotika S 53210/A-I, S 53210/A-II und S 53210/A-III.
2. Verfahren zur Herstellung der neuen Antibiotika S 53210/A-I und/oder S 53210/A-II und/oder S 53210/A-III, dadurch gekennzeichnet, dass man einen S 53210/A-I und/oder S 53210/A-II und/oder S 53210/A-III produzierenden Stamm von Microellobosporia auf oder in einem Nährmedium züchtet und S 53210/A-I und/oder S 53210/A-II und/oder S 53210/A-III isoliert.
3. Fermentationsbrühen, die bei der Züchtung eines S 53210/A-I und/oder S 53210/A-II und/oder S 53210/A-III produzierenden Stammes von Microellobosporia gewonnen werden.
4. Heilmittel oder Futtermittel, dadurch gekennzeichnet, dass es die Antibiotika S 53210/A-I und/oder S 53210/A-II und/oder S 53210/A-III enthält.
5. Ein S 53210/A-I und/oder S 53210/A-II und/oder S 53210/A-III produzierender Stamm von
Microellobosporia.
6. Der Stamm NRRL 11,122.
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,HAU INSPECTED
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