DE2724441A1

DE2724441A1 - Anthracyclinglycoside, verfahren zu ihrer herstellung und arzneimittel

Info

Publication number: DE2724441A1
Application number: DE19772724441
Authority: DE
Inventors: Masa Hamada; Taiji Inui; Masaaki Ishizuka; Hiroshi Naganawa; Toshikazu Oki; Tomio Takeichi; Hamao Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1976-05-31
Filing date: 1977-05-31
Publication date: 1977-12-22
Also published as: AU2541277A; ZA773228B; DK144569B; FI58159C; LU77449A1; YU114585A; YU43412B; FI771686A; YU43413B; YU134277A; SE436043B; CH634079A5; DK144569C; YU114485A; US4147778A; YU114685A; SE7706350L; YU40479B; GB1544195A; YU42642B

Description

Die Erfindung betrifft neue antibiotisch wirksame Anthracyclinglycoside» Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Antibiotika enthaltende Arzneimittel» welche sich für die Behandlung von bakteriellen Infekten und zur Hemmung des Tumorwachstums bei Warmblütern eignen. Im besonderen betrifft die Erfindung einen neuen Anthracyclinglycosid-Komplez (hier als "Eaumycin-Komplex" bezeichnet) sowie dessen einzelne bioaktive Komponenten (als "Baumycin A₁» A£> B. und B2¹¹ bezeichnet). Der Komplex und seine Bestandteile werden dadurch hergestellt» daß man einen baumycin-erzeugen-

709851/0814

M/18 156 „η

den Stamm von Streptomyces» vorzugsweise Streptomyces coeruleorubidus ME 130-A4 (FERM-P354O, ATCC 31276), in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, anorganische Salze sowie andere für das Wachstum des Mikroorganismus unter submersen aeroben Bedingungen erforderliche Substanzen enthält, bis zur Bildung einer relevanten Baumycinmenge durch den Mikroorganismus im Kulturmedium züchtet und gegebenenfalls das Baumycin aus dem Kulturmedium gewinnt. Baumycin Α..» A₂, B₁ und B₂ können durch Extraktion der gesamten Gärbrühe (mit oder ohne Abtrennung des Myzels) oder durch Extraktion aus dem Myzel und anschließende Aufspaltung und Isolierung der antibiotischen Komponenten nach säulenchromatographischen Standardmethoden gewonnen und getrennt werden. Der Baumycin-Komplex und die seine Bestandteile bildenden Anthracyclinglycoside, d.h. Baumycin A.« A2» B. und Bg» hemmen das Wachstum von gram-positiven Bakterien sowie jenes von verschiedenen Tumoren bei Warmblütern.

Die Erfindung umfaßt den Baumycin-Komplex und seine Komponenten Baumycin A₁, A₂, B₁ und B₂ als rohe Feststoffe, als gereinigte Feststoffe, in Form ihrer nicht-toxischen Säureadditionssalze und in Form von Komplexen mit Desoxyribonukleinsäure .

Von den beigefügten Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 das Absorptionsspektrum von Baumycin A₁ in Methanol im UV-Bereich und sichtbaren Bereich;

Fig. 2 das IR-Absorptionsspektrum von Baumycin A₁ (KBr-Pellet);

Fig. 3 das NMR-Spektrum von Baumycin A₁ in CDCl, (100 MHz);

Fig. 4 das Absorptionsspektrum von Baumycin A₂ in Methanol im UV-Bereich und sichtbaren Bereich;

- 2 -709851 /0814

^M/18156 ^M 272U41

Pig. 5 das IR-AbsorptionsSpektrum von Baumycin Ap (KBr-Pellet);

Pig. 6 das NMR-Spektrum von Baumycin A₂ in CDCl, (100 MHz);

Pig. 7 das Absorptionsspektrum von Baumycin B.. in Methanol im UV-Bereich und sichtbaren Bereich;

Pig. 8 das IR-Absorptionsspektrum von Baumycin B₁ (KBr-Pellet);

Fig. 9 das NMR-Spektrum von Baumycin B₁ in einem CDCl,/ CDjOD-Gemisch (100 MHz);

Pig. 10 das Absorptionsspektrum von Baumycin Bp in Methanol im UV-Bereich und sichtbaren Bereich;

Fig. 11 das IR-Absorptionsspektrum von Baumycin B₂ (KBr-Pellet);

Fig. 12 das NMR-Spektrum von Baumycin B₂ in einem CDCl,/ CD,OD-Gemisch (100 MHz);

Fig. 13 das Felddesorptions-Massenspektrum von Baumycin A₁ (Emitterstrom: 11 mA);

Fig. 14 das Felddesorptions-Massenspektrum von Baumycin A₂ (Emitterstrom: 12 mA);

Fig. 15 das Felddesorptions-Massenspektrum des Methylesters von Baumycin B₁ (Emitterstrom: 14 mA); und

Fig. 16 das Pelddesorptions-Massenspektrum des Methylesters von Baumycin B₂ (Emitterstrom: 14 mA).

709851 /08U

M/18 156

V)IU U W

Gegenstand der Erfindung sind die neuen Anthracyclinglycoside der allgemeinen Formel I

C-CH

(D

in der R eine Gruppe der Formeln

oder

bedeutet» sowie deren nicht-toxische Säureadditionssalze und Komplexe mit Desoxyribonukleinsäure.

Die Verbindungen der Formel I sind Bestandteile eines durch Fermentation erzeugten Anthracyclin-Komplexes (hier als "Baumycin-Komplex" bezeichnet). Der Baumycin-Komplex beinhaltet somit Anthracyclinglycoside der Formel IA

-A-

7098H1 / 0 R1

M/18 156

272U41

C—CH-,

(IA)

mit der Bezeichnung "Baumycin A" sowie Anthracyclinglycoside der Formel IB

CCH₃ °

	O	O
	\
j	J
/CH,	y
*{ ³*
on
I
KH₂

C—CH

(IB)

7098 R1 /0814

H/18 156

2 7 2 Λ Λ Λ 1

mit der Bezeichnung "Baumycin B^M. Es wurde festgestellt» daß Baumycin A und B jeweils in zwei bioaktive Stereoisomeren aufgespalten werden können, weshalb die Formel IA die Iso meren Baumycin A₁ und A₂ und die Formel IB die Isomeren Baumycin B₁ und B₂ darstellen. "Baumycin" bezieht sich im vorliegenden Rahmen auf das Antibiotikum, das mindestens eine der Verbindungen Baumycin A₁, A₂* B₁ und B₂ enthält.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden durch Fermentation verschiedener baumycin-erzeugender Stämme von Streptomyces hergestellt. Beispiele für solche Streptomyces-Stämme sind mehrere bekannte Daunomycin-, Adriamycin- und Carminomycinproduzierende Stämme, wie Streptomyces peuceticus subsp. carneus ATCC 21354, Streptomyces coeruleorubidus ATCC 13740, Streptomyces peuceticus subsp. caestus NRRL B-5337» Streptomyces peuceticus NRRL B-3826 oder Streptomyces coeruleorubidus NRRL B-3045.

Ein besonders bevorzugter baumycin-erzeugender Stamm wurde von den Erfindern aus einer am Institut für Mikrobielle Chemie, Osaki, Tokio, Japan, gesammelten Bodenprobe isoliert; dieser Stamm wird als "Stamm MS 130-A4" bezeichnet. Kulturen dieses Stammes wurden in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland und im Fermentation Research Institute, Japan, hinterlegt und den betreffenden ständigen Sammlungen von Mikroorganismen als "ATCC 31276" bzw. ¹¹FERM P-3540" einverleibt.

Der Stamm ME 130-A4 weist folgende Eigenschaften auf:

1) Morphologische Eigenschaften:

Unter dem Mikroskop zeigen sich offene Spiralen und Haken, die sich gut aus den verzweigten SubstratmyzeLien entwickeil. Wirbel treten nicht auf, und die reife Sporenkette besitzt eine mäßige Länge mit mehr als 10 Sporen. Die Sporen haben Abmessungen von 0,6 bis 0,8 ρ ι 1,0 bis 1,2 μπι; ihre Ober-

- 6 709851 /OfM 4

^11/18156 '⁵ 272AU1

fläche ist stachelig (spiny).

2) Wachstum auf verschiedenen Medien:

Die eingeklammerten Angaben stehen im Einklang mit dem Farbstandard "Color Harmony Manual", veröffentlicht von Container Corporation of America, V.St.A.;

(a) Auf Glycerin/Asparagin-Agar (ISP Medium No.5), inkubiert bei 27⁰C:

Hell-rötlichgelbes bis dunkelrotes (4ic, Pastel orange to 6 1/2 nc, Catchup) Wachstum; hellgraues (17 ge, Dusty Aqua Blue to 19 fe, Aqua Gray) Luftmyzel; hell-rötlichgelbes, lösliches Pigment;

(b) Auf Rohrzucker/Nitrat-Agar, inkubiert bei 27⁰C: Hell-rötlichgelbes, hellrotes bis dunkelrotes (6 1/2 le, Cedar) Wachstum; unbedeutendes, weißes Luftmyzel; geringfügiges, dunkelrotes, lösliches Pigment;

(c) Auf Glucose/Asparagin-Agar, inkubiert bei 27⁰C: Farbloses, hellgelbes bis helloranges Wachstum; geringfügiges, weißes bis hellgraues Luftmyzel» das nach 14-tägiger Inkubierung üppig wird; kein lösliches Pigment;

(d) Auf Stärke/anorganische Salze-Agar (ISP Medium No.4), inkubiert bei 27⁰C:

Hell-gelblichbraunes bis hell-rötlichgelbes Wachstum; hellgraues (19 dc, Aqua Gray) Luftmyzel; kein lösliches Pigment;

(e) Auf Tyrosinagar (ISP Medium No. 7), inkubiert bei 27⁰C:

Gräulich-rotbraunes bis braunes (4 ni, Chestnut Brown) Wachstum; blauweißes bis hellblaues (19 dc, Aqua Gray) Luftmyzel; dunkelbraunes, lösliches Pigment;

(f) Auf Nähragar, inkubiert bei 27⁰C:

- 7 709B^r)1/nftU

m/18 156 /ifc 2724U1

Gelblichbraunes Wachstum; weißes Luftmyzel; braunes, lösliches Pigment;

(g) Auf Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar (ISP Medium No. 2), inkubiert bei 27⁰C:

Mattoranges (5 ne, Tile Red) Wachstum; hellgraues (19 fe, Aqua Gray) Luftmyzel; unbedeutendes, braunes, lösliches Pigment;

(h) Auf Hafermehlagar (ISP Medium No. 3)» inkubiert bei 27⁰C:

Farbloses bis helloranges Wachstum; hellgraues (19 fe» Aqua Gray) Luftmyzel; kein lösliches Pigment;

(i) Auf Glycerin/Nitrat-Agar, inkubiert bei 27⁰C: Farbloses bis helloranges Wachstum; weißes bis hellgraues Luftmyzel; kein lösliches Pigment;

(;)) Auf Stärkeagar, inkubiert bei 27⁰C: Helloranges Wachstum; weißes bis hellgraues Luftmyzel, das nach 14-tägiger Inkubierung blaß aussieht; geringfügiges, helloranges, lösliches Pigment;

(k) Auf Calciummalatagar, inkubiert bei 27⁰C: Farbloses, helloranges bis mattoranges Wachstum, weißes bis hellgraues (17 ge, Dusty Aqua Blue) Luftmyzel; geringfügiges, rosafarbenes, lösliches Pigment;

(1) Auf Cellulose, inkubiert bei 27⁰C: Farbloses Wachstum, weißes bis matt-blaugrünes Luftmyzel; kein Luftmyzel;

(m) In Gelatine-Stichkultur, inkubiert bei 20⁰C: Geringfügiges, gelblichbraunes Wachstum; kein Luftmyzel; geringfügiges, braunes, lösliches Pigment;

(n) In Glucose/Pepton/Gelatine-Stichkultur, inkubiert bei 27⁰C:

Hell-gelblichbraunes bis gelblichbraunes Wachstum; geringfügiges, weißes Luftmyzel; dunkelbraunes, lösliches Pigment;

- 8 709851 /08U

M/18 156 "+ 272UA1

(ο) Auf Magermilch, inkubiert bei 27°C: Hell-gelblichbraunes, gelblichbraunes bis hellrotes Wachstum; geringfügiges, weißes luftmyzel; braunes» lösliches Pigment.

3) Physiologische Eigenschaften:

(a) Die Wachstumstemperatur wird auf Glucose/Asparagin-Agar bei 20, 24, 27, 30, 37 und 50⁰C bestimmt; die Optimaltemperatur beträgt etwa 30 bis 37⁰C;

(b) Gelatineverflüssigung in 15#iger Gelatine-Stichkultur bei 20⁰C und in Glucose/Pepton/Gelatine-Stichkultur bei 27⁰C:

Im ersteren Medium ist nach 20-tägiger Inkubierung eine schwache Gelatineverflüssigung festzustellen, während die Verflüssigung im letzteren Medium nach 14-tägiger Inkubierung schwach oder mäßig stark einsetzt;

(c) Stärkehydrolyse auf Stärke/anorganische Salze-Agar und Stärkeagar bei 27⁰C:

Eine starke Hydrolyse wird am ersteren Medium nach 3-tägiger Inkubierung und am letzteren Medium nach 5-tägiger Inkubierung festgestellt;

(d) Peptonisierung und Koagulierung der Magermilch bei 37⁰C:

Nach 7-tägiger Inkubierung setzt eine schwache bis mäßige Peptonisierung ein,und die Koagulierung ist nach etwa 10 bis 14 Tagen abgeschlossen;

(β) Melaninbildung in Trypton/Hefeextrakt-Nährbrühe (ISP Medium No. 1), auf Pepton/Hefeextrakt/Eieen-Agar (ISP Medium No. 6) und auf Tyrosinagar (ISP Medium No. 7) bei 27⁰C:
Bei allen Medien positiv;

(f) Verwertung der Kohlenhydrate von Pridham-Gottlieb-

709851/08U

M/18 156 _Ao

⁶ 272U41

Basalmedium (ISP Medium No. 9)» inkubiert bei 27⁰C: Üppiges Wachstum mit Glucose, L-Arabinose, D-Xyloset Rohrzucker» Rattinose;

(g) Verflüssigung von Calciummalat auf Calciummalatagar bei 27⁰C:

Nach 3-tägiger Inkubierung wird eine starke bis mäßige Verflüssigung um den Wachstumsbereich festgestellt;

(h) Nitratreduktion in Peptonwasser mit einem Gehalt von 1 % Natriumnitrat (ISP Medium No. 9)» inkubiert bei 27⁰C:
Negativ.

Eine Gesamtbetrachtung der obigen Merkmale von No. ME 130-A4 zeigt» daß der Stamm zum Genus Streptomyces gehört. Das luftmyzel bildet offene Spiralen» jedoch keine Wirbel. Die Sporenoberfläche ist stachelig (spiny). Auf den verschiedenen Medien wird ein helloranges bis mattrotes Wachstum festgestellt; das Luftmyzel ist hellgrau. Es wird ein geringfügiges» helloranges» lösliches Pigment erzeugt. Die Melaninbildung ist positiv, die proteolytische Wirkung schwach bis mäßig und die Stärkehydrolyse ausgeprägt. Aufgrund der vorgenannten Eigenschaften ist der Stamm No. ME 130-A4 von den bekannten Streptomycesarten Actinomyces coeruleorubidus ähnlich; vgl. International Journal of Systematic Bacteriology 18 (1968)» Seite 312; G.P. Gause, Zur Klassifizierung der Actinomyceten, Veb. Gustav Fischer Verlag Jena (1958), Seite 98.

Der Stamm ME 130-A4 und Act. coeruleobidus ISP 4145 wurden anhand von Parallelkulturen miteinander verglichen. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt:

- 10 f

709851/08U

M/18 156

Spiralen

Sporenoberfläche Luftmyzel
Wachstum

ME 13O-A4 Act.coeruleorubidus ISP 5145

positiv

stachelig

hellgrau

hellorange bis
mattrot

positiv

stachelig

hellgrau

hell-gelblichbraun bis mattrot

Melaninbildung: ISP Medium No.1 ISP Medium No.6 ISP Medium No.7

positiv

Il

positiv

ti
η

Stärkehydrolyse Koagulierung von Milch Peptonisierung von Milch

Verflüssigung von Gelatine

Nitratreduktion

Il

η it

negativ It

It

negativ

positiv positiv

Verwertung der Kohlenhydrate :

Glucose

L-Arabinose D-Xylose

D-Fructose Rohrzucker Inosit

L-Rhamnose Raffinose D-Mannit

optimale Wachstumstemperatur

erzeugte Antibiotika

*vgl. Journal of Pharmaceutical Science 56 (1967), 1691 P

- 11 -

709851/08U

It	Il
It	η
It	π
η	It
η	It
η	It
η	It
η	Il
etwa 37°C Baumycin Daunomycin	etwa 37°C Rubidomycin (Daunomycin)*

M/18 156 _Λ

Aus den Ergebnissen geht hervor, daß der vorliegende Stamm ME 130-A4 hinsichtlich der morphologischen und physiologischen Eigenschaften sehr eng mit Actinomyces coeruleorubidus übereinstimmt. Es besteht nur ein geringfügiger Unterschied bezüglich der Farbe des Wachstuns; der Stamm IiE 13O-A4 ist ein wenig stärker rot gefärbt als Act. coeruleorubidus.

Nach G.P. Gause (a.a.O.) ist die Nitratreduktion durch St. coeruleorubidus in Abhängigkeit vom Stamm dieser Species unterschiedlich. Der Stamm ME 13O-A4 kann somit als neuer Stamm von Streptomyces coeruleorubidus identifiziert werden.

Ba die Streptomyces leicht auf natürlichem oder künstlichem Wege mutierbar sind, schließen S. coeruleorubidus No. ME 130-A4 und die anderen baumycin-erzeugenden Streptomyces der Erfindung die vorgenannten typischen Stämme sowie sämtliche natürlichen und künstlichen baumycin-erzeugenden Varianten und Mutanten dieser Stämme ein.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt durch Kultivierung eines baumycin-erzeugenden Stammes von Streptomyces in einem herkömmlichen wäßrigen Nährmedium, das bekannte Nährquellen für Actinomycetes, d.h. Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze, enthält. Wie im Falle anderer Antibiotika wird für die Erzeugung relevanter Baumycinmengen die aerobe Submerskultur bevorzugt. Die allgemeinen Züchtungsmethoden für andere Actinomycetes können auch zur Kultivierung gemäß der Erfindung angewendet werden. Das Nährmedium enthält vorzugsweise handelsübliche Kohlenstoffquellen, wie Glycerin, Glucose, Stärke, Dextrin, Rohrzucker, Maltose, öle oder Fette, in entweder gereinigtem oder rohem Zustand, sowie handelsübliche Stickstoffquellen, wie So^abohnenpulver, Hefeextrakt, Pepton, Baumwollsaatpulver, getrocknete Hefe, Maiequellwasser (corn steep liquor) oder anorganische Sal ze, z.B. Ammoniumsulfat, Natriumnitrat oder Ammoniumchlorid.

- 12 -7098B1/08U

M/18 156

¹ 272U41

Vorzugsweise werden anorganische Salze mitverwendet» beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Phosphate. Nötigenfalls können auch Spurenmetalle und Schauminhibitoren, wie Adekanol (Handelsprodukt von Asahi Denka Ind. Co.) oder Silikon (Silicone» Handelsprodukt von Shinetsu Chem. Ind. Co.)» zugesetzt werden. Die Kulturtemperatur soll im Bereich von etwa 20 bis 35⁰C liegen und beträgt vorzugsweise etwa 25 bis 3O⁰C. Bei der Fermentation im Schüttelkolben oder unter submersen aeroben Bedingungen unter Belüftung und Bewegen gemäß den nachstehenden Beispielen erreicht die Baumycinbildung in der Kulturbrühe nach 3 bis 7 Tagen ein Maximum.

Gemäß der Erfindung können die Verbindungen (Baumycin) aus der Kulturbrühe gewonnen und nach den im folgenden beschriebenen Methoden voneinander getrennt werden.

Das bei der Gärung gebildete Baumycin liegt sowohl intracellulär als auch extracellular vor» wird jedoch hauptsächlich im Myzel angetroffen. Um den Baumycin-Komplex aus der Kulturbrühe zu gewinnen, kann man die Brühe filtrieren und das Filtrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel» wie Äthylacetat» Butylacetat» Chloroform oder n-Butanol, extrahieren. Das im Myzel befindliche Baumycin kann durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, Aceton, n-Butanol, Methanol, Äthanol, Äthylacetat oder Methyläthylketon» oder mit einer wäßrigen Lösung einer organischen oder anorganischen Säure» wie Chlorwasserstoff-» Schwefel- oder Essigsäure, gewonnen werden. Wahlweise kann man das Baumycin unmittelbar aus der Kulturbrühe mit Hilfe der vorgenannten Extraktionsmethoden ohne vorherige Abtrennung des Myzels extrahiert. Nach dem Eindampfen im Vakuum können die Baumycinextrakte mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 7 bis 9 reextrahiert werden, wonach man das Baumycin in einer sauren wäßrigen Lösung (pH <4) löst.

- 13 -

7098 B1/OB 14

m/18 156 <* 2 7 2 A A Λ 1

Das in der sauren wäßrigen Lösung vorliegende Baumycin wird dann nach Einstellung auf einen schwach basischen pH-Wert mit einem organischen Lösungsmittel reextrahiert. Indem man die vorgenannten Arbeitsgänge nötigenfalls wiederholt» kann der Baumycin-Komplex in geeigneter Form erhalten werden. Anstelle oder zusätzlich zur Lösungsmittelextraktion kann man die Gewinnung des Baumycins aus der Kulturbrühe durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Adsorptionsmitteln» wie Aktivkohle, Aluminiumoxid, Kieselsäure oder eines modifizierten Dextrans (z.B. des Handelsprodukts "Sephadex LH-20·¹; Pharmacia Fine Chemical Co., New York, N.Y.), Gegenstromverteilung oder Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung geeigneter organischer Lösungsmittel gewinnen. Die nach derartigen Methoden erhaltenen aktiven Extrakte werden unter vermindertem Druck eingedampft, wobei das rohe, rote Pulver des Baumycin-Komplexes erhalten wird.

Um die einzelnen Baumycin-Komponenten A₁, A₂, B₁ und B₂ aus dem Baumycin-Komplex zu erhalten, kann man eine weitere Reinigung und Auftrennung nach Standardtrennmethoden durchführen. Zu diesen Methoden gehören die Säulenchromatographie, bei der verschiedene Adsorbentien, wie Kieselsäure, modifizierte Dextrane (z.B. Sephadex LH-20),schwach saure Ionenaustauscherharze oder Aktivkohle, verwendet werden, die Gegenstromverteilung und die Flüssigkeitschromatographie, bei der geeignete organische Lösungsmittel eingesetzt werden, sowie Kombinationen der vorgenannten Methoden. Eine geeignete Trennmethode besteht z.B. darin, daß man den Baumycin-Komplex in einer geringen Menge Chloroform löst, die Lösung der Säulenchromatographie über Kieselsäure unterwirft und mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel (z.B. Chloroform/ Methanol) eluiert; dabei erhält man die Baumycinbestandteile A₁, A₂, B₁ und B₂. Die aktiven Eluate werden getrennt und unter vermindertem Druck eingedampft. Die Baumycin-Komponenten werden einzeln durch Chromatographie an Sephadex LH-20

- 14 70985 1 /081 A

M/18 156

2724U1

gereinigt. Nach dem Eindampfen der aktiven Eluate können Baumycin A₁* A₂, B₁ und B₂ in reiner kristalliner Form durch Umkristallisation aus einem geeigneten organischen lösungsmittel erhalten werden.

Die physikochemischen Eigenschaften von Baumycin A₁, A₂ » B₁ und B₂ sind wie folgt:

- 15 -

709851/08U

M/18 156

Baumycin

^A1

272U/,
A₂

1

H
6,65
6,43

N
2,04
2,08

0
29,83
30,88

C
60,27
60,61

H
6,72
6,43

N
2,31
2,08

0
29,52
30,88

C₃₄H₄₃NO₁₃

182 bis 185

185 bis 189

0,08
0,28
0,17
0,64

Aussehen

schwach basisches, amorphes, rotes Pulver

673,7

+ 150°
(CHCl-, c =

+ 135°
= 0,1)

Die saure wäßrige Lösung und die Methanollö
sung sind rot und nehmen im alkalischen Be
reich eine rötliche Purpurfarbe an;
Baumycin A₁ und A2 ergeben eine positive
Ninhydrinreaktion und reduzieren Fehling-
Lösung nicht.

Elementaranalyse
gef.:
ber.:

C
59,85
60,61

Löslich in saurem Wasser, Dimethylsulfoxid,
Methylcellosolve (Glykolmethyläther),
Methanol, Äthanol, n-Propanol, n-Butanol,
Äthylacetat, Butylacetat, Aceton, Methyl-
äthylketon, Methylendichlorid und Chloro
form; unlöslich in Wasser, η-Hexan, Cyclo-
hexan und Petroläther.

empirische
Formel

0,25
0,39
0,26
0,74

Molekularge
wicht

Schmelzpunkt, ⁰C

spezifische Dre
hung

Löslichkeit

R_f-Werte**
*C:M = 10:1
C:M:B = 7:3:3
C:M:A = 90:10:1
C:M:E = 80:20:4

Reaktion

- 16 -

709851/0814

M/18 156

IS

272U41

Baumycin	^A1	234,ί 252,; 289 478 497 532	A₂	234,ί 252,; 269 478 497 532
Absorptionsspektrum im UV- und sichtba ren Bereich und Maximum (E₁ ¹J_1n) m MeOH (Kurve 1)	Fig. 1 5 (452), > (327), 120), 127), 128), 76)	234,! 252,! 289 478 497 532
In 0,1n HCl-MeOH (Kurve 2)	234,5 (459), 252,5 (326), 289 (121), 479 (133), 497 (133), 532 (78)	250,ί 350 558 596
In 0,1n NaOH-MeOH (Kurve 3)	250,ί 350 558 597	Pig. 4 5 (427), > (311). 108), 125), 128), 84)
IR-Absorptionsspek trum (KBr)	5 (416), 83), 164), 152)	5 (4^ 5 (3 111 131 131 70)
HMR-Spektrum (PMR; Protonenresonanz)	Pig. 2	Γ7), ,
♦**C¹³-NMR-Spektrum	Fig. 3 (100 MHz,	5 (421), 80), 170), 164)
Charakteristi scher C-1"-Peak bei 106,7 ppm	Fig. 5
Fig. 6 in CDCl₃) .
Charakteristischer C-1"-Peak bei 101,6 ppm

* C = Chloroform, M = Methanol, B = Benzol, A = Ameisensäure» E = Essigsäure

♦♦ Dünnschichtchromatographie-Bedingungen: Kieselsäure-Dünnschicht 6OF₂₅₄ (Merck Co.), 23⁰C

*♦* Spektrum gemessen an einem Varian XL 100-Gerät bei 25.2 MHZ; die internen Standardsubstanzen sind CDCl, für Baumycin A₁ und TMS für Baumycin A₂;

Proben: A₁ = 27 mg/0,5 ml CDCl,; A₂ = 44 mg/0,6 ml CDCl₃

MeOH s Methanol

- 17 -

709851/0814

Μ/1θ 156

BauEycin

^Bl

27
B,

41

H
6,15
6,01

N
2,01
2,01

0
32,58
32,57

C
56,59
59,38

H
5,96
6,01

N
1,92
2,01

0
31,91
32,57

C₃₁₁H₁₁₁NO₁₁,

181 bis 189

197 bis 201

0,01
0,11
0,10
0,30

Aussehen

2U
>

schwach basisches, amorphes, rotes Pulver

687,7

+ 170°
(CHCl₃/Me0H = 1:

♦ 170°
l,c= 0,1)

Die saure, wäSrige Lösung und die Methanol
lösung sind rot und nehmen im alkalischen Be
reich eine rötliche Purpurfarbe an;
Baumycin B₁ und B- ergeben eine positive Nin-
hydrinreaktion und reduzieren Fehling-Lösung
nicht

Elementaranalyse
gef.:
ber.:

C
57,32
59,38

Löslich in saurem Wasser, Methylcellosolve,
Methanol, Äthanol, n-Propanol und n-Butanol;
unlöslich in Wasser, Äthylacetat, Aceton,
Hethylendichlorid, Chloroform, Tetrachlorkoh
lenstoff, Benzol, Toluol, Diäthyläther und
η-Hexan (Bauiaycin B₀ ist jedoch wasserlös
lich) *

empirische
j?or:nel

0,07
0,39
0,18
0,61

Molekularge
wicht

Schwerpunkt, ⁰C

spezifische Dre
hung

löslichkeit

R_f-Verte**
*C:M = 10:1
C:K:3 = 7:3:3
C:M:A = 90:10:1
C:M:S = 60:20:4

Reaktion

- 18 -

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M/16 156

Baumycin	^Bl	2724U1 ^B2
Adsorptionsspektrmn ia UV- und sichtba ren. Bereich und Maximum ^(S1cV ^{in Ke0H} (Kurve 1)	Fig. 7 231,5 (552), 253 (385), 290 (132), 176 (179), 195 (181), 530 (101)	Fig. 10 231 (575), 252 (111), 290 (130), 178 (176), 195 (183), 530 (120)
In 0,1η HCl-MeOH (Kurve 2)	231 (580), 253 (397), 290 (110), 176 (182), 195 (181), 530 (100)	231 (616), 253 (119), 290 (115), 176 (195), 191 (19D, 529 (105)
In 0,1η KaOH-KeOH (Kurve 3)	251 (153), 350 (65), 556 (206), 591 (195)	251 (199), 350 (7D, 556 (23D, 591 (218)
IR-AbscrrtionssOek- trum (KBr)	Fig. 8	Fig. 11
EMR-Spektrum (Pi-iR; Protonenreecnanz)	Fig. 9 (100 MHz, in CDC]	Fig. 12 .,/CD-zOD-Gemisch)
«♦*C¹⁵-KJS-Spektrum	Charakteristi scher C-1"-Peak bei 107,1 ppm	Charakteristi scher C-1"-Peak bei 102,1 ppm

* C = Chloroform, M = Methanol, B = Benzol, A = Ameisensäure, E = Essigsäure

** Dünnschichtchromatographie-Bedingungen: Kieselsäure-Dünnschicht 6OF₂₅₁₄ (Merck Co.), 23°C

*♦* Spektrum gemessen an einem Varian XL 100-Gerät bei 25,2 MHZ; die interne Bezugssubstanz ist TMS;

Proben: B₁ = I5 mg/0,6 ml CDCl^/Methanol (5:1) B₂ = 30 mg/0,6 ml CDCl /Methanol (1:1)

MeOH = Methanol

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2724U1

Die Struktur von Baumycin A₁I A₂ > B₁ und B₂ gemäß der Erfindung werden wie folgt bestimmt: Bei 30 Min. langer Hydrolyse mit 0,1n Salzsäure bei 85⁰C ergeben Baumycin A₁I Ap ι B₁ und Bp Daunomycinon und Daunosamin; Daunomycin wird aus den vorgenannten Baumycinkomponenten durch 15 Min. lange teilweise Hydrolyse mit 1#iger Schwefelsäure bei 32⁰C erhalten. Die physi^kochemischen Eigenschaften (wie die NT-IR-, Massen- und IR-Absorptionsspektren, der Schmelzpunkt und die dünnschichtchromatographischen R--Werte) von Daunomycinon, Daunosamin und Daunomycin, welche durch saure Hydrolyse aus Baumycin A und B erhalten werden, stimmen völlig mit den entsprechenden Daten für authentisches Daunomycin überein; vgl. Journal of American Chemical Society, 86 (1964), Seiten 5334/5335 und 5535/5336.

Die weitere Strukturaufklärung von Baumycin A₁ und A₂ gemäß der Erfindung wurde wie folgt durchgeführt: Die Hydrogenolyse von Baumycin A₂ mit Pd/BaSO, in Methanol ergibt einen Aglykonanteil und einen Zuckeranteil. Die Analyse des PMR- und Massenspektrums zeigt, daß das Aglykon 7-Desoxydaunomycinon ist. Bezüglich des Zuckeranteils von Baumycin A₁ und A₂ wurde das Tetraacetylderivat, das durch Umsetzung jedes Anteils (d.h. jenes von A₁ oder A₂) mit Essigsäureanhydrid in Pyridin erhalten wird, anhand des PMR-Spektrums und CI(chemische Ionisierung)-Massenspektrums analysiert. Es wurde folgende Struktur vorgeschlagen:

OCOCH,

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272U41

Zur weiteren Bestätigung der Struktur von Baumycin A₁ und A₂ wurde der jeweilige Molekülionenpeak durch die in jüngerer Zeit entwickelte Felddesorptions-Massenspektrumanalyse (FeIddesorption = PD) bestimmt; gefunden wurde ein Wert m/e = 674 (M + 1). wie in Fig. 13 und Fig. 14 gezeigt wird. Demgemäß haben sowohl Baumycin A₁ als auch Baumycin Ap die Summenformel C₅₄H₄₅NO Im Hinblick auf die unterschiedlichen Schmelzpunkte» spezifischen Drehungen, dünnschichtchromatographischen R_f-Werte und C -NMR-Peaks wurde festgestellt» daß Baumycin A₁ und A₂ Stereoisomere voneinander sind.

Die Strukturen von Baumycin B₁ und B₂ wurden wie folgt bestimmt:

Die Hydrogenolyse von Baumycin B₁ mit Pd/BaSO, in Methanol ergab einen Aglykonanteil und einen Zuckeranteil. Die Analyse des PMR-Spektrums und Kassenspektrums ergab, daß der Aglykonanteil 7-Desoxydaunomycinon ist. Bezüglich des Zuckeranteils wurde das Diacetylderivat» das durch Umsetzung des jeweiligen Zuckeranteils mit Essigsäureanhydrid in Pyridin erhalten wurde» anhand des PMR- und CI-Massenspektrums analysiert; es wurde folgende Struktur vorgeschlagen:

OCOCH₅

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Zur weiteren Bestätigung der Struktur von Baumycin B₁ und ^£ ₂ bestimmt man den jeweiligen Molekülionenpeak anhand des FD-Massenspektrums. Da sich der Icnenpeak von Baumycin B₁ und B₂ selbst nicht messen läßt, analysiert man den jeweiligen, durch Umsetzung mit Diazomethan erhaltenen Methylester. Dieser besitzt einen Molekülionenpeak bei m/e = 702 (M + 1), wie aus Fig. 15 und Fig. 16 hervorgeht. Die aus den Fig. 15 und 16 ersichtlichen Peaks bei m/e =716, 730 und 744 zeigen die Methylierung der Aminoreste in Daunosamin an. Obwohl Baumycin B₁ und Bp somit dieselbe Sumnenformel aufweisen, ergibt sich aus ihren unterschiedlichen Schmelzpunkten, dünnschichtchromatographischen R^-Werten und

C -NMR-Peaks, daß sie gegenseitige Stereoisomere darstellen.

Insgesamt geht aus den Resultaten der vorgenannten Untersuchungen hervor, daß Baumycin A₁ und A₂ die allgemeine

Formel

C—CE

- 22 -

709851 /081 L,

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und Baumycin B₁ und Bp die allgemeine Formel

272U41

C-CH,

aufweisen.

Baumycin A₁ und A₂ bzw. Baumycin B₁ und B₂ sind - wie erwähnt - jeweils Stereoisomere» die leicht an unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften» wie den Schmelzpunkten» der spezifischen !Drehung (A₁ und A₉)* den dünnschichtchromatographischen R--Werten und den C -NMR-Peaks, unterschieden werden können.

Sie vorgenannten Strukturen verdeutlichen» daß Baumycin A₁* A₂* B₁ und B₂ neue Anthracyclinglycosid-Antibiotika darstellen* welche dasselbe Aglykon und denselben Aminozucker (d.h. Daunosamin) wie Daunomycin enthalten» sich von diesem jedoch durch die oben gezeigten zusätzlichen» neuen Zuckeranteile unterscheiden. Sie Unterschiede zwischen den erfindungsgemäßen Baumycin-Antibiotika und bekannten Anthracyclin-Anti-

- 23 709851/0814

M/18 156 272U41

biotika wurden ferner von den Erfindern anhand von Vergleichen der durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie unter Verwendung verschiedener lösungsmittelsysteme erzielten R_f-Werte aufgezeigt.

Baumycin A₁* Apt B₁ und Bp weisen antimikrobiell Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Arten von Mikroorganismen auf. Tabelle I zeigt die Mindesthemmkonzentration (MHK) der erfindungsgemäßen Antibiotika! bestimmt nach der BrühenverdUnnungsmethode.

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709851/08U

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272UA1

TABELLE I

Antimikrobielles Spektrum von Baumycin A₁, A₉, B₁ und B₂ ^Ί ^c

Testmikroorganismus

MHE, Mg/ml

BM-A₁ BM-A₂ BM-B₁

Staph. aureus PDA2O9P	1,56	3,12	50	100
Staph. aureus Smith	0,78	1,56	50	50
B. subtilis ATCC 6633	0,78	3,12	100	>100
B. cereus ATCC 9634	1,56	3,12	100	>100
B. megateriura NRRL B-938	1,56	6,25	100	>100
Sarcina lutea ATCC 93**1	0,78	3,12	50	25
Micrococcus flavs	0,78	1,56	50	50
Coryne. bovis l8lO	1,56	6,25	50	50
Ps. fluorescens NIKJB-25¹»	>100	100	100	>100
Proteus morganii	>100	>100	>100	>100
Mycobacterium smegmatis ATCC 607	6,25	12,5	100	>100
Candida albicans IAM 4905	100	100	100	>100
Candida tropicalis	100	100	100	>100

BM = Baumycin

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Baumycin A₁* Ap, B₁ und Bp besitzen somit antimikrobiell Aktivität» insbesondere gegenüber gram-positiven Bakterien; sie sind daher therapeutisch wertvolle Substanzen für die Behandlung von Warmblütern (einschließlich des Menschen) gegen Diphtherie» Tuberkulose, Pneumonie» Tetanus und andere durch gram-positive Bakterien verursachte infektiöse Erkrankungen.

Baumycin Α..» Ap» B₁ und Bp zeigen bei Tierversuchen eine ausgeprägte Antitumorwirkung bei geringer Toxizität und
stellen daher wertvolle, das Wachstum von Tumoren bei
Warmblütern hemmende Arzneistoffe dar. Insbesondere ergeben Baumycin A₁, Ap. B₁ und Bg ausgeprägte Hemmeffekte gegenüber der Maus-l-1210-Leukämie. Beispielswelse wurden
BDP₁-MaUSe intraperitoneal mit 1 χ 10 L-1210-Zellen/Maus beimpft. 24 Stunden nach der Inokulierung wurde der Wirkstoff einmal täglich während 10 aufeinanderfolgenden Tagen intraperitoneal injiziert. Am 30. Tag wurden folgende
prozentuale Verlängerungen der Überlebensdauer gegenüber Vergleichstieren erzielt:

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272UA1

Dosis» mg/kg/Tag	Verlängerung d gegenüber den	BM-A₂	Ler Uberlebensdauer Vergleichsversuchen,?!	BM-B₂
	BM-A₁		BM-B₁	155
8			147	135
6			165	111
1»			136	99
2		167	117	99
1		173	105
0,5		163	99
0,25		151	99
0,125		141	93
0,06	>300
0,03	187
0,015	155
0,008	131
0,004	131

Akute Toxizität

Die nachstehende Tabelle zeigt die bei intraperitonealer Injektion der erfindungsgemäßen Antibiotika erzielten ID₁-Q-Werte:

- 27 709851/08U

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LD₅₀ , mg/kg

Baumycin A₁ 1,5 bis 2,5

Baumycin A₂ 15 bis 20

Baumycin B₁ 40 bis 60

Baumycin B₂ 75 bis 100

Die Verbindungen Baumycin A., A₂, B₁ und B₂ sind, wie erwähnt,neue Antibiotika,die sich sowohl für die Human- als auch für die Veterinärmedizin eignen und die eine ausgeprägte Hemmwirkung gegenüber malignen Tumoren bei Warmblütern (insbesondere ascitischen und festen Tumoren) aufweisen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen bilden mit einer Vielzahl von organischen und anorganischen Salzbildnern nichttoxische Säureadditionssalze, sowie mit Desoxyribonukleinsäure nicht-toxische Komplexe. Die mit pharmakologisch verträglichen Säuren, wie Schwefel-, Phosphor-, Chlorwasserstoff-, Essig-, Propion-, öl-, Palmitin-, Zitronen-, Bernstein-, Wein-, Glutamin- oder Pantothensäure, gebildeten Säureadditionssalze sowie die mit Desoxyribonukleinsäure gebildeten nicht-toxischen Komplexe können in derselben Weise wie die Baumycinverbindungen selbst eingesetzt werden. Die Salze werden nach den allgemein zur Salzbildung für Antibiotika verwendeten Methoden erzeugt, isoliert, gereinigt und formuliert. Im Falle der Komplexe mit Desoxyribonukleinsäure (DNA) kann aus Warmblütern und Mikroorganismen, wie Kalbsthymus, HeLa-Zellen, menschlichen und tierischen Embryonenzeilen oder Hefen, extrahierte DNA verwendet werden. Die Herstellung der Baumycin-DNA-Komplexe kann nach Methoden erfolgen, die in der Literatur für die Herstellung von DNA-Komplexen anderer Anthracyclin-Antibiotika (wie Adriamycin oder Daunorubicin) beschrieben sind; vgl. z.B. Nature, New Biol. 239 (1973),Seite 110 und Europ. J. Cancer 10 (1974)» Seite 399. Für die erfindungsgemäßen

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Zwecke sind die in Form der freien Basen vorliegenden Baumycinverbindungen mit ihren nicht-toxischen Säureadditionssalzen und DNA-Komplexen als gleichwertig anzusehen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich - wie erwähnt - für die Therapie von Warmblütern, die an einer durch gram-positive Bakterien verursachten Infektion oder einem malignen Tumor (z.B. einem festen oder ascitischen Tumor» wie L-1210-Leukämie) leiden. Bei der Behandlung wird dem Patienten oder Tier eine wirksame antibakterielle oder tumorhemmende Dosis von Baumycin A₁* A₂* B₁ oder B₂» eines Gemisches davon oder eines nicht-toxischen Säureadditionssalzes oder DNA-Komplexes davon verabreicht.

Die Erfindung betrifft ferner Arzneimittel» die eine wirksame antibakterielle oder tumorhemmende Menge von Baumycin A₁» A₂» B₁ oder B₂» eines Gemisches davon oder eines nichttoxischen Säureadditionssalzes oder DNA-Komplexes davon zusammen mit einem inerten, pharmakologisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthalten. Diese Arzneimittel können in einer beliebigen, für die parenterale Verabreichung geeigneten pharmazeutischen Form zubereitet werden.

Beispiele für zur parenteralen Verabreichung geeignete erfindungsgemäße Arzneipräparate sind sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können auch als sterile Festpräparate formuliert werden, die unmittelbar vor der Verwendung in sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder anderen sterilen, injizierbaren Medien gelöst werden können.

Die in der Praxis bevorzugt verwendeten Mengen des Baumycin-Antibiotikums sind je nach der verwendeten speziellen Verbindung, dem bestimmten formulierten Präparat, der

- 29 -

709851/08U

Art der Anwendung, dem Patienten, der behandelten Erkrankung und ihrer lokalisation verschieden. Die Baumycin-Antibiotika werden Menschen im allgemeinen intravenös oder lokal und anderen Warmblütern intraperitoneal, intravenös, subkutan oder lokal injiziert. Dabei sind vom Arzt zahlreiche, die Wirkung der Stoffe modifizierende Paktoren zu beachten, beispielsweise das Alter, Körpergewicht und Geschlecht, die Nahrung bzw. Diät, die Verabreichungszeit, der Verabreichungsweg, die Ausscheidungsgeschwindigkeit, der Zustand des Patienten, die angewendeten Wirkstoffkombinationen, Reaktionsempfindlichkeiten und die Schwere der Erkrankung. Die Verabreichung kann unter Wahrung der maximalen verträglichen Dosis kontinuierlich oder periodisch erfolgen. Die optimale Dosierung unter bestimmten Vorbedingungen kann vom Arzt mit Hilfe herkömmlicher Dosisbestimmungstests unter Berücksichtigung der vorgenannten Richtlinien festgestellt werden.

Als antibakterielle Mittel werden die Baumycin-Präparate im allgemeinen so verabreicht, daß die Konzentration des Wirkstoffs höher als die Mindesthemmkonzentration für den speziellen behandelten Organismus ist.

Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie jedoch zu beschränken.

Beispiel 1_

Es wird ein Nährmedium mit folgender Zusammensetzung hergestellt:

Kartoffelstärke	- 30 -	1	*
Glucose	1	*
"Prorich¹¹ (Sojabohnenpulver)	1,5
K₂HPO₄	0,1	*
MgSO₄*7H₂O	0,1	*
NaCl	0,3	*
Mineralstoffe*	0,125

(pH 7,4)

709851/0814

M/18	156	♦CuSO.	-5H₂O	2,8	g
		FeSO₄	-7H₂O	0,4	β
		MnCl₂	-4H₂O	3,2	ε
		ZnSO₄	-7H₂O	0,8	g

2724U1

in 500 ml Wasser

50 ml dieses Nährmediums werden in einem 500 ml-Kolben 15 Min. bei 12O⁰C sterilisiert und mit Hilfe einer Platinöse aus einer Schrägagarkultur von Streptomyces coeruleorubidus ME 130-A4 beimpft.

Die Inkubierung wird 72 Std. bei 28⁰C an einem Rotationsschüttelapparat (230 Upm) vorgenommen. Auf diese Weise erhält man die Impfkultür. Man stellt 7 Ltr. des nachstehenden Nährmediums her:

Rohrzucker 4 #

"Prorich"

(Sojaprotein, Ajinomoto Co.) 2,5 Ί»

NaCl 0,25 #

Calciumcarbonat 0,32 f>

Mineralstoffe* 0,125 $ (pH 7.4)

*CuSO₄	-5H₂O	1	,25	g
MnCl₂	-4H₂O	1	,25	g
ZnSO₄	'7H₂O	12	,5	g
	in 500 ml Wasser

50 ml des in einem 500 ml-Kolben verteilten und sterilisierten Mediums werden unter aseptischen Bedingungen mit 1 ml der vorgenannten Impfkultür beimpft. Die Fermentation wird während 7 Tagen bei 28⁰C an einem Rotationsschüttelapparat (230 Upm) durchgeführt.

Die erhaltene Kulturbrühe wird zur Trennung des Kulturfiltrate vom Mycel filtriert. Das Filtrat wird dreimal mit 1/5 Volumen

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¹⁵⁶ 2724U1

Chloroform extrahiert. Dae Mycel wird dreimal mit jeweils 2 Ltr. Aceton pro kg Filterkuchen extrahiert und der erhaltene Extrakt unter vermindertem Druck auf das halbe Volumen eingeengt.

Das Konzentrat wird dreimal mit 2 Ltr. Chloroform extrahiert. Die Extrakte werden mit der vom KuIturfiltrat erhaltenen Chloroformlösung vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. 10 g der erhaltenen öligen Substanz werden in 50 ml Chloroform gelöst. Dann gibt man 300 ml η-Hexan zu und zentrifugiert den sich bildenden Niederschlag 5 Min. bei 3000 Upini um in η-Hexan lösliche Verunreinigungen zu entfernen. Der erhaltene Niederschlag (1,4 g)wird in 100 ml Chloroform gelöst. Die lösung wird zur Gewinnung säurelöslicher Substanzen dreimal mit jeweils 150 ml 0,01 m Essigsäure extrahiert. Man stellt den Extrakt durch Zugabe von 2 m Trishydroxyaminomethanlösung auf einen pH-Wert von 8,5 ein und extrahiert die Lösung danach dreimal mit jeweils 100 ml Chloroform. Aus dem Chloroformextrakt werden durch Eindampfen unter vermindertem Druck zur Trockene 230 mg eines roten, pulverförmigen Rohprodukts (Baumycin-Komplex) erhalten.

Beispiel

Das pulverfönnige Rohprodukt von Beispiel 1 (230 mg) wird in 2 ml eines Chloroform/Methanol-Gemisches (10:1) gelöst. Die Lösung wird auf eine 65 cm lange und einen Durchmesser von 8 cm aufweisende Säule, die mit 80 g Kieselsäure gefüllt ist, aufgegeben und mit einem Chloroform/Methanol-Gemisch (10:1) gewaschen. Die BaumycIn-A₁-Fraktion wird zuerst eluiert, gefolgt vom Baumycin A₂» B₁ und B₂* wobei als Elutionsmittel ein 8:1-, 5:1- bzw. 2:1-Gemisch von Chloroform'Methanol verwendet werden.

Sie aktiven Fraktionen werden jeweils getrennt gesammelt und

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709851/08U

M/18 156 2724U1

xinter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Dann werden die Fraktionen jeweils auf eine Säule mit einer Länge von 25 cm und einem Durchmesser von 1,8 cm, die mit Sephadex LH-2O gefüllt ist, aufgegeben und mit einem Toluol/Methanol-Greaisch (3:1) gewaschen. Nach dem Eindampfen der Fraktionen erhält man durch Zugabe von η-Hexan zum Konzentrat jeweils ein rotes Pulver von 10 mg Baumycin A-.» 18 mg Baumycin A₂* 3 mg Baumycin B₁ bzw. 1 mg Baumycin B₂.

Beispiel

Es wird ein Nährmedium mit folgender Zusammensetzung hergestellt:

Kartoffelstärke	CNJ
Glucose	2 %
Hefeextrakt (Daigo Eyo Co.)	0,5 #
NaCl	0,25 %
Calciumcarbonat	0,32 j£
Sojamehl (Nishin Oil KK)	2 ?έ
Mineralstoffe*	0,2 <j> (pH 7,4)

♦gleich wie in Beispiel 1

Man stellt 8 Ltr. des vorgenannten Mediums her. Jeweils 50 ml werden dann in 500 ml-Kolben verteilt, 15 Min. bei 120⁰C sterilisiert und mit 1 ml der gemäß Beispiel 1 hergestellten Impfkultur von Streptomyces peuceticus subsp. carneus ATCC 21354 beimpft. Die Fermentation wird während 6 Tagen bei 28⁰C an einem Rotationsschüttelapparat durchgeführt. Anschließend filtriert man die Kulturbrühe, um das Mycel vom KuIturfiltrat abzutrennen. Nach Extraktion mit Chloroform und Aceton gemäß Beispiel 1 erhält man 10 g einer öligen Substanz, die man in 100 ml Methanol löst. Nach der Entfernung der in η-Hexan löslichen Substanzen durch Zugabe von

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M/18 156 f2

272U41

100 ml η-Hexan erhält man 1,2 g eines roten Niederschlags» den man in 100 ml Chloroform löst. Dann extrahiert man zur Gewinnung einer säurelöslichen Substanz mit 600 ml Natriumacetatpuffer (pH 3»0). Nach Zugabe von 0,5 m Äthylendiamintetraessigsäure zum Extrakt (bis zu einer Konzentration von 0,01 m) stellt man den pH-Wert mit 4 m Natriumhydroxid auf 8 ein.

Die aktiven Bestandteile der wäßrigen Lösung werden viermal mit jeweils 200 ml Chloroform, dann zweimal mit jeweils 500 ml n-Butanol extrahiert. Die erhaltenen Chloroform- und n-Butanolschichten werden getrennt unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 200 mg eines roten Pulvers, das hauptsächlich aus Baumycin B₂ besteht. Man löst dieses rohe Pulver in 5 ml Chloroform/Methanol, gibt die lösung auf eine mit 80 g Kieselsäure gefüllte Säule (Länge 23 cm, Durchmesser 3 cm) auf und wäscht mit dem 20:1-Chloroform/ Methanol-Gemisch. Baumycin B₁ und B₂ werden nacheinander mit dem 5:1- bzw. 2:1-Chloroform/Methanol-Gemisch eluiert. Die Fraktionen von Baumycin B₁ und B₂ werden getrennt unter vermindertem Druck eingedampft; man erhält 50 mg Baumycin B₁ und 8 mg Baumycin B₂. Das Baumycin B₁ und B₂ werden dann aus Methanol umkristallisiert, wobei man 31 mg bzw. 6,5 mg kristallines Material enthält. Bei dieser Methode werden sehr geringe Mengen von Baumycin A₁ und A₂ gebildet.

Beispiel

Nach der allgemeinen Methode von Beispiel 1 und 2 werden Baumycin A₁* A₂, B₁ und B₂ unter Verwendung der nachstehenden Streptomyces-Stämme erhalten:

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^3

M/18156 272U41

Stamme	peuceticus subsp. ATCC 21354	erhaltenes	A₂	Baumycin,	mg
	coeruleorubidus ATCC 13740	^A1	12	^B1	^B2
Streptomyces carneus	peuceticus subsp. NBRL B-5337	8	21	4	2
Streptomyces	peuceticus NERL B-3826	16	10	8	3
Streptomyces caestus	coeruleorubidus NRRL B-3045	11	5	7	3
Streptom ces	10	17	1	3
Streptomyces	26	5	6

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709851/0814

Claims

M/18 156 272U41 PATENTANSPRÜCHE

1.) Anthracyclinglycoside der allgemeinen Formel I

C—Ci

(I)

in der R eine Gruppe der Formeln

oder

CH,

bedeutet,

sowie deren nicht-toxische Säureadditionssalze und Desoxyribonukleinsäurekomplexe .

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709851 /08U

OBtöWAL INSPECTED

M/18 156

2. Baumycin A-, das Anthracyclinglycosid-Isomere der Formel

OCK

I Π
O OH O JL ^ Q CH

Il

C -CK

mit den folgenden charakteristischen Eigenschaften: (a) einem Schmelzpunkt von 182 bis l85°C,

(b) einer spezifischen Drehung LaJ + 150 (c = 0,1, CHCl₃),

(c) den folgenden durch Kieselsäure-Dünnschichtchromatographie bestimmten R~-Werten:

1. im Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol (10:1), R_f = 0,25,

2. im Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol/Benzol (7:3:3), R_f = 0,39,

3. im Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol/Ameisensäure (90:10:1), R_f = 0,26,

- 37 7098B1 /OßU

M/18 156

4. im Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol/Essigsäure (80:20:4), R_f = 0,74 und

(d) einem charakteristischen C ^-NMR-Absorptionspeak bei 106,7 ppm (relativ zu CDCl,) in Form einer Lösung in CDCl, bei einer Konzentration von 27 mg Baumycin A₁/ 0,5 ml CDCl₃ (Varian XL-100-Gerät bei 25,2 MHz),

sowie dessen nicht-toxische Säureadditionssalze und Desoxyribonukleinsäurekomplexe .

3. Baumycin A₂, das Anthracyclinglycosid-Isomere der Formel

C-CH^

mit den folgenden charakteristischen Eigenschaften:

- 38 -

7098B1 /08U

M/18 156 U-

272U41

(a) einem Schmelzpunkt von I85 bis 189⁰C,

(b) einer spezifischen Drehung [αJ_D + 135° (c = 0,1, CHCl₃),

(c) den folgenden durch Kieselsäure-DünnschichtChromatographie bestimmten R_-Werten:

1. im Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol (10:1), R_f = 0,08,

2. im Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol/Benzol (7:3:3), R_f = 0,28,

3. im Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol/Ameisensäure (90:10:1), R_f = 0,17,

4. im Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol/Essigsäure (80:20:4), R_f = 0,64 und

(d) einem charakteristischen C -NMR-Absorptionspeak bei 101,6 ppm (relativ zu Tetramethylsilan) in Form einer Lösung in CDCl, bei einer Konzentration von 44 mg Baumycin A₂/O,6 ml CDCl, (Varian XL-100-Ger'ät bei 25,2 MHz),

4. Baumycin B₁, das Anthracyclinglycosid-Isomere der Formel

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7098B1/08U

M/18 156

272UA1

mit den folgenden charakteristischen Eigenschaften

(a) einem Schmelzpunkt von l8l bis l89°C,

(b) den folgenden durch Kieselsäure-Dünnschichtchromatographie bestimmten R--Werten:

1. im Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol (10:1), R_f = 0,07,

2. im Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol/Benzol (7:3:3), R_f = 0,39,

3. im Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol/Ameisensäure (90:10:1), R_f = 0,18,

4. im Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol/Essigsäure (80:20:1«), R_f = 0,64 und

(c) einem charakteristischen C -NMR-Absorptionspeak bei 107,1 ppm (relativ zu Tetramethyleilan) in Form einer

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Lösung in CDCl,/Methanol (5:1) bei einer Konzentration von ^5 mg Baumycin B₁ZO,6 ml Lösungsmittel (Varian XL-100-Gerät bei 25,2 MHz),

sowie dessen nicht-toxische Säureadditionssalze und Desoxyribonukleinsäurekomplexe.

5. Baumycin B₂, das Anthracyclinglycosid-Isomere der Formel

mit den folgenden charakteristischen Eigenschaften

(a) einem Schmelzpunkt von 197 bis 201°C,

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7098 B 1 /OßU

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1. im Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol (10:1), R_f = 0,01,

2. im Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol/Benzol (7:3:3), R_f = 0,lH,

3. im Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol/Ameisensäure (90:10:1),R_f = 0,10

ή. im Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol/Essigsäure (80:20:110), R_f = 0,30 und

(c) einem charakteristischen C '-NMR-Absorptionspeak bei 102,1 ppm (relativ zu Tetramethylsilan) in Form einer Lösung in CDCl,/Methanol (1:1) bei einer Konzentration von 30 mg Baumycin B₂/O,6 ml Lösungsmittel (Varian XL-100-Gerät bei 25,2 MHz),

6. Verfahren zur Herstellung von Bauraycin A₁, A₂, B₁ und/oder Β-, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Baumycin A₁, A-, B₁ und/oder B₂ erzeugenden Stamm von Streptorayces aus der Gruppe bestehend aus Streptomyces coeruleorubidus ME 130-A¹I (FERM-P35¹*O, ATCC 31276), Streptomyces peuceticus subsp. carneus ATCC 2135²J, Streptomyces coeruleorubidus ATCC 137*10, Streptomyces peuceticus subsp. caestus NRRL B-5337, Streptomyces peuceticus NRRL B-3826 und Streptomyces coeruleorubidus NRRL B-3045 in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen so lange kultiviert, bis eine wesentliche Menge von Baumycin A₁, A₂, B₂ und/ oder B₂ durch den Mikroorganismus im Kulturmedium gebildet worden ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer zusätzlichen Stufe das Baumycin A₁, A₂, B₁ und/ oder B₂ aus dem Kulturmedium gewinnt.

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8. Arzneimittel, bestehend aus Baumycin A₁, A„, B und/oder Bp und/oder mindestens einem nicht-toxischen Säureadditionssalz und/oder Desoxyribonukleinsäurekomplex davon zusammen mit einem inerten, pharmakologisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.

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