DE2028403B2 - Pepstatin - Google Patents

Description

CH₃

CH₂ OH

CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CH-CH₂CO-NH-CH-CO-NH-CH-CH-CH₂-COOh

(L)

(L)

2. Verfahren zur Isolierung von Fepstatin gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stamm von Pepstatin erzeugenden Slreptomyces in einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen so lange gezüchtet wird, bis das Kulturmedium eine merkliche Aktivität zur Inhibierung von Pepsin besitzt und das Pepstatin von dem Kulturmedium abgetrennt wird.

3. Pepsininhibierendes pharmazeutisches Mittel, enthaltend die als Pepstatin bezeichnete Verbindung nach Anspruch 1, ihre pharmakologisch verträglichen Ester und bzw. oder Salze sowie übliche Trägerstoffe, Verdünnungsmittel und bzw. oder Hilfsstoffe.

Die Erfindung betrifft ein neues und wertvolles mikrobielles Produkt, das als Pepstatin bezeichnet (L)

wird und Pepsin sowie dessen Erzeugung zu inhibieren vermag Insbesondere bezieht sich die Erfindung aui ein Verfahren zu seiner Herstellung durch Gäruns sowie auf Methoden zu seiner Abtrennung und Reinigung. In den Rahmen der Erfindung fällt dieses Antipepsinmittel, seine Salze und Ester in verdünnten Lösungen, in Form von Rohkonzentraten, in Form von Rohfeststoffen sowie in Form von gereinigten Feststoffen und in reinen kristallinen Formen. Diese Substanz, ihre Salze und Ester eignen sich zur Inhibierune von Pepsin und besitzen eine therapeutische und^schützende Wirkung gegenüber einem experimentell erzeugten Magengeschwür bei Ratten und Mäusen Diese Verbindungen besitzin eine geringe Toxizitäl und eignen sich zur Behandlung von Geschwüren des menschlichen Magens und Duodenums.

Durch die Erfindung wird ein Pepsininhibitor vorgeschlagen, der als Pepstatin bezeichnet wird und folgende Struktur aufweist:

CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ CH₃

CH CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ CH CH

CH₂ CH CH CH, OH CH₁ CH₂ OH

Il I 1*1 I ' Il

CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CH-CH₂-CO-NH-CH-CO-Nh-CH-CH-CH₂-COOH

(L)

(L)

Diese Antipepsinverbindung sowie deren Salze und Ester verhindern wirksam eine Proteaseaktivität des Pepsins. Pepstatin ist in Methanol, Essigsäure, Dimethylsulfoxyd und Pyridin löslich und in Äthanol, Propanol, Butanol und Amylalkohol wenig löslich und löst sich in Äthylacetat, Butylacetat, Äthyläther, Tetrachlorkohlenstoff, Hexan, Petroläther, Benzol und Chloroform nicht.

Pepstatin schmilzt bei 228 bis 229° C und zeigt eine starke Endabsorption ohne ein Maximum, mit Ausnähme einer niedrigen Schulter bei 260 bis 270 ηΐμ (Ej* = ungelahrO,3). Die Linksdrehung? = [«] - 90° (C = 0,288 in Methanoi). Die Verbindung liefert eine positive Rydon-Smith-Reaktion (falls sie auf einem Dünnschichtchromatogramm gelestet wird und eine Natriumhydroxylösung vor dem Aufsprühen des Reagenzes versprüht wird). Die Hinhydrin-Reaktion ist negativ, desgleichen die Sakaguchi-Reaktion, die Naphtoresorcin-Reaktion sowie die Anisaldehyd/ Schwefelsäure-Reaktion. In dem Infrarolteil des Spektrums werden nach einer Pellelisierung mit Kaliumbromid folgende Banden festgestellt: 3320, 3090, 2955. 1710. 1635. 1545, 1470, 1420, 1390, 1370, 1300, (L)

1220, 1178, 1070 und 710 cm~'. Die Verbindung entspricht der Formel C₃₄H₆₃N₅O₉. Diese Forme ergibt sich durch das Massenspektrum des Methylesters des Diacetyl-Derivats sowie durch Elementaranalyse. Ferner liefert die Verbindung L-Valin unc L-Alanin nach einer Hydrolyse in einem Verhältnis von 2:1. Ferner weist sie eine Carboxylgruppe auf die einen Methylester liefert (C₃₅H₆SN₅O₉, F. 24S bis 251"C). Dieser Methylester inhibiert Pepsin

Durch die Erfindung wird ferner ein Verfahren zui Isolierung von Pepstatin vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Stamm von Pepstatir erzeugenden Streplomyces in einem Nährmediurr unter aeroben Bedingungen so lange gezüchtet wird bis das Kulturmedium eine merkliche Aktivität zui Inhibierung von Pepsin besitzt und das Pepstatir von dem Kulturmedium abgetrennt wird.

Ebenso fallen in den Rahmen der Erfindung dii Verwendung von Pepstatin zur Herstellung seine: Methyl- bzw. Äthylesters und seines Natrium-, Magne sium-, Calciumsalzcs. Die Salze und Ester von Pepsta tin vermögen ebenfalls Pepsin zu inhibieren.

Pepstatin weist eine Carboxylgruppe auf und laß

■.ich in einfacher Weise nach üblichen Methoden zur Umwandlung von Carboxylgruppen in Estergruppen verestern, beispielsweise durch Erhitzen in saurem Methanol, durch die Diazomethan-Reaktion od. dgl.

Die Zeichnungen zeigen in

F i g. 1 das Infrarotspektrum von Pepstatin, pelletisiert in Kaliumbromid,

F i g. 2 das Infrarotspektrum des Methylesters von Pepstatin, pelletisiert in Kaliumbromid.

Pepstatin wurde in Kulturfiltration von verschiedenen Schimmelpilzen festgestellt. Darüber hinaus konnte ermittelt werden, daß Pepstatin eine therapeutische oder schützende Wirkung gegenüber Magengeschwüren ausübt. Man kann behaupten, daß Pepstatin die erste Verbindung ist, die in spezifischer Weise Pepsin zu inhibieren vermag. Vor Pepstatin war kein spezifischer Pepsin-Inhibitor bekannt.

Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Pepstatin und seine pharmakologisch verträglichen Ester und Salze der üblichen Trägerstoffe und oder Verdünnungsmittel und/oder HilfsstofTe enthaltendes Pepsin inhibierendes Arzneimittel.

Pepstatin konnte bereits in einigen Spezien von Schimmelpilzen gefunden werden. Man nimmt an, daß diese Verbindung bei Schimmelpilzen weit verbreitet ist. Im folgenden werden die Charaktere von drei Stämmen beschrieben, aus welchen Pepstatin isoliert worden ist. Die Beschreibung in eckigen Klammern lehnt sich an den Color-Standard an, der im »Color Harmony Manual of Container Corporation of America« angegeben ist.

Eigenschaften des Stamms MC 144-Cl

Der Stamm wurde von einer Bodenprobe isoliert, die in einem Wald bei Cuxhaven in Westdeutschland im Jahre 1968 im August gesammelt worden ist. Dieser Stamm hat die Labornummer MC 144-Cl bekommen. Er wurde am 21. Mai 1969 in Kogyo Gijutsuin Hakko Kenkujyo hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer 312. Dieser Stamm wurde ferner in der »American Type Culture Collection« hinterlegt, und zwar unter der Nummer ATCC 21 469. Unter dem Mikroskop sieht man, daß die Substratmyzeln gut verzweigt sind und Luftthyphen in leicht gewellter Form aufweisen. An den Luftthyphen findet man offene Spiralen, endständige Spiralen sowie Höcker, es werden jedoch keine Wirtein beobachtet. Die Oberfläche der Sporen ist glatt.

Die Eigenschaften auf verschiedenen Medien sind wie folgt:

1. Auf einem Glyzerin-Czapek-Medium (gezüchtet bei 27°C): Der Wuchs ist hellgelb bis hellbraun und später hellgelblichbraun. Das Luftmyzel entwickelt sich leicht und ist gräulichweiß bis leichtgrau. Es wird ein gelbliches lösliches Pigment nach einem längeren Züchten erzeugt.

2. Auf einem Krainsky-Glucoseasparaginagar (gezüchtet bei 27°C): Der Wuchs ist hellgelb bis gelb [Pastel Yellow, l'/₂ fb]. Das Luftmyzel ist gräulichweiß bis leichtgrau. Kein lösliches Pigment.

3. Auf einem Calciummalatagar (gezüchtet bei 27' C): Der Wuchs ist schlecht und farblos. Das Luftmyzcl ist dünn und gräulichweiß bis leichtgrau. Kein lösliches Pigment. Keine transparente Zone wird um die Wuchsstelle herum beobachtet.

4. In Peptonwasser, das 1,0% Natriumnitrat (gezüchtet bei 27°C) enthält: Der Wuchs ist sehr schiecht und farblos. Kein Luftmyzel. Kein lösliches Pigment. Reduktion von Nitrat zu Nitrit ist nicht eindeutig.

5. Auf einer Kartoffelscheibe (gezüchtet bei 27'C): Der Wuchs ist sehr stark und hellgelb bis braun oder rötlichbraun [Rust Tan, 5 le-Brick Red, 6ng]. Das Luiunyzel entwickelt sich leicht und ist weiß bis gräulichweiß. Kein lösliches Pigment.

6. Auf einer Stärkeplatte (gezüchtet bei 27° C): Es wird bei einem 21tägigen Züchten kein Wuchs beobachtet.

7. Auf einem Peptonfleischextraktagar (gezüchtet bei 37° C): Es wird bei einem Züchten während einer Zeitspanne von 21 Tagen kein Wuchs beobachtet.

8. Auf einem Peptonfleischextraktagar (gezüchtet bei 27 C): Der Wuchs ist farblos, kein Luftmyzel, kein lösliches Pigment.

9. Auf einem koagulierten Loeffler-Serum (gezüchtet bei 37 und 30° C): Es wird nach einem Züchten während einer Zeitspanne von 21 Tagen kein Wuchs beobachtet.

10. In einem Fleischbrühe-Gelatinemedium (20 C): Der Wuchs ist farblos. Kein Luftmyzel. Kein lösliches Pigment. Es wird eine Verflüssigung der Gelatine nach dem dritten Tag des Züchtens beobachtet, wobei die Verflüssigung fortschreitet, d. h., die Verflüssigung ist stark.

11. In einem Milchmedium (gezüchtet bei 37 C): Der Wuchs ist farblos. Kein Luftmyzel. Kein lösliches Pigment. Die Milch gerinnt und wird anschließend peptonisiert. Die Koagulierung und Peptonisierung sind stark.

12. Auf einem Tyrosinagar (gezüchtet bei 27'C): Der Wuchs ist schlecht und farblos. Kein Luftmyzel. Kein lösliches Pigment. Die Tyrosinase ist negativ.

13. Auf Zellulose (gezüchtet bei 27' C): Es wird kein Wuchs während einer Zeitspanne von 21 Tagen beobachtet.

Die Verwendung von Kohlehydraten wird auf einem Pridham-Gottlieb-Medium (gezüchtet bei 27° C) getestet. Das Ergebnis ist folgendes: Glyzerin, Mannose und Rohrzucker werden verbraucht, wobei ein reichliches Wachstum eintritt. Arabinosa, Xylose, Rhamnosc, Fruktose, Inosirol, Sorbit, Maltose, Laktose, Raffinose, Dulcit, Salicin und Inulin werden nicht verbraucht. Dextrin und Stärke werden leicht verbraucht. Mannit und Galaktose ergeben einen sehr leichten Wuchs und scheinen nicht verbraucht zu werden. Die Eigenschaften des Stamms MC 144-Cl, wie er vorstehend beschrieben wurde, lassen sich wie folgt zusammenfassen: Er gehört zu den Streptomyces und bildet Spiralen, jedoch keine Wirtel. Außerdem liefert er Sporen mit einer glatten Oberfläche und erzeugt ein übermäßiges Wachstum auf Kartoffelschciben, wobei das Wachstum jedoch auf anderen Medien nicht derartig übermäßig ist. Bei einem Züchten bei 37° C ist der Wuchs schlecht. Er besitzt eine starke proteolytische Aktivität. Der Wuchs ist hellgelb, gelb oder hellbraun auf verschiedenen Medien. Das Luftmyzel ist dünn und gräulichweiß oder leicht grau auf verschiedenen Medien. Er gehört zu dem nichtchromogenen Typ. Der rötlichbraune Wuchs auf Kartoffelscheiben ist charakteristisch. Vergleicht

man diese Eigenschaften mit denjenigen bekannter Spezies, dann stellt man Ähnlichkeiten zwischen diesem Stamm und Actinomyces longisporus-flavus Krasinikov (beschrieben in »International Journal of Systematic Bacteriology«, 18, 342, 1968, sowie in Bd. 2, S. 237 des Buchs »The Actinomycetes« von S. A. W a k s m a η) fest. Die Unterschiede und Ähnlichkeiten sind wie folgt:

Stamm der gleichen Spezies zugeschrieben werden wie der Stamm MC 144-Cl.

Eigenschaften von MC210-A1

	Stamm MC 144-Cl	A. longisporus-flavus
Wirtel	keine	keine
Spirale	gebildet	gebildet
Oberfläche
der Sporen	glatt	glatt
Luftmyzel ....	dünn, gräulich	schlecht oder
	weiß bis	keines*)
	leichtgrau	reichlich.
		weißlichgelb
		bis bräunlich
		gelb**)
Wachstum ...	hellgelb, gelb.	gelb
	hellbraun
Tyrosinase ...	keine	keine
Proteolytische
Wirkung ...	stark	mittel
Hydrolyse
von Stärke	fraglich	schwach
Verbrauch von
Kohlenstoff
Rohrzucker	verbraucht	nicht verbraucht
Rhamnose	nicht verbraucht	verbraucht
Arabinose ..	nicht verbraucht	verbraucht
Xvlose	nicht verbraucht	verbraucht
Fraktose ...	nicht verbraucht	verbraucht

*) Beschrieben in »Int. J. Systematic Bacteriology«. 18. 342. 1968. **) Beschrieben in »Actinomycelcs« von S.A. Wa k s m a η. Bd. 2.

S. 237.

Wie vorstehend beschrieben, unterscheidet sich der Stamm MC 144-Cl von A. longisporus-flavus hinsichtlich des Verbrauchs von Kohlehydraten sowie hinsichtlich des Charakters des Luftmyzels. Die Farbe des Wachses des Stammes MC 144-Ci auf Karioffelscheiben ist charakteristisch. Dieser Stamm wird einer neuen Spezies zugeschrieben, die als Streptomyces testaceus gekennzeichnet wird.

Eigenschaften des Stamms MC 221-C 2

Es handelt sich um einen Stamm, der von einem Boden isoliert worden ist, welcher im Oktober 1968 in Kamakura gesammelt worden ist. Dieser Stamm erhielt die Nummer MC221-C2. Unter dem Mi kroskop sieht man, daß das Myzel gut verzweigt ist und Lufthypen aufweist, die endständige Spiralen und Hocker bilden. Es werden keine Wirtel gebildet. Das Luftmyzel ist gekrümmter als dasjenige des Stammes MC 144-Cl. Dieser Stamm verbraucht Galaktose in geringem Ausmaß. Die Verflüssigung von Gelatine ist schwach. Mit Ausnahme dieser Merkmale hinsichtlich des Zuckerverbrauchs und der Verflüssigung von Gelatine ähnelt dieser Stamm dem vorstehend be schriebenen Stamm MC 144-Cl. Daher kann dieser Dieser Stamm wurde von einer Bodenprobe isoliert, die bei Toyonaka, Osaka, im Oktober 1968 gesammelt worden ist. Dieser Stamm erhielt die Labornummer MC 210-Al. Er wurde in Kogyo Gijutsuin

i.o Hakko Kenkyujyo am 21. Mai 1969 unter der Nummer 313 hinterlegt. Dieser Stamm wurde ferner in der »American Type Culture Collection« hinterlegt, und zwar unter der Nummer 21468. Unter dem Mikroskop sieht man, daß die Substratmyzeln gut verzweigt sind und sich zu einem typischen Luftmyzel erstrecken, das eine Schlangenform aufweist. Außerdem werden Spiralen gebildet. Die Bildung von Wirtein wird nicht beobachtet. Die Oberfläche der Sporen ist glatt.

Die Eigenschaften auf verschiedenen Medien sind wie folgt:

1. Auf einem Glyzerin-Czapek-Agarmedium (gezüchtet bei 27"C): Der Wuchs ist farblos. Das Luftmyzel ist dünn und weiß, leichtgrau oder grau. Kein lösliches Pigment.

2. Auf einem Krainsky-Glucoseasparaginagar (gezüchtet bei 27°C): Der Wuchs ist farblos bis hellgelb. Das Luftmyzel ist gräulichweiß bis leichtgrau. Es wird ein leichtgelbgefärbtes lösliches Pigment gebildet.

3. Auf einem Calciummalatagar (gezüchtet bei 27 C): Der Wuchs ist farblos. Das Luftmyzcl ist weiß, leicht bräunlichgrau bis grau. Kein lösliches Pigment. Es wird keine transparente Zone um die Wuchsstelle herum beobachtet.

4. In Peptonwasser, das 1,0% Natriumnitrat enthält (gezüchtet bei 27"C): Der Wuchs ist farblos. Das Luftmyzel ist weiß. Kein lösliches Pigment. Es

wird etwas Nitrit gebildet.

5. Auf Kartoffelscheiben (gezüchtet bei 27⁰C): Der Wuchs ist hellgelblichbraun bis dunkelgelb [Mustard, 2Ie]. Es treten reichlich Luftmyzeln auf, die weiß, gräulichweiß bis leichtgrau sind.

Es wird ein hellgelblichbraunes lösliches Pigment

gebildet.

6. Auf einer Stärkeplatte (gezüchtet bei 27"C): Der Wuchs ist hellgelb bis gelb. Das Luftmyzel ist weiß bis bräunhchweiß bis leichtbräunlichgrau.

Es wird ein hellgelbes bis gelbes lösliches Pigment

gebildet. Die Hydrolyse von Stärke ist schwach.

7. Auf einen Peptonfleischextraktagar (gezüchtet bei 37°C): Der Wuchs ist farblos. Das Luftmyzel ist weiß. Kein lösliches Pigment

8. Auf einem Peptonfleischextraktagar (gezüchtet

bei 27°C): Der Wuchs ist farblos. Es werden reichlich Luftmyzeln gebildet, die weiß sind.

Kein lösliches Pigment

9. Auf einem koagulierten Loeffler-Serum (gezüchtet

bei 37⁰C): Der Wuchs ist farblos bis hellgelb

Das Luftmyzel ist gelblichweiß. Kein lösliches Pigment, keine Verflüssigung.

10. In einer Gelatinekultur (gezüchtet bei 20°C)

Der Wuchs ist farblos, hellgelb bis hellgelblich-

braun. Das Luftmyzel ist weiß. Es wird ein bräunliches lösliches Pigment gebildet. Nacl einem ungefähr 20tätigen Züchten wird eine sehi schwache Verflüssigung festgestellt.

11. In Milch (gezüchtet bei 37°C): Der Wuchs ist Erfindungsgemäß werden daher nicht die Namen farblos. Kein Luftmyzel. Kein lösliches Pigment. der vorstehend angegebenen Spezies verwendet, son-Die Milch wird geronnen und peptonisiert, wobei dem der Begriff »Pepstatinerzeugende Streptomyces« jedoch die Gerinnung und die Peptonisierung re- eingesetzt.

lativ schwach sind. 5 Verfahren zum Testen der Aktivität von Pepstatin

12. Auf einem Tyrosinagar (gezüchtet bei 27° C): Der im Hinblick auf die Inhibierung von Pepsin:
Wuchs ist farblos. Das Luftmyzel ist weiß, grau- Die von K u η i t ζ i s in »J. General Physiology«, lichweiß bis leichtgrau. Kein lösliches Pigment. 30, 291, 1947, beschriebene Methode wird modifi-Die Tyrosinase ist negativ. ziert, wobei Pepsin (in den Handel gebracht von der

13. Auf Zellulose (gezüchtet bei 27"C): Der Wuchs _I0 Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) und ist gering, und es wird keine Zersetzung beob- Kasein (in den Handel gebracht von Wako Junyaku, achtet. . Osaka, Japan) verwendet werden. Kasein wird in einem

0,08-m Milchsäurepuffer (pH 2,2) in einer Menge von

Es wird die Verwendung von Kohlehydraten auf 0,6% aufgelöst, worauf 1 ml dieser Kaseinlösung dem Pridham-Gottlieb-Mcdium getestet, wobei fol- i₅ 0,7 ml eines 0,02n-HCl-0,02-m KCI-Puffers (prJ 2,0) gende Ergebnisse erhalten werden: Glyzerin, Xylose, und 0,2 ml dieser Pufferlösung mit und ohne Test-Glukose, Fruktose, Mannose, Galaktose, Inosit, Man- probe zugesetzt werden. Dann wird bei 37⁰C während nit. Sorbit, Maltose, Rohrzucker, Raffinose, Dextrin einer Zeitspanne von 3 Minuten inkubiert. Anschlie- und Stärke werden verbraucht, wobei ein guter Wuchs ßend werden 0,1 ml, enthaltend 4 μg Pepsin in 0,02 nerzielt wird. Laktose und Salicin werden nicht ver- 20 HCl 0,02-m KCl-Puffer (pH 2,0) zugesetzt, worauf braucht, da der Wuchs sehr gering ist. Rhamnose, vermischt und bei 37°C während einer Zeitspanne Arabinose, Dulcit und Inolin werden nicht ver- von 30 Minuten inkubiert wird. Dann werden 2,OmI braucht. Die Eigenschaften des Stammes MC210-A1. Perchlorsäure (1,7 m) zum Abstoppen der Reaktion welcher vorstehend beschrieben worden ist, lassen zugesetzt.

sich wie folgt zusammenfassen: Er gehört zu einem 25 Nach einer Stunde wird zentrifugiert, worauf die nicht-chromogenen Typ von Streptomyces. Es werden überstehende Flüssigkeit auf ihre optische Dichte (a) Spiralen, jedoch keine Wirtein gebildet. Die Ober- bei 280 ηΐμ untersucht wird. Die Reaktionsmischung fläche der Sporen ist glatt. Der Wuchs ist farblos, ohne Pepstatin wird in ähnlicher Weise behandelt, hellgelb oder gelb auf verschiedenen Medien. Auf Aus dieser optischen Dichte wird der Prozentsatz der verschiedenen Medien ist das Luftmyzel weiß bis ₃₀ Inhibierung (b-a)/b ■ 100 berechnet. Die Pepstatinleichtgrau. Es wird im allgemeinen kein lösliches menge in einem Testmaterial wird aus dem Prozent-Pigment erhalten, es tritt höchstens ein gelblich bis satz der Inhibierung und einer Standardkurve für die bräunliches Pigment in geringer Menge auf. Der Konzentration von Pepstatin und dem Prozentsatz Siamm besitzt eine schwache proteolytische Aktivität der Inhibierung erhalten. Pepstatin zeigt eine 50%ige und hydrolytische Aktivität auf Stärke. Von den bc- 35 Inhibierung, wenn es in einer Menge von 0,02 μg der kannten Spezies von Schimmelpilzen ähnelt Strep- Reaktionsmischung zugesetzt wird.
tomyces argenteolus (beschrieben von Fried, Per- Pepstatin erzeugende Streptomyces liefern unter man. Langlykke und Tit us in »International geeigneten Bedingungen Pepstatin. Die Herstellung Journal of Systematic Bacteriology«. 18, 295, 1968, erfolgt in der Weise, daß Sporen oder Myzeln des sowie in dem Buch »Actinomycetes« von 40 Pepstatin erzeugenden Organismus auf ein geeignetes S. A. Waksman, Bd. 2, S. 175) am meisten diesem Medium aufgeimpft werden, worauf unter aeroben Stamm. Der Stamm MC 210-Al ähnelt S. argenteolus, Bedingungen gezüchtet wird. Zur Erzeugung von mit Ausnahme des Verbrauchs von Kohlehydraten Pepstatin ist ein Züchten auf einem festen Medium und der Verflüssigung von Gelatine. Daher wird der möglich, zur Erzeugung größerer Mengen wird jedoch Stamm MC 210-Al als eine Variante dieser Spezies 45 ein Züchten in einem flüssigen Medium bevorzugt, eingestuft, d. h. von Streptomyces argenteolus var Jede Gärungstemperatur kann innerhalb des Betoyonakensis. reiches eingehalten werden, in welchem die Pepstatin Streptomyces testaceus und Streptomyces argen- erzeugenden Organismen wachsen und Pepstatin teolus var. toyonakensis umfassen alle Mutanten und erzeugen können, wobei jedoch 25 bis 35° C bevorzugt Varianten, d. h. alle pepstatinerzeugenden Mutanten 50 werden. Medien, die aus bekannten Nährquellen für und Varianten. Man kann keinen Unterschied zwi- Schimmelpilze bestehen, eignen sich zur Herstellung sehen diesen Spezies einschließlich ihrer Mutanten von Pepstatin. Beispielsweise seien Peton, Fleisch- und Varianten und der Definition von Streptomyces extrakt, Hefeextrakt, Maisflüssigkeit, Baumwollsamentestaceus und S. argenteolus var. toyonakensis machen. mehl, Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, N-Z-Amin, Ka-Darüber hinaus ist Pepstatin ein Inhibitor einer Pro- 55 sein. Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumtcase und vermag die Aktivität der Protease in sulfat sowie andere stickstoffhaltige Materialien, wie Schimmelpilzen zu steuern. Man nimmt daher an, beispielsweise Weizenkleie, Reiskleie o. dgl, als gedaß Pepstatin in breitem Umfange durch Schimmel- eignete Stickstoffquellen erwähnt. Die im Handel pilze erzeugt wird. Erfindungsgemäß konnte Pep- erhältlichen Produkte, wie beispielsweise Laktose, statin auch von anderen Stämmen isoliert werden, die 60 Glyzerin. Rohrzucker, Stärke, Glukose, Maltose, Mezu anderen Spezies gehören. Beispielsweise wurde lassen sowie andere Kohlehydrate oder Fette in reiner festgestellt, daß ein anderer Stamm, und zwar der oder roher Form eignen sich als Kohlenstoffquellen. Stamm MC 284-Cl. der von einer Bodenprobe iso- Glyzerin, Glukose, Maltose, Dextrin und Stärke sind liert worden ist, welche bei Shinhoriuchi, Saitama Beispiele für billige und geeignete Kohlenstoffquellen Prefecture gesammelt worden ist, ebenfalls Pepstatin 65 zur Erzeugung von Pepstatin. Natriumchlorid, Naerzeugt. Dieser Stamm erzeugt ebenfalls Mitomycine trium- oder Kaliumphosphat, Calciumcarbonat oder und wurde versuchsweise als Streptomyces caespitosus Magnesiumionen können ebenfalls zugesetzt werden, klassifiziert. Spuren von Metallsalzen können gegebenenfalls zu-

gesetzt werden. Alle Arten von Bestandteilen, die von Pepstatin erzeugenden Organismen zur Erzeugung von Pepstatin verbraucht werden können, sind geeignet. Alle Materialien, die sich zum Züchten von Schimmelpilzen als geeignet erwiesen haben, lassen sich verwenden.

Die Gärung wird so lange fortgesetzt, bis sich eine merkliche Menge an Pepstatin angereichert hat. Beispielsweise wird der Stamm MC 144-Cl auf verschiedene Medien aufgeimpft, die verschiedene Kohlenstoffquellen. verschiedene Stickstoffquellen, 3% NaCl, 0,1% MgSO₄· 7H₂O, 0,1% K₂HPO₄ und 0,1 ml/100 ml einer Metallösung enthalten, worauf bei 27 bis 29° C auf einer sich hin- und herbewegenden Maschine gezüchtet wird (Schwingungsbreite 8 cm, 200 Hin- und Herbewegungen pro Minute). Die Metallösung besteht aus 700 mg CuSO₄ · 5 H,O, 100 mg FeSO₄-7H₂O, 800mg MnCl₂-4H₂O und 200mg ZnSO₄ · 7H₂O in 100 ml destilliertem Wasser. Schüttelkolben mit einem Volumen von 500 ml werden verwendet, wobei jeweils 100 ml eines jeden Mediums in den Kolben eingebracht werden. Jeden Tag werden aus der Schüttelkultur 0,05 ml eines lOOfach verdünnten Brühefiltrats auf ihre Antipepsinaktivität getestet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle I zusammengefaßt. Die Pepstatin-Erzeugung wird bereits nach 2tägigem Züchten unter Schütteln ersichtlich. Die maximale Ausbeute wird nach 4- bis 7tägigem Züchten festgestellt. Der pH beträgt bei der maximalen Erzeugung ungefähr 9,0. Sogar dann, wenn ein pH von 9,0 während des Züchtens unter Schütteln während einer Zeitspanne von 10 Tagen aufrechterhalten wird, wird keine Abnahme des Pepstatins beobachtet, woraus dessen Stabilität hervorgeht. Wie aus der Tabelle I ersichtlich ist, können verschiedene Kohlenstoffquellen und stickstoffhaltige Materialien zur Herstellung von Pepstatin verwendet werden.

Tabelle I Erzeugung von Pepstatin in verschiedenen Medien

Medium-Nr.

Zeitspanne (Tage) des Züchtens und Inhibicrung (in %) von Pepsin durch 0,05 ml eines lOOfach verdünnten Kulturfiltrats

(pH)

1	7,4
2	6,9
3	6,2
4	5,3
5	7,8
6	7,9
7	7.6
8	7,3
9	5.7
10	7,2
Il	6,3
12	5,3
3	6,7
14	7,6
15	6,3
16	5.3

	4	(pH)
(%)	6,8
9,9	7.9
50	8,0
56	5.3
47	8,5
36	8,0
37	7,7
18	8,2
8,2	7,7
82	8,4
84	6,3
40	5.4
35	8,0
81	8,2
83	5,5
52	5,4
31

24,1 84 71 64 39 32 29 9.4 92 81 69 43 83 84 76 31

Kohlenstoff- und Stickstoffquellen der Medien

(pH)

7.8 8,1 8.4 5,4 8,8 8,6 7,9 8.5 8,3 8,7 6,5 5.4 8.5 8,4 6.4 5.8 86
70
62

85
83
80

83
85
77-

(pH)

8,5
8.4
8,5
5,4
8,9
8,7
8,2
8,3
8,2
8,4
7.0
5.4
8.4
8.2
7,8
6,3

J"'" L

14,0

(pH)

8,8 8,7 8,7 7,2 9,0 8.8 8,6 7,6 8,7 8,3 8,3 5,9 8,8 8,3 8,3 7,1

85 67

72

82 82

85 88 81

Nr. 1: 2% Glyzerin, 0,75% Fleischextrakt, 0,75% Pepton; Nr. 2: 2% Glyzerin, 1,0% N-Z-Amin, 0,2% Hefeextrakt; Nr. 3: 2% Glyzerin, 1,5% Sojabohnenmehl; Nr. 4: 2% Glyzerin, 1,5% Maisflüssigkeit; Nr. 5: 2% Laktose, 0,75% Fleischextrakt, 0,75% Pepton; Nr. 6: 2% Laktose, 1,0% N-Z-Amin, 0,2% Hefeextrakt; Nr. 7: 2% Laktose, 1,5% Sojabohnenmehl; Nr. 8: 2% Laktose, 1,5% Maisflüssigkeit; Nr. 9: 1% Glukose, 1% Laktose, 0,75% Fleischextrakt, 0,75% Pepton; Nr. 10: 1% Glukose, 1% Laktose, 1% N-Z-Amin, 0,2% Hefeextrakt; Nr. 11: 1% Glukose, 1% Laktose, l,5%Sojabohnenmehl; Nr 12: 1% Glukose, 1% Laktose, 1,5% Maisflüssigkeit; Nr. 13: 2% Glukose, 1,0% N-Z-Amin, 0,2% Hefeextrakt; Nr. 14: 2% Glukose, 1,0% N-Z-Amin, 0,2% Hefeextrakt; Nr. 15: 2% Glukose, 1,5% Sojabohnenmehl; Nr. 16: 2% Glukose, 1,5% Maisflüssiekeit.

Zur Herstellung von Pepstatin durch Gärung kann man auf die üblichen Methoden zurückgreifen, die

zur Herstellung von Antibiotika verwendet werden. Beispielsweise können 1001 eines Mediums in eine rostfreie Gärungseinrichtung mit einem Fassungsvermögen von 2001 eingebracht und sterilisiert werden, worauf der Pepstatin erzeugende Organismus aufge-

impft wird. Das Gären wird dann unter Zufuhr von 1001 steriler Luft pro Minute durchgeführt. Nach 45 bis 60 Stunden erreicht die Erzeugung an Pepstatin ihren Höhepunkt.

Erfindungsgemäß werden ferner Methoden zur Isolierung und Reinigung von Pepstatin, seinen Salzen sowie seinen Estern zur Verfugung gestellt.

Pepstatin ist bei einem pH von 2,0 bis 9,0 stabil, wenn die Lösungen bei diesen verschiedenen pH-

Werten auf 60^aC während einer Zeitspanne von 30 Minuten erhitzt werden. Pepstatin verliert dabei keinerlei Aktivität.

Pepstatin, das in Wasser nur wenig löslich ist, liegt nicht nur in der Kulturbrühe, sondern auch in der Myzelmasse vor. Ist die Gärungsausbeute nicht groß, dann liegt das meiste Pepstatin in dem flüssigen Teil vor. 1st die Ausbeute jedoch hoch, dann findet man eine große Menge eingeschlossen in der Myzelmassc. Pepstatin in der Myzelmasse wird mit Lösungs- |_O mitteln extrahiert, in welchen Pepstatin löslich ist. Beispielsweise erfolgt die Extraktion mit Methanol. Pepstatin weist Carboxylgruppen auf und bildet Salze, beispielsweise Salze von Na ⁺ , Ka ⁺ , NH₄ ⁺, Li ⁺ , Ca⁺⁺, Mg⁺⁺, Cu⁺\ Ba⁺⁺, Fe⁺⁺, Mn⁺⁺ od. ,₅ dgl. Natrium- oder Kaliumsalze von Pepstatin besitzen ähnliche Löslichkeiten wie Pepstatin, wobei jedoch die Salze von Calcium, Magnesium und Schwermetallen in Wasser und Methanol weniger löslich sind. Daher ist es zweckmäßig, Pepstatin aus der Myzelmasse in die Lösungsmittel in saurem Zustand zu extrahieren. Pepstatin ist in Methanol, das Calciumchlorid enthält, löslicher. Daher besteht eine geeignete Methode zur Extraktion von Pepstatin aus einer Myzelmasse darin, die Extraktion unter Verwen- *₅ dung eines sauren Methanols durchzuführen, das CaCl₂ enthält. Pepstatin in dem flüssigen Teil wird mit mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahiert, in welcher Pepstatin löslicher ist als in Wasser. Beispielsweise erfolgt die Extraktion mit Butanol. Die Eindampfung einer Pepstatin-Lösung lietert ein rohes Pulver, das Pepstatin oder Pepstatin-Kristalle enthält. Ist die Gärungsausbeute hoch, dann liefert die Eindampfung des Butanolextrakts aus der Kulturbrühe Pepstatin-Kristalle.

Pepstatin ist eine stabile Verbindung. Daher kann das Kulturfiltrat durch Destillation konzentriert werden, vorzugsweise unter vermindertem Druck. Aus der konzentrierten Lösung oder aus dem getrockneten Rückstand erfolgt eine Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, beispielsweise Methanol, Butanol od. dgl. Pepstatin ist in diesen Verbindungen in ausreichendem Maße löslich. Die Kulturbrühe, welche Myzeln enthält, kann mit Lösungsmitteln, die mit Wasser nicht mischbar sind, extrahiert werden, beispielsweise mit Propanol, Butanol oder Amylalkohol, wobei das Pepstatin in dem flüssigen Teil sowie in dem Myzelteil gleichzeitig extrahiert wird.

Zur Extraktion von Pepstatin in die Lösungsmittel kann man auf übliche Methoden zurückgreifen, beispielsweise kann man Vielstufen-Extraktionsmethoden anwenden. Dabei kann beispielsweise eine Podobealniak-Zentrifuge verwendet werden.

Die Adsorption eignet sich ebenfalls zur Extraktion und Reinigung von Pepstatin. Zu diesem Zweck eignen sich Aktivkohle, Ionenaustauscherharze, Aluminiumoxyd, Kieselgel od. dgl. Beispielsweise kann Pepstatin in Kulturfiltraten durch Aktivkohle adsorbiert und anschließend mit Wasser gewaschen werden. Pepstatin auf Kohlenstoff wird mit Methanol oder wäßrigem Methanol eluiert. Bei der Eluierung hat eine Erhöhung der Temperatur eine Ausbeutesteigerung zur Folge. Wird beispielsweise Aktivkohle dem Kulturfiltrat in einer Menge von 2,0% zugesetzt und wird die Kohle zweimal mit dem 20fachen Volumen an Methanol bei 40⁰C unter Rühren behandelt, dann wird Pepstatin eluiert, wobei die Ausbeute aus dem Kulturfiltrat ungefähr 80% beträgt. Die Aktivkohle-Chromatographie eignet sich ferner zur Reinigung von Pepstatin. Beispielsweise kann man nach einer Adsorption von Pepstatin an Kohlenstoff und nach dem Waschen des Kohlenstoffs mit 40%igem wäßrigem Methanol (Methanol 40: H₂O 60) eine Pepstatin-Chromatographie unter Verwendung von b0%igem wäßrigem Methanol (Methanol 80: H₂O 20) durchführen. Die Verwendung von Aktivkohle eignet sich ferner zur Entfernung von gefärbten Verunreinigungen. Die Kieselgel-Chromatographie ist ebenfalls zur Reinigung von Pepstatin geeignet. Beispielsweise eignet sich eine Mischung aus n-Butanol, Essigsäure, Wasser und Butylacetat (4:1:1:4, bezogen auf das Volumen) oder eine Mischung aus Äthylacetat und Methanol (3:1, bezogen auf das Volumen) als Lösungsmittelsystem zur Reinigung von Pepstatin mittels Kieselgel-Chromatographie. Eine Aluminiumoxyd-Chromatographie kann ebenfalls zur Reinigung herangezogen werden. Beispielsweise wird eine derartige Chromatographie unter Verwendung von Methanol, Äthanol, Butanol oder einer Mischung aus diesen Alkoholen mit Estern durchgeführt.

Pepstatin weist eine Carboxylgruppe auf. Als Folge dieser Säuregruppe werden starke oder schwach basische Ionenaustauscherharze zur Extraktion und Reinigung von Pepstatin verwendet.

Pepstatin läßt sich selbst in sehr einfacher Weise kristallisieren. Ein Lösungsmittel, in welchem Pepstatin löslich ist, eignet sich zur Kristallisation. Ein Beispiel ist Methanol.

Die Carboxylgruppe des Pepstatins läßt sich in einfacher Weise in einen Ester umwandeln, und zwar durch Einhaltung üblicher Methoden zur Herstellung von Estern, beispielsweise durch Erhitzen mit dem entsprechenden Alkohol nach der Säure- oder Diazomethan-Methode. Ester sind ebenfalls zur Inhibierung von Pepsin geeignet. Der Methylester ist aktiver als das Pepstatin.

Ist die Ausbeute an Pepstatin in dem Nährungsmedium hoch, dann werden Pepstatin-Kristalle nach einer einfachen Methode erhalten. Beispielsweise erfolgt eine Extraktion von Pepstatin mit Butanol und eine Konzentration des Butanolextraktes unter Vakuum, wobei kristallines Pepstatin erhalten wird, das aus Methanol umkristallisiert wird. Dabei werden weiße Pepstatin-Kristallnadeln erhalten.

Nachfolgend werden die Eigenschaften von Pepstatin beschrieben. Pepstatin kristallisiert in Form weißer nadelartiger Kristalle aus. Das am meisten gereinigte Pepstatin schmilzt bei 228 bis 229'C. Es ist optisch aktiv. Der Wert \_'i\" beträgt in einei 0,288%igen Methanollösung -90°. Die Elementaranalyse liefert folgende Ergebnisse: Berechnet füi C₃₄H^₃N₅O₉: C 59,53, H 9,25, N 10,21, O 20,99. Ge funden: C 59,02, 60,27, H 9,27, 9,37, N 10,11, 9,90 O21,41, 21,15. Auf der Basis der Analyseergebnissf können die Formeln C₃₅H₆₅H₅O₁₀ (die berechneter Werte sind wie folgt: C 58,72, H 9,15, N 9,78, O 22,35 und C₃₅H₆₅N₅O₉ (die berechneten Werte sind wi< folgt: C 60,06, H 9,36, N 10,01, O 20,57) nicht ausge schlossen werden. Jedoch wird die Formel C₃₄H₆₃N₅O durch das Massenspektrum bestätigt. Der Hauptpeal des Methylesters von Diacetylpepstatin liegt bei 78! und derjenige des Methylesters von Pepstatin be 699. Die Bestimmung des Molekulargewichts nach de Akiya-Berger-Methode unter Verwendung einer Pyr idinlösung von Pepstatin ergibt ein Molekulargewich von 600 bis 730.

824

Das Infrarotspektrum wird in F i g. 1 gezeigt Bei den nachstehend angegebenen Wellenzahlen werden Banden beobachtet: 3320, 3090, 2955, 1710. 1635. 1545, 1470, 1450, 1420, 1390, 1370, 1300, 1220. 1178, 1070 und 710 cm"¹. Das Infrarotspektrum des Methylesters von Pepstatin wird in F i g. 2 gezeigt. Das NMR-Spektrum des Methylesters von Diacetylpepstatin wird unter Verwendung der Varian HA-100-Vorrichtung in Tetradeuteromethanol unter Verwendung von Trimethylsilan als interner Standard auf- ι ο genommen. Es wird durch F i g. 3 wiedergegeben.

Die Hydrolyse von Pepstatin in 6n-HCl bei 100 C während einer Zeitspanne von 18 Stunden liefert L-Alanin und L-Valin, und zwar, wie eine Aminosäureanaiyse ergibt, in einem Verhältnis von 1:2. Pepstatin liefert eine positive Rydon-Smith-Reaktion. Diese Ergebnisse sowie die Banden in dem Infrarotspektrum bei 1635 und 1545 cm"¹ weisen auf Peplidbindungen in Pepstatin hin.

Die Bande in dem Infrarotspektrum bei 1710 cm ' zeigt das Vorliegen einer Carboxylgruppe in Pepstatin. Diese Carboxylgruppe gibt sich ferner durch eine Adsoiption an einem Anionenaustauscherharz zu erkennen. Die Behandlung von Pepstatin mit Diazomethan oder ein Erhitzen mit Schwefelsäure und einem Alkohol liefert den entsprechenden Ester. Der Methylester von Pepstatin zeigt eine Esterbande bei 1730 cm"¹ an Stelle der Bande von 1710 cm"¹. Die Elementaranalyse des Methylesters liefert folgende Werte: Berechnet für C₃₅H₆₅N₅O₉: C 60,05, H 9,36, N 10,00, O 20,57. Gefunden: C 59,88, H 9,35, N 9,74, O 20,69.

Pepstatin, das eine Carboxylgruppe aufweist, bildet Salze. Die Salze lassen sich in einfacher Weise durch Neutralisation oder durch Zugabe einer berechneten Menge einer Base zu der Methanollösung des Pepstatins herstellen. Beispielsweise können folgende Verbindungen hergestellt werden: Natriumpepstatin (F. 250 bis 252° C, Zersetzung, berechnet für C₃₄H₆₂N₅O₉Na: C 57,68, H 8,82, N 9,89, 0 20,34, Na 3,24. Gefunden: C 57,97, H 8,92, N 9,96, O 20,26,

CH₃ CH₃

Na 2.98), Magnesiumpepstatin (F. 262 bis 263 C, Zersetzung, berechnet für: C₃₄H₆₂N₅O₉I^ Mg: C 58,58. H 8 06, N 10,04, O 20,65, Mg 1,74. Gefunden: C 58,30. H 9,05, N 9,94, O 20,84, Mg 1,49) und Calciumpepstatin (F. 262 bis 263^CC, Zersetzung, berechnet für: C₃₄H₆-^O₉IZICa: C 57,93, H 8,86, N 9,93, O 20.42. Ca 2,84. Gefunden: C 57,92, H 8,98, N 9,62, O 20.07, Ca 2,62). Calciumpepstatin ist weniger löslich in Wasser und Methanol als Pepstatin, während Pepstatin in Methanol mit CaCl₂ löslicher ist als ohne CaCl₂. Pepstatin, das eine Carboxylgruppe aufweist, liefen ferner ein Amid. Beispielsweise ergibt die Behandlung des Methylesters von Pepstatin in Methanol das Pepstatinamid.

Eine Behandlung von Pepstatin mit Essigsäureanhydrid in Pyridin liefert Diacetyl- und Monoacetyl-Pepstatin. Diese Verbindungen werden durch Säulenchromatographie unter Verwendung vor. Kieselgci und MethanolZAceton/Chloroform (5 :25 : 70, bezogen auf das Volumen) abgetrennt.

Bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselgel G werden die folgenden Rf-Werte Tür Pepstatin in den folgenden Lösungsmitteln festgestellt: 0,78 für ButylacetatZButanol/Essigsäure Wasser (6:6:1:1, bezogen auf das Volumen), 0,73 für ButylacetatZButanolZEssigsäure/Wasser (6:4:1:1), 0,76 Tür ButylacetatZButanol/Essigsäurc Wasser (4:4:1:1, bezogen auf das Volumen).

Bei einer Hochspannungselektrophorese unter Verwendung eines sauren Lösungsmittels, wie beispielsweise einer Mischung aus Ameisensäure, Essigsäure und Wasser (25:75 :900, bezogen auf das Volumen) unter einer Spannung von 350OVoIt während einer Zeitspanne von 15 Minuten bewegt sich Pepstatin nicht, woraus hervorgeht, daß keine basische Gruppe in Pepstatin vorliegen kann.

Die folgende Struktur wird für Pepstatin an Hand von Abbauuntersuchungen, des NMR-Spektrums sowie der Massenspektrometrie von Pepstatin und seinen Derivaten vorgeschlagen:

CH₃ CH₃ CH₃ CH₃

CH CH

I

CH₂ UH CH₃ CH₂ OH

Il I Il I Il

CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CH-CH₇-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CH-Ch₂-COOH

CH CH₃ CH₃ CH₃ CH₃
CH₂ CH CH

(L)

(L)

Pepstatin besitzt eine geringe Toxizität. Mäuse, Hunde, Ratten und Kaninchen vertragen eine orale Verabreichung von 2000 mg/kg des Pepstatins ohne irgendwelche toxische Anzeichen. Die LD₅₀ gegenüber Tieren bei intraperitonealer Verabreichung ist etwa wie folgt: Mäuse: 1000mg/kg, Ratten: 880mg/kg, Kaninchen 820 mg/kg, Hunde 450 mg/kg. Eine tägliche orale Verabreichung von 250 mg/kg an Ratten während einer Zeitspanne von 90 Tagen hat keinerlei Toxizitätserscheinungen zur Folge. Die Ratten wachsen mit ihrer normalen Wachstumsgeschwindigkeit.

Oral verabreichtes Pepstatin wird nicht absorbiert. Werden beispielsweise oral 50 mg/kg verabreicht, dann findet man kein Pepstatin im Blut und im Urin 24 Stunden nach der Verabreichung. Ungefähr 90% lassen sich in den Exkrementen nachweisen, die (L)

72 Stunden nach der Verabreichung ausgeschieden werden.

Die Ester, das Amid sowie die Acetylderivate von Pepstatin zeigen eine 50%ige Inhibierung von Pepsin nach der vorstehend beschriebenen Methode bei den folgenden Konzentrationen: Pepstation 0,01 μg/ml: der Methylester 0,008 μg/ml; der Äthylester 0,01 μψ ml; der p-Bromphenacylester 0,01 μg/ml; das Amid 0,027 μg/ml; das Monoacetylderivat 1,^gZmI; das Diacetylderivat 4,2^g/ml; der Methylester des Diacetylderivats 4,26 μg/ml. Jedoch zeigt Pepstatin keine Inhibierung gegenüber Thrombokinase, Plasmin Trypsin, Kallikrein, «-Chymotrypsin und Papain und zwar auch nicht in einer Menge von 250 μgZml Daher ist Pepstatin ein starker spezifischer Pepsininhibitor. Proctase ist eine Art von Pepsin, die aus

Aspergillus niger erhalten wird (vgl. Agricultural Biological Chemistry [Japan], Bd. 28, S. 216 bis 223, 1964). In der Reaktionsmiscb'.mg, wie sie vorstehend beschrieben worden ist, mit der Ausnahme, daß die gleiche Menge Proctase an Stelle des Pepsins eingesetzt wird, sind die Konzentrationen für eine 50%ige Inhibierung wie folgt: 0,02 μg/ml gegen eine Kaseinhydrolyse.

Ein starker Pepsininhibitor war bisher noch nicht bekannt. Wenn auch Schwefelsäureester von Polysacchariden dafür bekannt waren, daß sie Pepsin inhibieren, so ist die Wirkung dennoch sehr schwach, wobei außerdem ferner eine Blutkoagulierung inhibiert wird. Pepstatin ist ein starker Pepsininhibitor, wie aus der 50%igen Inhibierung hervorgeht. Außerdem übt es keinen Einfluß auf die Blutkoagulierung aus. Die starke inhibierende Wirkung gegenüber Pepsin zeigt, daß Pepstatin gegenüber Magengeschwüren wirksam ist. Dies wurde auch durch klinische Untersuchungen bestätigt.

Ein Magengeschwür von Ratten, das nach der Methode erzeugt worden ist, wie sie von T a k a g i et al. in »Japanese Journal of Pharmacology«, 18, 9 bis 18, 1968, beschrieben wird, d.h. durch Einbringen männlicher Ratten in einen Käfig bei einer Temperatur von 23° C während einer Zeitspanne von 22 Stunden, kann therapeutisch durch Pepstatin behandelt werden. 50 mg/kg des Pepstatins werden oral 30 Minuten vor dem Streß verabreicht. Die Ratten werden 43 Stunden nach dem Streß geschlachtet. Das Heilungsausmaß des Geschwürs beträgt 76,3%. Beträgt die Dosis 10 mg/kg, dann wird das Heilungsausmaß des Geschwürs zu 65.6% ermittelt. Nach der Verabreichung von 50 mg/kg Pepstatin unmittelbar nach dem Streß, wobei die Verabreichung einmal täglich während einer Zeitspanne von 4 Tagen erfolgt, werden die Ratten geschlachtet. Dabei ist eine schnelle Heilung von Geschwüren bei der Behandlung mit Pepstatin zu erkennen.

Die Wirkung gegenüber Magengeschwüren von Ratten, welche durch eine Magenausgangsreizung verursacht wird, konnte ebenfalls sichergestellt werden. Es wird die von Watenabe und K asuy a in »Chemical Pharmaceutical Bulletin«, 11, 1282, 1963, beschriebene Methode angewendet. Bei Ratten, denen 2 mg/kg oder größere Dosen 30 Minuten und 14 Stunden nach einer Magenausgangsreizung verabreicht wurden, konnte kein Geschwür festgestellt werden. Die 50-%-Inhibierungsdosis beträgt 0,5 mg/kg. Die Pepsinaktivität im Magensaft liegt etwa 10% unterhalb derjenigen einer Verg'.cichsprobe. Pepstatin besitzt daher eine gut schützende und heilende Wirkung gegenüber Shay-Rattengeschwüren. Eine orale Verabreichung von Pepstatin oder dessen Estern an Patienten mit Magen- oder Duodenumgeschwüren, wobei 1 bis 4 Tabletten zwischen den Mahlzeiten, die 25 bis 100 mg Pepstatin enthalten, d. h. 3- bis 4mal pro Tag, verabreicht werden, zeigen eine heilende Wirkung. Nach der Verabreichung verschwinden die Schmerzen schnell.

Pepstatin inhibiert nicht Papsin das eine Sulfhydrylgruppe als aktive Stelle aufweist. Jedoch zeigt Pepstatin eine inhibierende Wirkung gegenüber karrageenininduzierten Ödemen (C. A. Winter, E. A. R i s 1 e y and G. W. N u s s : Proc. Soc. Exp. Biol. & Med., III, 544, 1962). Pepstatin wird intraperitoneal injiziert, worauf Karrageenin (0,1ml einer l%igen Lösung) in die RaI tenhinterpfoten eingespritzt werden.

Nach 1,3,5 und 24 Stunden wird das ödem gemessen. Man stellt fest, daß eine mehr als 30%igc Inhibierung bei Verwendung von nicht weniger als 1,25 mg/kg Pepstatin eintritt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

100 ml eines Mediums, das 1,0% Glukose, 1,0%

ίο Stärke, 0,75% Pepton, 0,75% Fleischextrakt, 0,3% NaCl. 0,1 % MgSO₄ · 7H₂O, 0,1 % K₂HPO₄ und eine Metallionenlösung (700 mg CuSO₄-5H₂O, 100 mg FeSO₄-7H₂O, 800 mg MnCl₂-4H₂O und 200 mg ZnSO₄ · 7H₂O, gelöst in 100 ml destilliertem Wasser) enthält, werden verwendet, 0,1 ml werden in einen Schüttelkolben mit einem Fassungsvermögen von 500 m! gegeben und bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 20 Minuten sterilisiert. Der pH wird auf 7,0 nach der Sterilisicrung eingestellt. Dann werden Sporen und Myzeln des Stammes MC 144-Cl aul einem Agarmedium aufgeimpft, worauf bei 27 C auf '■ einer Schüttelmaschine gezüchtet wird (150 Hin- und Herbewegungen pro Minute bei einer Schwingungsbreite von 8 cm). Der pH beträgt am dritten Tag des Züchtens 5,7 und am vierten Tag 6,3. Die Bestimmung der Reduktion von Zucker nach der Anthronmethode ergibt eine optische Dichte von 0,9/0,005 ml am ersten Tag, 0,3/0,005 ml am vierten Tag und praktisch keine am fünften Tag. Die Kulturbrühe wird am fünften Tag filtriert, worauf 0,05 ml des lOOfach verdünnten Filtrats eine 64%ige Inhibierung von Pepsin zeigen. Am fünften Tag wird die Kulturbrühe von 29 Schüttelkolben vereinigt und filtriert. Das Pepstatin in dem Filtrat wird mit 2400 ml und 2000 ml n-Butanol nacheinarderfolgend extrahiert. Die Butanolextrakte werden vereinigt und unter reduziertem Druck eingedampft. Dabei werden 4 g eines braunen rohen Pulvers erhalten. Die 50-%-Inhibierung von Pepsin gibt sich durch Zugabe von 0,13 μg dieses Pulvers zu der Testlösung zu erkennen.

Beispiel 2

Pepstatin wird aus einem Rohpulver gereinigt, das nach einer ähnlichen Methode, wie sie im Beispiel 1 gezeigt wird, hergestellt worden ist. Dieses Rohpulver zeigt eine 50%ige Inhibierung von Pepsin bei einer Zugabe von 0,16 μg zu der Testlösung. Das Pulver wird in einer Menge von 2,1 g in 30 ml destilliertem Wasser aufgelöst, worauf diese Lösung durch eine Säule mit einer Länge von 72 cm aus 18 g

. Aktivkohle mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/Minute geschickt wird. 400 ml eines destillierten Wassers und 300 ml eines 40%igen wäßrigen Methanols werden zum Waschen der Kolonne durchgeschickt, worauf das Pepstatin auf der Kolonne mit 80%igem wäßrigen Methanol (Methanol 80: Wasser 20) eluiert wird. Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt, wobei jede Fraktion 5 g wiegt. Fraktionen, die Pepstatin enthalten, werden vereinigt und unter einem Vakuum eingedampft. Dabei erhält man 0,7 g eines weißen Pulvers. Dieses Pulver zeigt eine 50%ige Inhibierung von Pepsin bei einer zugesetzten Menge von 0,54 μg zu der Testlösung.

B e i s ρ i c 1 3

4000 ml des Kulturnitrats werden nach der gleichen Methode, wie sie im Beispiel 1 beschrieben worden ist, hergestellt. Man stellt eine 58%ige Inhibierung

von Pepsin fest, wenn 0,05 ml der lOOfach verdünnten Lösung dem Pepsininhibierungstest unterzogen werden. 80 g Aktivkohle werden zugesetzt, worauf während einer Zeitspanne von 20 Minuten gerührt wird. Anschließend ist alles Pepstatin in dem Kulturfiltrat adsorbiert. Der Kohlenstoff, welcher durch Filtration abgetrennt worden ist, wird mit 2000 ml Wasser gewaschen, worauf das Pepstatin auf der Kohle aufeinanderfolgend mit 2000 ml und 1500 ml Methanol bei 40⁰C eluiert wird. Die Methanoleluate werden vereinigt und unter Vakuum eingedampft. Dabei werden 15 g eines braunen rohen Pulvers erhalten. Die 50%ige Inhibierung von Pepsin wird in der Weise festgestellt, daß 0,6 ag dieses Pulvers zu der Testlösung zugesetzt werden. Dieses Pulver A'ird in 1000 ml Wasser aufgelöst und durch eine Säule geschickt, die 100 g Aktivkohle (Durchmesser 3 cm) enthält. Die Chromatographie wird in ähnlicher Weise im Beispiel 2 durchgeführt, wobei 1,5 g eines weißen Pulvers erhalten werden. Die 50-%-Inhibierung von Pepsin wird durch Zugabe von 0,06 μg dieses Pulvers zu der Testlösung gezeigt.

Beispiel 4

Die vollständige Reinigung wird, ausgehend von 0,38 g eines Pulvers, gestartet, das nach einer ähnlichen Methode, wie sie im Beispiel 3 gezeigt worden ist, erhalten worden ist. Bei einer Zugabe von 0,06 [ig zu der Testlösung wird eine 50%ige Inhibierung festgestellt. Die Substanz wird in 5,0 ml einer Lösungsmittelmischung aufgelöst, die aus Butanol, Essigsäure, Wasser und Butylacetat (4:1:1:4. bezogen auf das Volumenverhältnis) besteht. Die Lösung wird durch eine Kieselgelsäule (90% Kieselgel, Durchmesser 2,2 cm) geschickt. Diese Säule ist mit der gleichen Lösungsmittelmischung gewaschen worden. Die gleiche Lösungsmittelmischung wird inschließend durchgeschickt, worauf das Eluat in Fraktionen von jeweils 5 g gesammelt wird. Pepstatin erscheint in den Fraktionen 9 bis 15. Die Eindampfung dieser Fraktionen in vereinigter Form liefert 0,27 g eines weißen Pulvers. 0,04 μg zeigen eine 50-%-Inhibierung. Die Umkristallisierung dieses Pulvers aus Methanol liefert 0,13 g nadelartiger Pepstatin-Kristalle. Die Zugabe von 002 jig der Kristalle zu der Testlösung ergibt eine 50-%-Inhibierung von Pepsin.

Beispiel 5

Ein nach der im Beispiel 2 beschriebenen Methode hergestelltes weißes Pulver zeigt eine 50-%-Inhibierung von Pepsin bei einer Zugabe von 0,06 μg zu der Testlösung. 0,4 g des Pulvers werden in 5,0 ml einer Lösungsmittelmischung (Äthylacetat/Methanol, 3: 1) aufgelöst. Es wird die im Beispiel 4 beschriebene Silikagel-Chromatographiemethode angewendet, wobei jedoch als Lösungsmittelmischung Äthylacetat/Methanol (3:1) verwendet wird. Das Eluat wird in jeweils 5 g wiegenden Fraktionen gesammelt. Das Pepstatin erscheint in den Fraktionen 10 bis 20. Die Eindampfung der vereinigten Fraktionen liefert 0,29 g eines weißen Pulvers, das eine 50-%-Inhibierung durch Zugabe von 0,03 μg zu der Testlösung zeigt. Die Umkristaliisation aus Methanol liefert 0,14 g nadelartiger Pepstatin-Kristalle (F. 224 bis 226"C).

Beispiel 6

1501 des Mediums, das gemäß Beispiel 1 beschrieben worden ist, werden in eine Gärungsvorrichtung aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen vor 200 1 gegeben und bei 115" C während einer Zeit spanne von 30 Minuten sterilisiert. 1 1 der untei Schütteln gezüchteten Brühe des Stammes MC144-C wird aufgeimpft. Die Schüttelkultur wird nach dei gleichen Methode wie im Beispiel 1 während eine: Zeitspanne von 72 Stunden hergestellt. Die Gärung in der Gärungseinrichrung erfolgt unter Rühren bei 200 UpM. 2001 einer sterilisierten Luft/Minute werden

ίο bei 24° C während einer Zeitspanne von 72 Stunden eingeleitet. Anschließend beträgt der pH 7,42. 0,05 ml des 250fach verdünnten Kulturfiltrats zeigen eine 51,5-%-Inhibierung von Pepsin, 4,5 kg Diatomeenerde werden zugegeben, worauf filtriert und der Kuchen mit 121 destilliertem Wasser gewaschen wird. Das gewaschene Filtrat wird dem Kulturfiltrat zugesetzt, wooei das Gesamtvolumen 133 1 beträgt. Dieses Filtrat wird unter Verwendung von 3n-NaOH auf einen pH von 8,2 gebracht und aufeinanderfolgend mit

601 und 301 n-Butanol extrahiert. Die Butanolextrakte werden vereinigt und mit 11 1 und 91 Wasser nacheinanderfolgend gewaschen. Dann erfolgt eine Konzentrierung durch Destillation un ter vermindertem Druck. Der Niederschlag wird gesammelt und getrocknet.

Dabei wurden 38,4 g eines braunen Pulvers erhalten. Es zeigt eine 50-%-Inhibierung von Pepsin durch Zugabe von 0,10 ^g zu der Testlösung. Die überstehende Flüssigkeit wird weiter zur Trockne eingedampft, wobei 13,0 g eines braunen Rohpulvers erhalten werden. Es zeigt eine 50-%-Inhibierung von Pepsin durch Zugabe von 0,17 μg dieses Test-Materials zu der Testlösung. Die Ausbeute aus dem Kulturfiltrat beträet 70%.

Beispiel 7

30001 des im Beispiel 1 beschriebenen Mediums werden in eine 6000-1-Gärungseinrichtung gegeben. Nach einer Sterilisierung werden 1101 einer 28 Stunden lang gezüchteten Brühe (die Züchtung erfolgt in einer 200-1-Gärungseinrichtung, wie sie im Beispiel 3 beschrieben wird) aufgeimpft, worauf die Gärung unter Rühren mit 190UpM sowie unter Belüften (25001 einer sterilen Luft/Minute bei 24 C) fortgesetzt wird. Die Brühe wird nach 65 Stunden dauernder Gärung gesammelt. Der pH beträgt 7,5. Es werden 77,5 kg Dicalits zugesetzt, worauf dnrch eine Filterpresse filtriert wird. Der Filterkuchen wird mit 2001 Wasser gewaschen. Das Gesamtvolumen des Filtrats sowie des zum Waschen verwendeten Wassers beträgt

27901. Der pH wird unter Verwendung von 3η NaOH auf 8,2 eingestellt; dann erfolgt eine Extraktion mit 14001 n-Butanol. Der Pepsin-Inhibierungstest zeigt, daß das Filtrat 423 g Pepstatin enthält. Der Butanolextrakt enthält 362 g Pepstatin. Der Butanolextrakt wird unter vermindertem Druck auf 105 1 konzentriert. Der Niederschlag wird abgetrennt (das Nettogewicht des Niederschlags beträgt 3670 g). Die konzentrierte Lösung wird weiter auf 101 konzentriert, worauf der Niederschlag (Nettogewicht 1540 g) gesammelt wird.

Die Niederschläge werden vereinigt und in 161 Methanol bei ungefähr 40^rjC aufgelöst. Die Methanollösung enthält 297 g Pepstatin. Aktivkohle wird in einer Menge von 1500 g der warmen Lösung zugesetzt, worauf filtriert wird. Die Methanollösung wird abgekühlt, worauf Kristalle in einer Nettomenge von 400 g erscheinen. Diese Kristalle werden abgetrennt. Die Kohle wird mit heißem Methanol in einer Menge von 8 1 dreimal gewaschen. Diese Methanollösungen

werden der überstehenden Flüssigkeit der Kristalle zugesetzt, worauf auf 1 1 konzentriert und abgekühlt wird. Dabei werden 63 g Pepstatin-Krbtalle erhalten. Der Myzelkuchen, der Dikalite enthält, wird mit 500 ml eines heißen Methanols extrahiert. Die Methanollösung wird unter Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit 151 eines heißen Äthanols gewaschen. Anschließend wird er in 201 eines heißen Methanols aufgelöst. 1000 g Kohle werden dem heißen Methanol zugesetzt. Die Abdampfung von Methanol bis auf 1 1 sowie das anschließende Kühlen haben die Ausfällung von Pepstatin-Kristaüen in einer Menge von 170 g zur Folge.

Beispiel 8

548 mg Pepstatin werden in ungefähr 50 ml Methanol gelöst. Eine Ätherlösung, die Diazomethan in einer Menge von 3 g/200 ml enthält, wird so lange zugesetzt, bis eine gelbe Diazomethanfarbe zurückbleibt. Unmittelbar danach erfolgt eine Eindampfung unter Vakuum. Dabei werden 560 mg eines weißen Pulvers erhalten. Die Umkristallisation aus Methanol liefert weiße nadelförmige Kristalle mit einem F. von 249 bis 251 C. Es wird eine Esterbande bei 1730 cm"¹ in dem Infrarotspektrum festgestellt. Diese Bande löst die bei 1710 cm"¹ liegende Carboxylbande des Pepstatins ab. Eine Zugabe von 0,015 μg dieses Esters an der Testlösung ergibt eine 50-%-Inhibierung.

Beispiel 9

Sporen und Myzel des Stammes MC 210-AI werden auf ein Medium aufgeimpft, das 2,5% Glyzerin, 0,5% Fleischextrakt, 0,5% Pepton, 1,0% Hefeextrakt, 0.2% NaCl, 0,05% MgSO₄-7H₂O, 0,05% K₂HPO₄ und 0,32% CaCO₃ enthält. 100 ml dieses Mediums werden in einen Schüttelkolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml gegeben und vor der Beimpfung sterilisiert. Dann erfolgt ein Züchten unter Schütteln bei 27' C während einer Zeitspanne von 7 Tagen. Der pH beträgt am fünften Tag 7,5 und am siebten Tag 7,7. Die Zugabe von 0,1 ml des auf das 25fache verdünnten Kulturfiltrats zu der Tcstlösung zeigt eine 32%ige Inhibierung von Pepsin. Die Kulturfiltrate von 50 KoI-ben werden vereinigt, worauf das Pepstatin in dem vereinigten Filtrat mit 20001 n-Butanol extrahiert wird. Die Verdampfung unter vermindertem Druck des Extraktes liefert 2,0 g eines braunen Pulvers. Eine Zugabe von 1,5 μg dieses Pulvers zu der Testlösung ergibt eine 50-%-Inhibierung von Pepsin. Das Rohpulver wird in 30 ml Wasser suspendiert und durch eine mit Aktivkohle gefüllte Säule (18 g, 1,5 cm im Durchmesser) geschickt. 300 ml einer 30%igen wäßrigen Methanollösung werden durchgeschickt, worauf das Pepstatin auf der Säule mit einem 80%igen wäßrigen Methanol eluiert wird. Das Elual wird in Fraktionen gesammelt, wobei jede Fraktion 5 g wiegt. Das Pepstatin erscheint in den Fraktionen 28 bis 45. Diese Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum eingedampft, wobei 0,35 g eines weißen Pulvers erhalten werden, das eine 50-%-Inhibicrung von Pepsin bei einer Zugabc von 0,3 μg zu der Testlösung zeigt. Die Reinigung von Pepstatin unter Verwendung dieses Pulvers erfolgt nach der im Beispiel 4 beschriebenen Methode. Dabei werden Pepstatin-Kristalle erhalten, die an Hand des Infrarotspektrums sowie einer Dünnschichtchromatographic identifiziert werden.

Beispiel 10

Es wird in einer Weise verfahren, die der im Beispiel 9 beschriebenen Weise ähnlich ist, wobei an Stelle des Stamms MC2I0-A1 der Stamm MC284-C1 unter Schütteln gezüchtet wird. Der pH beträgt am dritten Tage 6,2 und am siebten Tage 7.8. Werden 0,05 ml des 50fach verdünnten Kulturfiltrats der Testlösung zugesetzt, dann wird eine 29%ige Inh'bierung von Pepsin beobachtet. Aus 3000 ml des Kulturfiltrats wird Pepstatin in n-Butanol in einer Menge von 1500 ml extrahiert, worauf die Eindampfung unter Vakuum 1,5 g liefert. Die Zugabe von 0.35 ug dieses Pulvers zu der Tesllösung ergibt eine 50-%-Inhibierung von Pepsin. Die Dünnschichtchromatographie zeigt den gleichen Fleck wie Pepstatin. 5 mg werden aus dem Dünnschichtchromatogramm kristallisiert. Die Identität mit Pepstatin wird an Hand des Infrarotspektrums sowie an Hand der biologischen Aktivität bestätigt.

Beispiel 11

114 mg Pepstatin werden in 40 ml Äthanol gelöst und mil 40 ml Benzol sowie einigen Tropfen konzentrierter Schwefelsäure während einer Zeitspanne von 4 Stunden am Rückfluß gekocht. Dann erfolgt eine Neutralisation unter Verwendung von Natriumbicarbonat. Nach der Filtration wird das Filtrat unter einem verminderten Druck zur Trockne konzentriert. Dabei werden 75 mg eines weißen Pulvers erhalten. Dieses Pulver wird mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält 48 mg des Äthylesters von Pepstatin (F. 190 bis 193 C). Berechnet für C₃₆H₁₁₇NsO₉: C 60,56, H 9,45, N 9,80, 0 20,16. Gefunden : C 60,96, H 9,65, N 9,43, O 19.70. Eine Zugabe von 0.02 jig zu der Testlösung ergibt eine 50%ige Inhibicrung von Pepsin.

Beispiel 12

405 mg des Melhyleslers von Pepstatin werden in Methanol gelöst, worauf Ammoniakgas während einer Zeitspanne von 14 Stunden eingeleitet wird. Während dieser Reaktion tritt ein Niederschlag auf. Dieser Niederschlag wird nach der Reaktion abfiltrierl und fällt in einer Menge von 324 mg an. Er besteht aus einem weißen Pulver aus Pepstatinamid, das mit dem Methylester von Pepstatin verunreinigt ist. Dieses Pulver wird unter Verwendung einer Mischungaus Chloroform, Aceton und Methanol (5 : 3 : 2, bezogen auf das Volumen) einer Kieselgel-Chromatographie unterzogen. Die Fraktionen bestehen aus jeweils 5 g. Das Pepstatinamid erscheint in den Fraktionen Nr. 101 bis 350. Eine Verdampfung dieser Fraktionen liefert 260 mg des reinen Pepstatinamids (F. 229 bis 231"C). Analyse: Berechnet fürCv₁H₆₄N₆O₈: C 59,62. H 9,41, N 12,27, O 18,68. Gefunden: C 59,69, H 9,45, N 12,17, O 18,24. Eine Zugabe von 0,054 μg zu der Tesllösung ergibt eine 50%ige Inhibierung von Pepsin.

In den Rahmen der Erfindung fallen Pepstatin, Additionssalze von Pepstatin mit anorganischen Basen und organischen Basen, beispielsweise Natrium, Kalium, Ammoniak, Calcium, Magnesium, Glucosamin, Mannosamin, Galactosamin, Eisen(lI)-Verbindungen, Eisen(l 11 (-Verbindungen, Kupfer(l I)-Verbindungen, Kupfer(I)-Verbindungen od. dgl., sowie Ester von Pepstatin, beispielsweise der Methylester, Äthylester,

Propylester, Butylester, lsobutylester, Pentylester, Isopentylester, Benzylester. Für therapeutische Zwecke eignen sich Salze nichttoxischer Basen. Salze mit toxischen Basen können für Isolationszwecke verwendet werden, beispielsweise können toxische Basen als Ausfällungsmittel aus Lösungen eingesetzt werden.

Gegebenenfalls können mit den erfindungsgerm Verbindungen auch andere Arzneimittel vermi werden, beispielsweise Antihistamine, Antibioi Pufferungsmittel, wie beispielsweise Natriumcarbc Calciumcarbonat, Aluminiumsilikat, Magnesium bonat od. dgl., Nervenberuhigungsmittel.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   !. Pepsininhibitor, der als Pepstatin bezeichnet wird und folgende Struktur besitzt: CH₃ CH₃ CH₃

   CH CH₃ CH₃
   CH₁ CH

   CH₃ CH₃

   \ /
   CH

   CH
   CH, OH

   CH₃ CH₃

   \ / CH