NO129682B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av en pepsin-inhibitor, betegnet pepstatin.

Nærværende oppfinnelse vedrorer en fremgangsmåte for fremstilling av et nytt og anvendelig mikrobielt produkt betegnet pepstatin og med den generelle formel:

samt salter, estere og amidet av dette ved fermentering. Denne substans, dens salter, estere og amidet er effektivt til å hemme pepsin og oppviser terapeutisk og beskyttende virkning på eksperimentelt mavesår hos rotter og mus. Den har lav giftig-

het og er anvendelig for behandling av mavesår og tolvfinger-tarmsår hos mennesker.

Det er nå ifolge nærværende oppfinnelse fremskaffet en antipep-sinforbindelse (og dens salter og estere), som er effektiv i å hemme proteasevirkning for pepsin, og nevnte anti-pepsinforbin-delse er opploselig i metanol, eddiksyre, dimetylsulfoksyd og pyridin, svakt opploselig i etanol, propanol, butanol, amylalkohol, i det vesentlige uopploselig i etylacetat, butylacetat, etyl-eter, karbontetraklorid, heksan, petroleumeter, benzen og<1> kloroform, smelter ved 228-229°C, oppviser sterk sluttabsorpsjon uten et maksimum bortsett fra en lav skulder ved 260-270 mu for E,

27 ~ 1 cm = ca. 0,3, oppviser venstredreining på [oc]D = -90° (C = 0,288 i metanol), gir positiv Rydon-Smith-reaksjon (hvis det underso-kes på tynnlagskromatogram, og natriumhydroksydopplosning for-stoves for påsproytning av reagensen), er negativ ved

ninhydrin, Sakaguchi, naftoresorcin, anisaldehyd-svovelsyre-reaksjoner, oppviser folgende bånd i det infrarode område av spektret når pellettert med kaliumbromid: 3320, 3090, 2955, 1710, 1635, 1545, 1470, 1450, 1420, 1390, 1370, 1300, 1220, 1178, 1070, 710 cm"''', og har formlen C34H63N5°g som vises ved massespektret av metylesteren av diacetylderivatet og ved elementæranalyse,

gir L-valin og L-alanin i forholdet 1 : 2 etter hydrolyse, har en karboksylgruppe som gir metylester (C35H65N5Dg? s.p. 249 - 251°C) , som er aktiv ved hemning av pepsin.

Innenfor oppfinnelsens ramme faller fremstilling av pepstatin, dets salter, dets estere som er aktive i å hemme pepsin. Pepstatin har en karboksylgruppe og forestres lett ved vanlige metoder for omdannelse av karboksyl til ester, slik som oppvarmning i sur metanol, diazometan-reaksjon etc. Fig. 1 er det infrarode absorpsjonsspektrum for pepstatin pellettert i kaliumbromid. Fig. 2 er det infrarode absorpsjonsspektrum for metylester av pepstatin pellettert i kaliumbromid. Fig. 3 er det kjernemagnetiske resonansspektrum for metylesteren av diacetylpepstatin tatt i tetradeuterometanol.

Ifolge oppfinnelsen fremstilles pepstatin ved en fremgangsmåte som karakteriseres ved at man dyrker Streptomyces testaceus ATCC No. 21469 eller Streptomyces argenteoius var toyonakensis ATCC No. 21468 i et næringsmedium under aerobe betingelser og utvinner pepstatinet fra næringsmediet , hvorpå man eventuelt fremstiller salter, estere eller amidet av dette. Næringsmediet inneholder karbonkilder, nærings-karbonkilder og nitrogenkilder.

Den systematiske utskillelse av mikrobielle produkter som er virksomme i å hemme enzymer ble begynt av nærværende oppfinnere i 1965, og aquayamycin som hemmer tyrosin-p-hydroksylase, fusar-syre som hemmer dopamin-p-hydroksylase og som oppviser hypoten-siv virkning, og leupeptiner som hemmer trypsin, plasmin og kallikrein er blitt funnet av nærværende oppfinnere. Disse har også antatt at mikroorganismer produserer proteaser, esteraser etc. og for beskyttelsen av deres egne enzymer ville inhibito-rer også produseres. Ved fortsettelsen av disse studier ble pepstatin funnet i kulturfiltrater fra actinomyceter. Dessuten, pepstatin ble bekreftet å oppvise terapeutisk eller beskyttende virkning mot mavesår. Det kan også fremheves at pepstatin er den forste forbindelse for spesielt å hemme pepsin. En spesifikk pepsininhibitor har ikke vært kjent for pepstatin. Som det vises ved nærværende oppfinnelse er pepstatin

funnet i to arter actinomyceter og det antas

å være utstrakt fordelt i actinomyceter. Ved nærværende oppfinnelse beskrives to stammer, fra hvilke pepstatin ble isolert. Angivelsen i parentes [] folger farvestandarden angitt i Color Harmony Manual of Container Corporation of America.

Egenskaper for stammen MC144-C1:

Stammen ble isolert fra en jordprbve samlet i en skog ved Cux Haven i Vest-Tyskland i august 1968 og ble i laboratoriet for nærværende oppfinnere nummerert som nr. MC144-C1. Den ble deponert i Kogyo Gijutsuin Hakko Kenkujyo 21.mai 1969 og depone ringsnummeret er 312. Denne stamme er blitt deponert i American Type Culture Collection og gitt nummeret ATCC 21469, og er derfor nå tilgjengelig for forskere. Mikroskopisk er substratmyceliet godt forgrenet med utstikkende lufthyfer i svak bolge-form. På lufthyfer dannes åpne spiraler, endespiraler og haker, men snoinger iakttas ikke. Overflaten av sporene er jevn.

Egenskapene på forskjellige media er som folger:

1) På glycerol Czapek medium (dyrket ved 27°C): veksten er blek-gul til blekbrun og senere blekt gullig brun; luftmycelium ut-vikler seg svakt og er grålig-hvitt til lysegrått; gullig opploselig pigment produseres etter forlenget dyrkning. 2) På Krainsky glukose-asparagin-agar (dyrket ved 27°C): veksten er blekgul til gul [<p>astel Yellos, 1 1/2 fb]5 luftmycelium er grålig-hvitt til lysegrått; intet opploselig pigment. 3) På kalsiummalat-agar (dyrket ved 27°C): veksten er dårlig og farvelos; luftmycelium er tynt og grålig-hvitt til lysegrått5 intet opploselig pigment; ingen transparent sone iakttas rundt veksten. 4) I peptonvann som inneholder 1,0 % natriumnitrat (dyrket ved 27°C): veksten er meget dårlig og farvelos; intet luftmycelium; intet opploselig pigment; reduksjon av nitrat til nitritt er ikke klar. 5) På potetskiver (dyrket ved 27°C) : veksten er IMig og blek-gul, blekbrun eller rodlig brun [Rust Tan, 5 le-BrickRed, 6ng]; luftmycelium er svakt og hvitt til grålig-hvitt; intet opploselig pigment. 6) På stivelsesskiver (dyrket ved 27°C): vekst ble ikke iakttatt når dyrket i 21 dager. 7) På pepton-kjottekstrakt-agar (dyrket ved 37°C): vekst ble ikke iakttatt når dyrket i 21 dager. 8) På pepton-kjottekstrakt-agar (dyrket ved 27°C): veksten er farvelos; intet luftmycelium; intet opploselig pigment. 9) På Loeffler-koagulert serum (dyrket ved 37°C og 30°C): vekst ble ikke iakttatt når dyrket i 21 dager. 10) Stavkultur i buljong-gelatin (20°C): veksten er farvelos; intet luftmycelium; intet opploselig pigment; utflytning av gelatin ble iakttatt på den tredje dag av dyrkningen og fort-satte, d.v.s. utflytningen er sterk. 11) I melkemedium (dyrket ved 37°C): veksten er farvelos; intet luftmycelium, intet opploselig pigment, melken koaguleres og peptoniseres deretter, koagulering og peptonisering er sterk. 12) På tyrosin-agar (dyrket ved 27°C): veksten er dårlig og farvelos; intet luftmycelium; intet opploselig pigment; tyrosinase er negativ. 13) På cellulose (dyrket ved.27°C): vekst ble ikke iakttatt i 21 dager.

i-

Utnyttelse av karbohydrater ble provet på Pridb^nf-Gottlieb-medium (dyrket ved 27°C) og resultatét var. åorrt folger: 'Glye er ol, mannose og sukrose utnyttes og gir livlig vekst; arabinose, xylose, rhamnose, fruktose, inosirol, sorbitol, maltose, laktose, raffinose, dulcitol, salicin og inulin utnyttes ikke; dekstrin og stivelse utnyttes svakt; mannitol og galaktose gir meget svak vekst og synes ikke å utnyttes. Egenskapene for stammen MC144-C1 som er beskrevet foran kan trekkes opp som folger: Den horer til Streptomyces,danner spiraler, men ikke snoinger, gir sporer med jevn overflate, gir livlig vekst på potetskiver, men ikke så livlig på andre media, når dyrket ved 37°C er veksten dårlig, den har sterk proteolytisk aktivitet, veksten er blekgul, gul eller blek-brun på forskjellige media, luftmycelium er tynt og grålig-hvitt eller lysegrått på forskjellige media, den horer til den ikke-kromogene type, den rodaktige brune vekst på potetskiver er karakt e ristisk. Hvis disse egenskaper sammenliknes med dem for kjente arter, da er det likheter mellom denne stamme og Actinomyces longisporus-flavus som Krasini-kov beskrev i International Journal of Systematic Bacteriology 18, 342, 1968 og i bind 2, side 237 i boken "The Actinomycetes" skrevet av S.A. Waksman. Forskjellene og likhetene er som folger: Som foran beskrevet er stammen MC144-C1 forskjellig fra A. longisporus-flavus ved utnyttelse av karbohydrater og karakteren av luftmycelium. Fargen for veksten av stammen MC144-C1 på potetskiver er karakteristisk og denne stamme ble klassifisert som ~. en ny art betegnet Streptomyces testaceus.

Egenskaper for MC210-A1:

Denne stamme ble isolert fra en jordprove samlet ved Tokyonaka, Osaka i oktober 1968 og ble gitt nummeret MC210-A1 i oppfinnernes laboratorium. Denne stamme ble deponert i Kogyo Gijutsuin Hakko Kenkyujyo 21* mai 1969 og gitt deponeringsnummeret 313. Denne stamme er blitt deponert i American Type Culture Collection og gitt nummeret 21468, og derfor er den nå tilgjengelig for forskere. Mikroskopisk er substratmyceliet vel forgrenet med utstikkende typisk luftmycelium i viklingsform og spiraler dannes. Snoinger iakttas ikke. Overflaten av sporene er jevn.

Egenskapene på forskjellige media er som folger:

1) På glycerol Czapek-agar (dyrket ved 27°C): veksten er fargelos; luftmycelium er tynt og hvitt, lysegrått, eller grått; intet opploselig pigment. 2) På Krainsky glukose-asparagin-agar (dyrket ved 27°C): veksten er fargelos til blek-gul; luftmycelium er grålig hvitt til lysegrått; et svakt gul-farget, opploselig pigment dannes. 3) På kalsiummalat-agar (dyrket ved 27°C): veksten er farvelos; luftmycelium er hvitt, svakt brunlig-grått til grått; intet opploselig pigment; ingen transparent sone iakttas rundt veksten. 4) I peptonvann som inneholder 1,0 % natriumnitrat (dyrket ved 27°C) : veksten er farvelos; luftmycelium er hvitt; intet opploselig pigment; svak nitritt-dannelse. 5) På potetskiver (dyrket ved 27°C): veksten er svakt gullig-brun til morkegul [Mustard, 21e]; luftmycelium er rikelig og hvitt, gråaktig hvitt til lysegrått; svakt gullig-brunt, opploselig pigment dannes. 6) På stivelsesplater (dyrket ved 27°C): veksten er blek-gul til gul; luftmycelium er hvitt til brunaktig hvitt til svakt brunaktig-grått; blek-gult til gult, opploselig pigment dannes; hydrolyse av stivelse er svak. 7) På pepton-kjottekstrakt-agar (dyrket ved 37°C): veksten er farvelos; luftmycelium er hvitt; intet opploselig pigment. 8) På pepton-kjottekstrakt-agar (dyrket ved 27°C): veksten er farvelos; luftmycelium er rikelig og hvitt; intet opploselig pigment. 9) På Loeffler-koagulert serum (dyrket ved 37°C): veksten er farvelos til blek-gul; luftmycelium er gullig-hvitt;

intet opploselig pigment; ingen utflytning.

10) Stavkultur i gelatin (dyrket ved 20°C): veksten er farvelos, blek-gul til blek gullig-brun; luftmycelium er hvitt; brunaktig opploselig pigment dannes; utflytning iakttas etter ca. 2o dagers dyrkning og meget svak. 11) I melk (dyrket ved 37°C): veksten er farvelos; intet luftmycelium; intet opploselig pigment; melken koaguleres og peptoniseres skjont koagulering og peptonisering er rela-tiv svak. 12) På tyrosin-agar (dyrket ved 27°C): veksten er farvelos; luftmycelium er hvitt, grålig-hvitt til lysegrått; intet opploselig pigment; tyrosinase er negativ. 13) På cellulose (dyrket ved 27°C): veksten er svak og spaltning iakttas ikke.

Utnyttelsen av karbohydrater ble provet på Pridham-Gottlieb-medium og de folgende resultater ble oppnådd: glycerol, xylose, glukose, fruktose, mannose, galaktose, inositol, mannitol, sorbitol, maltose, sukrose, raffinose, dekstrin og stivelse utnyttes og gir god vekst; laktose og salicin utnyttes ikke for-di veksten er meget svak, rhamnose, arabinose, dulcitol og inulin utnyttes ikke. Egenskapene for stammen MC210-A1 som er beskrevet foran kan summeres opp som folger: Den tilhorer den ikke-kromogene art av Streptomyces; spiraler dannes, men ikke snoinger; overflaten av sporene er jevn; veksten er farvelos, svakt gul eller gul på forskjellige media; luftmycelium er hvitt til lysegrått på forskjellige media; opploselig pigment foreligger vanligvis ikke bortsett fra gullig til brunlig pigment, svakt; den har svak proteolytisk virkning og hydrolytisk virkning på stivelse. Blant kjente arter av Actinomycetes likner Streptomyces argenteolus beskrevet av Fried, Perman, Lang-lykke og Titus i international Journal of Systematic Bacteriology 18, 295, 1968 og i boken "Actinomycetes" av S.A. Waksman, bind 2, side 17 5, mest denne stamme. Stammen MC210-A1 likner S. argenteolus bortsett fra utnyttelse av karbohydrater og utflytning av gelatin. Derfor ble stammen MC210-A1 betegnet som en variant av denne art, d.v.s. Streptomyces argenteolus var. toyonakensis.

Ved nærværende oppfinnelse anvendes i stedet for navnene

på foran angitte arter pepstatin-produserende Streptomyces for beskrivelsen.

Metoder for å undersoke aktiviteten for pepstatin som hemmer pepsin: Metoden som er beskrevet av Kunitzis i J. General Physiology, 30, 291, 1947 ble modifisert og pepsin, som markedsfores av Sigman Chemical Co., St. Louis Missouri, U.S.A. og kasein, som markedsfores av Wako Junyaku, Osaka, japan, ble anvendt. Kase-inet opploses i 0,08 M melkesyrepuffer (pH 2,2) ved 0,6 % og til 1 ml av denne kaseinopplosning tilsettes 0,7 ml 0,02 N HCl-0,02 M KC1 puffer (pH 2,0) og 0,2 ml av denne pufferopplos-ning med eller uten en prove og inkuberes ved 37°C i 3 minutter. Deretter tilsettes 0,1 ml inneholdende 4 yug pepsin i 0,02 N HCL-0,02M KC1 puffer (pH 2,0), blandes og inkuberes ved 37°C

i 30 minutter. Deretter tilsettes 2,0 ml perklorsyre (1,7 M) for å stanse reaksjonen. Etter 1 time ble det sentrifugert og den overstående væske underkastes bestemmelsen på optisk tetthet (a) ved 280 mu. Reaksjonsblandingen uten pepstatin ble behandlet på liknende måte og fra denne optiske tetthet ble prosentinhiberingen (b-a)/b x 100 beregnet. Mengden pepstatin i et provemateriale oppnås fra den prosentuelle hemning og en standardkurve for konsentrasjonen av pepstatin og prosent hemning. Pepstatin viste 50 % hemning når 0,02 jug ble tilsatt til reaksjonsblandingen.

pepstatin fremstilles ved å inokulere sporer eller my-celia fra en pepstatin-produserende organisme i et egnet medium og derpå dyrke under aerobe betingelser. For produksjon av pepstatin er dyrkning på et fast medium mulig, men for produksjon av store mengder foretrekkes dyrkning i et flytende medium. Enhver fermenteringstemperatur kan anvendes innen området i hvilket pepstatin-produserende organismer kan vokse og produsere pepstatin, skjont 25 - 3 5°C foretrekkes. Media bestående av kjente næringskilder for actinomyceter er anvendelige for produksjon av pepstatin. F.eks. er kommersielle produkter, slik som pepton, kjbttekstrakt, gjærekstrakt, maisstopevæske, bomulls-fromel, soyabonnemel, gjærekstrakt, N-A amin, kasein, natriumnitrat, ammoniumnitrat, ammoniumsulfat og andre nitrogenfoldige materialer slik som hvetekli, riskli etc. anvendelige som nitro-genkilde. Kommersielle tilgjengelige produkter, slik som laktose, glycerol, sukrose, stivelse, glukose, maltose, melasse og andre karbohydrater eller fettarter i ren tilstand eller rå tilstand er anvendelige som karbonkilde. Blant disse er glycerol, glukose, maltose, dekstrin og stivelse eksempler på billige og egnede karbonkilder for produksjon av pepstatin. Natriumklorid, natrium- eller kaliumfosfat, kalsiumkarbonat eller magnesiumio-ner kan også tilsettes. Spor av metallsalter kan tilsettes hvis nodvendig. Enhver art av bestanddeler som kan anvendes av pepstatin-produserende organismer for produksjon av pepstatin er anvendelige. Ethvert materiale som er kjent for dyrkning av actinomyceter er anvendelig.

Fermenteringen fortsettes inntil pepstatin i det vesentlige er akkumulert. F.eks. stammen MC1M+-C1 ble inokulert ;i . forskjellige media som inneholder forskjellige karbonkilder, forskjellige nitrogenkilder, NaCl 0,3 %, MgSO^t^O 0,1%, K2HP0> 0,1%, metallopplosning 0,1 ml/100 ml og rystedyrket ved 27-29 C på en resiproserende rystemaskin (amplitude 8 cm, 200 slag/minutt). Metallopplosningen besto av CuSO^^^O 700 mg, FeSO^R^O 100 mg, MnC^AR^O 800 mg, ZnSO^^^O 200 mg i 100 ml destillert vann. Rysteflasker med volum 500 ml ble brukt og 100 ml av hvert medium ble anbragt. På hver dag av rystedyrkningen ble 0,5 ml av 100 ganger fortynnet suppefiltrat undersokt på anti-pepsin-aktivitet, og resultatene som vises i tabell 1 ble iakttatt. Pepstatinproduksjon ble iakttatt allerede efter to dagers ryste-dyrkning, og det maksimale utbytte ble funnet på h. - 7- dag av dyrkningen. pH ved den maksimale produksjon var ofte ca. 9, 0. Selvom pH 9,0 ble opprettholdt under rystedyrkningen i 10 dager ble -ingen nedsettelse av pepstatin iakttatt, hvilket viser dets stabile egenskaper. Som vist i tabell 1 kan forskjellige karbonkilder og nitrogenholdige materialer anvendes for produksjon av pepstatin. Karbon-og nitrogenkilder av media: nr. 1 2$ glycerol, 0, 75% kjottekstrakt, 0,75$ pepton; nr. 2, 2% glycerol, 1, 0% "N-Z amin',' °>2$ gjærekstrakt; nr. 3, 2, 0% glycerol, 1, 5% soyabonnemel; nr. h, 2% glycerol, 1, 5% maisstopevæske; nr. 5, 2% laktose, 0,75$ kjottekstrakt, 0,75$ pepton; nr. 6, 2% laktose, 1,0$'k-Z amin" 0,2$ gjærekstrakt; nr. 7, 2$ laktose, 1,5$ soyabonnemel; nr. 8, 2$ laktose, 1,5$ maisstopevæske; nr. 9, 1$ glukose, 1$ laktose, 0,75$ kjottekstrakt, 0,75$ pepton; nr..10, 1$ glukose, 1$ laktose, 1$"n-Z amin" 0,2$ gjærekstrakt; nr. 11, 1$ glukose, 1$ laktose, 1,5$ soyabonnemel; nr. 12, 1$ glukose, 1$ laktose, 1,5$ maisstopevæske; nr. 13, 2$ glukose, 1,0$"n-Z amin'^ 0,2$ gjærekstrakt; nr. lh, 2% glukose, 1,0$ "N-Z amin'^ 0,2$ gjærekstrakt; nr. 15, 2$ glukose, 1,5$ soyabonnemel; nr. 16, 2$ glukose, 1,5$ maisstopevæske.

For produksjon av pepstatin ved fermentering kan de vanlige metoder som anvendes for antibiotika brukes. F.eks., 100 liter av et medium ble anbragt i et rustfritt fermentering skar med volum 200 liter og sterilisert, pepstatin-produserende organismer ble inokulert og fermenteringen ble utfort under luftning med 100 liter steril luft/minutt, hvorpå produksjon av pepstatin nådde et maksimum efter h5 - 60 timer.

Efter nærværende oppfinnelse er det fremskaffet fremgangsmåter for isolering, rensning av pepstatin, dets salter og pepstatin-estre.

Pepstatin er stabilt ved pH 2,0 - 9,0, når opplosningen. ved disse forskjellige pH oppvarmes ved 60°C i 30 minutter, og pepstatin blir tilbake uten noen nedsettelse av aktiviteten.

Pepstatin som bare er svakt opploselig i vann foreligger ikke bare i dyrkningsvæsken, men inneholdes også i myceliumsmassen. Når fermenteringsutbyttet ikke er stort foreligger mesteparten av pepstatin i den flytende del, men når det er hoyt inneholdes en stor mengde 1 myceliumsmassen. Pepstatin i myceliumsmassen ekstraheres med opplosningsmidler i hvilke pepstatin er opploselig, f.eks. med metanol. Pepstatin har karboksylgrupper og danner salter slik som Na<+>, Ka+, NH^_<+>, Li<+>, Ca<++>, Mg<++>, Cu<++>, Ba<++>, Fe<++>, Mn<++> etc. Natrium- eller kaliumsalter av pepstatin har liknende opploseligheter som pepstatin, men salter av kalsium, magnesium og tungmetaller er mindre oppløselige i vann og metanol. Derfor er det onskelig å ekstrahere pepstatin fra myceliumsmassen til opplosningsmidlene i sur tilstand. Pepstatin er mere opploselig i metanol som inneholder kalsiumklorid, og derfor er det en egnet metode å ekstrahere pepstatin i myceliumsmassen med sur metanol som inneholder CaC^. Pepstatin i den flytende del ekstraheres med med vann ikke blandbare opplosningsmidler i hvilke pepstatin er mere opploselig enn i vann, f.eks. med butanol. Fordampning av pepstatinopplosningen gir rått pulver som inneholder pepstatin eller krystaller av pepstatin. Hvis fermenteringsutbyttet er hoyt gir fordampning av buta-nolekstrakt fra dyrkningssuppen krystaller av pepstatin.

Pepstatin er en stabil forbindelse og derfor kan dyrkningsfiltratet konsentreres ved destillasjon, fortrinnsvis under redusert trykk, og fra den konsentrerte opplosning eller den torkede rest ekstraheres det med organiske opplosningsmidler, slik som metanol, butanol etc i hvilke pepstatin er tilstrekkelig opploselig. Dyrkningsvæsken som inneholder mycelium kan utsettes for ekstraksjon med et med vann ikke blandbart opplosningsmiddel, slik som propanol, butanol eller amylalkohol for å ekstrahere pepstatin i den flytende del og i myceliedelen på én gang.

For ekstraksjon av pepstatin i opplosningsmidler kan vanlige metoder som anvender fler-trinns-ekstrahering, f.eks. Podobeal-niak-sentrifuge, anvendes.

Adsorpsjonsmetoder er også anvendelige for ekstrahering og rensning av pepstatin. For dette-formål er aktivt kull, ioneutvekslerharpikser, aluminiumoksyd, silikagel etc. anvendelig. F.eks. pepstatin i dyrkningsfiltrater kan adsorberes med aktivt kull og eftervaskes med vann, pepstatin på kull elueres med metanol eller vanndig metanol. For eluering oker hevningen av tempera-turen elueringsutbyttet. F.eks. aktivt kull ble tilsatt til dyrkningsfiltratet med 2,0$, og kullet ble behandlet to ganger med 20 ganger volumet av metanol ved hO°C under omroring, derpå ble pepstatin eluert og utbyttet fra dyrkningsfiltratet var ca. 80$. Karbonkromatografi er anvendelig for rensning av pepstatin. F.eks. efter at pepstatin var adsorbert på kull, ble dette' vasket med h0%] s vanndig metanol (metanol hOiH^ O 60), og pepsta-tinkromatografi utfort med 80$'s vanndig metanol (metanol 80:^0 20)Bruken av kull var også til hjelp for å fjerne farvede for-urensninger. Silikagelkromatografi er også anvendelig for rensning av pepstatin. F.eks. n-butanol-eddiksyre-vann-butylacetat (^rltlrU- i volum) eller etylacetat-metanol (3:1 i volum) var anvendelige opplosningsmiddelsystemer for rensning av pepstatin ved en silikagelkromatografi. Aluminiumoksydkromatografi er også anvendelig for rensning. F.eks. utfores den under anvendelse av metanol, etanol, butanol eller blandingen av disse alkoholer med estere.

Pepstatin har karboksylgrupper. Avhengig av denne syreegenskap anvendes sterke eller svake.basiske ioneutvekslerharpikser for ekstraksjon og rensning av pepstatin.

Pepstatin selv krystalliseres lett. Et opplosningsmiddel i hvilket pepstatin er opploselig er anvendelig for krystall!sasjonj f.eks. metanol er et eksempel som anvendes for krystallisasjon.

Karboksylgrupper i pepstatin omdannes lett til sine estere efter vanlige metoder for fremstilling av estere, f.eks. ved oppvarmning med den tilsvarende alkohol ved sur eller diazometan-metoden. Estere er også aktive ved hemning av pepsin. Metylestere er mere aktive enn pepstatin.

Hvis utbyttet av pepstatin i fermenteringsvæsken er hoyt oppnåes krystaller av pepstatin ved enkle metoder. F.eks. ekstraksjon av pepstatin med butanol og konsentrasjon av butanolekstraktet under vakuum gir krystallinsk pepstatin som omkrystalliseres fra metanol og gir hvite nålekrystaller av pepstatin.

Egenskaper for pepstatin beskrives her. Pepstatin krystalliserer som hvite nålekrystaller og det mest rensede pepstatin smelter ved 228 - 229°C. Det er optisk aktivt, og -9O<0> ble oppnådd for [a]5 i 0,288$'s metanolopplosning. Elementæranalysen ga de folgende resultater: beregnet for C^H<g>^<N>^O^: C 59 , 53, H 9,25, N 10,21, 0 20,99; funnet: C 59,02, 60,27, H 9,<2>7, 9,37, N 10,11, 9,90, 0 21,Vi, 21,15. På basis av de analytiske resultater kan formlen <C>25<E>6^ 5<0>10 (verdiene beregnet er C 58 , 72, H 9,15, N 9,78, 0 22,35) og C^H6^09 (verdiene beregnet er C 60,06, H 9,36, N 10,01, 0 20,57) ikke utelukkes, imidlertid ble formlen C^H^N^O^ understøttet av massespektret. Hovedtoppen av metylesteren av diacetylpepstatin var 783 og den for metylesteren av pepstatin 699. Molekylvektsbestemmelsen efter Akiya-Berger-metoden under anvendelse av en pyridinopplosning av pepstatin viste molekylvekten 600 - 730.

Det infrarode spektrum vises i fig. 1, hvor de folgende bånd iakttas: 3320, 3090, 2955, 1710, 1635, 15^5, 1^70, Hf 50, 1^20, 1390, 1370, 1300, 1220, 1178, 1070, 710 cm-1. Det infrarode spektrum for metylesteren av pepstatin vises i fig. 2. Det kjernemagnetiske resonansspektrum for metylesteren av diacetylpepstatin ble tatt med"Varian HA-lOO"utstyr i tetradeuterometanol under anvendelse av trimetylsilan som den indre standard og vises i' fig. 3.

Hydrolysen av pepstatin i 6n HC1 ved 100°C i 18 timer gir L-alanin og L-valin, som vises av aminosyre-analyse- i forholdet 1:2. Pepstatin gir positiv Rydon-Smith-reaksjon, og disse resultater og bånd i det infrarode spektrum ved 1635 og 15^5 cm<->"'" angir pep-tidbindinger i pepstatin.

Båndet i det infrarode spektrum ved 1710 cm<->"'" angir nærværet av karboksylgrupper i pepstatin.. Det vises også ved adsorpsjonen på en anioneutvekslerharpiks. Behandlingen av pepstatin med di-azometan eller oppvarmning med svovelsyre og en alkohol gir den tilsvarende ester. Metylesteren av pepstatin som fremstilles viser et esterbånd ved 1730 cm<-1> i stedet for båndet ved 1710 cm-"'". Et resultat av elementæranalyse av metylesteren var som folger: beregnet for C35<H6>5<N>5°9: c 6o>°5, H 9,36, N 10,00, 0 20,57; funnet: C 59,88, H 9,35, N 9,7^, 0 20,69. Pepstatin^som har en karboksylgruppe^danner salter, og saltene fremstilles lett ved noytrallsasjon eller ved å tilsette en beregnet mengde av en base til metanolopplosningen av pepstatin. F.eks. natriumpepstatin (s.p. 250 - 252°C, spaltning; beregnet for C3lfH62N^09Na: C 57,68, H 8,82, N 9,89, 0 20,3>+, Na 3,2*4-; funnet: C 57,97, H 8,92, N 9,96, 0 20,26, Na 2,98), magnesium-pepstatin (s.p. 2 57- 258°C, spaltning;,beregnet for C3l+H^2<N>^<0g->|Mg: C 58,58, H 8,96, N 10,0<1>+, 0 20,65, Mg 1,7^; funnet: G 58,30, H 9,05, N 9,9^, 0 20,8<*>+, Mg l,!+9) og kalsiumpepstatin (s.p. 262-263°C spaltning; beregnet for C^H^N^Ogica: C 57,93, H 8,86,

N 9,93, 0 20,<!>+2, Ca 2,8^; funnet: C 57,92, H 8,98, N 9,62, 0 20,07, Ca 2,62) ble fremstilt. Kalsiumpepstatin er mindre opploselig i vann og metanol enn pepstatin, pepstatin er imidlertid mere opploselig i metanol med CaCl2 enn i den uten CaCl2. Pepstatin som.har karboksylgrupper gir amid. F.eks. behandling av metylesteren av pepstatin i metanol ga pepstatinamid.

En behandling av pepstatin med eddiksyreanhydrid i pyridin gir diacetyl- og monoacetylpepstatiner, som skilles ved kolonnekro-matografi under anvendelse av silikagel og metanol-aceton-kloroform (5:25:70 i volum).

Ved tynnlagskromatografier under anvendelse av silikagel G ble de folgende Rf-verdier iakttatt for pepstatin i de folgende opplosningsmidler: 0,78, butylacetat-butanol-eddiksyre-vann (6:6:1 :1 i volum), 0,73 butylacetat- butanol-eddiksyre-vann (6:<*>+:l:l), 0,7b butylacetat-butanol-eddiksyre-vann (Vr^-rl:! i volum).

Ved hoyspenningselektroforese under anvendelse av surt opplosningsmiddel, slik som maursyre-eddiksyre-vann (25:75:900 i volum) under 3500V i 15 minutter beveger pepstatin seg ikke, hvilket antyder ingen basisk gruppe i pepstatin.

Den folgende struktur ble foreslått for pepstatin ved avbygnings-studier, n.m.r.spektret og massespektrometri av pepstatin og dets derivater:

Pepstatin har lav giftighet. Mus, hunder, rotter og kaniner tål-te oral administrasjon av 2.000 mg/kg av pepstatin uten noen tegn på forgiftning. LD^q for dyr ved de intraperitoneale injek-sjoner er tilnærmet som folger: mus 1.000 mg/kg; rotter 880 mg/ kg; kaniner 820 mg/kg; hunder ^50 mg/kg..Daglige doser på 250 mg/kg ved oral administrasjon til rotter i 90 dager forårsaket ikke noen forgiftning og rottene vokste med normal veksthastig-het .

Pepstatin inngitt oralt absorberes ikke. F.eks. når 50 mg/kg ble gitt oralt ble intet pepstatin funnet i blodet eller urinen 2<*>+ timer efter administrasjonen, og ca. 90$ ble vist i ekskre-menter som utskilles i lbpet av 72 timer efter administreringen.

Esterene, amicfei: og acetylderivatene av pepstatin viste 50$ hemning av pepsin ved metoden som er beskrevet foran ved de folgende konsentrasjoner: pepstatin 0,01p,g/ml; metylesteren 0,008vig/ ml; etylester 0,01y.g/ml; p-bromofenacylesteren 0,01 p,g/ml; amidet 0,027$ V-g/nil; monoacetylderivatet 1,1 jig/ml; diacetylderivatet h, 2 jig/ml; me tyle ster av diacetylderivatet 2,26 jig/ml: Imidlertid viser pepstatin ingen hemning overfor thrombokinase, plasmin, trypsin, kallikrein, oc-chymotrypsin og papain selv ved 250vig/ml. Således er pepstatin en sterk spesifikk pepsin-inhibitor. Proktase er en art pepsin som oppnåes fra Aspergillus ni-ger som angitt i Agri cultural Biological Chemistry (Japan), bind 28, s. 216-223, I96V. I reaksjonsblandingen som foran beskrevet bortsett fra at den inneholder samme mengde proktase i stedet for pepsin var konsentrasjoner for 50$'s hemning som folger: 0,02 ug/ml mot kaseinhydrolyse.

En sterk pepsin-inhibitor har aldri vært kjent for. Skjont svo-velsyreestere av polysakkarider har vært kjent å hemme pepsin er virkningen meget svak og den hemmer også blodkoagulering. Pepstatin er en sterk inhibitor for pepsin som vist ved 50$'s hemningskonsentrasjon som beskrevet foran, og den har ingen virkning på blodkoaguleringen. Den sterke pepsinhemmende virkning viser at pepstatin er effektiv på mavesår. Dette er blitt bekreftet ved kliniske studier.

Mavesår hos rotter fremkalt ved metoden som er beskrevet av Ta-kagi og medarb. i Japanese Journal of Pharmacology, 18, s. 1 - 18, 1968, d.v.s. anbringe hanrotter i et bar ved 23°C i 22 timer, beskyttes eller behandles terapeutisk med pepstatin. Når 50 mg/kg pepstatin ble inngitt oralt 30 minutter for belastningen, og rotter ble drept k- 8 timer efter belastningen^var helbre-delsesforholdet av mavesåret 76,3$. Når dosen var 10mg/kg var hemningsprosenten for mavesår 65,6$. Når 50 mg/kg pepstatin ble inngitt umiddelbart efter belastningen og én gang daglig i h dager og rotter ble drept ble den hurtige helbredelse av mavesår vist hos rotter som er behandlet med pepstatin.

Virkningen mot mavesår på rotter frembragt ved pylorus-underbinding (Shay rotter) er også vist. Metoden som er beksrevet av Watanabe og Kasuya i Chemical Pharmaceutical Bulletin, 11, 1282, 1963 ble anvendt. Hos rotter administrert med 2mg/kg eller stor-re doser 30 minutter og lh timer efter pylorus-underbinding ble intet mavesår funnet. 50$'s hemningsdose var 0,5 mg/kg. Pepsin-aktiviteten i mavesaften var ingen eller mindre enn 10$ av den for kontrollen. Således viste pepstatin sterk beskyttende og hel-bredende virkning mot mavesår hos Shay rotter. Oral administrasjon av pepstatin eller dets estere til mavesårs- og tolvfinger-tarmspasien med 1 - h tabletter som inneholder 25 - 100 mg pepstatin mellom måltidene, d.v.s. 3 - *+ ganger pr. dag viste hel-bredende virkning, og ingen giftighetstegn. Etter administrasjon forsvant smerten hurtig.

Pepstatin hemmer ikke papain som har en sulfhydrylgruppe som aktivt sted, imidlertid viser pepstatin hemning av carragen fremkalt bdema. (CA. Winter, E.A. Risley og G.W. Nuss: Proe. Soc. Exp. Biol. og Med., Ill, 5^*+, 1962). Pepstatin ble injisert intraperitonealt og carragen (0,1 ml av en l$'s opplosning) ble injisert til rottens bakpote, og 1, 3? 5 og 2h timer deretter ble odema målt. Derpå ble mere enn 30$<*>s hemning vist ved ikke mindre enn 1,25 mg/kg pepstatin.

De folgende eksempler fremlegges for å illustrere nærværende oppfinnelse.

Eksempel 1.

100 ml av et medium som inneholder glukose 1,0$, stivelse 1,0$, pepton 0,75$, kjottekstrakt 0,75$, NaCl 0,3$, MgS01+.7H20 0,1$, K^HPO^ 0,1$ og metallionopplosning (CuSO^HgO 700 mg, FeS01+.7H20 100 mg, MnCl2AH20 800 mg, ZnSO^<R>^<O> 200 mg) opploses i 100 ml destillert vann). 0,1 ml ble anbragt i en rysteflaske på 500 ml's volum og sterilisert ved 120°C i 20 minutter.

pH ble justert til 7,0 etter sterilisasjonen. En dråpe sporer og mycelium av stammen MCl^-Cl på et agarmedium ble inokulert og rystedyrket ved 27°C på en rystemaskin (130 slag pr. minutt og 8 cm's amplitude). pH var 5,7 på den tredje dag for rystedyrkningen og 6,3 på den fjerde dag. Bestemmelsen av sukkerreduksjon ved anthron-metoden viste den optiske tetthet på 0,9/0,005 ml

på den fbrste dag, 0,3/0,005 -"ni på den fjerde dag og nesten ingen på den femte dag. Den dyrkede suppe ble på den femte dag filtrert og 0,05 ml av 100 ganger fortynnet filtrat viste 6h%* s hemning av pepsin. Dyrkningssuppen på den femte dag.av 29 rysteflasker ble forenet og filtrert, og pepstatin i filtratet ble ekstrahert med 2^+00 ml og 2000 ml n-butanol suksessivt. Butano-ekstraktene ble forenet og fordampet under redusert trykk og gir brunt, rått pulver på h g. 50$'s hemning av pepsin ble vist ved å tilsette 0,13 Ug/av dette pulver til proveopplbsningen.

Eksempel 2.

Pepstatin ble ytterligere renset fra et rått pulver, som ble oppnådd ved en liknende metode som vist i eksempel 1. Dette rå pulver viste 50$'s hemning av pepsin ved å tilsette 0,16 \ ig til proveopplbsningen. Pulvret på 2,1 g ble opplost i 30 ml destillert vann og denne opplosning ble fort gjennom en kolonne (72 cm i lengde) på aktivt kull (18 g) med en hastighet på 2ml/minutt. h00 ml destillert vann og 300 ml ^O^s vanndig metanol ble fort gjennom for å vaske kolonnen, og pepstatin på kolonnen ble eluert med 80$'s vanndig metanol (metanol 80 : vann 20).

Eluatet ble samlet i fraksjoner, hver veiende 5g,.og fraksjoner som inneholder pepstatin ble forenet og fordampet under vakuum og gir 0,7 g av et hvitt pulver. Dette pulver viste 50$'s hemning av pepsin ved å tilsette 0,05^ ] ig til proveopplbsningen.

Eksempel 3.

^+000 ml av dyrkningsfiltratet ble fremstilt efter den samme metode som er beskrevet i eksempel 1. Det viste 58$'s hemning av pepsin når 0,05 ml av den 100 ganger fortynnede opplosning ble utsatt for hemningsproven for pepsin. 80 g aktivt kull ble■til-satt og rbrt om i 20 minutter. Derpå ble alt pepstatin i dyrkningsf iltratet adsorbert. Kullet som ble skilt fra ved filtreringen ble vasket med 2.000 ml vann, og pepstatin på kullet ble eluert med 2.000 ml og 1.500 ml metanol suksessivt ved h0°C. Me-tanoleluatene ble forenet og dampet inn under vakuum og gir "15

>g av et brunt, rått pulver. 50$'s hemning av pepsin ble iakttatt ved tilsetning av 0,6 jig av dette pulver til prbveopplbs-

ningen. Dette pulver ble opplost i 1.000 ml vann og fort gjennom en kolonne som inneholder 100 g aktivt kull (3 cm i diameter) og kromatografi ble utfort ved liknende behandlinger som er angitt i eksempel 2 og gir 1,5 g av det hvite pulver. 50$'s hemning av pepsin ble vist ved å tilsette 0,06 u.g av dette pulver til proveopplbsningen.

E ksempel h .

Den fullstendige rensning ble begynt fra 0,38 g av et pulver som ble oppnådd ved en liknende metode som vist i eksempel 3 og viste 50$'s hemning ved å tilsette 0,06 ] ig til proveopplbsningen. Det ble opplost i 5,0 ml av en opplosningsmiddelblanding bestående av.butanol, eddiksyre, vann og butylacetat i volumforholdet h : 1 : 1 : k og fort gjennom en silikagel-kolonne (90 g silikagel og 2,2cm i diameter), som var blitt vasket med den samme opplosningsmiddelblanding. Den samme opplosningsmiddelblanding ble ytterligere fort gjennom og eluatet ble samlet i.fraksjoner hver på 5 g. Derefter viste pepstatin seg i fraksjonene fra 9 til 15 og.fordampning av disse fraksjoner kombinert ga 0,27 g av et hvitt pulver og 0,0*+ jig viste 50$'s hemning. Krystallisa-sjonen av dette pulver fra metanol ga 0,13 g nålekrystaller av pepstatin. Tilsetningen av 0,02 y,g av krystallene til proveopplbsningen viste 50$'s hemning av pepsin.

Eksempel 5.

Et hvitt pulver fremstilt som beskrevet i eksempel 2 viste 50$'s hemning av pepsin ved å tilsette 0,06 jig til proveopplbsningen. Pulveret på 0,<*>+ g ble opplost i 5,0 ml av en opplosningsmiddelblanding (etylacetat-metanol 3:1). Silikagel-kromatografi som beskrevet i eksempel *f, men under anvendelse av opplbsningsmid-delblandingen av etylacetat-metanol i forholdet 3:1 ble utfort, og eluatet ble samlet i fraksjoner, hver veiende 5g. Derefter viste pepstatin seg i fraksjonene 10 til 20. Fordampningen av de forenede fraksjoner ga 0,29 g hvitt pulver, som viste 50$'s hemning ved å tilsette 0,03 V-g til proveopplbsningen. Krystallisasjon fra metanol ga 0, lh g nålekrystaller av pepstatin, s.p. 22k - 226°C.

Eksempel 6.

150 liter av mediet, som var det samme som er beskrevet i eksempel 1, ble anbragt i en rustfri stål fermenteringsanordning med volum 200 liter og sterilisert ved 115°C i 30 minutter, og 1 liter av ry stekul tur suppen av stammen MClU^f-Cl ble inokulert. Ry-stekulturen ble utfort ved den samme behandling som i eksempel 1 i 72 timer. Fermenteringen i fermenteringsanordningen ble utfort under omroring med 200 omdreininger pr. minutt og 200 liter sterilisert luft/minutt ved 2h°C og fortsatt i 72 timer. Derefter

var pH 7,^+2 og 0,05 ml av 250 ganger fortynnet dyrkningsfiltrat viste 51,5$' s hemning av pepsin. Diatomerjord på U,5 kg ble tilsatt, filtrert og kaken ble vasket med 12 liter destillert vann. Det vaskede filtrat ble tilsatt til dyrkningsfiltratet og det totale volum var 133 liter. Dette filtrat ble gitt pH 8,2 med 3n NaOH og ekstrahert med 60 liter og 30 liter n-butanol suksessivt. Butanolekstraktene ble forenet og vasket med 11 liter og 9 liter vann suksessivt og konsentrert ved destillasjon under redusert trykk. Fellingen ble samlet opp og torket og gir 38,<*>+ g av et brunt pulver. Det viste 50$'s hemning av pepsin ved å tilsette 0,10|ig til proveopplosningen. Den ovenstående væske ble ytterligere dampet inn til tbrrhet og gir 13,0 g av et brunt, rått pulver. Det viste 50%' s hemning av pepsin ved å tilsette 0,17y.g til proveopplosningen. Utbyttet fra dyrkningsf iltratet til dette pulver var 70$.

Eksempel 7.

3000 liter av mediet som beskrevet i eksempel 1 ble anbragt i en 6.000 liters fermenteringsanordning og efter sterilisering ble 110 liter av 28 timers dyrkningssuppe i 200 liters fermentering sanordning som beskrevet i eksempel 3 inokulert, og fermenteringen ble fortsatt under omroring med 190 omdreininger pr. minutt og under luftning med 2.500 liter steril luft pr. minutt ved 2h°C. Suppen ble tatt ut efter 65 timers fermentering. pH var 7,5 og 77,5 kg "Dicalite" ble tilsatt og filtrert gjennom fil-terpresse, og filterkaken ble vasket med 200 liter vann. Det totale volum av filtratet og vannet som anvendes for vaskningen

(var 2.790 liter. pH ble innstilt på 8,2 med 3n NaOH og ekstrahert med lAOO liter n-butanol. Hemningsproven for pepsin viste

at filtratet inneholdt ^23 g pepstatin, og butanolekstraktet inneholdt 362 g pepstatin. Butanolekstraktet ble konsentrert under redusert trykk til 10? liter og fellingen ble skilt fra (den fuktige vekt for fellingen var 3.760 g). Den konsentrerte opplosning ble ytterligere konsentrert til 10 liter og fellingen (fuktig vekt 1.5^0 g) ble samlet opp. Fellingene ble forenet og opplost i 16 liter metanol ved ca. hO°C. Metanolopplosningen inneholdt 297 g pepstatin. Aktivt kull på 1.500 g ble tilsatt til den varme metanolopplosning og filtrert. Metanolopplosningen ble kjolt, derpå fremkom krystaller (fuktig vekt

h00 g) og disse ble skilt fra. Kullet ble vasket med varm meta-noi på 8 liter 3 ganger, og disse metanolopplosninger ble tilsatt til den ovenstående væske av krystaller og konsentrert til 1 liter og avkjolt og gir 63 g krystaller av pepstatin.

Myceliekaken som inneholder"Dicalite"bl.e ekstrahert med 500 liter varm metanol, og metanolopplosningen ble fordampet under vakuum. Resten ble vasket med 15 liter varm etanol og derefter opplost i 20 liter varm metanol. 1000 g kull ble tilsatt til den varme metanol, og efter avkjoling felte krystaller av pepstatin (170 g) ut.

Eksempel 8.

Pepstatin (5^8 mg) ble opplost i ca. 50 ml metanol, en eteropp-losning som inneholder diazometan 3 g/ 200 ml ble tilsatt inntil den gule farve for diazometan forblir. Umiddelbart derefter ble den fordampet under vakuum og gir 560 mg hvitt pulver. 0m-krystallisas jonen fra metanol ga hvite nålekry staller, s.p. 2^+9

- 25l°C. Den viser esterbånd ved 1730 cm"1, i det infrarode

spektrum og i dette bånd forsvant karboksylbåndet i pepstatin ved 1710 cm <1>. Tilsetning av 0,015 V- g av denne ester til proveopplosningen viste 50$'s hemning.

Eksempel 9.

En dråpe sporer og myceliet av stammen MC210-A1 ble inokulert.

i. et medium som inneholder glycerol 2,5$, kjottekstrakt 0,5$, pepton 0,5$, gjærekstrakt 1,0$, NaCl 0,2$, MgSO^./^O 0,05$, K^PO^ 0,05$ og CaCO^ 0,32$. 100 ml av dette medium ble anbragt i en rysteflaske på 500 ml i volum og sterilisert for inokule-ring. Den ble rystedyrket ved 27°C i 7 dager. pH var 7,5 på den femte dag og 7,7 på den syvende dag. Tilsetning av 0,1 ml av det 25 ganger fortynnede dyrkningsfiltrat til proveopplbsningen viste 32$'s hemning av pepsin. Dyrkningsfiltråtene fra 50 flasker ble forenet, og pepstatin i det forenede filtrat ble ekstrahert med 2.000 liter n-butanol. Fordampningen under redusert trykk av ekstraktet ga 2,0 g av et brunt pulver. Tilsetning av 1,5 Ug av dette pulver til proveopplbsningen viste 50$'s hemning av pepsin. Det rå pulver ble suspendert i 30 ml vann og fort gjennom en kolonne av kull (18 g, 1,5 cm i diameter). 300 ml 30$'s vanndig metanol ble fort gjennom og derefter ble pepstatin i kolonnen eluert med 80$'s vanndig metanol. Eluatet ble samlet i fraksjoner som hver veier 5 g. Pepstatin opptråtte i fraksjonene 28 - H-5. Disse fraksjoner ble forenet og dampet inn under vakuum og gir 0,35 g av et hvitt pulver, som viste 50$'s hemning av pepsin ved å tilsette 0,3 Ug til proveopplbsningen. Rensnin-gen av pepstatin i dette pulver ved den samme metode som er beskrevet i eksempel h ga krystaller av pepstatin som ble identi-fisert ved det infrarode spektrum og tynnlags-kromatografi.

Eksempel 10.

114 mg pepstatin ble opplost i 40 ml etanol og tilbakelopsbehand-let med 40 ml benzen og flere dråper konsentrert svovelsyre i

h timer. Det ble neutralisert med natriumbikarbonat, og efter filtreringen ble filtratet konsentrert under redusert trykk til tørrhet og gir 75 mg hvitt pulver. Dette pulver ble vasket med vann og torket og gir <1>+8 mg etylester av pepstatin, s.p. 190 - 193°C Beregnet for C^<H>^<N>^Og: C <6>0,56, H 9,1+5, N 9,80, 0

20,16; funnet: C 60,96, H 9,65, N 9,<1>+3, 0 19,70. Tilsetning av 0,02yig til proveopplosningen viste 50$'s hemning av pepsin.

Eksempel 11.

<1>+05 mg metylester av pepstatin ble opplost 1 metanol og ammoni-umgass ble innfort i lh timer. Under denne reaksjon oppsto en felling og filtreringen efter reaksjonen ga 32<*>4- mg av et hvitt pulver av pepstatinamid som var forurenset med metylesteren av pepstatin. Dette pulver ble underkastet silikagel-kromatografi under anvendelse av kloroform-aceton-metanol (5:3:2 i volum') og fraksjonene var hver på 5 g. Pepstatinamid opptråtte i fraksjonene nr. 101. - 350, hvis fordampning ga 260 mg rent pepstatinamid, s.p. 229 - 23i°C. Analyse: beregnet for C^H^N^Og: C

59,62, H 9,<1>+1, N 12,27, 0 18,68; funnet: C 59,69, H 9,^5, N 12,17, 0 l8,2l+. Tilsetning av 0,051+ Ug til proveopplosningen viste 50$'s hemning av pepsin.

Innenfor rammen av nærværende oppfinnelse faller fremstilling av pepstatin, salter av pepstatin med uorganiske baser og organiske baser, slik som natrium, kalium, ammoniakk, kalsium, magnesium, glukosamin, mannosamin, galaktosamin, ferro, ferri, kupri, kupro etc. og estere av pepstatin slik som metyl-^ etyl, propyl, butyl-, isobutyl-, pentyl7 isopentyl-, benzylestere etc. For terapeutiske formål er salter fra ikke-giftige baser anvendelige, men salter med giftige baser er anvendelige ved isoleringsbehandlinger,

f.eks. som utfellingsmidler fra oppløsningene.

Når onsket for spesielle formål og for å gjore dem farmasøytisk aksepterbare kan det tilblandes forbindelsene fremstilt etter nærværende oppfinnelse andre medikamenter, slik som antihistaminer, sulfa-droger, antibiotika, pufringsmidler, slik som natriumbikarbonat, kalsiumkarbonat, aluminiumsilikat, magnesiumkarbonat etc, nervebedovende midler slik som metokropromid, oxazepam etc.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en pepsininhi bitor, be

   tegnet pepstatin,med strukturformelen

   og salter, estere og amidet av dette, karakterisert ved at Streptomyces testaceus ATCC No. 21469 eller Streptomyces argenteolus var, toyonakensis ATCC No. 21468 dyrkes i et næringsmedium under aerobe betingelser, og at man utvinner pepstatinet fra næringsmediet, hvorpå man eventuelt fremstiller salter, estere eller amidet av dette.