NO129682B - - Google Patents
Download PDFInfo
- Publication number
- NO129682B NO129682B NO02289/70A NO228970A NO129682B NO 129682 B NO129682 B NO 129682B NO 02289/70 A NO02289/70 A NO 02289/70A NO 228970 A NO228970 A NO 228970A NO 129682 B NO129682 B NO 129682B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- pepstatin
- methanol
- pepsin
- growth
- inhibition
- Prior art date
Links
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 claims description 160
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 claims description 160
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 claims description 158
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 40
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 40
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 19
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 16
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 7
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 6
- 241000958254 Streptomyces argenteolus Species 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 135
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 39
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 33
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 32
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 23
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 16
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 16
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 16
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 14
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 12
- -1 Sakaguchi Chemical compound 0.000 description 12
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 11
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 11
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 9
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 9
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 9
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 8
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 8
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 8
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 6
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 6
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 5
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 5
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 5
- 239000002021 butanolic extract Substances 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 5
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 5
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 5
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 5
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 5
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 5
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical class [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 4
- QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N Diacetyl Chemical group CC(=O)C(C)=O QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YXHKONLOYHBTNS-UHFFFAOYSA-N Diazomethane Chemical compound C=[N+]=[N-] YXHKONLOYHBTNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UGZVBQBZBBMPMB-UHFFFAOYSA-N acetic acid butan-1-ol butyl acetate hydrate Chemical compound O.CC(O)=O.CCCCO.CCCCOC(C)=O UGZVBQBZBBMPMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 4
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 4
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 4
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 3
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical class [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 230000002467 anti-pepsin effect Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 3
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 3
- UREBWPXBXRYXRJ-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;methanol Chemical compound OC.CCOC(C)=O UREBWPXBXRYXRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 3
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 3
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- BBBFYZOJHSYQMW-LGDQNDJISA-N (2s)-2,4-diamino-4-oxobutanoic acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O BBBFYZOJHSYQMW-LGDQNDJISA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- DGMPVYSXXIOGJY-UHFFFAOYSA-N Fusaric acid Chemical compound CCCCC1=CC=C(C(O)=O)N=C1 DGMPVYSXXIOGJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 2
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 2
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N N-Pentanol Chemical compound CCCCCO AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 2
- NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N Salicin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(CO)cccc1 NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 2
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 2
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 2
- NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N alpha-salicin Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001362 calcium malate Substances 0.000 description 2
- OLOZVPHKXALCRI-UHFFFAOYSA-L calcium malate Chemical compound [Ca+2].[O-]C(=O)C(O)CC([O-])=O OLOZVPHKXALCRI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940016114 calcium malate Drugs 0.000 description 2
- 235000011038 calcium malates Nutrition 0.000 description 2
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 2
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 2
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 2
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- XCQHIHYTTLZESJ-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol;propan-2-one Chemical compound OC.CC(C)=O.ClC(Cl)Cl XCQHIHYTTLZESJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 239000012225 czapek media Substances 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N galactitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 2
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000013586 microbial product Substances 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N salicin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N 0.000 description 2
- 229940120668 salicin Drugs 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 2
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 2
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMGMINKVTPDDRZ-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-n-[1-[[5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]-4-methylpentanamide;n-[1-[[5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]-4-methyl-2-(propanoylamino)pentanamide Chemical compound CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N.CCC(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N BMGMINKVTPDDRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-CBPJZXOFSA-N 2-amino-2-deoxy-D-mannopyranose Chemical compound N[C@@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-CBPJZXOFSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- KCOULPRVOZDQEL-IFNZWHIZSA-N Aquayamycin Chemical compound C1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1C1=CC=C(C(=O)C=2[C@]3(C(=O)C[C@](C)(O)C[C@@]3(O)C=CC=2C2=O)O)C2=C1O KCOULPRVOZDQEL-IFNZWHIZSA-N 0.000 description 1
- KCOULPRVOZDQEL-UHFFFAOYSA-N Aquayamycin Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1C1=CC=C(C(=O)C=2C3(C(=O)CC(C)(O)CC3(O)C=CC=2C2=O)O)C2=C1O KCOULPRVOZDQEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000765308 Aspergillus niger N-(5'-phosphoribosyl)anthranilate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 244000056139 Brassica cretica Species 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 108010011078 Leupeptins Proteins 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMBCNGLMRSLPH-UHFFFAOYSA-N O.OC=O.CC(O)=O Chemical compound O.OC=O.CC(O)=O FWMBCNGLMRSLPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108010036222 Pepstatins Proteins 0.000 description 1
- 208000008469 Peptic Ulcer Diseases 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000786363 Rhampholeon spectrum Species 0.000 description 1
- 241001134665 Streptomyces longisporoflavus Species 0.000 description 1
- 102220600074 Succinate dehydrogenase [ubiquinone] cytochrome b small subunit, mitochondrial_I96V_mutation Human genes 0.000 description 1
- YKTSYUJCYHOUJP-UHFFFAOYSA-N [O--].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] Chemical compound [O--].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] YKTSYUJCYHOUJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940035674 anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N anthrone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 description 1
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003861 general physiology Effects 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Chemical class 0.000 description 1
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001077 hypotensive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- XOOMNEFVDUTJPP-UHFFFAOYSA-N naphthalene-1,3-diol Chemical compound C1=CC=CC2=CC(O)=CC(O)=C21 XOOMNEFVDUTJPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- ADIMAYPTOBDMTL-UHFFFAOYSA-N oxazepam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2NC(=O)C(O)N=C1C1=CC=CC=C1 ADIMAYPTOBDMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004535 oxazepam Drugs 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000161 signs of toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000001117 sulphuric acid Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 125000000383 tetramethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- PQDJYEQOELDLCP-UHFFFAOYSA-N trimethylsilane Chemical compound C[SiH](C)C PQDJYEQOELDLCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/8142—Aspartate protease (E.C. 3.4.23) inhibitors, e.g. HIV protease inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/02—Linear peptides containing at least one abnormal peptide link
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/803—Physical recovery methods, e.g. chromatography, grinding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Fremgangsmåte for fremstilling av en pepsin-inhibitor, betegnet pepstatin.
Nærværende oppfinnelse vedrorer en fremgangsmåte for fremstilling av et nytt og anvendelig mikrobielt produkt betegnet pepstatin og med den generelle formel:
samt salter, estere og amidet av dette ved fermentering. Denne substans, dens salter, estere og amidet er effektivt til å hemme pepsin og oppviser terapeutisk og beskyttende virkning på eksperimentelt mavesår hos rotter og mus. Den har lav giftig-
het og er anvendelig for behandling av mavesår og tolvfinger-tarmsår hos mennesker.
Det er nå ifolge nærværende oppfinnelse fremskaffet en antipep-sinforbindelse (og dens salter og estere), som er effektiv i å hemme proteasevirkning for pepsin, og nevnte anti-pepsinforbin-delse er opploselig i metanol, eddiksyre, dimetylsulfoksyd og pyridin, svakt opploselig i etanol, propanol, butanol, amylalkohol, i det vesentlige uopploselig i etylacetat, butylacetat, etyl-eter, karbontetraklorid, heksan, petroleumeter, benzen og<1> kloroform, smelter ved 228-229°C, oppviser sterk sluttabsorpsjon uten et maksimum bortsett fra en lav skulder ved 260-270 mu for E,
27 ~ 1 cm = ca. 0,3, oppviser venstredreining på [oc]D = -90° (C = 0,288 i metanol), gir positiv Rydon-Smith-reaksjon (hvis det underso-kes på tynnlagskromatogram, og natriumhydroksydopplosning for-stoves for påsproytning av reagensen), er negativ ved
ninhydrin, Sakaguchi, naftoresorcin, anisaldehyd-svovelsyre-reaksjoner, oppviser folgende bånd i det infrarode område av spektret når pellettert med kaliumbromid: 3320, 3090, 2955, 1710, 1635, 1545, 1470, 1450, 1420, 1390, 1370, 1300, 1220, 1178, 1070, 710 cm"''', og har formlen C34H63N5°g som vises ved massespektret av metylesteren av diacetylderivatet og ved elementæranalyse,
gir L-valin og L-alanin i forholdet 1 : 2 etter hydrolyse, har en karboksylgruppe som gir metylester (C35H65N5Dg? s.p. 249 - 251°C) , som er aktiv ved hemning av pepsin.
Innenfor oppfinnelsens ramme faller fremstilling av pepstatin, dets salter, dets estere som er aktive i å hemme pepsin. Pepstatin har en karboksylgruppe og forestres lett ved vanlige metoder for omdannelse av karboksyl til ester, slik som oppvarmning i sur metanol, diazometan-reaksjon etc. Fig. 1 er det infrarode absorpsjonsspektrum for pepstatin pellettert i kaliumbromid. Fig. 2 er det infrarode absorpsjonsspektrum for metylester av pepstatin pellettert i kaliumbromid. Fig. 3 er det kjernemagnetiske resonansspektrum for metylesteren av diacetylpepstatin tatt i tetradeuterometanol.
Ifolge oppfinnelsen fremstilles pepstatin ved en fremgangsmåte som karakteriseres ved at man dyrker Streptomyces testaceus ATCC No. 21469 eller Streptomyces argenteoius var toyonakensis ATCC No. 21468 i et næringsmedium under aerobe betingelser og utvinner pepstatinet fra næringsmediet , hvorpå man eventuelt fremstiller salter, estere eller amidet av dette. Næringsmediet inneholder karbonkilder, nærings-karbonkilder og nitrogenkilder.
Den systematiske utskillelse av mikrobielle produkter som er virksomme i å hemme enzymer ble begynt av nærværende oppfinnere i 1965, og aquayamycin som hemmer tyrosin-p-hydroksylase, fusar-syre som hemmer dopamin-p-hydroksylase og som oppviser hypoten-siv virkning, og leupeptiner som hemmer trypsin, plasmin og kallikrein er blitt funnet av nærværende oppfinnere. Disse har også antatt at mikroorganismer produserer proteaser, esteraser etc. og for beskyttelsen av deres egne enzymer ville inhibito-rer også produseres. Ved fortsettelsen av disse studier ble pepstatin funnet i kulturfiltrater fra actinomyceter. Dessuten, pepstatin ble bekreftet å oppvise terapeutisk eller beskyttende virkning mot mavesår. Det kan også fremheves at pepstatin er den forste forbindelse for spesielt å hemme pepsin. En spesifikk pepsininhibitor har ikke vært kjent for pepstatin. Som det vises ved nærværende oppfinnelse er pepstatin
funnet i to arter actinomyceter og det antas
å være utstrakt fordelt i actinomyceter. Ved nærværende oppfinnelse beskrives to stammer, fra hvilke pepstatin ble isolert. Angivelsen i parentes [] folger farvestandarden angitt i Color Harmony Manual of Container Corporation of America.
Egenskaper for stammen MC144-C1:
Stammen ble isolert fra en jordprbve samlet i en skog ved Cux Haven i Vest-Tyskland i august 1968 og ble i laboratoriet for nærværende oppfinnere nummerert som nr. MC144-C1. Den ble deponert i Kogyo Gijutsuin Hakko Kenkujyo 21.mai 1969 og depone
ringsnummeret er 312. Denne stamme er blitt deponert i American Type Culture Collection og gitt nummeret ATCC 21469, og er derfor nå tilgjengelig for forskere. Mikroskopisk er substratmyceliet godt forgrenet med utstikkende lufthyfer i svak bolge-form. På lufthyfer dannes åpne spiraler, endespiraler og haker, men snoinger iakttas ikke. Overflaten av sporene er jevn.
Egenskapene på forskjellige media er som folger:
1) På glycerol Czapek medium (dyrket ved 27°C): veksten er blek-gul til blekbrun og senere blekt gullig brun; luftmycelium ut-vikler seg svakt og er grålig-hvitt til lysegrått; gullig opploselig pigment produseres etter forlenget dyrkning. 2) På Krainsky glukose-asparagin-agar (dyrket ved 27°C): veksten er blekgul til gul [<p>astel Yellos, 1 1/2 fb]5 luftmycelium er grålig-hvitt til lysegrått; intet opploselig pigment. 3) På kalsiummalat-agar (dyrket ved 27°C): veksten er dårlig og farvelos; luftmycelium er tynt og grålig-hvitt til lysegrått5 intet opploselig pigment; ingen transparent sone iakttas rundt veksten. 4) I peptonvann som inneholder 1,0 % natriumnitrat (dyrket ved 27°C): veksten er meget dårlig og farvelos; intet luftmycelium; intet opploselig pigment; reduksjon av nitrat til nitritt er ikke klar. 5) På potetskiver (dyrket ved 27°C) : veksten er IMig og blek-gul, blekbrun eller rodlig brun [Rust Tan, 5 le-BrickRed, 6ng]; luftmycelium er svakt og hvitt til grålig-hvitt; intet opploselig pigment. 6) På stivelsesskiver (dyrket ved 27°C): vekst ble ikke iakttatt når dyrket i 21 dager. 7) På pepton-kjottekstrakt-agar (dyrket ved 37°C): vekst ble ikke iakttatt når dyrket i 21 dager. 8) På pepton-kjottekstrakt-agar (dyrket ved 27°C): veksten er farvelos; intet luftmycelium; intet opploselig pigment. 9) På Loeffler-koagulert serum (dyrket ved 37°C og 30°C): vekst ble ikke iakttatt når dyrket i 21 dager. 10) Stavkultur i buljong-gelatin (20°C): veksten er farvelos; intet luftmycelium; intet opploselig pigment; utflytning av gelatin ble iakttatt på den tredje dag av dyrkningen og fort-satte, d.v.s. utflytningen er sterk. 11) I melkemedium (dyrket ved 37°C): veksten er farvelos; intet luftmycelium, intet opploselig pigment, melken koaguleres og peptoniseres deretter, koagulering og peptonisering er sterk. 12) På tyrosin-agar (dyrket ved 27°C): veksten er dårlig og farvelos; intet luftmycelium; intet opploselig pigment; tyrosinase er negativ. 13) På cellulose (dyrket ved.27°C): vekst ble ikke iakttatt i 21 dager.
i-
Utnyttelse av karbohydrater ble provet på Pridb^nf-Gottlieb-medium (dyrket ved 27°C) og resultatét var. åorrt folger: 'Glye er ol, mannose og sukrose utnyttes og gir livlig vekst; arabinose, xylose, rhamnose, fruktose, inosirol, sorbitol, maltose, laktose, raffinose, dulcitol, salicin og inulin utnyttes ikke; dekstrin og stivelse utnyttes svakt; mannitol og galaktose gir meget svak vekst og synes ikke å utnyttes. Egenskapene for stammen MC144-C1 som er beskrevet foran kan trekkes opp som folger: Den horer til Streptomyces,danner spiraler, men ikke snoinger, gir sporer med jevn overflate, gir livlig vekst på potetskiver, men ikke så livlig på andre media, når dyrket ved 37°C er veksten dårlig, den har sterk proteolytisk aktivitet, veksten er blekgul, gul eller blek-brun på forskjellige media, luftmycelium er tynt og grålig-hvitt eller lysegrått på forskjellige media, den horer til den ikke-kromogene type, den rodaktige brune vekst på potetskiver er karakt e ristisk. Hvis disse egenskaper sammenliknes med dem for kjente arter, da er det likheter mellom denne stamme og Actinomyces longisporus-flavus som Krasini-kov beskrev i International Journal of Systematic Bacteriology 18, 342, 1968 og i bind 2, side 237 i boken "The Actinomycetes" skrevet av S.A. Waksman. Forskjellene og likhetene er som folger: Som foran beskrevet er stammen MC144-C1 forskjellig fra A. longisporus-flavus ved utnyttelse av karbohydrater og karakteren av luftmycelium. Fargen for veksten av stammen MC144-C1 på potetskiver er karakteristisk og denne stamme ble klassifisert som ~. en ny art betegnet Streptomyces testaceus.
Egenskaper for MC210-A1:
Denne stamme ble isolert fra en jordprove samlet ved Tokyonaka, Osaka i oktober 1968 og ble gitt nummeret MC210-A1 i oppfinnernes laboratorium. Denne stamme ble deponert i Kogyo Gijutsuin Hakko Kenkyujyo 21* mai 1969 og gitt deponeringsnummeret 313. Denne stamme er blitt deponert i American Type Culture Collection og gitt nummeret 21468, og derfor er den nå tilgjengelig for forskere. Mikroskopisk er substratmyceliet vel forgrenet med utstikkende typisk luftmycelium i viklingsform og spiraler dannes. Snoinger iakttas ikke. Overflaten av sporene er jevn.
Egenskapene på forskjellige media er som folger:
1) På glycerol Czapek-agar (dyrket ved 27°C): veksten er fargelos; luftmycelium er tynt og hvitt, lysegrått, eller grått; intet opploselig pigment. 2) På Krainsky glukose-asparagin-agar (dyrket ved 27°C): veksten er fargelos til blek-gul; luftmycelium er grålig hvitt til lysegrått; et svakt gul-farget, opploselig pigment dannes. 3) På kalsiummalat-agar (dyrket ved 27°C): veksten er farvelos; luftmycelium er hvitt, svakt brunlig-grått til grått; intet opploselig pigment; ingen transparent sone iakttas rundt veksten. 4) I peptonvann som inneholder 1,0 % natriumnitrat (dyrket ved 27°C) : veksten er farvelos; luftmycelium er hvitt; intet opploselig pigment; svak nitritt-dannelse. 5) På potetskiver (dyrket ved 27°C): veksten er svakt gullig-brun til morkegul [Mustard, 21e]; luftmycelium er rikelig og hvitt, gråaktig hvitt til lysegrått; svakt gullig-brunt, opploselig pigment dannes. 6) På stivelsesplater (dyrket ved 27°C): veksten er blek-gul til gul; luftmycelium er hvitt til brunaktig hvitt til svakt brunaktig-grått; blek-gult til gult, opploselig pigment dannes; hydrolyse av stivelse er svak. 7) På pepton-kjottekstrakt-agar (dyrket ved 37°C): veksten er farvelos; luftmycelium er hvitt; intet opploselig pigment. 8) På pepton-kjottekstrakt-agar (dyrket ved 27°C): veksten er farvelos; luftmycelium er rikelig og hvitt; intet opploselig pigment. 9) På Loeffler-koagulert serum (dyrket ved 37°C): veksten er farvelos til blek-gul; luftmycelium er gullig-hvitt;
intet opploselig pigment; ingen utflytning.
10) Stavkultur i gelatin (dyrket ved 20°C): veksten er farvelos, blek-gul til blek gullig-brun; luftmycelium er hvitt; brunaktig opploselig pigment dannes; utflytning iakttas etter ca. 2o dagers dyrkning og meget svak. 11) I melk (dyrket ved 37°C): veksten er farvelos; intet luftmycelium; intet opploselig pigment; melken koaguleres og peptoniseres skjont koagulering og peptonisering er rela-tiv svak. 12) På tyrosin-agar (dyrket ved 27°C): veksten er farvelos; luftmycelium er hvitt, grålig-hvitt til lysegrått; intet opploselig pigment; tyrosinase er negativ. 13) På cellulose (dyrket ved 27°C): veksten er svak og spaltning iakttas ikke.
Utnyttelsen av karbohydrater ble provet på Pridham-Gottlieb-medium og de folgende resultater ble oppnådd: glycerol, xylose, glukose, fruktose, mannose, galaktose, inositol, mannitol, sorbitol, maltose, sukrose, raffinose, dekstrin og stivelse utnyttes og gir god vekst; laktose og salicin utnyttes ikke for-di veksten er meget svak, rhamnose, arabinose, dulcitol og inulin utnyttes ikke. Egenskapene for stammen MC210-A1 som er beskrevet foran kan summeres opp som folger: Den tilhorer den ikke-kromogene art av Streptomyces; spiraler dannes, men ikke snoinger; overflaten av sporene er jevn; veksten er farvelos, svakt gul eller gul på forskjellige media; luftmycelium er hvitt til lysegrått på forskjellige media; opploselig pigment foreligger vanligvis ikke bortsett fra gullig til brunlig pigment, svakt; den har svak proteolytisk virkning og hydrolytisk virkning på stivelse. Blant kjente arter av Actinomycetes likner Streptomyces argenteolus beskrevet av Fried, Perman, Lang-lykke og Titus i international Journal of Systematic Bacteriology 18, 295, 1968 og i boken "Actinomycetes" av S.A. Waksman, bind 2, side 17 5, mest denne stamme. Stammen MC210-A1 likner S. argenteolus bortsett fra utnyttelse av karbohydrater og utflytning av gelatin. Derfor ble stammen MC210-A1 betegnet som en variant av denne art, d.v.s. Streptomyces argenteolus var. toyonakensis.
Ved nærværende oppfinnelse anvendes i stedet for navnene
på foran angitte arter pepstatin-produserende Streptomyces for beskrivelsen.
Metoder for å undersoke aktiviteten for pepstatin som hemmer pepsin: Metoden som er beskrevet av Kunitzis i J. General Physiology, 30, 291, 1947 ble modifisert og pepsin, som markedsfores av Sigman Chemical Co., St. Louis Missouri, U.S.A. og kasein, som markedsfores av Wako Junyaku, Osaka, japan, ble anvendt. Kase-inet opploses i 0,08 M melkesyrepuffer (pH 2,2) ved 0,6 % og til 1 ml av denne kaseinopplosning tilsettes 0,7 ml 0,02 N HCl-0,02 M KC1 puffer (pH 2,0) og 0,2 ml av denne pufferopplos-ning med eller uten en prove og inkuberes ved 37°C i 3 minutter. Deretter tilsettes 0,1 ml inneholdende 4 yug pepsin i 0,02 N HCL-0,02M KC1 puffer (pH 2,0), blandes og inkuberes ved 37°C
i 30 minutter. Deretter tilsettes 2,0 ml perklorsyre (1,7 M) for å stanse reaksjonen. Etter 1 time ble det sentrifugert og den overstående væske underkastes bestemmelsen på optisk tetthet (a) ved 280 mu. Reaksjonsblandingen uten pepstatin ble behandlet på liknende måte og fra denne optiske tetthet ble prosentinhiberingen (b-a)/b x 100 beregnet. Mengden pepstatin i et provemateriale oppnås fra den prosentuelle hemning og en standardkurve for konsentrasjonen av pepstatin og prosent hemning. Pepstatin viste 50 % hemning når 0,02 jug ble tilsatt til reaksjonsblandingen.
pepstatin fremstilles ved å inokulere sporer eller my-celia fra en pepstatin-produserende organisme i et egnet medium og derpå dyrke under aerobe betingelser. For produksjon av pepstatin er dyrkning på et fast medium mulig, men for produksjon av store mengder foretrekkes dyrkning i et flytende medium. Enhver fermenteringstemperatur kan anvendes innen området i hvilket pepstatin-produserende organismer kan vokse og produsere pepstatin, skjont 25 - 3 5°C foretrekkes. Media bestående av kjente næringskilder for actinomyceter er anvendelige for produksjon av pepstatin. F.eks. er kommersielle produkter, slik som pepton, kjbttekstrakt, gjærekstrakt, maisstopevæske, bomulls-fromel, soyabonnemel, gjærekstrakt, N-A amin, kasein, natriumnitrat, ammoniumnitrat, ammoniumsulfat og andre nitrogenfoldige materialer slik som hvetekli, riskli etc. anvendelige som nitro-genkilde. Kommersielle tilgjengelige produkter, slik som laktose, glycerol, sukrose, stivelse, glukose, maltose, melasse og andre karbohydrater eller fettarter i ren tilstand eller rå tilstand er anvendelige som karbonkilde. Blant disse er glycerol, glukose, maltose, dekstrin og stivelse eksempler på billige og egnede karbonkilder for produksjon av pepstatin. Natriumklorid, natrium- eller kaliumfosfat, kalsiumkarbonat eller magnesiumio-ner kan også tilsettes. Spor av metallsalter kan tilsettes hvis nodvendig. Enhver art av bestanddeler som kan anvendes av pepstatin-produserende organismer for produksjon av pepstatin er anvendelige. Ethvert materiale som er kjent for dyrkning av actinomyceter er anvendelig.
Fermenteringen fortsettes inntil pepstatin i det vesentlige er akkumulert. F.eks. stammen MC1M+-C1 ble inokulert ;i . forskjellige media som inneholder forskjellige karbonkilder, forskjellige nitrogenkilder, NaCl 0,3 %, MgSO^t^O 0,1%, K2HP0> 0,1%, metallopplosning 0,1 ml/100 ml og rystedyrket ved 27-29 C på en resiproserende rystemaskin (amplitude 8 cm, 200 slag/minutt). Metallopplosningen besto av CuSO^^^O 700 mg, FeSO^R^O 100 mg, MnC^AR^O 800 mg, ZnSO^^^O 200 mg i 100 ml destillert vann. Rysteflasker med volum 500 ml ble brukt og 100 ml av hvert medium ble anbragt. På hver dag av rystedyrkningen ble 0,5 ml av 100 ganger fortynnet suppefiltrat undersokt på anti-pepsin-aktivitet, og resultatene som vises i tabell 1 ble iakttatt. Pepstatinproduksjon ble iakttatt allerede efter to dagers ryste-dyrkning, og det maksimale utbytte ble funnet på h. - 7- dag av dyrkningen. pH ved den maksimale produksjon var ofte ca. 9, 0. Selvom pH 9,0 ble opprettholdt under rystedyrkningen i 10 dager ble -ingen nedsettelse av pepstatin iakttatt, hvilket viser dets stabile egenskaper. Som vist i tabell 1 kan forskjellige karbonkilder og nitrogenholdige materialer anvendes for produksjon av pepstatin. Karbon-og nitrogenkilder av media: nr. 1 2$ glycerol, 0, 75% kjottekstrakt, 0,75$ pepton; nr. 2, 2% glycerol, 1, 0% "N-Z amin',' °>2$ gjærekstrakt; nr. 3, 2, 0% glycerol, 1, 5% soyabonnemel; nr. h, 2% glycerol, 1, 5% maisstopevæske; nr. 5, 2% laktose, 0,75$ kjottekstrakt, 0,75$ pepton; nr. 6, 2% laktose, 1,0$'k-Z amin" 0,2$ gjærekstrakt; nr. 7, 2$ laktose, 1,5$ soyabonnemel; nr. 8, 2$ laktose, 1,5$ maisstopevæske; nr. 9, 1$ glukose, 1$ laktose, 0,75$ kjottekstrakt, 0,75$ pepton; nr..10, 1$ glukose, 1$ laktose, 1$"n-Z amin" 0,2$ gjærekstrakt; nr. 11, 1$ glukose, 1$ laktose, 1,5$ soyabonnemel; nr. 12, 1$ glukose, 1$ laktose, 1,5$ maisstopevæske; nr. 13, 2$ glukose, 1,0$"n-Z amin'^ 0,2$ gjærekstrakt; nr. lh, 2% glukose, 1,0$ "N-Z amin'^ 0,2$ gjærekstrakt; nr. 15, 2$ glukose, 1,5$ soyabonnemel; nr. 16, 2$ glukose, 1,5$ maisstopevæske.
For produksjon av pepstatin ved fermentering kan de vanlige metoder som anvendes for antibiotika brukes. F.eks., 100 liter av et medium ble anbragt i et rustfritt fermentering skar med volum 200 liter og sterilisert, pepstatin-produserende organismer ble inokulert og fermenteringen ble utfort under luftning med 100 liter steril luft/minutt, hvorpå produksjon av pepstatin nådde et maksimum efter h5 - 60 timer.
Efter nærværende oppfinnelse er det fremskaffet fremgangsmåter for isolering, rensning av pepstatin, dets salter og pepstatin-estre.
Pepstatin er stabilt ved pH 2,0 - 9,0, når opplosningen. ved disse forskjellige pH oppvarmes ved 60°C i 30 minutter, og pepstatin blir tilbake uten noen nedsettelse av aktiviteten.
Pepstatin som bare er svakt opploselig i vann foreligger ikke bare i dyrkningsvæsken, men inneholdes også i myceliumsmassen. Når fermenteringsutbyttet ikke er stort foreligger mesteparten av pepstatin i den flytende del, men når det er hoyt inneholdes en stor mengde 1 myceliumsmassen. Pepstatin i myceliumsmassen ekstraheres med opplosningsmidler i hvilke pepstatin er opploselig, f.eks. med metanol. Pepstatin har karboksylgrupper og danner salter slik som Na<+>, Ka+, NH^_<+>, Li<+>, Ca<++>, Mg<++>, Cu<++>, Ba<++>, Fe<++>, Mn<++> etc. Natrium- eller kaliumsalter av pepstatin har liknende opploseligheter som pepstatin, men salter av kalsium, magnesium og tungmetaller er mindre oppløselige i vann og metanol. Derfor er det onskelig å ekstrahere pepstatin fra myceliumsmassen til opplosningsmidlene i sur tilstand. Pepstatin er mere opploselig i metanol som inneholder kalsiumklorid, og derfor er det en egnet metode å ekstrahere pepstatin i myceliumsmassen med sur metanol som inneholder CaC^. Pepstatin i den flytende del ekstraheres med med vann ikke blandbare opplosningsmidler i hvilke pepstatin er mere opploselig enn i vann, f.eks. med butanol. Fordampning av pepstatinopplosningen gir rått pulver som inneholder pepstatin eller krystaller av pepstatin. Hvis fermenteringsutbyttet er hoyt gir fordampning av buta-nolekstrakt fra dyrkningssuppen krystaller av pepstatin.
Pepstatin er en stabil forbindelse og derfor kan dyrkningsfiltratet konsentreres ved destillasjon, fortrinnsvis under redusert trykk, og fra den konsentrerte opplosning eller den torkede rest ekstraheres det med organiske opplosningsmidler, slik som metanol, butanol etc i hvilke pepstatin er tilstrekkelig opploselig. Dyrkningsvæsken som inneholder mycelium kan utsettes for ekstraksjon med et med vann ikke blandbart opplosningsmiddel, slik som propanol, butanol eller amylalkohol for å ekstrahere pepstatin i den flytende del og i myceliedelen på én gang.
For ekstraksjon av pepstatin i opplosningsmidler kan vanlige metoder som anvender fler-trinns-ekstrahering, f.eks. Podobeal-niak-sentrifuge, anvendes.
Adsorpsjonsmetoder er også anvendelige for ekstrahering og rensning av pepstatin. For dette-formål er aktivt kull, ioneutvekslerharpikser, aluminiumoksyd, silikagel etc. anvendelig. F.eks. pepstatin i dyrkningsfiltrater kan adsorberes med aktivt kull og eftervaskes med vann, pepstatin på kull elueres med metanol eller vanndig metanol. For eluering oker hevningen av tempera-turen elueringsutbyttet. F.eks. aktivt kull ble tilsatt til dyrkningsfiltratet med 2,0$, og kullet ble behandlet to ganger med 20 ganger volumet av metanol ved hO°C under omroring, derpå ble pepstatin eluert og utbyttet fra dyrkningsfiltratet var ca. 80$. Karbonkromatografi er anvendelig for rensning av pepstatin. F.eks. efter at pepstatin var adsorbert på kull, ble dette' vasket med h0%] s vanndig metanol (metanol hOiH^ O 60), og pepsta-tinkromatografi utfort med 80$'s vanndig metanol (metanol 80:^0 20)Bruken av kull var også til hjelp for å fjerne farvede for-urensninger. Silikagelkromatografi er også anvendelig for rensning av pepstatin. F.eks. n-butanol-eddiksyre-vann-butylacetat (^rltlrU- i volum) eller etylacetat-metanol (3:1 i volum) var anvendelige opplosningsmiddelsystemer for rensning av pepstatin ved en silikagelkromatografi. Aluminiumoksydkromatografi er også anvendelig for rensning. F.eks. utfores den under anvendelse av metanol, etanol, butanol eller blandingen av disse alkoholer med estere.
Pepstatin har karboksylgrupper. Avhengig av denne syreegenskap anvendes sterke eller svake.basiske ioneutvekslerharpikser for ekstraksjon og rensning av pepstatin.
Pepstatin selv krystalliseres lett. Et opplosningsmiddel i hvilket pepstatin er opploselig er anvendelig for krystall!sasjonj f.eks. metanol er et eksempel som anvendes for krystallisasjon.
Karboksylgrupper i pepstatin omdannes lett til sine estere efter vanlige metoder for fremstilling av estere, f.eks. ved oppvarmning med den tilsvarende alkohol ved sur eller diazometan-metoden. Estere er også aktive ved hemning av pepsin. Metylestere er mere aktive enn pepstatin.
Hvis utbyttet av pepstatin i fermenteringsvæsken er hoyt oppnåes krystaller av pepstatin ved enkle metoder. F.eks. ekstraksjon av pepstatin med butanol og konsentrasjon av butanolekstraktet under vakuum gir krystallinsk pepstatin som omkrystalliseres fra metanol og gir hvite nålekrystaller av pepstatin.
Egenskaper for pepstatin beskrives her. Pepstatin krystalliserer som hvite nålekrystaller og det mest rensede pepstatin smelter ved 228 - 229°C. Det er optisk aktivt, og -9O<0> ble oppnådd for [a]5 i 0,288$'s metanolopplosning. Elementæranalysen ga de folgende resultater: beregnet for C^H<g>^<N>^O^: C 59 , 53, H 9,25, N 10,21, 0 20,99; funnet: C 59,02, 60,27, H 9,<2>7, 9,37, N 10,11, 9,90, 0 21,Vi, 21,15. På basis av de analytiske resultater kan formlen <C>25<E>6^ 5<0>10 (verdiene beregnet er C 58 , 72, H 9,15, N 9,78, 0 22,35) og C^H6^09 (verdiene beregnet er C 60,06, H 9,36, N 10,01, 0 20,57) ikke utelukkes, imidlertid ble formlen C^H^N^O^ understøttet av massespektret. Hovedtoppen av metylesteren av diacetylpepstatin var 783 og den for metylesteren av pepstatin 699. Molekylvektsbestemmelsen efter Akiya-Berger-metoden under anvendelse av en pyridinopplosning av pepstatin viste molekylvekten 600 - 730.
Det infrarode spektrum vises i fig. 1, hvor de folgende bånd iakttas: 3320, 3090, 2955, 1710, 1635, 15^5, 1^70, Hf 50, 1^20, 1390, 1370, 1300, 1220, 1178, 1070, 710 cm-1. Det infrarode spektrum for metylesteren av pepstatin vises i fig. 2. Det kjernemagnetiske resonansspektrum for metylesteren av diacetylpepstatin ble tatt med"Varian HA-lOO"utstyr i tetradeuterometanol under anvendelse av trimetylsilan som den indre standard og vises i' fig. 3.
Hydrolysen av pepstatin i 6n HC1 ved 100°C i 18 timer gir L-alanin og L-valin, som vises av aminosyre-analyse- i forholdet 1:2. Pepstatin gir positiv Rydon-Smith-reaksjon, og disse resultater og bånd i det infrarode spektrum ved 1635 og 15^5 cm<->"'" angir pep-tidbindinger i pepstatin.
Båndet i det infrarode spektrum ved 1710 cm<->"'" angir nærværet av karboksylgrupper i pepstatin.. Det vises også ved adsorpsjonen på en anioneutvekslerharpiks. Behandlingen av pepstatin med di-azometan eller oppvarmning med svovelsyre og en alkohol gir den tilsvarende ester. Metylesteren av pepstatin som fremstilles viser et esterbånd ved 1730 cm<-1> i stedet for båndet ved 1710 cm-"'". Et resultat av elementæranalyse av metylesteren var som folger: beregnet for C35<H6>5<N>5°9: c 6o>°5, H 9,36, N 10,00, 0 20,57; funnet: C 59,88, H 9,35, N 9,7^, 0 20,69. Pepstatin^som har en karboksylgruppe^danner salter, og saltene fremstilles lett ved noytrallsasjon eller ved å tilsette en beregnet mengde av en base til metanolopplosningen av pepstatin. F.eks. natriumpepstatin (s.p. 250 - 252°C, spaltning; beregnet for C3lfH62N^09Na: C 57,68, H 8,82, N 9,89, 0 20,3>+, Na 3,2*4-; funnet: C 57,97, H 8,92, N 9,96, 0 20,26, Na 2,98), magnesium-pepstatin (s.p. 2 57- 258°C, spaltning;,beregnet for C3l+H^2<N>^<0g->|Mg: C 58,58, H 8,96, N 10,0<1>+, 0 20,65, Mg 1,7^; funnet: G 58,30, H 9,05, N 9,9^, 0 20,8<*>+, Mg l,!+9) og kalsiumpepstatin (s.p. 262-263°C spaltning; beregnet for C^H^N^Ogica: C 57,93, H 8,86,
N 9,93, 0 20,<!>+2, Ca 2,8^; funnet: C 57,92, H 8,98, N 9,62, 0 20,07, Ca 2,62) ble fremstilt. Kalsiumpepstatin er mindre opploselig i vann og metanol enn pepstatin, pepstatin er imidlertid mere opploselig i metanol med CaCl2 enn i den uten CaCl2. Pepstatin som.har karboksylgrupper gir amid. F.eks. behandling av metylesteren av pepstatin i metanol ga pepstatinamid.
En behandling av pepstatin med eddiksyreanhydrid i pyridin gir diacetyl- og monoacetylpepstatiner, som skilles ved kolonnekro-matografi under anvendelse av silikagel og metanol-aceton-kloroform (5:25:70 i volum).
Ved tynnlagskromatografier under anvendelse av silikagel G ble de folgende Rf-verdier iakttatt for pepstatin i de folgende opplosningsmidler: 0,78, butylacetat-butanol-eddiksyre-vann (6:6:1 :1 i volum), 0,73 butylacetat- butanol-eddiksyre-vann (6:<*>+:l:l), 0,7b butylacetat-butanol-eddiksyre-vann (Vr^-rl:! i volum).
Ved hoyspenningselektroforese under anvendelse av surt opplosningsmiddel, slik som maursyre-eddiksyre-vann (25:75:900 i volum) under 3500V i 15 minutter beveger pepstatin seg ikke, hvilket antyder ingen basisk gruppe i pepstatin.
Den folgende struktur ble foreslått for pepstatin ved avbygnings-studier, n.m.r.spektret og massespektrometri av pepstatin og dets derivater:
Pepstatin har lav giftighet. Mus, hunder, rotter og kaniner tål-te oral administrasjon av 2.000 mg/kg av pepstatin uten noen tegn på forgiftning. LD^q for dyr ved de intraperitoneale injek-sjoner er tilnærmet som folger: mus 1.000 mg/kg; rotter 880 mg/ kg; kaniner 820 mg/kg; hunder ^50 mg/kg..Daglige doser på 250 mg/kg ved oral administrasjon til rotter i 90 dager forårsaket ikke noen forgiftning og rottene vokste med normal veksthastig-het .
Pepstatin inngitt oralt absorberes ikke. F.eks. når 50 mg/kg ble gitt oralt ble intet pepstatin funnet i blodet eller urinen 2<*>+ timer efter administrasjonen, og ca. 90$ ble vist i ekskre-menter som utskilles i lbpet av 72 timer efter administreringen.
Esterene, amicfei: og acetylderivatene av pepstatin viste 50$ hemning av pepsin ved metoden som er beskrevet foran ved de folgende konsentrasjoner: pepstatin 0,01p,g/ml; metylesteren 0,008vig/ ml; etylester 0,01y.g/ml; p-bromofenacylesteren 0,01 p,g/ml; amidet 0,027$ V-g/nil; monoacetylderivatet 1,1 jig/ml; diacetylderivatet h, 2 jig/ml; me tyle ster av diacetylderivatet 2,26 jig/ml: Imidlertid viser pepstatin ingen hemning overfor thrombokinase, plasmin, trypsin, kallikrein, oc-chymotrypsin og papain selv ved 250vig/ml. Således er pepstatin en sterk spesifikk pepsin-inhibitor. Proktase er en art pepsin som oppnåes fra Aspergillus ni-ger som angitt i Agri cultural Biological Chemistry (Japan), bind 28, s. 216-223, I96V. I reaksjonsblandingen som foran beskrevet bortsett fra at den inneholder samme mengde proktase i stedet for pepsin var konsentrasjoner for 50$'s hemning som folger: 0,02 ug/ml mot kaseinhydrolyse.
En sterk pepsin-inhibitor har aldri vært kjent for. Skjont svo-velsyreestere av polysakkarider har vært kjent å hemme pepsin er virkningen meget svak og den hemmer også blodkoagulering. Pepstatin er en sterk inhibitor for pepsin som vist ved 50$'s hemningskonsentrasjon som beskrevet foran, og den har ingen virkning på blodkoaguleringen. Den sterke pepsinhemmende virkning viser at pepstatin er effektiv på mavesår. Dette er blitt bekreftet ved kliniske studier.
Mavesår hos rotter fremkalt ved metoden som er beskrevet av Ta-kagi og medarb. i Japanese Journal of Pharmacology, 18, s. 1 - 18, 1968, d.v.s. anbringe hanrotter i et bar ved 23°C i 22 timer, beskyttes eller behandles terapeutisk med pepstatin. Når 50 mg/kg pepstatin ble inngitt oralt 30 minutter for belastningen, og rotter ble drept k- 8 timer efter belastningen^var helbre-delsesforholdet av mavesåret 76,3$. Når dosen var 10mg/kg var hemningsprosenten for mavesår 65,6$. Når 50 mg/kg pepstatin ble inngitt umiddelbart efter belastningen og én gang daglig i h dager og rotter ble drept ble den hurtige helbredelse av mavesår vist hos rotter som er behandlet med pepstatin.
Virkningen mot mavesår på rotter frembragt ved pylorus-underbinding (Shay rotter) er også vist. Metoden som er beksrevet av Watanabe og Kasuya i Chemical Pharmaceutical Bulletin, 11, 1282, 1963 ble anvendt. Hos rotter administrert med 2mg/kg eller stor-re doser 30 minutter og lh timer efter pylorus-underbinding ble intet mavesår funnet. 50$'s hemningsdose var 0,5 mg/kg. Pepsin-aktiviteten i mavesaften var ingen eller mindre enn 10$ av den for kontrollen. Således viste pepstatin sterk beskyttende og hel-bredende virkning mot mavesår hos Shay rotter. Oral administrasjon av pepstatin eller dets estere til mavesårs- og tolvfinger-tarmspasien med 1 - h tabletter som inneholder 25 - 100 mg pepstatin mellom måltidene, d.v.s. 3 - *+ ganger pr. dag viste hel-bredende virkning, og ingen giftighetstegn. Etter administrasjon forsvant smerten hurtig.
Pepstatin hemmer ikke papain som har en sulfhydrylgruppe som aktivt sted, imidlertid viser pepstatin hemning av carragen fremkalt bdema. (CA. Winter, E.A. Risley og G.W. Nuss: Proe. Soc. Exp. Biol. og Med., Ill, 5^*+, 1962). Pepstatin ble injisert intraperitonealt og carragen (0,1 ml av en l$'s opplosning) ble injisert til rottens bakpote, og 1, 3? 5 og 2h timer deretter ble odema målt. Derpå ble mere enn 30$<*>s hemning vist ved ikke mindre enn 1,25 mg/kg pepstatin.
De folgende eksempler fremlegges for å illustrere nærværende oppfinnelse.
Eksempel 1.
100 ml av et medium som inneholder glukose 1,0$, stivelse 1,0$, pepton 0,75$, kjottekstrakt 0,75$, NaCl 0,3$, MgS01+.7H20 0,1$, K^HPO^ 0,1$ og metallionopplosning (CuSO^HgO 700 mg, FeS01+.7H20 100 mg, MnCl2AH20 800 mg, ZnSO^<R>^<O> 200 mg) opploses i 100 ml destillert vann). 0,1 ml ble anbragt i en rysteflaske på 500 ml's volum og sterilisert ved 120°C i 20 minutter.
pH ble justert til 7,0 etter sterilisasjonen. En dråpe sporer og mycelium av stammen MCl^-Cl på et agarmedium ble inokulert og rystedyrket ved 27°C på en rystemaskin (130 slag pr. minutt og 8 cm's amplitude). pH var 5,7 på den tredje dag for rystedyrkningen og 6,3 på den fjerde dag. Bestemmelsen av sukkerreduksjon ved anthron-metoden viste den optiske tetthet på 0,9/0,005 ml
på den fbrste dag, 0,3/0,005 -"ni på den fjerde dag og nesten ingen på den femte dag. Den dyrkede suppe ble på den femte dag filtrert og 0,05 ml av 100 ganger fortynnet filtrat viste 6h%* s hemning av pepsin. Dyrkningssuppen på den femte dag.av 29 rysteflasker ble forenet og filtrert, og pepstatin i filtratet ble ekstrahert med 2^+00 ml og 2000 ml n-butanol suksessivt. Butano-ekstraktene ble forenet og fordampet under redusert trykk og gir brunt, rått pulver på h g. 50$'s hemning av pepsin ble vist ved å tilsette 0,13 Ug/av dette pulver til proveopplbsningen.
Eksempel 2.
Pepstatin ble ytterligere renset fra et rått pulver, som ble oppnådd ved en liknende metode som vist i eksempel 1. Dette rå pulver viste 50$'s hemning av pepsin ved å tilsette 0,16 \ ig til proveopplbsningen. Pulvret på 2,1 g ble opplost i 30 ml destillert vann og denne opplosning ble fort gjennom en kolonne (72 cm i lengde) på aktivt kull (18 g) med en hastighet på 2ml/minutt. h00 ml destillert vann og 300 ml ^O^s vanndig metanol ble fort gjennom for å vaske kolonnen, og pepstatin på kolonnen ble eluert med 80$'s vanndig metanol (metanol 80 : vann 20).
Eluatet ble samlet i fraksjoner, hver veiende 5g,.og fraksjoner som inneholder pepstatin ble forenet og fordampet under vakuum og gir 0,7 g av et hvitt pulver. Dette pulver viste 50$'s hemning av pepsin ved å tilsette 0,05^ ] ig til proveopplbsningen.
Eksempel 3.
^+000 ml av dyrkningsfiltratet ble fremstilt efter den samme metode som er beskrevet i eksempel 1. Det viste 58$'s hemning av pepsin når 0,05 ml av den 100 ganger fortynnede opplosning ble utsatt for hemningsproven for pepsin. 80 g aktivt kull ble■til-satt og rbrt om i 20 minutter. Derpå ble alt pepstatin i dyrkningsf iltratet adsorbert. Kullet som ble skilt fra ved filtreringen ble vasket med 2.000 ml vann, og pepstatin på kullet ble eluert med 2.000 ml og 1.500 ml metanol suksessivt ved h0°C. Me-tanoleluatene ble forenet og dampet inn under vakuum og gir "15
>g av et brunt, rått pulver. 50$'s hemning av pepsin ble iakttatt ved tilsetning av 0,6 jig av dette pulver til prbveopplbs-
ningen. Dette pulver ble opplost i 1.000 ml vann og fort gjennom en kolonne som inneholder 100 g aktivt kull (3 cm i diameter) og kromatografi ble utfort ved liknende behandlinger som er angitt i eksempel 2 og gir 1,5 g av det hvite pulver. 50$'s hemning av pepsin ble vist ved å tilsette 0,06 u.g av dette pulver til proveopplbsningen.
E ksempel h .
Den fullstendige rensning ble begynt fra 0,38 g av et pulver som ble oppnådd ved en liknende metode som vist i eksempel 3 og viste 50$'s hemning ved å tilsette 0,06 ] ig til proveopplbsningen. Det ble opplost i 5,0 ml av en opplosningsmiddelblanding bestående av.butanol, eddiksyre, vann og butylacetat i volumforholdet h : 1 : 1 : k og fort gjennom en silikagel-kolonne (90 g silikagel og 2,2cm i diameter), som var blitt vasket med den samme opplosningsmiddelblanding. Den samme opplosningsmiddelblanding ble ytterligere fort gjennom og eluatet ble samlet i.fraksjoner hver på 5 g. Derefter viste pepstatin seg i fraksjonene fra 9 til 15 og.fordampning av disse fraksjoner kombinert ga 0,27 g av et hvitt pulver og 0,0*+ jig viste 50$'s hemning. Krystallisa-sjonen av dette pulver fra metanol ga 0,13 g nålekrystaller av pepstatin. Tilsetningen av 0,02 y,g av krystallene til proveopplbsningen viste 50$'s hemning av pepsin.
Eksempel 5.
Et hvitt pulver fremstilt som beskrevet i eksempel 2 viste 50$'s hemning av pepsin ved å tilsette 0,06 jig til proveopplbsningen. Pulveret på 0,<*>+ g ble opplost i 5,0 ml av en opplosningsmiddelblanding (etylacetat-metanol 3:1). Silikagel-kromatografi som beskrevet i eksempel *f, men under anvendelse av opplbsningsmid-delblandingen av etylacetat-metanol i forholdet 3:1 ble utfort, og eluatet ble samlet i fraksjoner, hver veiende 5g. Derefter viste pepstatin seg i fraksjonene 10 til 20. Fordampningen av de forenede fraksjoner ga 0,29 g hvitt pulver, som viste 50$'s hemning ved å tilsette 0,03 V-g til proveopplbsningen. Krystallisasjon fra metanol ga 0, lh g nålekrystaller av pepstatin, s.p. 22k - 226°C.
Eksempel 6.
150 liter av mediet, som var det samme som er beskrevet i eksempel 1, ble anbragt i en rustfri stål fermenteringsanordning med volum 200 liter og sterilisert ved 115°C i 30 minutter, og 1 liter av ry stekul tur suppen av stammen MClU^f-Cl ble inokulert. Ry-stekulturen ble utfort ved den samme behandling som i eksempel 1 i 72 timer. Fermenteringen i fermenteringsanordningen ble utfort under omroring med 200 omdreininger pr. minutt og 200 liter sterilisert luft/minutt ved 2h°C og fortsatt i 72 timer. Derefter
var pH 7,^+2 og 0,05 ml av 250 ganger fortynnet dyrkningsfiltrat viste 51,5$' s hemning av pepsin. Diatomerjord på U,5 kg ble tilsatt, filtrert og kaken ble vasket med 12 liter destillert vann. Det vaskede filtrat ble tilsatt til dyrkningsfiltratet og det totale volum var 133 liter. Dette filtrat ble gitt pH 8,2 med 3n NaOH og ekstrahert med 60 liter og 30 liter n-butanol suksessivt. Butanolekstraktene ble forenet og vasket med 11 liter og 9 liter vann suksessivt og konsentrert ved destillasjon under redusert trykk. Fellingen ble samlet opp og torket og gir 38,<*>+ g av et brunt pulver. Det viste 50$'s hemning av pepsin ved å tilsette 0,10|ig til proveopplosningen. Den ovenstående væske ble ytterligere dampet inn til tbrrhet og gir 13,0 g av et brunt, rått pulver. Det viste 50%' s hemning av pepsin ved å tilsette 0,17y.g til proveopplosningen. Utbyttet fra dyrkningsf iltratet til dette pulver var 70$.
Eksempel 7.
3000 liter av mediet som beskrevet i eksempel 1 ble anbragt i en 6.000 liters fermenteringsanordning og efter sterilisering ble 110 liter av 28 timers dyrkningssuppe i 200 liters fermentering sanordning som beskrevet i eksempel 3 inokulert, og fermenteringen ble fortsatt under omroring med 190 omdreininger pr. minutt og under luftning med 2.500 liter steril luft pr. minutt ved 2h°C. Suppen ble tatt ut efter 65 timers fermentering. pH var 7,5 og 77,5 kg "Dicalite" ble tilsatt og filtrert gjennom fil-terpresse, og filterkaken ble vasket med 200 liter vann. Det totale volum av filtratet og vannet som anvendes for vaskningen
(var 2.790 liter. pH ble innstilt på 8,2 med 3n NaOH og ekstrahert med lAOO liter n-butanol. Hemningsproven for pepsin viste
at filtratet inneholdt ^23 g pepstatin, og butanolekstraktet inneholdt 362 g pepstatin. Butanolekstraktet ble konsentrert under redusert trykk til 10? liter og fellingen ble skilt fra (den fuktige vekt for fellingen var 3.760 g). Den konsentrerte opplosning ble ytterligere konsentrert til 10 liter og fellingen (fuktig vekt 1.5^0 g) ble samlet opp. Fellingene ble forenet og opplost i 16 liter metanol ved ca. hO°C. Metanolopplosningen inneholdt 297 g pepstatin. Aktivt kull på 1.500 g ble tilsatt til den varme metanolopplosning og filtrert. Metanolopplosningen ble kjolt, derpå fremkom krystaller (fuktig vekt
h00 g) og disse ble skilt fra. Kullet ble vasket med varm meta-noi på 8 liter 3 ganger, og disse metanolopplosninger ble tilsatt til den ovenstående væske av krystaller og konsentrert til 1 liter og avkjolt og gir 63 g krystaller av pepstatin.
Myceliekaken som inneholder"Dicalite"bl.e ekstrahert med 500 liter varm metanol, og metanolopplosningen ble fordampet under vakuum. Resten ble vasket med 15 liter varm etanol og derefter opplost i 20 liter varm metanol. 1000 g kull ble tilsatt til den varme metanol, og efter avkjoling felte krystaller av pepstatin (170 g) ut.
Eksempel 8.
Pepstatin (5^8 mg) ble opplost i ca. 50 ml metanol, en eteropp-losning som inneholder diazometan 3 g/ 200 ml ble tilsatt inntil den gule farve for diazometan forblir. Umiddelbart derefter ble den fordampet under vakuum og gir 560 mg hvitt pulver. 0m-krystallisas jonen fra metanol ga hvite nålekry staller, s.p. 2^+9
- 25l°C. Den viser esterbånd ved 1730 cm"1, i det infrarode
spektrum og i dette bånd forsvant karboksylbåndet i pepstatin ved 1710 cm <1>. Tilsetning av 0,015 V- g av denne ester til proveopplosningen viste 50$'s hemning.
Eksempel 9.
En dråpe sporer og myceliet av stammen MC210-A1 ble inokulert.
i. et medium som inneholder glycerol 2,5$, kjottekstrakt 0,5$, pepton 0,5$, gjærekstrakt 1,0$, NaCl 0,2$, MgSO^./^O 0,05$, K^PO^ 0,05$ og CaCO^ 0,32$. 100 ml av dette medium ble anbragt i en rysteflaske på 500 ml i volum og sterilisert for inokule-ring. Den ble rystedyrket ved 27°C i 7 dager. pH var 7,5 på den femte dag og 7,7 på den syvende dag. Tilsetning av 0,1 ml av det 25 ganger fortynnede dyrkningsfiltrat til proveopplbsningen viste 32$'s hemning av pepsin. Dyrkningsfiltråtene fra 50 flasker ble forenet, og pepstatin i det forenede filtrat ble ekstrahert med 2.000 liter n-butanol. Fordampningen under redusert trykk av ekstraktet ga 2,0 g av et brunt pulver. Tilsetning av 1,5 Ug av dette pulver til proveopplbsningen viste 50$'s hemning av pepsin. Det rå pulver ble suspendert i 30 ml vann og fort gjennom en kolonne av kull (18 g, 1,5 cm i diameter). 300 ml 30$'s vanndig metanol ble fort gjennom og derefter ble pepstatin i kolonnen eluert med 80$'s vanndig metanol. Eluatet ble samlet i fraksjoner som hver veier 5 g. Pepstatin opptråtte i fraksjonene 28 - H-5. Disse fraksjoner ble forenet og dampet inn under vakuum og gir 0,35 g av et hvitt pulver, som viste 50$'s hemning av pepsin ved å tilsette 0,3 Ug til proveopplbsningen. Rensnin-gen av pepstatin i dette pulver ved den samme metode som er beskrevet i eksempel h ga krystaller av pepstatin som ble identi-fisert ved det infrarode spektrum og tynnlags-kromatografi.
Eksempel 10.
114 mg pepstatin ble opplost i 40 ml etanol og tilbakelopsbehand-let med 40 ml benzen og flere dråper konsentrert svovelsyre i
h timer. Det ble neutralisert med natriumbikarbonat, og efter filtreringen ble filtratet konsentrert under redusert trykk til tørrhet og gir 75 mg hvitt pulver. Dette pulver ble vasket med vann og torket og gir <1>+8 mg etylester av pepstatin, s.p. 190 - 193°C Beregnet for C^<H>^<N>^Og: C <6>0,56, H 9,1+5, N 9,80, 0
20,16; funnet: C 60,96, H 9,65, N 9,<1>+3, 0 19,70. Tilsetning av 0,02yig til proveopplosningen viste 50$'s hemning av pepsin.
Eksempel 11.
<1>+05 mg metylester av pepstatin ble opplost 1 metanol og ammoni-umgass ble innfort i lh timer. Under denne reaksjon oppsto en felling og filtreringen efter reaksjonen ga 32<*>4- mg av et hvitt pulver av pepstatinamid som var forurenset med metylesteren av pepstatin. Dette pulver ble underkastet silikagel-kromatografi under anvendelse av kloroform-aceton-metanol (5:3:2 i volum') og fraksjonene var hver på 5 g. Pepstatinamid opptråtte i fraksjonene nr. 101. - 350, hvis fordampning ga 260 mg rent pepstatinamid, s.p. 229 - 23i°C. Analyse: beregnet for C^H^N^Og: C
59,62, H 9,<1>+1, N 12,27, 0 18,68; funnet: C 59,69, H 9,^5, N 12,17, 0 l8,2l+. Tilsetning av 0,051+ Ug til proveopplosningen viste 50$'s hemning av pepsin.
Innenfor rammen av nærværende oppfinnelse faller fremstilling av pepstatin, salter av pepstatin med uorganiske baser og organiske baser, slik som natrium, kalium, ammoniakk, kalsium, magnesium, glukosamin, mannosamin, galaktosamin, ferro, ferri, kupri, kupro etc. og estere av pepstatin slik som metyl-^ etyl, propyl, butyl-, isobutyl-, pentyl7 isopentyl-, benzylestere etc. For terapeutiske formål er salter fra ikke-giftige baser anvendelige, men salter med giftige baser er anvendelige ved isoleringsbehandlinger,
f.eks. som utfellingsmidler fra oppløsningene.
Når onsket for spesielle formål og for å gjore dem farmasøytisk aksepterbare kan det tilblandes forbindelsene fremstilt etter nærværende oppfinnelse andre medikamenter, slik som antihistaminer, sulfa-droger, antibiotika, pufringsmidler, slik som natriumbikarbonat, kalsiumkarbonat, aluminiumsilikat, magnesiumkarbonat etc, nervebedovende midler slik som metokropromid, oxazepam etc.
Claims (1)
- Fremgangsmåte for fremstilling av en pepsininhi bitor, betegnet pepstatin,med strukturformelenog salter, estere og amidet av dette, karakterisert ved at Streptomyces testaceus ATCC No. 21469 eller Streptomyces argenteolus var, toyonakensis ATCC No. 21468 dyrkes i et næringsmedium under aerobe betingelser, og at man utvinner pepstatinet fra næringsmediet, hvorpå man eventuelt fremstiller salter, estere eller amidet av dette.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4616669 | 1969-06-13 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO129682B true NO129682B (no) | 1974-05-13 |
Family
ID=12739413
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO02289/70A NO129682B (no) | 1969-06-13 | 1970-06-12 |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US3740319A (no) |
AT (1) | AT295454B (no) |
AU (1) | AU1584970A (no) |
BE (1) | BE751931A (no) |
CA (1) | CA928238A (no) |
CH (1) | CH550247A (no) |
CS (1) | CS171685B2 (no) |
DE (1) | DE2028403C3 (no) |
DK (1) | DK128124B (no) |
ES (1) | ES380545A1 (no) |
FI (2) | FI47498B (no) |
FR (1) | FR2052964B1 (no) |
GB (1) | GB1314231A (no) |
IE (1) | IE34196B1 (no) |
IL (1) | IL34543A (no) |
LU (1) | LU61119A1 (no) |
NL (1) | NL166279C (no) |
NO (1) | NO129682B (no) |
PH (2) | PH9382A (no) |
PL (1) | PL81272B1 (no) |
RO (1) | RO71556B (no) |
SE (1) | SE381673B (no) |
YU (1) | YU35272B (no) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5022116B1 (no) * | 1970-04-28 | 1975-07-28 | ||
JPS5434837B2 (no) * | 1972-02-08 | 1979-10-29 | ||
DK132899C (da) * | 1972-04-07 | 1976-07-26 | Takeda Chemical Industries Ltd | Fremgangsmade til fremstilling af de proteaseinhiberende stoffer pepsinostreptiner eller salte deraf |
US3963579A (en) * | 1973-10-17 | 1976-06-15 | Sanraku-Ocean Co., Ltd. | Microbiological process for the production of pepstatins |
US4206283A (en) * | 1975-09-12 | 1980-06-03 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Protease inhibitors |
US4101650A (en) * | 1977-04-06 | 1978-07-18 | Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai | Pepstatin floating minicapsules |
US5833946A (en) * | 1995-06-06 | 1998-11-10 | Bayer Corporation | Dissemination of fungal infections: animal model and method of prophylaxis |
GB0807621D0 (en) * | 2008-04-25 | 2008-06-04 | Ineos Healthcare Ltd | Use |
-
1970
- 1970-05-14 US US00037165A patent/US3740319A/en not_active Expired - Lifetime
- 1970-05-18 IE IE644/70A patent/IE34196B1/xx unknown
- 1970-05-18 IL IL34543A patent/IL34543A/xx unknown
- 1970-05-18 GB GB2392870A patent/GB1314231A/en not_active Expired
- 1970-06-02 PH PH11496*UA patent/PH9382A/en unknown
- 1970-06-03 AU AU15849/70A patent/AU1584970A/en not_active Expired
- 1970-06-04 AT AT500570A patent/AT295454B/de not_active IP Right Cessation
- 1970-06-05 CS CS3969*BA patent/CS171685B2/cs unknown
- 1970-06-08 ES ES380545A patent/ES380545A1/es not_active Expired
- 1970-06-08 YU YU1462/70A patent/YU35272B/xx unknown
- 1970-06-09 DE DE2028403A patent/DE2028403C3/de not_active Expired
- 1970-06-12 LU LU61119D patent/LU61119A1/xx unknown
- 1970-06-12 NO NO02289/70A patent/NO129682B/no unknown
- 1970-06-12 FR FR7021557A patent/FR2052964B1/fr not_active Expired
- 1970-06-12 BE BE751931D patent/BE751931A/xx not_active IP Right Cessation
- 1970-06-12 FI FI01670/70A patent/FI47498B/fi active
- 1970-06-12 CH CH894270A patent/CH550247A/xx not_active IP Right Cessation
- 1970-06-12 SE SE7008222A patent/SE381673B/xx unknown
- 1970-06-12 CA CA085332A patent/CA928238A/en not_active Expired
- 1970-06-12 PL PL1970141274A patent/PL81272B1/pl unknown
- 1970-06-12 DK DK304570AA patent/DK128124B/da not_active IP Right Cessation
- 1970-06-12 NL NL7008657.A patent/NL166279C/xx not_active IP Right Cessation
- 1970-06-12 FI FI701670A patent/FI47498C/fi active
- 1970-06-13 RO RO76141A patent/RO71556B/ro unknown
-
1974
- 1974-07-09 PH PH16026A patent/PH10881A/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PH9382A (en) | 1975-10-22 |
AT295454B (de) | 1972-01-10 |
DE2028403B2 (de) | 1975-04-24 |
RO71556B (ro) | 1984-07-30 |
CH550247A (de) | 1974-06-14 |
BE751931A (fr) | 1970-11-16 |
SE381673B (sv) | 1975-12-15 |
DK128124B (da) | 1974-03-04 |
ES380545A1 (es) | 1972-10-01 |
NL7008657A (no) | 1970-12-15 |
IE34196B1 (en) | 1975-03-05 |
PL81272B1 (no) | 1975-08-30 |
FR2052964B1 (no) | 1974-10-11 |
NL166279C (nl) | 1981-07-15 |
CS171685B2 (no) | 1976-10-29 |
DE2028403A1 (de) | 1971-01-28 |
FR2052964A1 (no) | 1971-04-16 |
US3740319A (en) | 1973-06-19 |
LU61119A1 (no) | 1970-08-12 |
YU146270A (en) | 1980-04-30 |
AU1584970A (en) | 1971-12-09 |
YU35272B (en) | 1980-10-31 |
IE34196L (en) | 1970-12-13 |
IL34543A (en) | 1974-03-14 |
FI47498C (fi) | 1973-12-10 |
IL34543A0 (en) | 1970-07-19 |
DE2028403C3 (de) | 1975-11-27 |
NL166279B (nl) | 1981-02-16 |
CA928238A (en) | 1973-06-12 |
FI47498B (no) | 1973-08-31 |
PH10881A (en) | 1977-09-26 |
GB1314231A (en) | 1973-04-18 |
RO71556A (ro) | 1984-05-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Bajwa et al. | The biology of mycorrhiza in the ricaceae: ix. peptides as nitrogen sources for the ericoid endophyte and for mycorrhizal and non‐mycorrhizal plants | |
US3840516A (en) | Biologically active substance,pepstatin and production processes thereof | |
NO129682B (no) | ||
US4052449A (en) | Biologically active substance, bestatin, and production thereof | |
US5013550A (en) | Antibiotics called "chloropolysporins B and C", a process for their preparation, and their therapeutic and veterinary use | |
US4029547A (en) | Biologically active substance, bestatin, and production thereof | |
US4409210A (en) | Antibiotic compound | |
EP0196189B1 (en) | Novel enzyme inhibiting substance | |
NO783545L (no) | Fremgangsmaate til fremstilling av deoksynarasinantibiotisk kompleks | |
US4014860A (en) | Plasminostreptin (enzyme inhibitor) and method for producing it from streptomyces | |
SU1442063A3 (ru) | Способ получени гербицида N 51262 | |
JPS6261037B2 (no) | ||
NO132240B (no) | ||
US4066507A (en) | Process for producing l-leupeptins | |
JPS6010720B2 (ja) | 抗生物質c―15003 p―4の製造法 | |
US4533631A (en) | Fermentation process for preparation of antibiotic Bu-2517 | |
EP0253413B1 (en) | New antibiotics called "mureidomycins a, b, c and d" a process for their preparation and their therapeutic use | |
US4169140A (en) | Antibiotics SF-1771 substance and SF-1771-B substance as well as the production of these substances | |
US4179573A (en) | (2S,3R)-3-amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoic acid | |
JP2989662B2 (ja) | 新規酵素阻害物質ベナルチンならびにその製造法 | |
EP0344234A1 (en) | Antibiotic compounds | |
US3629406A (en) | Sparsogenin and sparsogenin a and methods of preparation | |
JPS6225156B2 (no) | ||
JP4095815B2 (ja) | トリプシンの新規インヒビターtu−5350物質とその製造法及び用途 | |
NO155701B (no) | Fremgangsmaate til fremstilling av et terapeutisk aktivt derivat av tallysomycin a eller b |