Sposób wytwarzania nowej pepstatyny Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego produktu pochodzenia bakteryjnego, zwa¬ nego pepstatyna, hamujacego pepsyne o wzorze, przedstawionym na rysunku. W szczególnosci wy¬ nalazek dotyczy sposobu wytwarzania na drodze fermentacyjnej oraz metod odzyskiwania i oczy¬ szczania. Sposobem wedlug wynalazku otrzymuje sie wymieniony czynnik antypepsynowy i jego sole w rozcienczonych roztworach, w postaci surowych koncentratów, nieoczyszczonych substancji stalych, oczyszczonych substancji stalych oraz w czystej postaci krystalicznej. Zwiazek ten i jego sole od¬ znaczaja sie wlasciwosciami hamowania pepsyny, dzieki czemu dzialaja zarówno leczniczo, jak i za¬ pobiegawczo w doswiadczalnym owrzodzeniu zo¬ ladka u szczurów i myszy. Toksycznosc tych zwiaz¬ ków jest niska i sa one przydatne w leczeniu owrzodzenia zoladka i dwunastnicy u czlowieka.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie zwia¬ zek antypepsynowy oraz jego sole o wlasnosciach hamowania czynnosci proteazowej pepsyny. Wy¬ mieniony zwiazek antypepsynowy jest rozpuszczal¬ ny w metanolu, kwasie octowym, dwumetylosulfo- tlenku i pirydynie, slabo rozpuszczalnym w etano¬ lu, propanolu, butanolu, alkoholu amylowym, nie¬ rozpuszczalny w octanie etylowym, octanie butylo- wym, eterze etylowym, czterochlorku wegla, heksa¬ nie, eterze naftowym, benzenie i chloroformie.Temperatura topnienia tego zwiazku wynosi 228°C—229°C, wykazuje on silne pochlanianie kon- 25 30 cowe bez szczytu z wyjatkiem niskiego szczytu przy 260 nm — 270 nm, E 10A cm = okolo 0,3, wy¬ kazujacy lewoskretnosc [a]27 = — 90°C (C = 0,288 w metanolu) dajacy dodatnia reakcje Rydon-Smitha (i ile badanie przeprowadza sie za pomoca chroma¬ tografii cienkowarstwowej, a roztwór wodorotlenku sodowego rozpyli sie przed rozpyleniem odczynni¬ ka), nie reagujacy z ninhydryna, dajacy ujemny odczyn Sakaguchi, z naftorezorcyna, aldehydem anyzowym — kwasem siarkowym, wykazujacy na¬ stepujace pasma w podczerwonej czesci widma, przy stabletkowaniu z bromkiem potasowym: 3320, 3090, 2955, 1710, 1635, 1545, 1470, 1450, 1420, 1390, 1370, 1300, 1220, 1178, 1070, 710 cm"1, o wzorze C34H63N509 wyznaczonym przez widmo masowe estru metylowego dwuacetylowej pochodnej oraz na podstawie analizy elementarnej, zawierajacym L-waline i L-alanine w stosunku 2:1 po hydrolizie, posiadajacy grupe karboksylowa, dajaca ester me¬ tylowy (C35H65N5Og) o temperaturze topnienia 249°C—257°C, który dziala jako inhibitor pepsyny.Nowy zwiazek otrzymany sposobem wedlug wy¬ nalazku wykazuje dzialanie hamujace pepsyne.Pepstatyna posiada grupe karboksylowa i jest latwo estryfikowana zwyklymi metodami, uzywa¬ nymi dla przeprowadzenia grupy karboksylowej w estrowa, takimi, jak ogrzewanie w zakwaszonym metanolu, reakcja z dwuazometanem itd. 81272Fig. 1. przedstawia widmo w podczerwieni pepstatyny w tabletce z bromkiem potasowym.Fig. 2. przedstawia widmo w podczerwieni estru metylowego pepstatyny w tabletce z bromkiem potasowym. 5 Fig. 3. przedstawia widmo jadrowego rezonansu magnetycznego estru metylowego dwuacetylo- pepstatyny, wykonane w tetradeuterometanolu.Zgodnie z niniejszym wynalazkiem podaje sie ponizej proces wytwarzania pepstatyny, który obej- io muje hodowle szczepu promieniowca w plynnym podlozu, w warunkach napowietrzania zawieraja¬ cym zródlo wegla, skladniki odzywcze bedace zródlem wegla oraz' zródlo azotu az do momentu nagromadzenia sie odpowiednich ilosci pepstatyny 15 w wymienionym podlozu, oraz ekstrahowanie z niego i wyizolowanie pepstatyny.Systematyczny przeglad produktów bakteryj¬ nych, odznaczajacych sie zdolnoscia hamowania aktywnosci enzymatycznej zostal rozpoczety w ro- 20 ku 1965 i znaleziono akwajamycyne hamujaca (3-hydroksylaze tyrozynowa, kwas fuzarowy hamu¬ jacy — hydroksylaze DOPA-aminy, i wykazujacy dzialanie hypotensyjne, jak równiez leupeptyny ha¬ mujace trypsyne, plazmine i kalikreine. Sadzono, ze 25 drobnoustroje wytwarzaja proteazy, esterazy itd., a dla ochrony przed wlasnymi enzymami zmuszone sa do wytwarzana inhibitorów. Kontynuowanie tych badan doprowadzilo do wykrycia pepstatyny w przesaczach hodowli wielu promieniowców. Po- 30 nadto potwierdzono wlasnosci terapeutyczne i za¬ pobiegawcze pepstatyny w przypadkach owrzodze¬ nia zoladka. Nalezy takze podkreslic, ze pepstatyna jest pierwszym zwiazkiem, hamujacym swoiscie pepsyne. Przed wykryciem pepstatyny nie znano 35 zadnego swoistego inhibitora pepsyny. Jak wyka¬ zalo w niniejszym wynalazku, obecnosc pepstatyny stwierdzono w kilku szczepach promieniowców i wydaje sie, ze jest ona wsród nich szeroko roz¬ powszechniona. W niniejszym wynalazku podano 40 charakterystyke trzech szczepów, z których wyizo¬ lowano pepstatyne. Opis podany w nawiasach { } dotyczy standardów barw podanych w podreczni¬ ku: Color Harmony Manual of Container Corpora¬ tion ofAmerica. 45 Charakterystyka szczepu MC144-C1: Szczep wyizolowano z próbki gleby, pobranej w lesie w okolicy Cux-Haven w Niemczech Za¬ chodnich w sierpniu 1968 i oznaczono numerem MC144-C1. Zdeponowano go w Kogyo Gijutsuin 50 Hakko Kenkujyo 21 maja 1969 roku pod numerem 312. Zdeponowano go równiez w American Type Culture Collection pod numerem ATCC 21469, wo¬ bec czego szczep ten jest w chwili obecnej dostep¬ ny dla badaczy. W badaniu mikroskopowym stwier- 55 dza sie dobrze rozgaleziona grzybnie powietrzna o lekko falistych strzepkach powietrznych. Na strzepkach powietrznych tworza sie otwarte spira¬ le, koncowe spirale i haozyki, nie stwierdza sie na¬ tomiast wezlów. Powierzchnia zarodników jest 60 gladka.Charakter wzrostu na poszczególnych podlozach przedstawiavsie nastepujaco: 1) na podlozu glicerolowym Czapka (przy hoT dowli w 27°C): wzrost jest bladozólty do blado- 65 4 brazowego, a pózniej blado-zóltawo-brazowy; grzybnia powietrzna rozwija sie slabo i ma barwe szaro-biala do lekko szarej: przy przedluzonym ho¬ dowaniu kolonie wytwarzaja rozpuszczalny pigment barwy zóltawej. 2) na agorze Krainsky'ego z glukoza i asparagi- na (przy hodowli w 27°C): wzrost jest bladozólty do zóltego (zlocien pastelowa {l1/2) fbj; grzybnia po¬ wietrzna jest barwy szarobialej do jasnoszarej, nie stwierdza sie rozpuszczalnego pigmentu. 3) na agarze z jablczanem wapniowym (przy ho¬ dowli w 27°C): wzrost jest skapy i bezbarwny; grzybnia powietrzna jest delikatna, barwy szaro bialej do jasnoszarej; brak rozpuszczalnego pig¬ mentu; brak przejrzystej strefy wokól kolonii. 4) na wodzie peptonowej, zawierajacej 1,0% azo¬ tanu sodowego (przy hodowli w 27°C): wzrost jest bardzo skapy i bezbarwny; brak grzybni powietrz¬ nej; brak rozpuszczalnego pigmentu; redukcja azo¬ tanu do azotynu nie jest wyrazna. 5) na skrawkach ziemniaka (przy hodowli w 27°C); wzrost jest obfity o barwie bladozóltej, bladobrazowej lub czerwonawobrazowej {Rust Tan, 5 le BriokRed, 6 ng} grzybnia powietrzna deli¬ katna o barwie bialej do szarobialej; brak roz¬ puszczalnego pigmentu. 6) na plytkach skrobiowych (przy hodowli w 27°C): brak wzrostu nawet po 21 dniach hodowa¬ nia. 7) na agarze peptonowym z wyciagiem miesnym (przy hodowli w 37°C): brak wzrostu nawet po 21 dniach hodowania. 8) na agarze peptonowym z wyciagiem miesnym (przy hodowli w 27°C): bezbarwne kolonie bez grzybni powietrznej; brak rozpuszczalnego pig¬ mentu. 9) na skoagulowanej surowicy Loefflera (przy hodowli w 37°C i 30°C): brak wzrostu nawet po 21 dniach hodowania. 10) hodowla kluta na zelatynie iz bulionem (w temperaturze 20°C): wzrost, bezbarwny; brak grzybni powietrznej; brak rozpuszczalnego pigmen¬ tu; rozpuszczanie sie zelatyny obserwuje sie od trzeciego dnia rozpuszczanie sie postepuje co ozna¬ cza, ze jest silne. 11) na podlozu z mlekiem (przy hodowli w tem¬ peraturze 37°C): wzrost bezbarwny; brak grzybni powietrznej; brak rozpuszczalnego pigmentu; mle¬ ko jest koagulowane, a nastepnie peptonizowane; zarówno koagulacja, jak i peptonizacja sa silne. 12) na agarze z tyrozyna (przy hodowli w tem¬ peraturze 27°C): wzrost jest skapy i bezbarwny; brak grzybni powietrznej; brak rozpuszczalnego pigmentu; nie stwierdza sie wytwarzania tyrozy- nazy. 13) na celulozie (przy hodowli w temperaturze 27°C): brak wzrostu nawet po 21 dniach hodowania.Wykorzystanie cukrowców badano na podlozu Pridham-Gottlieba (przy hodowli w temperaturze 27°C), uzyskujac nastepujace wyniki: obfity wzrost uzyskano, stosujac glicerol, mannoze i sacharoze; nte stwierdzono wykorzystywania nastepujacych cukrowców: arabinozy, ksylozy, ramnozy, fruktozy, inozytolu, sorbitolu, maltozy, laktozy, rafinozy, dul- citolu, salicyny i inuliny; stwierdzono slabe wyko- j5 81272 6 rzystywanie dekstryny i skrobi; stosujac mannitol i galaktoze uzyskano slaby wzrost — wydaje sie, ze nie sa one wykorzystywane. Wlasciwosci szcze¬ pu MC144-Cl opisane powyzej mozna podsumowac nastepujaco: szczep nalezy do promieniowców, wy¬ twarzajac spirale, ale bez wezlów, wytwarzajac zarodniki o gladkiej powierzchni, wykazujac obfity wzrost na skrawkach ziemniaka, a na innych pod¬ lozach nie tak obfity; przy hodowli w temperaturze 37°C wzrost jest slaby; szczep wykazuje silna aktywnosc proteolityczna; kolonie sa — barwy bladozóltej, zóltej lub bladobrazowej w zalezno¬ sci od podloza; grzybnia powietrzna jest delikatna i barwy szarobialej, lub jasnoszarej na róznych podlozach: nalezy do typu nie chromogennego; cha¬ rakterystyczny jest wzrost barwy czerwonawobra- zowej. na skrawku ziemniaczanym.Porównujac te wlasnosci z wlasnosciami szcze¬ pów juz poznanych stwierdza sie podobienstwo miedzy tym szczepem a Actinomyces longisporus- -flavus Krasilnikowa, opisanym w International Journal of Systematic Bacteriology 18, 342, 1968 oraz w tomie 2 na stronie 237 ksiazki „Actino- mycetes" napisanej przez S.A. Waksmana.Róznice i podobienstwa sa nastepujace: wezly spirale powierzchnia zarodników grzybnia powietrzna wzrost wytwarzanie tyrozynazy aktywnosc proteolitycz¬ na hydroliza skrobi wykorzystanie wegla: sacharoza ramnoza arabinoza ksyloza fruktoza i sizczep MC144-C1 brak tworzy gladka cienka, szaro- biala do jasno¬ szarej bladozólty, zólty, blado- brazowy nie wytwarza silna watpliwa wykorzystana nie wykorzy¬ stywana nie wykorzy¬ stywana nie wykorzy¬ stywana nie wykorzy¬ stywana A. longisporus- -flavus brak tworzy gladka slaba lub brak * obfita, bialawa, zóltawa do bra- zowawozóltej ** zólty nie wytwarza sredniej mocy slaba nie wykorzystana wykorzystana wykorzystana wykorzystana | wykorzystana * opis w. Int. J. Systematic Bacteriology, 18, 342, 1968 ** opis w: Actinomycetes — S. A. Waksman, vol. 2, 237.Jak wynika z powyzszego opisany szczep MC144-C1 rózni sie od A. longisporus-flavus wy¬ korzystywaniem cukrowców i charakterem grzybni powietrznej. Barwa wzrostu szczeku :,:C144-C1 na skrawku ziemniaczanych jest charakterystyczna i szczep ten uznano za nowy rodzaj i nazwano go Streptomyces testaceus. 5 Charakterystyka szczepu MC 221-C2: Szczep wyizolowano z próbek gleby, pobranej w Kamakura w pazdzierniku 1968 roku i oznaczo¬ no numerem MC221-C2. W badaniu mikroskopo¬ wym stwierdza sie dobrze rozgaleziona grzybnie !o podstawowa, wytwarzajaca strzepki powietrzne, tworzace spirale koncowe i haczyki. Nie stwierdza sie wytwarzania wezlów. Grzybnia powietrzna jest bardziej wypukla, niz grzybnia powietrzna szczepu MC144-C1. Wykorzystanie galaktozy jest nieznacz- !5 ne, a uplynnianie zelatyny slabe. Z wyjatkiem wy¬ korzystania cukrów i uplynniania zelatyny szczep przypomina wyzej opisany szczep MC144-C1. Dla¬ tego zaliczono go do tego samego gatunku 3ako szczep MC144-C1. 20 Charakterystyka szczepu MC210-A1: Szczep wyizolowano z próbek ziemi, pobranej w Toyonaka, kolo Osaki, w pazdzierniku 1968 roku i oznaczono numerem MC210-A1.Szczep ten zdeponowano w Kogyo Gijutsin 25 Hakko Kenkyujyo 21 maja 1969 roku pod nume¬ rem 313. Szczep ten zdeponowano równiez w Ame¬ rican Type Culture Colection pod numerem 21468, wobec czego szczep ten jest w chwili obecnej do¬ stepny dla badaczy. Mikroskopowo grzybnia pod- 30 stawowa jest dobrze rozgaleziona, wytwarzajac grzybnie powietrzna o strzepkach w ksztalcie spi¬ ral i sprezyn. Nie stwierdzono tworzenia sie wezlów. Powierzchnia zarodników jest gladka.Charakter wzrostu na poszczególnych podlozach 35 przedstawia sie nastepujaco: 1) na agarze glicerolowym Czapka (przy hodowli w temperaturze 27°C): wzrost jest bezbarwny, grzybnia powietrzna cienka i biala, jasnoszara lub szara; brak wytwarzania rozpuszczalnego pigmentu. 40 2) na agorze Krainsky'ego z glukoza i asparagina (przy hodowli w temperaturze 27°C): wzrost jest bezbarwny lub bladozólty; grzybnia powietrzna jest szarobiala do jasnoszarej; stwierdza sie wy¬ twarzanie rozpuszczalnego pigmentu o barwie 45 jasnozóltej. 3) na agarze z jablczanem wapniowym (przy ho¬ dowli w temperaturze 27°C): wzrost jest bezbarw¬ ny; grzybnia powietrzna jest biala, jasnobrazowa- woszara do szarej; brak wytwarzania rozpuszczal- 50 nego pigmentu; brak przejrzystej strefy wokól ko¬ lonii. 4) na wodzie peptonowej, zawierajacej l,0°/o azo¬ tan sodowy (przy hodowli w temperaturze 27°C): wzrost jest bezbarwny; grzybnia powietrzna barwy 55 bialej; brak wytwarzania rozpuszczalnego pigmen¬ tu; wytwarza sie nieznaczna ilosc azotynu. 5) na skrawku ziemniaczanym (przy hodowli w temperaturze 27°C): wzrost jest zóltawobrazowy do ciemnozóltego {Mustard, 21e}; grzybnia po- 6o wietrzna jest obfita biala, szarobiala do jasnosza¬ rej; stwierdza sie wytwarzanie rozpuszczalnego pigmentu, barwy bladozóltawobrazowej. 6) na plytce skrobiowej (przy hodowli w tempe¬ raturze 27°C): wzrost jest bladozólty do zóltego; 65 grzybnia powietrzna jest biala do jasnobrazowa-7 81272 8 woszarej; stwierdza sie wytwarzanie rozpuszczal¬ nego pigmentu barwy bladozóltej; do zóltej; hy¬ droliza skrobi jest slaba. 7) na agarze z peptonowym wyciagiem miesnym (przy hodowli w temperaturze 37°C): wzrost jest bezbarwny, grzybnia powietrzna biala; brak wy¬ twarzania rozpuszczalnego pigmentu. 8) na agarze peptonowym z wyciagiem miesnym (przy hodowli w temperaturze 27°C): wzrost jest bezbarwny; grzybnia powietrzna jest obfita, barwy bialej; nie stwierdza sie wytwarzania rozpuszczal¬ nego pigmentu. 9) na skoagulowanej surowicy Loefflera (przy ho¬ dowli w temperaturze 37°C): wzrost jest bezbarw¬ ny do bladozóltego; grzybnia powietrzna jest zól- tawobiala; brak wytwarzania rozpuszczalnego pi¬ gmentu; brak uplynniania podloza. 10) hodowla kluta na zelatynie (w temperaturze 20°C): wzrost jest bezbarwny, bladozólty do blado- zóltawobrazowego; grzybnia powietrzna jest biala; stwierdza sie wytwarzanie rozpuszczalnego pig¬ mentu barwy brazowawej; slabe uplynnianie pod¬ loza stwierdza sie po okolo 20 dniach hodowli. 11) na mleku (przy hodowli w temperaturze 27°C): wzrost jest bezbarwny; grzybnia powietrzna nie wytwarza sie; mleko jest koagulowane i pepto- nizowane, chociaz zarówno koagulacja, jak i pepto- nizacja sa wzglednie slabe. 12) na agarze z tyrozyna (przy hodowli w tempe¬ raturze 27°C): wzrost jest bezbarwny; grzybnia po¬ wietrzna jest biala, szarobiala do jasnoszarej; brak wytwarzania rozpuszczalnego pigmentu; nie stwierdza sie wytwarzania tyrozynazy. 13) na celulozie (przy hodowli w temperaturze 27°C): wzrost jest slaby; nie stwierdza sie roz¬ kladu.Wykorzystanie cukrów badano, stosujac podlo¬ ze Pridhama-Gottlieba. Uzyskano nastepujace wyniki: glicerol, ksyloza, glukoza, fruktoza, man- noza, galaktoza, inozytol, mannitol, sorbitol, mal¬ toza, sacharoza, rafinoza, dekstryna i skrobia byly wykorzystane, dajac dobry wzrost; laktoza i sali- cyna nie byly wykorzystywane — wzrost byl bar¬ dzo slaby; ramnoza, arabinoza, dulcitol i inulina nie byly wykorzystywane. Wlasnosci szczepu MC210-A1 opisane wyzej mozna podsumowac na¬ stepujaco: szczep nalezy do niechromogonnego typu promieniowców; tworza sie spirale, ale nie wezly; powierzchnia zarodników jest gladka wzrost jest bezbarwny, bladozólty lub zólty w zaleznosci od podloza; grzybnia powietrzna jest biala do jasno szarej na róznych podlozach; na ogól nie stwierdza sie wytwarzania rozpuszczalnego pigmentu z wy¬ jatkiem slabego wytwarzania pigmentu .barwy zól¬ tawej do brazowawej; wykazuje slaba aktywnosc proteolityczna i hydrolityczna na skrobi. Sposród znanych szczepów promieniowców najbardziej po¬ dobnym do opisanego szczepu okazal sie Strepto- myces argenteolus, opisany przez Frieda, Permana, Langlykke'go i Titusa w „International Journal of Systematic Bacteriology" 18, 295, 1968 oraz w kciazce „Actinomycetes" S.A. Waksmana, tom 2, strona 175.Szczep MC210-A1 przypomina szczep S. argen¬ teolus z wyjatkiem wykorzystania cukrów i roz¬ puszczania zelatyny. Uznano wiec szczep MC210-A1 jako odmiane tego gatunku, nazywajac go Strepto- myces argenteolus var. toyonakansis.Sposób oznaczania aktywnosci inhibitorowej 5 pepstatyny w stosunku do pepsyny: zmodyfikowa¬ no metode Kuaitaisa, opisana w J. General Physio- logy, 30, 291, 1947 uzywajac pepsyny, produkcji firmy Sigma Chemical Co., St. Louis Missouri, U.S.A. oraz kazeiny, produkcji firmy Wako Junyaku, io Osaka, Japonia. Do 1 ml 0,6% roztworu kazeiny w 0,08 M buforze kwasu mlekowego (pH =2,2) dodaje sie 0,7 ml buforu 0,02 N HCL — 0,02M KC1 (pH= 2,0) i 0,2 ml tego samego buforu zawieraja¬ cego badana próbke, zas do kontroli dodaje sie 15 0,2 ml tego buforu bez wydanej próbki i inkubuje w temperaturze 37°C przez 3 minuty. Nastepnie dodaje sie 0,1 ml buforu 0,02 N HC1 — 0,02 M KC1 (pH = 2,0) zawierajacego 4 \ig pepsyny i inkubuje w temperaturze 37°C przez 30 minut. Reakcje prze- 20 rywa sie dodajac 2,0 ml kwasu nadchlorowego (1,7 M). Po uplywie 1 godziny, wiruje sie i oznacza sie gotowosc optyczna supernatantu (a) przy 280 nm.Podobnie postepuje sie z mieszanina reakcyjna, nie zawierajaca pepstatyny, okreslajac jej gestosc 25 optyczna (b). Procent zahamowania oblicza sie, stosujac wzór (b—a)bXl00.Ilosc pepstatyny w badanym materiale okresla sie na podstawie odsetka zahamowania z krzywej standardowej, wykreslonej dla stezen pepstatyny 30 i odsetka zahamowania. 0,02 \Kg pepstatyny dodano do mieszaniny reakcyjnej powoduje 50% zahamo¬ wanie.Szczepy promieniowców, wytwarzajacych pepsta- tyne wytwarzaja ja w odpowiednich warunkach, 35 które osiaga sie przez zaszczepienie zarodnikami lub grzybnia tych szczepów odpowiedniego podlo¬ za i prowadzenie hodowli w warunkach powietrz¬ nych.Wytwarzanie pepstatyny jest równiez mozliwe 40 przy hodowli na podlozu stalym, jednakze do wy¬ twarzania znacznych ilosci lepiej jest prowadzic hodowle na podlozu plynnym. Fermentacje mozna prowadzic w kazdej temperaturze, w której szcze¬ py wytwarzajace pepstatyne moga rosnac i wy- 45 twarzac pepstatyne, chociaz szczególnie korzystna temperatura jest 25°C—35°C. Podloza skladajace sie ze znanych zródel odzywczych dla promie¬ niowców sa równiez korzystne dla wytwarzania pepstatyny. Na przyklad produkty handlowe takie, 50 jak pepton, wyciag miesny, wyciag drozdzowy, wy¬ ciag namokowy kukurydzy, maka z nasion bawel¬ ny, maka sojowa, wyciag drozdzowy, N-Z amina, kazeina, azotan sodowy, azotan amonowy, siarczan amonowy i inne substancje azotowe takie, jak 55 otreby pszenne, otreby ryzowe itd. sa uzytecznym zródlem azotu. Dostepne w handlu produkty takie, jak laktoza, glicerol, sacharoza, skrobia, glukoza, maltoza, melas i inne cukrowce lub tluszcze w sta¬ nie oczyszczonym lub surowym sa uzyteczne jako 60 zródlo wegla.Sposród nich, glicerol, glukoza, maltoza, dekstry¬ na i skrobia sa przykladami tanich i odpowied¬ nich zródel wegla dla wytwarzania pepstatyny.Chlorek sodowy, fosforan sodowy lub potasowy, 65 weglan wapniowy lub jon magnezowy mozna rów-9 81272 10 niez dodac do pozywki. Jezeli potrzeba, mozna do¬ dac w ilosciach sladowych sole metali. Kazdy ro¬ dzaj skladnika, który moze byc wykorzystany przez szczep wytwarzajacy pepstatyne jest ko¬ rzystny dla jej wytwarzania. Wszystkie podloza stosowane w hodowli promieniowców sa pozy¬ teczne.Fermentacje prowadzi sie tak dlugo, az nagro¬ madzi sie odpowiednia ilosc pepstatyny. Np. szcze¬ pem MC144-C1 zaszczepia sie rózne podloza, za¬ wierajace rózne zródla wegla, rózne zródla azotu, 0,3% NaCl, 0,1% MgS04 . 7H20, 0,1% KH2P04, roz¬ twór metali w ilosci 0,1 ml na 100 ml podloza, i prowadzi wstrzasana hodowle w temperaturze 27°C—29°C na wstrzasarce o amplitudzie 8 cm i 200 wahaniach/minute. Roztwór metali sklada sie z 700 mg CuS04 . 5H20, 100 mg FeS04 . 7H20, 800 mg MnCl2 • 4H20, 200 mg ZnS04 • 7H20 w 100 ml wody destylowanej. Uzywano kolbek o po¬ jemnosci 500 ml, do których dodawano 100 ml podloza. Kazdego dnia hodowli wstrzasanej okresla¬ no aktywnosc antypepsynowa w 0,5 ml przesaczu brzeczki rozcienczonej 100 razy — uzyskane wyni¬ ki zestawiono w tabeli 1.Wytwarzanie pepstatyny stwierdzano juz po dwóch dniach hodowli wstrzasanej a najwyzsza wydajnosc osiagano na 4—7 dzien hodowli. pH w szczytowym momencie wytwarzania wynosilo cze¬ stokroc okolo 9.0. Utrzymujac pH = 9.0, w hodowli wstrzasanej, nawet przez 10 dni nie stwierdzano spadku aktywnosci pepstatyny, co przemawia za jej opornoscia.Jak wykazano w tabeli 1 dla produkcji pepsta¬ tyny moga byc wykorzystane rózne zródla wegla i skladniki azotowe.Zródla wegla i azotu w podlozach: Nr 1 — 2% glicerolu, 0,75% wyciagu miesnego, 0,75% pepto¬ nu; Nr 2 — 2% glicerolu, 1,0% N-Z amine, 0,2% wyciagu drozdzowego; Nr 3 — 2% glicerolu, 1,5% maki sojowej; Nr 4 — 2% glicerolu, 1,5% wy¬ ciagu namokowego kukurydzy; Nr 5 — 2% lakto¬ zy, 0,75% wyciagu miesnego, 0,75% peptonu; 10 20 35 40 Nr 6 — 2% laktozy, l*0%N-Z-aniiny, 0(,2 wy¬ ciagu drozdzowego; Nr 7 — 2% laktozy, 1,5% maki sojowej; Nr 8 — 2% laktozy, 1,5% wyciagu namo¬ kowego kukurydzy; Nr 9 — 1% glukozy, 1% lakto¬ zy, 0,75% wyciagu miesnego, 0,75% peptonu; Nr 10 — 1% glukozy, 1% laktozy, 1,0% N-Z-aminy, 0,2% wyciagu drozdzowego; Nr 11 — 1% glukozy, 1% laktozy, 1,5% maki sojowej; Nr 12 — 1% glu¬ kozy, 1% laktozy, 1,5% wyciagu namokowego ku¬ kurydzy; Nr 13 — 2% glukozy, 1,0% N-Z-aminy, 0,2% wyciagu drozdzowego; Nr 14 — 2% glukozy, 1,0% N-Z-aminy, 0,2% wyciagu drozdzowego; Nr 15 — 2% glukozy, 1,5% maki sojowej; Nr 16 — 2% glukozy, 1,5% wyciagu namokowego kukury¬ dzy.Dla wytwarzania pepstatyny na drodze fermen¬ tacji mozna stosowac zwykle metody, uzywane przy wytwarzaniu antybiotyków.Na przyklad wprowadza sie 100 litrów podloza do tanku fermentacyjnego, ze stali nierdzewnej, o pojemnosci 200 litrów, wyjalawia i zaszczepia szczepem wytwarzajacym pepstatyne. Fermentacje prowadzi sie w warunkach napowietrzania, wpro¬ wadzajac 100 litrów jalowego powietrza na minute.Po uplywie 45—60 godzin wytwarzanie pepstatyny osiaga szczyt.Pepstatyna jest stala w pH = 2,0—9,0; przy pod¬ grzewaniu roztworów o róznym pH w temperatu¬ rze 60°C przez 30 minut nie wykazuje zadnego spadku aktywnosci.Pepstatyne, która jest tylko nieznacznie roz¬ puszczalna w wodzie, stwierdza sie nie tylko w brzeczce fermentacyjnej, lecz równiez i w grzybni.Gdy wydajnosc fermentacyjna jest nieduza, wów¬ czas pepstatyna wystepuje glównie w brzeczce, natomiast, gdy wydajnosc jest wysoka, wówczas znaczne ilosci wystepuja w grzybni.Pepstatyne zawarta w grzybni ekstrahuje sie przy pomocy rozpuszczalników, w których pepsta¬ tyna jest rozpuszczalna, takich, jak na przyklad metanol. Pepstatyna posiada grupe karboksylowa Tablica 1 Wytwarzanie pepstatyny na róznych podlozach Pod¬ loze Nr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Dzien hodowli i % zahamowania pepsyny przez 0,05 i 2 PH 7,4 6,9 6,2 5,3 7,8 7,9 7,6 7,3 5,7 7,2 6,3 5,3 6,7 7,6 6,3 5,3 przesaczu hodowli, rozcienczonego \ /o 9,9 50 56 47 36 37 18 8,2 82 84 40 35 81 83 52 31 4 PH 6,8 7,9 8,0 5,3 8,5 8,0 7,7 8,2 7,9 8,4 6,3 5,4 8,0 8,2 5,5 5,4 % 24,1 84 71 64 39 32 29 9,4 92 81 69 43 83 84 76 31 5 PH 7,8 8,1 8,4 5,4 8,8 8,6 7,9 8,5 8,3 8,7 6,5 5,4 8,5 8,4 6,4 5,8 % 86 70 62 — — — — 85 83 80 — 83 85 77 ~ PH 8,5 8,4 8,5 5,4 8,9 8,7 8,2 8,3 8,2 8,4 7,0 5,4 8,4 8,2 7,8 6,3 100 razy 8 % 14 88 75 55 48 37 22 13 87 87 83 42 86 88 82 48 PH 8,8 8,7 8,7 7,2 9,0 8,8 8,6 7,6 8,7 8,3 8,3 5,9 8,8 8,3 8,3 7,1 ml 7 % 85 67 72 — — — — 88 82 82 — 85 88 8181272 li 12 i tworzy sole takie jak Na+, Ka+, NH4+, Li+, Ca++, Mg++, Cu++,Ba++, Fe++ , Mn++ itd. Sole sodowa lub potasowa pepstatyny maja rozpuszczalnosc po¬ dobna do pepstatyny, zas sole wapniowe, magne¬ zowe lub metali ciezkich sa slabiej rozpuszczalne 5 w wodzie i metanolu. Wskazane wiec jest ekstra¬ howanie pepstatyny z masy grzybni do rozpuszczal¬ ników w warunkach kwasnych. Pepstatyna jest lepiej rozpuszczalna w metanolu, zawierajacym chlorek wapniowy, a wiec odpowiednia metoda io jest ekstrahowanie pepstatyny z masy grzybni za¬ kwaszonym metanolem, zawierajacym CaCl2.Pepstatyne, zawarta w brzeczce fermentacyjnej, ekstrahuje sie za pomoca rozpuszczalników, nie mieszajacych sie z woda, w których pepstatyna 15 jest lepiej rozpuszczalna niz w wodzie, na przyklad za pomoca butanolu. Przez odparowywanie roztwo¬ rów pepstatyny uzyskuje sie surowy proszek, za¬ wierajacy pepstatyne, lub krysztaly pepstatyny. Od¬ parowujac wyciagi butanolowe z brzeczki przy wy- 20 sokiej wydajnosci fermentacyjnej, uzyskuje sie krysztaly pepstatyny.Poniewaz pepstatyna jest zwiazkiem trwalym, mozna zageszczac przesacze hodowlane, najlepiej pod zmniejszonym cisnieniem, a nastepnie ekstra- 25 howac pepstatyne z zageszczonego roztworu lub . z wysuszonej pozostalosci za pomoca rozpuszczal¬ ników takich, jak metanol, butanol i tym podobne, w których pepstatyna jest w dostatecznym stopniu rozpuszczalna. Mozna równiez ekstrahowac pepsta- 30 tyne jednoczesnie z brzeczki fermentacyjnej i z grzybni rozpuszczalnikami, nie mieszajacymi sie z woda, jak na przyklad propanolem, butanolem lub alkoholem amylowym.Dla ekstrahowania pepstatyny do rozpuszczalni- 35 ków nadaja sie zwykle metody przy uzyciu wielo¬ stopniowego ekstraktora, jak na przyklad wirówki Podbielniaka.Metoda adsorpcyjna jest równiez korzystna dla ekstrakcji i oczyszczania pepstatyny. Dla tych ce- 40 lów korzystny jest wegiel aktywny, zywice jono- -wymienne, zel glinowy, krzemowy i tym podobne.Pepstatyne zawarta w przesaczach hodowlanych mozna na przyklad adsorbowac na weglu aktyw¬ nym, a po przemyciu woda eluowac metanolem 45 lub wodnym roztworem metanolu. Podwyzszenie temperatury w czasie wymywania zwieksza wydaj¬ nosc tego procesu. I tak, do przesaczu hodowli do¬ daje sie wegla aktywnego w ilosci 2%, wegiel za¬ daje sie dwukrotnie 20 objetosciami metanolu w 50 temperaturze 40°C przy stalym mieszaniu, a na¬ stepnie eluuje sie pepstatyne, z wydajnoscia okolo 80%. Korzystnym sposobem oczyszczania pepstaty¬ ny jest chromatografia na weglu: na przyklad po zaadsorbowaniu pepstatyny na weglu przemywa sie 55 go 40% wodnym roztworem metanolu (metanol 40:H2O 60), przeprowadza sie chromatografie pep¬ statyny 80% wodnym roztworem metanolu (meta¬ nol 80:H2O 20). Uzycie wegla ulatwia usuniecie barwnych zanieczyszczen. 60 Chromatografia na zelu krzemionkowym jest ko¬ rzystna dla oczyszczania pepstatyny. Stosuje sie przy tym n-butanol-kwas octowy-woda-octan buty¬ lowy (4:1:1:4 w stosunku objetosciowym) lub octan etylowy-metanol <3:1 w stosunku objetosciowym) 65 jako ukladów rozpuszczlników. Stosuje sie na przyklad metanol, etanol, butanol lub mieszanine tych alkoholi z estrami.Pepstatyna posiada grupe karboksylowa. W zwiaz¬ ku z ta wlasnoscia kwasowa do ekstrahowania i oczyszczania pepstatyny mozna uzywac mocnych lub slabych zywic jono-wymiennych.Sama pepstatyna latwo krystalizuje. Przykladem rozpuszczalnika, w którym pepstatyna jest latwo rozpuszczalna, a tym samym korzystnym dla kry¬ stalizacji, jest metanol.Grupe karboksylowa pepstatyny latwo jest prze¬ prowadzic w grupy estrowe za pomoca zwyklych metod otrzymywania estrów, jak na przyklad przez ogrzewanie z odpowiednim alkoholem w obecnosci kwasu lub za pomoca dwuazometanu. Estry rów¬ niez hamuja pepsyne. Ester metylowy jest bardziej aktywny niz pepstatyna. Jezeli wydajnosc pepsta¬ tyny w brzeczce fermentacyjnej jest wysoka otrzy¬ muje sie krysztaly pepstatyny za pomoca prostych metod. Na przyklad ekstrahujac pepstatyne buta¬ nolem i zageszczajac wyciag butanolowy pod zmniejszonym cisnieniem otrzymuje sie krystalicz¬ na pepstatyne, która przekrystalizowuje sie z meta¬ nolu,, otrzymujac biale igly krysztalów pepstatyny.Ponizej opisane sa wlasnosci pepstatyny. Pepsta¬ tyna krystalizuje w postaci bialych, igielkowatych krysztalów. Najlepiej oczyszczona pepstatyna topi sie w temperaturze 228°C—229°C. Jest optycznie czynna, [a]27 = -900 dla 0,228% roztworu w meta¬ nolu. Wyniki analizy elementarnej przedstawiaja sie nastepujaco: dla wzoru CaAH^NsOg — wyliczo¬ no: C 59,53, H 9,25, N 10,21, O 20,99, znaleziono.C 59,02, 60,27, 9,27, 9,37, N 10,11, 9,90, O 21,41, 21,15. Na podstawie wyników analitycznych nie mozna wykluczyc wzorów C35H65N5O10 (wartosci wyliczone: C 58,72, H 9,15, N 9,78, O 22,35) i C35H65N509 (wartosci wyliczone: C 60,06, H 9,36.N 10,01, O 20,57) jednak za wzorem C34H63N509 przemawia widmo masowe. Pasmo macierzyste dla estru metylowego dwuacetylopepstatyny znajduje sie przy 783, a dla estru metylowego pepstatyny — przy 699. Ciezar czasteczkowy, okreslony metoda Akiya-Bergera przy uzyciu roztworu pepstatyny w pirydynie wynosi 600—730.Widmo w podczerwieni, przedstawione na fig. 1 wykazuje nastepujace pasma: 3320, 3090, 2955, 1710, 1635, 1545, 1470, 1450, 1420, 1390, 1370, 1300, 1220, 1178, 1070, 710 cm"1. Widmo w podczerwieni estru metylowego pepstatyny przedstawiono na fig. 2.Widmo jadrowego rezonansu magnetycznego estru metylowego dwuacetylopepstatyny w tetradeutero- metanolu przy uzyciu wyposazenia Varian HA-100 i przy uzyciu trójmetylosilanu, jako wzorca przed¬ stawiono na fig. 3.Stosunek L-alaniny do L-waliny, okreslony na podstawie analizy aminokwasów po hydrolizie pep¬ statyny w 6 N HC1 w 100°C przez 18 godzin wynosi 1 : 2. Pepstatyna daje dodatnia reakcje Rydon-Smi- tha — a te wyniki, jak i pasma w widmie w pod¬ czerwieni przy 1635 i 1545 cm-1 wskazuja na wia¬ zania peptydowe w pepstatynie. Pasmo w widmie w podczerwieni przy 1710 cm-1 wskazuje na obec¬ nosc grupy karboksylowej w pepstatynie, która j13 81272 14 wskazuje równiez adsorpcja na anionowej zywicy wymiennej.Przez ogrzewanie pepstatyny z dwuazometanem lub przez ogrzewanie, z kwasem siarkowym i al¬ koholem otrzymuje sie odpowiedni ester. Ester me¬ tylowy pepstatyny wykazuje pasmo przy 1730 cm-1 zamiast pasma przy 1710 cm-1. Wyniki analizy elementarnej estru metylowego sa nastepujace: dla wzoru C35H65N509 wyliczono: C 60,05, H 9,36, N 10,00, C 20,57; znaleziono: C 59,88, H 9,35, N 9,74, O 20,69.Pepstatyna, majac grupe karboksylowa, tworzy sole, które mozna latwo otrzymac zobojetniajac lub dodajac wyliczona ilosc zasady do metanolowego roztworu pepstatyny. Przygotowano na przyklad: sól sodowa pepstatyny (temperatura topnienia 250°C—252°C, z rozkladem, wyliczono dla wzoru C34H62N509Na — C 57,68, H 8,82, N 9,89, O 20,34, Na 3,24; znaleziono: C 57,97, H 8,92, N 9,96, O 20,26, Na 2,98), sól magnezowa pepstatyny (o tempera¬ turze topnienia 257°C—258°C z rozkladem, wyliczo¬ no dla wzoru: C34H62N509V2Mg : C 58,58, H 8,96, N 10,04, O 20,65, Mg 1,74; znaleziono: C 58,30, H 9,05, N 9,94, O 20,84, Mg 1,49) oraz sól wapniowa (temperatura topnienia 262°C—263°C, wyliczono dla wzoru C34H62N509V2Ca — C 57,93, H 8,86, N 9,93, O 20,42, Ca 2,84; znaleziono: C 57,92, H 8,98, N 9,62, O 20,07, Ca 2,62). Sól wapniowa pepstatyny jest sla¬ biej rozpuszczalna w wodzie i metanolu niz pepsta¬ tyna, natomiast pepstatyna jest lepiej rozpuszczal¬ na w metanolu zawierajacym CaCl2, niz w meta¬ nolu nie zawierajacym CaCl2. Pepstatyna, majac grupe karboksylowa, tworzy amidy. Na przyklad przez reakcje estru metylowego pepstatyny w me¬ tanolu otrzymuje sie amid pepstatyny.Zadajac pepstatyne bezwodnikiem octowym w pi¬ rydynie, otrzymuje sie dwuacetylowa i jednoace- tylowa pochodna pepstatyny, które rozdziela sie za pomoca chromatografii kolumnowej na zelu krze¬ mionkowym i eluowaniu mieszanina metanol-ace- ton-chloroform (5 : 25 : 70 w stosunku objetoscio¬ wym).W chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym G otrzymuje sie nastepujace war¬ tosci Rf dla pepstatyny przy uzyciu nizej podanych ukladów rozpuszczalników: 0,78 — octan butylu — butanol — kwas octowy — woda (6:6:1:1 w sto¬ sunku objetosciowym), 0,73 — octan butylu — bu¬ tanol — kwas octowy — woda (6 : 4 :1 :1 w stosun¬ ku objetosciowym), 0,76 — octan butylu — buta¬ nol — kwas octowy — woda (4:4:1:1 w stosunku objetosciowym).W elektroforezie wysokonapieciowej, przy uzyciu kwasnych solwentów takich, jak kwas mrówko¬ wy — kwas octowy — woda (25 :75 : 900 w stosunku objetosciowym) przy napieciu 3500 V przez 15 mi¬ nut nie stwierdzono przesuwania sie pepstatyny z linii startu, co przemawia za brakiem grup zasa¬ dowych w pepstatynie.Na podstawie badan produktów degradacji, wid¬ ma jadrowego rezonansu magnetycznego, widma i spektrometrii masowej okreslono wzór podany na rysunku jako wzór strukturalny pepstatyny i jej pochodnych.Pepstatyna jest slabo toksyczna. Myszy, psy, szczury i króliki toleruja dawke doustna w wy¬ sokosci 2,000 mg/kg wagi ciala nie wykazujac zad¬ nych objawów toksycznych. Wartosci LD50 przy wstrzyknieciu sródotrzewnowym sa nastepujace: dla myszy 1,000 mg/kg wagi ciala; dla szczura s 880 mg/kg wagi ciala; dla królika 820 mg/kg wagi ciala; dla psa 450 mg/kg wagi ciala. Dzienne poda¬ wanie szczurom doustnie 250 mg/kg wagi ciala przez okres 90 dni nie powoduje zadnych objawów tok¬ sycznych a szybkosc wzrostu odpowiada szybkosci io wzrostu zwierzat kontrolnych.Pepstatyna podana doustnie nie jest absorbowa¬ na. Na przyklad po podaniu 50 mg/kg wagi ciala nie stwierdza sie pepstatyny ani we krwi ani w moczu w ciagu 24 godzin po podaniu natomiast is okolo 90% stwierdza sie w kale w ciagu 72 godzin po podaniu.Estry, pochodne amidowe i acetylowe pepstatyny wykazuja przy uzyciu metody podanej powyzej 50% zahamowanie pepsyny w nastepujacych stezeniach: 20 pepstatyna — 0,01 (Jtg/ml; ester metylowy 0,008 [ig/ml; ester etylowy 0,01 ^ig/ml; ester p-bromofena- cylowy 0,01 ^ig/ml; amid 0,027 ^ig/ml; pochodna mo- noacetylowa 1,1 [ig/ml; dwuacetylowa pochodna 4,2 [ig/ml; ester metylowy dwuacetylowej pochod- 25 nej 2,26 ^g/ml. Natomiast w stosunku do tromboki- nazy plazminy, trypsyny, kalikreiny, a-chymotryp- syny i papainy, pepstatyna nie wykazuje dzialania hamujacego nawet w stezeniu 250 ^g/ml. Co wska¬ zuje, ze pepstatyna jest wysoce swoistym inhibito- so rem pepsyny. Przeprowadzono badania porównaw¬ cze uzywajac proktazy, enzymu w rodzaju pepsyny, wyizolowanego z Aspergillus niger, opis którego po¬ dano w czasopismie Argicultural Biological Chemi- stry (jap. vol. 28, p. 216—223, 1964. Stosujac miesza- 35 nine reakcyjna, jak podano wyzej, z wyjatkiem uzycia proktazy w miejsce pepsyny uzyskano 50% zahamowanie hydrolizy kazeiny przy dawce 0,02 fjig/ml.Przed odkryciem pepstatyny nie znano zadnego 40 silnego inhibitora pepsyny. Wprawdzie wiadomo bylo, ze estry siarczanowe polisacharydów hamuja pepsyne, jednak dzialanie ich jest bardzo slabe, a ponadto dzialaja one hamujaco na krzepniecie krwi. Natomiast pepstatyna jest silnym inhibitorem 45 pepsyny, za czym przemawiaja stezenia powoduja¬ ce 50% zahamowanie, podane powyzej, a przy tym nie wywiera dzialania hamujacego na krzepniecie krwi. Silne dzialanie inhibitorowe w stosunku do pepsyny wskazuje na jej skuteczne dzialanie 50 w owrzodzeniu zoladka, co istotnie potwierdzily badania kliniczne.Owrzodzenie zoladka u szczurów wywolywano metoda opisana przez Takagi i wsp. w czasopismie Japonese Journal of Pharmacology (18,9—18, 1968) 55 polegajaca na umieszczeniu szczurów w klatce w temperaturze 23°C na okres 22 godzin. Modelem tym poslugiwano sie dla okreslenia skutecznosci profilaktycznej i terapeutycznej pepstatyny. Szczu¬ rom podawano pepstatyne doustnie w dawce 60 50 mg/kg wagi ciala na 30 minut przed wywola¬ niem stressu i zabijano w 48 godzin po zastosowaniu stressu. W tych warunkach wyleczenie uzyskano w 76,3%. Przy dawce 10 mg/kg wagi ciala zahamo¬ wanie owrzodzenia uzyskano w 65,6%. Szybkie wy- 65 leczenie owrzódzlenia -stwierdzano równiez w tych15 81272 16 przypadkach, w których pepstatyne zastosowano w dawce 50 mg/kg wagi ciala bezposrednio po wy¬ wolaniu stressu i podajac te sama dawke raz dzien¬ nie przez 4 dni, po których zwierzeta zabijano.Stwierdzono równiez skutecznosc pepstatyny w owrzodzeniach, wywolanych u szczurów (szczepu Shay) przez podwiazanie odzwiernika. Zastosowano metode opisana przez Watanabe i Kasuya w cza¬ sopismie Chemical Pharmaceutical Bulletin 11, 1282, 1963. Stosujac pepstatyne w dawce 2 mg/kg wagi ciala lub wyzej w 30 minut i 14 godzin po podwia¬ zaniu odzwiernika nie stwierdzono owrzodzenia. 50% zahamowanie uzyskano przy dawce 0.5 mg/kg wagi ciala. W soku zoladkowym nie stwierdzono aktywnosci pepsyny lub wynosila ona mniej niz 10% w porównaniu z kontrola. Tak wiec pepstaty- na wykazuje silne dzialanie zapobiegawcze i leczni¬ cze w przypadkach owrzodzenia zoladka u szczu¬ rów Shay. Stosowanie doustne pepstatyny ludziom w przypadku owrzodzenia zoladka i dwunastnicy 1 do 4 tabletek, zawierajacych 25 do 100 mg pepsta¬ tyny, miedzy posilkami wywiera efekt leczniczy i nie wywoluje objawów toksycznych. Po podaniu ból szybko ustepuje.Pepstatyna nie hamuje papainy, która posiada grupe sulfhydrylowa w centrum aktywnym, nato¬ miast dziala hamujaco na obrzek wywolany karage- nina. (C. A. Winter, E. A. Risley, and G. W. Nuss: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. III, 544, 1962). Pepsta¬ tyne wstrzykiwano sródotrzewnowo a karagenine (0.1 ml 0,1% roztworu) wstrzykiwano do poduszecz- ki tylnej lapki i mierzono obrzek po 1, 3, 5 i 24 go¬ dzinach. Stwierdzono zahamowanie powyzej 30% przy dawce nie mniejszej niz 1,25 mg pepstatyny na kg wagi ciala.Ponizej podane przyklady objasniaja blizej spo¬ sób wedlug wynalazku, nie ograniczajac jednak jego zakresu.Przyklad I. 100 ml podloza, zawierajacego 1,0% glukozy, 1,0% skrobi, 0,75% peptonu, 0,75% wyciagu miesnego, 3,0% NaCl, 0,1% MgS04 • 7H20, 0,1% KH2P04 i 0,1 ml roztworu jonów metali (CuS04 • 5H20 — 700 mg, FeS04 • 7H20 — 100 mg, MnCl2 . 4HzO — 800 mg, ZnS04 . 7H20 —200 mg — rozpuszczone w 100 ml wody destylowanej) umiesz¬ czano we flaszkach wstrzasanych o pojemnosci 500 ml i wyjalawiano w 120°C przez 20 minut. pH doprowadzano do 7,0 po wyjalowieniu. Podloze zaszczepiono jednym oczkiem zarodników i grzybni szczepu MC144-C1, hodowanego na podlozu agaro¬ wym, i hodowano w temperaturze 27°C na wstrza- sarce (100 wahniec na minute przy amplitudzie 8 cm). pH w trzecim dniu hodowli wynosilo 5,7 a czwartego dnia 6,3.Oznaczajac cukry metoda antronowa stwierdzo¬ no, ze pierwszego dnia gestosc optyczna wynosila 0,9/0,005 ml, czwartego dnia 0,3/0,005 ml, natomiast piatego dnia nie stwierdzono obecnosci cukrów re¬ dukujacych. 0,05 ml przesaczu pieciodniowej brzecz¬ ki w rozcienczeniu 1:100 powodowal zahamowanie pepsyny w 64%. Brzeczke hodowli pieciodniowej z Z9 kolb wstrzasanych polaczono razem, przesaczo¬ no, z przesaczu ekstrahowano pepstatyne 2400 ml n-butanolu a nastepnie 2000 ml n-butanolu. Ekstra¬ kty butanolowe laczono razem, odparowywano pod zmniejszonym cisnieniem, uzyskujac 4 g brazowego, surowego proszku. 50% zahamowanie uzyskano do¬ dajac do testowego roztworu 0,13|Ag tego proszku.Przyklad II. Surowy proszek, otrzymany w 5 sposób, jak w przykladzie I, poddano dalszemu oczyszczaniu. Proszek ten, dodany w ilosci 0,16 fxg do testowego roztworu powoduje 50% zahamowanie pepsyny. 2,1 g surowego proszku rozpuszczano w 30 ml destylowanej wody i przepuszczano przez ko- 10 lumne dlugosci 72 cm, zawierajaca 18 g wegla ak¬ tywnego z szybkoscia 2 ml/minute. Przemywano kolumne 400 ml wody destylowanej i 300 ml 40% wodnego roztworu metanolu, a nastepnie eluowano pepstatyne 80% wodnym roztworem metanolu (me- 15 tanol : woda = 80:20).Eluat odbierano we frakcjach wazacych 5 g, frak¬ cje zawierajace pepstatyne laczono razem i odpa¬ rowywano pod zmniejszonym cisnieniem uzyskujac 0,7 g bialego proszku. Proszek ten, dodany do testo- 2 wegó" roztworu w ilosci 0,054 g, powoduje 50% za¬ hamowanie pepsyny.Przyklad III. 4000 ml przesaczu brzeczki przygotowano w sposób, jak w przykladzie I. 0,05 ml tego przesaczu, rozcienczonego 1:100 po- 25 woduje 50% zahamowanie pepsyny. Do przesaczu dodano 80 g aktywnego wegla i mieszano przez 20 minut; po tym czasie cala pepstatyna zawarta w przesaczu zostaje zaadsorbowana na weglu.Wegiel odsacza sie i przemywa 2000 ml wody 30 a pepstatyne eluuje sie 2000 ml i 1500 ml metanolu w temperaturze 40°C.Metanolowe eluaty laczy sie i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem uzyskujac 15 g brazowe¬ go, surowego proszku, 0,6 ^g tego proszku, dodane 35 do testowego roztworu powoduje 50% zahamowanie pepsyny. Proszek rozpuszcza sie w 1000 ml wody i przepuszcza przez kolumne (o srednicy 3 cm) za¬ wierajaca 100 g wegla aktywnego. Chromatografie przeprowadza sie w sposób jak w przykladzie II 40 uzyskujac 1,5 g bialego proszku. 0,06 \ig tego prosz¬ ku dodane do testowego roztworu powoduje 50% zahamownaie pepsyny.Przyklad IV. Calkowite oczyszczenie prze¬ prowadzono na proszku, uzyskanym w ilosci 0,38 g, 45 jak w przykladzie III. Proszek ten dodany w ilosci 0,06 }ig do testowego roztworu powoduje 50% zaha¬ mowanie pepsyny. Proszek ten rozpuszcza sie w 5.0 ml mieszaniny rozpuszczalników skladajacej sie z butanolu, kwasu octowego, wody i octanu buty- 50 lowego w stosunku objetosciowym 4 :1 :1 : 4, i prze¬ puszczono przez kolumne z zelu krzemionkowego (90 g zelu krzemionkowego, kolumna o srednicy 2,2 cm), przemywajac tym samym roztworem. Eluo¬ wano ta sama mieszanine i odbierano frakcje 5-gra- 55 mowe. Pepstatyna pojawiala sie we frakcjach od 9 do 15, które razem i odparowywano, uzyskujac 0,27 g bialego proszku, wykazujacego 50% zahamo¬ wanie przy dodaniu 0,04 \ig roztworu testowego.Przez krystalizacje tego proszku z metanolu uzy- 60 skuje sie 0,13 g krysztalów w ksztalcie igiel. Do¬ danie 0,02 g tych krysztalów do testowego roztwo¬ ru powoduje 50% zahamowanie.Przyklad V. W sposób, jak w przykladzie II, uzyskuje sie proszek, który dodany w ilosci 0.06 [ig 65 do roztworu testowego powoduje 50% zahamowa- j17 81272 18 nie pepsyny, 0,4 g tego proszku rozpuszcza sie w 5,0 ml mieszaniny solwentowej (octan etylowy — metanol = 3:1). Przeprowadza sie chromatografie na zelu krzemionkowym, uzywajac mieszaniny oc¬ tanu etylowego i metanolu w stosunku 3 :1 i od¬ biera sie frakcje 5 gramowe. Po odparowaniu po¬ laczonych frakcji uzyskuje sie 0,29 g bialego prosz¬ ku, który dodany w ilosci 0,03 \ig do testowego roztworu powoduje 50% zahamowanie pepsyny.Przez krystalizacje z metanolu uzyskuje sie 0,14 g krysztalów igielkowatych pepstatyny o tempera¬ turze topnienia 224°C—226°C.Przyklad VI. 150 litrów podloza, opisanego w przykladzie I, umieszcza sie w 200 litrowym tanku fermentacyjnym, ze stali nierdzewnej, i wy¬ jalawia przez 30 minut w temperaturze 115°C, a nastepnie zaszczepia 1 litrem brzeczki z hodowli wstrzasanej szczepu MC144-C1. Hodowle wstrzasana prowadzi sie przez 72 godziny w sposób, jak w przy¬ kladzie I. Fermentacje w tanku przeprowadza sie w temperaturze 24°C przy ciaglym mieszaniu z szybkoscia 200 obrotów/minute i przepuszczajac 200 litrów jalowego powietrza/minute.Fermentacje prowadzi sie przez 72 godziny. War¬ tosc pH wynosi wówczas 7,42, a 0,05 ml przesaczu hodowli w rozcienczeniu 1 : 250 powoduje 51,5% za¬ hamowanie pepsyny. Do brzeczki dodaje sie 4,5 kg ziemi okrzemkowej, odsacza, ciasto przemywa 12 litrami destylowanej wody. Przesacze po przemyciu dodaje sie do przesaczu hodowli uzyskujac razem 133 litry. pH doprowadza sie do 8,2 za pomoca 3 N NaOH i ekstrahuje kolejno 60 litrami i 30 litra¬ mi metanolu. Ekstrakty butanolowe laczy sie ra¬ zem, przemywa kolejno 11 litrami i 9 litrami wody i odparowuje pod zmniejszonym ciesnieniem. Osad gromadzi sie i suszy, uzyskujac 38,4 g brazowego proszku. Dodany w ilosci 0,10 \ig do roztworu te¬ stowego powoduje 50% zahamowanie pepsyny. Su- pernatant równiez odparowuje sie do stanu suche¬ go uzyskujac 13,0 g surowego, brazowego proszku, który dodany w ilosci 0,17 ^g do roztworu testowe¬ go powoduje 50% zahamowanie pepsyny. Wydaj¬ nosc tej preparatyki wynosi 70%.Przyklad VII. 3000 litrów podloza, opisanego w przykladzie I, wprowadza sie do tanku fermen¬ tacyjnego o pojemnosci 6000 litrów. Po wyjalowie¬ niu wprowadza sie do niego 110 litrów 28-godzinnej hodowli, prowadzonej w 200 litrowym tanku fer¬ mentacyjnym, jak opisano w przykladzie III. Fer¬ mentacje prowadzi sie w temperaturze 24°C przy ciaglym mieszaniu i szybkoscia 190 obrotów/minute i napowietrzaniu w ilosci 2500 litrów jalowego po¬ wietrza/minute. Fermentacje prowadzi sie przez 65 godzin. pH brzeczki doprowadza sie do 7,5 i do¬ daje 77,5 kg dikalitu a nastepnie przepuszcza przez prase filtracyjna, ciasto przemywa 200 litrami wo¬ dy.Calkowita objetosc przesaczu brzeczki i wody uzytej do przemywania wynosi 2790 litrów. pH te¬ go roztworu doprowadza sie do 8,2 za pomoca 3 N NaOH i ekstrahuje 1400 litrami n-butanolu.Na podstawie wyników testu hamowania stwier¬ dzono, ze przesacz zawiera 423 g pepstatyny a wy¬ ciag butanolowy 362 g pepstatyny. Wyciag butano- lowy odparowano pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 150 litrów, oddzielajac osad, którego waga mokra wynosila 3b670 g. Stezony roztwór zageszcza¬ no do objetosci 10 litrów uzyskujac osad (którego waga wilgotna wynosila 1,540 g), polaczone osady rozpuszczono w 16 litrach metanolu w tempera¬ turze okolo 40°C. Roztwór metanolowy zawieral 297 g pepstatyny. 1500 g aktywnego wegla dodano do goracego roztworu metanolowego i przesaczono.Przez oziebienie roztworu metanolowego wytraco¬ no krysztaly (waga wilgotna 400 g), które odsa¬ czono.Wegiel przemyto trzykrotnie 8 litrami goracego metanolu i oddano roztwory metanolowe do super- natantu pokrystalicznego i odparowano do objetos¬ ci 1 litra, oziebiono i uzyskano 63 g krysztalów pepstatyny.Ciasto grzybni, zawierajace dikalit, ekstrahowano 500 litrami goracego metanolu, roztwór metanolowy odparowano pod zmniejszonym cisnieniem. Pozo¬ stalosc przemyto 15 litrami goracego metanolu i rozpuszczono w 20 litrach goracego metanolu. Do goracego roztworu metanolu dodano 1000 g wegla.Po odparowaniu metanolu do objetosci 1 litra i ozie¬ bieniu uzyskano 170 g krysztalów pepstatyny.Przyklad VIII. 548 g pepstatyny rozpuszczono w okolo 50 ml metanolu. Do roztworu tego dodano roztwór eteru, zawierajacy dwuazometan w ilosci 3 g/200 ml az do momentu utrzymania sie zóltej barwy dwuazometanu, po czym roztwór natych¬ miast odparowano pod zmniejszonym cisnieniem, uzyskujac 560 mg bialego proszku. Przez rekrysta¬ lizacje z metanolu uzyskano krysztaly w postaci bialych igiel o temperaturze topnienia 249°C—251°C.Krysztaly te wykazuja charakterystyczne dla estru pasmo przy 1730 cm-1 w podczerwieni nato¬ miast pasmo, przy 1710 cm-1 w podczerwieni, cha¬ rakterystyczne dla grupy karboksylowej pepstaty¬ ny zanika. Dodanie 0,015 \ig tego estru do testowe¬ go roztworu powoduje 50% zahamowanie.Przyklad IX. Podloze, zawierajace 2,5% gli¬ cerolu, 0,5% wyciagu miesnego, 0,5% peptonu, 1,0% wyciagu drozdzowego, 0,2% NaCl, 0,05% MgS04 • 7H20, 0,05% K2HP04, i 0,32% CaC03, za¬ szczepiono jednym oczkiem zarodników i grzybni szczepu MC210-A1. 100 ml tego podloza wprowa¬ dzono do kolby wstrzasanej o objetosci 500 ml i wyjalowiono przed zaszczepieniem. Hodowle wstrzasana prowadzono przez 7 dni w temperatu¬ rze 27°C. Piatego dnia pH wynosilo 7,5, a siódme¬ go — 7,7. Dodanie 0,1 ml przesaczu hodowli, roz¬ cienczonego 25 razy do roztworu testowego powo¬ dowalo zahamowanie pepsyny w 32%. Przesacze hodowli z 50 kolb polaczono razem i ekstrahowano 2000 litrami n-butanolu.Po odparowaniu wyciagu pod zmniejszonym cis¬ nieniem uzyskano 2,0 g brazowego proszku, który w ilosci 1,5 |xg powodowal 50% zahamowanie w warunkach standardowych. Surowy proszek za¬ wieszono w 30 ml wody i przepuszczano przez kolumne z wegla (18 g wegla, kolumna o srednicy 1,5 cm). Przez kolumne przepuszczono 300 ml 30% wodnego roztworu metanolu a nastepnie eluowano pepstatyne z kolumny za pomoca 80% wodnego roztworu metanolu.Eluat odbierano we frakcjach 5 gramowych. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6019 81272 20 Pepstatyna pojawiala sie we frakcjach od 28 do 45.Frakcje te polaczono razem i odparowano pod zmniejszonym cisnieniem uzyskujac 0,35 g bialego proszku, który w ilosci 0,3 \ig powoduje 50% za¬ hamowanie pepsyny w warunkach standardowych.Przez oczyszczanie tego proszku metoda, opisana w przykladzie IV uzyskuje sie krysztaly pepstaty- ny, zidentyfikowane na podstawie widma w pod¬ czerwieni i chromatografii cienkowarstwowej.Przyklad X. 114 mg pepstatyny rozpuszczo¬ no w 40 ml etanolu i ogrzewano przez 4 godziny pod chlodnica zwrotna z 40 ml benzenu i kilkoma kroplami stezonego kwasu siarkowego. Zobojetnia¬ no roztworem weglanu sodowego, po przesaczeniu przesacz odparowywano pod zmniejszonym cisnie¬ niem do stanu suchego, uzyskujac 75 mg bialego proszku. Proszek przemywano woda i suszono, uzyskujac 48 mg estru etylowego pepstatyny o temperaturze topnienia 190°C—193°C. Dla wzoru C36H67N509 wyliczono: C 60,56, H 9,45, N 9,80 O 20,16; znaleziono: C 60,96, H 9,65, N 9,43,, O 19,70.Badanie 0,02 g do roztworu standardowego powo¬ duje 50% zahamowanie pepsyny.Przyklad XI. 405 mg estru metylowego pepstatyny rozpuszczono w metanolu, a nastepnie przez roztwór przepuszczano gazowy amoniak w ciagu 14 godzin. Wytracony w czasie tej reakcji osad odsacza sie uzyskujac 324 mg bialego proszku amidu pepstatyny, zanieczyszczonego estrem mety¬ lowym pepstatyny.Proszek poddano chromatografii na zelu krze¬ mionkowym, eluujac mieszanina chloroform-ace- ton-metanol (5:3:2 w stosunku objetosciowym) i odbierano frakcje po 5 g. Amid pepstatyny poja¬ wial sie we frakcjach 101—350, po odparowaniu których uzyskano 260 mg czystego amidu pepsta¬ tyny, o temperaturze topnienia 229°C—231°C. Dane analityczne: dla wzoru C34H64N608 wyliczono: C 59,62, H 9,41, N 12,27, O 18,68. Znaleziono: C 59,69, H 9,45, N 12,17, O 18,24. 0,054 g powoduje 50% zahamowanie pepsyny w warunkach standar¬ dowych.Z otrzymanych sposobem wedlug wynalazku pepstatyn mozna otrzymac sole addycyjne pepsta- tyn z nieorganicznymi oraz organicznymi zasadami takimi, jak sodowa, potasowa, amonowa, wapnio¬ wa, magnezowa glukozaminy, mannozaminy, galak- tozaminy, zelazawa, zelazowa, miedziowa, miedzia- wa i tym podobne oraz estrów pepstatyny takich, jak ester metylowy, etylowy, propylowy, butylowy, izobutylowy, pentylowy, izopentylowy, nezylo- wy itd.Dla celów terapeutycznych korzystne sa sole zasad nietoksycznych natomiast sole zasad toksycz- 5 nych nadaja sie do izolowania, jak na przyklad do wytracania z roztworów. Ze wzgledu na specjalne wskazania i o ile jest to zgodne z wymogami far¬ maceutycznymi — zwiazki, otrzymane sposobem wedlug wynalazku mozna laczyc z innymi lekami, io takimi, jak srodki antyhistaminowe, antybiotyki, substancje buforujace, takie, jak dwuweglan sodo¬ wy, weglan wapniowy, krzemian glinowy, weglan magnezowy i tym podobne lub tez z czynnikami blokujacymi uklad nerwowy, jak methochropro- 15 mide, czy oxazepam i inne. PL PL