DE2028403A1

DE2028403A1 - Pepstatin

Info

Publication number: DE2028403A1
Application number: DE19702028403
Authority: DE
Inventors: Hamao Takeuchi Tomio Hamada Masa Hoya Maeda Kenji Okami Yoshiro Tokio Aoyagi Takaaki Fujisawa Kanagawa Umezawa, (Japan)
Original assignee: Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Ken kyu Kai, Tokio
Priority date: 1969-06-13
Filing date: 1970-06-09
Publication date: 1971-01-28
Also published as: NL166279B; YU146270A; BE751931A; IE34196B1; FI47498B; AT295454B; IE34196L; FR2052964B1; DE2028403C3; DK128124B; NL166279C; GB1314231A; CS171685B2; PH9382A; AU1584970A; CA928238A; FI47498C; ES380545A1; NL7008657A; NO129682B

Description

ZAIDAN HOJIlI BISSIBUTSU KAßAKTJ KENKYÜ KAI, Tokyo / Japan

Pepstatin

Die Erfindung betrifft ein neues und wertvolles mikrobiellss Produkt, das als Pepstatin bezeichnet wird und Pepsin oewie dessen Erzeugung zu inhibieren vermag. Insbesondere bcaieiit j sich die Erfindung auf ein Verfahren zu seiner Herstellung durch Gärung-sowie auf Methoden, zu seiner Abtrennung und Hei*· nigung. In den Bahmen der Erfindung fällt dieses Antipepsiamittel, seine Salze und Ester in verdünnten Lösungen, in ?ora von Hohkonzentraten, in Form von Rohfeststoffen sowie in . Porm von gereinigten !Feststoffen und in reinen kristallinen Formen. Diese Substanz, ihre Salze und Ester eignen sich «r.J Inhibierung von Pepsin-und besitzen eine therapeutische _t.

009*885/2240

und schützende Wirkung gegenüber einem experimentell erzeugten Magengeschwür bei Ratten und Mäusen. Diese Verbindungen besitzen eine geringe Toxizität und eignen sich zur Behandlung von Geschwüren des menschlichen Magens und Duodenums.

Durch die Erfindung wird eine Antipepsinverbindung (sov/ie deren Salze und Ester) zur Verfugung gestellt, welche in wirksamer Weise eine Protsasewirkung von Pepsin zu verhindern vermag. Diese Antipepsinverbindung ist in Methanol, Essigsäure, Dimethylsulfoxyd und Pyridin löslich und in Äthanol, Propanol, Butapol und Amylalkohol wenig löslich und löst sich in Äthylacetat, Butylacetat, Äthyläther;' Tetrachlorkohlenstoff, Hexan, Petroläther, Benzol und Chloroform nicht. Sie schmilzt bei 228 - 229⁰C und zeigt eine starke End- . absorption ohne ein Maximum, mit Ausnahme einer niedrigen Schulter bei 260 - 270 mu (E^_n, = ungefähr 0,3). Die Links-

nrj Il du

drehung [a] J' = -90° (C » 0,288 in Methanol). Die Verbindung liefert eine positive Rydon-Smith-Reaktion (falls sie auf einem Dünnschichtchromatogramra getes.tet wird und eine Natriumhydroxydlösung vor dem Aufsprühen des Reagenses versprüht wird). Die Ninbydrin-Reaktio» ist negativ, desgleichen die Sakaguchi-Reaktion, die Naphthoresorcin-Reaktion sowie die Anisaldehyd/Söhwefelsäure-Reaktioii. In dem Infrarotteil des Spektrums werden nach einer Pelletisierung mit Kaliumbromid folgende Banden festgestellt: 3520, 3090,£955, 1710, 1635,. 1^45*, 1470, 1450, 1420» 1390, 1370, 1300, 1220, T 1178, 1070 und 710 cm""¹. Die Verbindung entspricht der formel ^34%3^5^9* ¹M-⁶⁸⁰ SOwael ergibt sich durch das Massenspektrum dea Methylesters des Diacetyl-Derivats sowie durch Elementaranalyse, Ferner liefert die Verbindung Ii-Valin und !-Alanin nach einer Hydrolyse in einem Verhältnis von 2:1. Ferner weist sie eine Carboxylgruppe auf, die einen Kethylester liefert (C₅₅Hg₅N₅O₉, E, 249 -251⁰C). Dieser Methylester in-

009885/2240

hibiert Pepsin.

Ferner fallen in den Rahmen der Erfindung die Salze und Ester dieser Verbindung, die ebenfalls Pepsin zu inhibieren vermögen. Pepstatin weist eine Carboxylgruppe! auf und lässt sich in einfacher Weise nach Üblichen Lethoden zur Umwandlung von Carboxylgruppen in Estergruppen verestern, beispielsweise } durch Erhitzen in f.aurem Methanol, durch die Diazomethanreaktion oder dergleichen.

Die Figur 1 zeigt das Infrarotspektrum von Pepstatin, pelletisiert in Kaliumbromid. ^- >

Die Figur 2 ist das InfrarotSpektrum des Methylesters von Pepstatin, pelletisiert in Kaliumbromid.

Die Figur. 3 ist das NMR-Spektrum des Methylesters von Diacetylpepetatin, genommen in Tetradeuteromethanol.

Durch die Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Herstellung von Pepstatin zur Verfügung gestellt. Dieses Verfahren besteht darin, einen Stamm von Schimmelpilzen in einer wässrigen Lösung zu ztichten, die Kohlenstoffquellen und Nährkohlenstoff quellen sowie Stickstoffquellen enthält, und zwar unter aeroben Bedingungen, wobei das Züchten solange fortgesetzt wird, bis eine erhebliche Menge an Pepstatin in der Lösung angereichert ist. Dann wird das Pepstatin extrahiert und isoliert.

Ferner fallen in den Rahmen der Erfindung Methoden zur Herstellung der Ester aus Pepstatin.

Pepstatin wurde in KuIturfiltraten von verschiedenen Schinimel-

009885/2240

pilzen festgestellt. Darüber hinaus konnte ermittelt werden, dass Pepstatin eine therapeutische oder schützende Wirkung gegenüber Magengeschwüren ausübt. Man kann behaupten, dass Pepstatin die erste Verbindung ist, die in spezifischer Weise Pepsin zu inhibieren vermag. Vor Pepstatin war kein spezifischer Pepsin-Inhibitor bekennt,»' Pepstatin konnte bereits in einigen Spezies Von Schimmelpilzen gefunden werden.

Man nimmt an, dass diese Verbindung bei Schimmelpilzen weit verbreitet ist. Erfindungsgemäss werden die Charaktere von 3 Stäir-men beschrieben,, aus welchen Pepstatin isoliert worden ist. Die Beschreibung in Klammern [ ] lehnt sich an den Color-Standard an, der im "Color Harmony Manual of Container Corporation of America" geschildert ist.

Eigenschaften des Stamms MC144-C1: .

Der Stamm wurde von einer Bodenprobe isoliert, die in einem Wald bei Cuxhaven in Westdeutschland im Jahre 1958 im August gesammelt worden ist. Dieser Stamm hat die Labornummer MC144-C1 bekommen. Er wurde am 21. Mai 1969 in Kogyp, Gijuteuin Hakko Kenkujyo hinterlegt und erhielt die Hinter- j legungsnummer 312. Dieser Stamm wurde ferner in der "American Type Culture Collection" hinterlegt, und zwar unter der Hummer ATCC 21469. Unter dem Mikroskop sieht man, dass die Substratmyeeln gut verzweigt sind und Lufthyphen in leicht gewellter Form aufweisen. An den luf thyphen findet man offene Spiralen,' endständige Spiralen sowie Hocker, es werden jedoch keine Wirtein beobachtet. Die Oberfläche der Sporen ist glatt.' !

Die Eigenschaften auf verschiedenen Medien sind wie folgts

1) Auf einem Glyzerin-Czapek-Medium (gezüchtet bei 27⁰C)i Der Wuchs ist hellgelb bis hellbraun und später hell gelblich-

- 5 - ■ ■ ,

"braun. Das Luftmyzel entwickelt sich leicht und ist gräulichweiss bis leicht grau. Es wird ein gelbliches lösliches Pigment nach einem längeren Züchten erzeugt.

2) Auf einem Krainsky-G-lucoseasparaginagar (gezüchtet bei 27°C)i Der Wuchs ist hellgelb bis gelb [Pastel Yellow, 1 1/2 f b]. Das J Luftmyzel ist gräulich-weiss bis leicht grau. Kein lösliches Pigment.

3) Auf einem Gaiciummalatagar (gezüchtet bei 27°C): Der Wuchs ist schlecht und farblos. Das Luftmyzel ist dünn und gräulicnweiss bis leicht grau. Kein lösliches Pigment." JCeine, transparente Zone wird um die Wuchsstelle herua beobachtet.

4) In Peptonwasser, das 1,0 i<> Natriumnitrat (gezüchtet bei 27^pC) enthält: Der Wuchs ist sehr schlecht und farblos. Kein Luftmyzel. Kein lösliches Pigment. Reduktion von Uitrat zu Nitrit ist nicht eindeutig.

5) Auf einer Kartoffelscheibe (gezüchtet bei 27°C): Der Wuchs ist sehr stark und hellgelb bis braun oder rötlich-braun [Rust !Dan, 5 Ie-Brick Red, 6ng]. Das Luftmyzel entwickelt sich leicht und ist weiss bis graulich weiss. Kein lösliches Pigment.

6) Auf einer Stärkeplatte (gezüchtet bei 27°0): Es wird bei einem 21-tägigen Züchten kein Wuchs beobachtet.

7) Auf einem Peptonfleischextraktagar (gezüchtet bei "57°O): Es wird bei einem Züchten während einer Zeitspanne von 21 Sagen kein Wuchs beobachtet.

8) Auf einem Peptonfleischexteaktagar (gezüchtet bei 27°C): Der Wuchs ist farblos, kein'Luftmyzel, kein lösliches Pigment.

009885/2240

2028A03

9) Auf einem koagulierten Loeffl.er-Senim (gezüchtet bei 37 und JO⁰C): Es wird nach einem Züchten während einer Zeitspanne von 21 Tagen kein l/ucha

10) In einem PXeischbrHhe-G&latinemedima (2Q⁰G)s Der Wuchs ist farblos, Kein Luftmyzel,, Kein lösliches Pigment. Es wird eine Verflüssigung der Gelatine nach dem dritten Tag des Züchtens beobachtet, wobei die Verflüssigung fortschreitet, d.h. die Verflüssigung ist stark»

11) In einem Milchmedium (gezüchtet bei 31⁰G) ι Der ¥uchs ist farblos. Kein'Iuftmyzel« Kein lösliches Pigment. Die Milch gerinnt und wird anschliessend peptoxiisiert^ Die Koa.gulierun^ und Peptonisierung sind starke

12) Auf einem Tyrosinagar (gezüchtet bei 27°C)s Der Wuchs ist schlecht und farblos. Kein luftmyzel. Kein lösliches Pigment. Die Tyrosinase ist negativ.

13) Auf Zellulose (gezüchtet bei 27°0); Es wird kein Wuchs während einer Zeitspanne νυη 21 Tagen beobachtet.

Die Verwendung von Kohlehydraten wird auf einem Pridham-Gottlieb-Medium (gezüchtet bei 27°C) getestet. Das Ergebnis ist folgendes: Glyzerin, Mannose und Rohrzucker 'werden verbraucht, wobei ein reichliches Wachstum eintritt. Arabinosa, Xylose, Rhamnose, Fruktose, Iaosiröl, Sorbit, Maltose, Laktose, Raffinose, Dulcit, Salicin und Inulin werden nicht verbraucht. Dextrin und Stärke werden leicht verbraucht. Mannit und Galaktose ergeben einen sehr leichten Wuctis and scheinen nicht verbraucht zu werden·. Die Eigenschaften des Stamms MO144-01, wie er vorstehend beschrieben wurde₉ lassen sich wie folgt zusammenfassen: Er gehört zu den Stretstomyces und

■■ - 7 -

bildet Spiralen, {jedoch keine Wirtel. Ausserdem liefert er Sporen mit einer glatten Oberfläche und "erzeugt ein überraässiges Wachstum auf Kartoffelßcheiben, wobei das Wachstum jedoch auf anderen Medien nicht derartig übermässig int. Bei einem Züchten bei ?7°C ist der Wuchs schlecht. Er besitzt eine starke proteo-Iytische Aktivität. Der Wuchs ist hellgelb, gelb oder hellbraun J

gräülich-weiss oder leicht grau auf verschiedenen Medien". Er gehört zu dem nieht-chromogenen Typ. Der rötlich-braune Wuchs auf Kartoffelscheiben ist charakteristisch, fergleicht man diese Eigenschaften mit denjenigen bekannter Spezies,, dann stellt rann Ähnlichkeiten zwischen diesen Stamm und Actlnomyces I longisporus-flavus Krasinikov (beschrieben in "International Journal of Systematic Bacteriology¹¹ 18, 542, 1968 sowie in Band 2, Seite 237 des Buchs "The Actinomycetes" von S.A. Waksman) fest. Die Unterschiede und Ähnlichkeiten sind wie folgt:

009885/2240

Stamm MC144-01

A.. longis-porus-f lavus

O IO OS 60

Wirtel Spirale Oberfläche der Sporen Luftmyzel

Wachstum

Tyrosinase Proteolytische Wirkung Hydrolyse von Stärke Verbrauch von Kohlenstoff:

Rohrzucker

Rhamnose

Arabinose

Xylose

Fraktose

keine

gebildet

glatt

dünn, gräulichweiss bis leicht grau

hellgelb, gelb, hellbraun

keine
stark
fraglich

verbraucht nicht verbraucht nicht verbraucht nicht verbraucht nicht verbraucht

keine

gebildet glatt

schlecht oder keines* reichlich, weisslich-gelb bis bräunlich gelb**

gelb

keine

mittel

schwach

CO. I

nicht verbraucht verbraucht verbraucht verbraucht verbraucht

»Beschrieben in "Int.«!.Systematic Bacteriology", 18, 342, si 968 **Beschrieben in-"Actinomycetes" von S.A. Waksman, Band 2,'Seite 23

■ - 9 -

Wie vorstehend beschrieben, unterecllöidet eich djer Stamm MC144-C1 von A. longisporus-flavua hinsichtlich des Verbrauchs von Kohlehydraten sowie hinsichtlich des Charakters des Luftmyzels. Die Farbe des Wachses des Stammes MG144*01 auf Kartoffeleheiben ist charakteristisch, Dieser Stamm wird einer neuen Spezies zugeschrieben, die als Streptomyces testaceus gekennzeichnet wird.

Eigenschaften deB Stamms MG221-C2;

Es handelt sich einen Stamm, der von einem Boden isoliert worden ist, welcher im Oktober 1968 in Kamakura ,gesammelt worden ist. Dieser Stamm erhielt die Nummer HO221-G2. Unter'^em Mikroskop sieht man, dass das Myzel gut verzweigt ist und Lufthypen aufweist, die endständige Spiralen und Höcker bilden. Es werden keine Wirtel gebildet. Das Luftmyzel ist gekrümmter als dasjenige des Stammes MC144~C1. Dieser Stamm verbraucht Galaktose in [] geringem Ausmaß, Die Verflüssigung von Gelatine ist schwach. Mit Ausnahme dieser Merkmale hinsichtlich des Zuckerverbirauchs J und der Verflüssigung von Gelatine ähnelt dieser Stamm dem j vorstehend beschriebenen Stamm MC144-C1. Daher kann dieser Stamm der gleichen Spezies zugeschrieben werden wie der Stamm MC144-01.

Eigenschaften von M0210-A1: .'

Dieser Stamm wurde von einer Bödenprobe isoliert, die bei Toyonaka, Osaka, im Oktober 1968 gesammelt worden ist. Dieser ] Stamm erhielt die Iiabornummer MG21O-A1. Er wurde in Kogyo "J Gijutsuin Hakko'Kenkyujyo am 21.Mai 1969 unter der Nummer 313 hinterlegt. Dieser Stamm wurde ferner in der "American Type Culture Collection" hinterlegt, und zwar unter der Nummer 21468. Unter dem Mikroskop, sieht man, dass die Substratmyzeln gut ver- j zweigt sind und sich zu einem typischen Luftmyzel erstrecken, das eine Schlangenform aufweist. Ausserdem werden Spiralen ge-

009885/2240

"bildet. Die Bildung von Wirtein wird nicht beobachtet. Die Oberfläche der Sporen ist glatt*

iDie Eigenschaften auf verschiedenen Medien Bind wie folgt:

1) Auf einem Gyl2erin-0zapek-Agarmedium (gezüchtet bsi 27°C): Der Wuchs ist farblos. Das Luftmyzel ist dünn und weiss, leicht grau oder grau. Kein lösliches 3?'\gment,

2) Auf einem Krainsky-Glueoseasparaginagar (gezüchtet bei 27°0): Der Wuchs ist farblos bis hellgelb. Das Luftmyzel ist gräulich-weiss bis leicht grau. Es wird ein Leicht gelbgefärbtes lösliches Pigment gebildet» ''*'

3) Auf einem Cacliummalatagar (gezüchtet bei 27⁰C): Per Wuchs ist farblos. Das Luftmyzel ist weiss, leicht bräunlich-grau •bis grau. Kein lösliches Pigment. Es wird.keine transparente ] Zone um die Wuchsstelle herum beobachtet.

4) In Peptonwasser, das 1,0 $■natriumnitrat enthält (gezüchtet bei 27°G): Der Wuchs ist Xarb^/os„ Das Luftmyzel ist weiss.

Kein lösliches Pigment. Es wird etwas Nitrit gebildet.

5) Auf Kartoffelscheiben (gezüchtet bei 27°G): Der'Wuchs ist hell gelblich-braun bis dunkeIgeIb [Mustard, 21ej. Es treten J reichlich Luftmyzeln auf, die weiss, gräulich-weiss bis · leicht' grau sind. Es wird ein hell gelblich-braunes lösliches Pigment gebildet. ; -=■_·-·"<

6) Auf einer Stärkeplatte (gezüchtet bei 27°0): Der Wuchs ist hellgelb bis gelb. Das Luftmyzel ist weiss bis bräunlich-weiss bis leicht bräunlich-grau. Es wird ein hellgelbes bis gelbes

0098.85/224©

lösliches Pigment gebildet. Die Hydrolyse von Stärke ist schwach.

7) 'Auf einem Peptonfleischextraktagar (gezüchtet bei 37°C): DerΛ/uchs ist farblos. Das luftmyzel ist weiss. Kein lösliches 'Pigment. '

8) Auf einem Peptonfleischextraktagar (gezüchtet bei 27°C): Der-V/uchs ist farblos. Es werden reichlich Luftmyzeln gebildet, die weiss sind. Kein lösliches Pigment.

9) Auf einem koagulierten Loeffler-Seruni (gez.üchtet bei 37⁰C): Der Wuchs ist farblos bis hellgelb. Das Luftmyzel'ist gelblich-weiss. Kein lösliches Pigment, keine Verflüssigung.

10) In einer Gelatinekultur (gezüchtet bei 20⁰C): Der V/uchs ] ist farblos, hellgelb bis hell gelblich-braun. Das Luftmyzel ist weiss. Es wird ein bräunliches lösliches Pigment gebildet. Nach einem ungefähr 20-tägigen Züchten wird eine sehr schwache Verflüssigung festgestellt. .

11) In Milch (gezüchtet bei 37°C): Der Wuchs ist farblosi Kein ;j Luftmyzel. Kein lösliches Pigment. Die Milch wird geronnen und peptonisiert, wobei ;jedoch die Gerinnung und die Peptonisierung relativ schwach sind.

12) Atf einem Tyrosinagar (gezüchtet bei 27°C): Der Wuchs ist farblos. Das Luftmyzel ist weiss, gräulich-weiss bis leicht grau. Kein lösliches Pigment. Die Tyrosinase ist negativ.

13) Auf Zellulose (gezüchtet bei 27°C): Der V/uchs ist gering und es wird keine Zersetzung beobachtet.

Es wird die Verwendung von Kohlehydraten auf den Pridham-

009885/2240'

Gottlieb-Medium getestet, wobei folgende Ergebnisse erhalten werden; Glyzerin, Xylose, Glukose, Fruktose_s Mannose, Galakto-Be, Inosit, Mannit, Sorbit, Kaitose, Rohrzucker, Raffinooe, Dextrin und Stärke werden verbraucht, wobei ein guter Wuchs , ■erzielt wird. laktoße und Salicin werden nicht verbraucht, da der Wuchs sehr gering let. Khanmos®, Asabinos®, Bulcit und Inolin werden nicht "Verbraucht. U.i© Sigenseiiaf ten des Stamms ] MO.21O-A1, welcher vorstehend beschrieben worden ist, lassen eich'wie folgt zusammenfassen; Er gehört zu einem nicht-chromogenen lyp von Streptomyces. Es werden Spiralen, jedoch ] keine Wirtein gebildet. Die Oberfläche der Sporen ist glatt. Der Wuchs ist farblos, hellgelb oder gelb auf-^rersöhiedenen Medien. Auf verschiedenen Medien ist das Luftmysel weiss J bis leicht grau. Es wird im allgemeinen kein lösliches Pigment erhalten, es tritt höchstens ein gelblich bis bräunliches _# Pigment in geringer Menge auf. Der Stamm besitzt eine schwache ' proteolytißche Aktivität und hydrolytische Aktivität auf Stärke. Von den bekannten Spezies von Schimmelpilzen ähnelt ] Streptomyces argenteolus (beschrieben von Fried", "Perman, Lariglykke unu Titus in "International Journal of Systematic j Bacteriology" 18, 295, 1968 sowie in dem Buch "Actinomycetes" von S.A.Waksman, Band 2, Seite 175 am meisten diesem Stamm. Der Stamm MC21O-A1 ähnelt S. argenteolus, mit Ausnahme des Verbrauchs von Kohlehydraten und der Verflüssigung von Gelatine. Daher wird der Stamm MC21O-A1 als eine Variante dieser Spezies eingestuft, d.h. von Streptomyces argenteolus var. toyonakensis.

Streptomyces testaceus und Streptomycee argenteolus var. toyonakensis -umfassen alle Mutanten und Varianten, d.h„ alle Pepstatin-erzeugenden Mutanten und Varianten. Man kann keinen j Unterschied zwischen diesen Spezies einschliesslich ihrer Mutanten und Varianten und der Definition von Streptomyces testaceus und S₁ argenteolus var. toyonakensis machen. Darüber

009885/2240

hinaus Ist Pepstatin ein Inhibitor einer Protease und vermag die Aktivität der. Protease in Schimmelpilzen zu steuern. Man nimmt daher, an,"dass Pepstatin in breitem· Umfange durch j Schimmelpilzeerzeugt wird. Erfindungsgemäss konnte Pepstatin auch.von anderen Stämmen isoliert werden, d£e zu anderen Spezies gehören. Beispielsweise wurde festgestellt, dass ein anderer Stamm, und zwar der Stamm MC284-G1, der von einer Bodenprobe isoliert worden ist, welche bei Shinhoriuchi, Sajiftama Prefecture gesammelt worden ist, ebenfalls Pepstatin erzeugt. Dieser Stamm erzeugt ebenfalls Mitomycine und wurde versuchsweise als Streptomyces caespitosus klassifiziert.

Erfindungsgemäss werden daher nicht die Namen der vorstehend angegebenen Spezies verwendet, sondern der Begriff "Pepstatin- j erzeugende Streptomyces¹¹ eingesetzt.

Verfahren zum besten der Aktivität von Pepstatin im Hinblick auf die Inhibierung von Pepsin:

Die von Kunitzis in "J. GeneralPhysiology», 30, 291, 1947, beschriebene Methode wird modifiziert, wobei Pepsin (in den ] Handel gebracht von der Sigma Chemical Co., St. IiOuis,'¹.. Missouri, USA)· und Kasein (in den Handel gebracht" von Vako Junyaku, Osaka, Japan) verwendet werden. Kasein wird in einem· 0,08m-Milchsäurepuffer (pH 2,2) in einer Menge von 0,6 j> auf- / gelöst, worauf_1 ml dieser Kaseinlösung 0,7 ml eines 0;02n HCl-0,02m KCl-Puffers (pH'2,0) und 0,2 ml dieser Pufferlösung mit 1 und ohne Testprobe zugesetzt werden. Dann'wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 3 Minuten inkubiert. Anschliessend werden 0,1 ml, enthaltend 4 ug Pepsin in 0,02n HCl-O,02m KGl-Puffer (pH 2,0) zugesetzt, worauf vermischt und bei 37°0 während einer Zeitspanne von 30 Minuten inkubiert wird. Dann werden 2,0 ml Perchlorsäure (i,7m) zum Abstoppen der Reaktion zugesetzt.

009885/2240

Nach 1 Stunde wird zentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit auf ihre optische Dichte (a) bei 280 mu untersucht wird. Die pLeaktioBsmischung ohne 3?ep9 tatin wird in ähnlicher Weise behandelt. Aus dieser optischen Dichte wird der Prozentsatz derluhibieruiig (b-a)/b χ 100 berechnet, ' Die Pepstatinmenge in einem Testmaterial wird aus dem Prossentsatz der Inhibierung und einer Standardkurve für die konzentration von Pepstatin waä dem Prozentsatz der Inhibierung erhalten. Pepstatin zeigt eine 50 $ige Inhibie-rung» .· wenn es in einer Menge von 0,02 ug der Reaktionsraischung,zugesetzt wir-d. "·-..■

Pepstatin-araeugende Streptomyces lisfem unter geeigneten Bedingungen Pepstatin. Die Herstellung erfolgt in der Weise, dass Sporen oder Myzein des Pepstatin-erzeugenden Organismus auf ein geeignetes Medium auf geimpft werden, v/orauf unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird. Zur Erzeugung von Pepstatin ist ein Züchten auf einem festen Medium möglich, zur Erzeugung grösserer Mengen wird jedoch ein Züchten in einem flüssigen Medium bevorzugt;--Jede Gärungstemperatur kann innerhalb des Bereiches eingehalten werden, in welchem die Pepstatin-erzeugenden Organismen wachsen und Pepstatin erzeugen können, wobei jedoch 25 - 35⁰C bevorzugt werden. Medien, die aus bekannten Hährquellen für Schimmelpilze bestehen, eignen sich zur Herstellung von Pepstatin. Beispielsweise seien Peton, Fleischextrakt, Hefesxtrakt, Maisflüssigkeit, Baumwollsamenmehl, Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, N-Z-Amin, Kasein, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat sowie andere stickstoffhaltige Materialien, wie beispielsweise Weizenkleie, Reiskleie oder dergleichen, als geeignete Stickstoffquellen erwähnt. Die im Handel erhältr iichen Produkte, wie beispielsweise Laktose, Glyzerin,

009885/2 24 0

Rohrzucker, Stärke, Glukose» Maltose, Melassen sowie andere Kohlehydrate oder Fette in reiner oder roher Form eignen sich als Kohlenstoff quellen. Glyzerin, Glukose/Maltose» Dextrin und Stärke' aind Beispiele für "billige und geeignete Kohlens to ff quellen zur Erzeugung von Pepstatin,, natriumchlorid, JTatrium- oder Kallumphosphat, Calciumcarbonat oder Kagnesiumionen können ebenfalls zugesetzt werden. Spuren von Metallsalzen können gegebenenfalls zugesetzt werden. Alle Arten von Bestandteilen, die von J?epstatin-erzeugenden Organismen zur Erzeugung von Pepstatin verbraucht werden können, sind geeignet. Alle Materialien, die sich zum Züchten von Schimmelpilzen als geeignet erwiesen haben, «lassen 3ich verwenden.

Die Gärung wird solange fortgesetzt, bis sich eine merkliche Menge an Pepstatin angereichert hat. Beispielsweise wird der Stamm MC144-C1 auf verschiedene Medien aufgeimpft, die verschiedene Kohlenstoffquellen, verschiedene Stickstoffquellen, 3 % KaCl, 0,1 $ HgSO4.7HjO₁ 0,1 )6 K2HPO4 Md 0,1 al/ 1OO ml einer Metallösung enthalten, worauf bei 27 - 29⁰C auf einer sich hin- und herbewegenden Maschine gezüchtet wird (SchwiDgungsbreite 8 cm, 200 Hin- und Herbewegungen pro Minute), Me Metallösung besteht aus 700 ng CuSO 4.5H₂O, 100 mg FeSO4.711^), 800 mg HnCl₂^H₂O und 200 mg ZnSO 4.7H₂Q-in 100 ml destilliertem Wasser. Schüttelkolben mit einem Volumen von 500 ml werden verwendet, wobei jeweils 100 ml eines jeden Mediums in den Kolben eingebracht werden. Jeden !Dag werden aus der Schüttelkultur 0,05 ml eines 100-fach verdünnten Brühefiltrats auf ihre Antipepsinaktivität getestet. Me Ergebnisse sind in der Tabelle I zusammengefasst. Me Pepstatin-Erzeugung wird bereits nach 2-tägigem Züchten unter Schütteln ersichtlich. Me maximale Ausbeute ■ wird nach 4 - 7-tägigem Züchten festgestellt. Dex pH beträgt bei der maximalen Erzeugung ungefähr 9,0. Sogar dann, venn

009885/2240

ein pH vo|i 9_gO während des fStieMia® imier geliutielM während einer Zeitspanne iroa 10 Sagen ©lafeeo&t erhalten wird, wird keine Abrahme des pepstatias "beoteG&tfir^ woraus äessea Stabilität hervorgeht. Wie aus tes? fabell© S erslclitiäeJa ist₉ köuaen verschiedene Koblenstoffguellea «SS stiekstof^oÄtlge Platerialien sur Herstellfffig von

tabelle I

Erzeugung yon Pepstatin in verschiedenes'Medien

Zeitspanne. (Sage) des Züchtens und Inhibierang (in fo) von Pepsin durch O_SO5 ml eines 100-fach verdünnten Ixü.tur£iltrats

Medium-	1 .	pH	3	9,9	3	PH	4	<>*	5	pH	86
Hr.	ο ■ ■ 2	7,4		50	6,8	24,1	7,8	70
€0 ^! 3	6,9	56	• 7,9	84	.. 8,1	62
	;.6.,2	47	8,0	71	8,4	-
	5,3	36	5,3	■64'	5,4	—
ro ' 6	7,8	• 57 .	■e,5	39	8,8	—
£ 7	7,9	18, ·"·	8,0	32	8,6	—
° 8	7,6	' 8,2 '	*Ί,Ί'*	29	7,9	85
.9	7,3	. 82	B₁Z	9,4	8,5	83
10	5,7	84	7,7	. 92	S3 ■	80
11	7,2	40	8,4. ·	81	8,7	-
12	.6,3	35	6,3	69	6,5	83
" 13	" 5,3	81	5,4	43	5,4	85
14	6,7	83	8,0	83	8,5	77
15	7,6	52	8,2	84	8,4	C=S
16	6,3	31	5,5	76	6,4
	5,5	5,4	31	§„8

6	pH'	f	pH	7	85
8,5	14,0	8,8		67
8,4	88	.8,7		72
8,5	75	8,7
5,4	55	7,2	-
8,9'	48	9,0	-
8,7	37	8,8	-
8,2	22	. 8,6	88
8,3	.13	' 7,6	.82
8,2	87	8,7	82
8,4	87	8,3
7,0	83	8,3	85
5v4	42	5,9	68
8,4	86	8,8	81
8,2	88	8,3
7,8	82	. 8,3

6,3 48 7,1 - <»'

Kohlenstoff» rad Stick® totfGmttpis ame Iisfiiea

Nr. 1s 2 % Glyzeria, O₉75 $ !!©Iseliestimistp ®₀75 # Peptonj Nr. 2s £ fS Slyaeris, I₂O $ l^g~Äsiis2_a Q₀ 2 $ He£©extrakt£ Nr. 3s 2 % ölyzssdssj, 1,5 $ Soga1)Qimea®3iLl§ Ηεό 4s 2 fS Glyzerin,, 1,-5 $ Maisflüssigkeit j Nr,. 5 s 2 fS Mhtom©_s p„75 ^ Fleischextrakt, 0,75 # P-dsptoni Nr. 6s '2 f> 1-SMoS-Q₁, l/® jS N-Z-Ämin, 0,2 # Hefeextrakti Ir. ?g 2 $ ialst©SQ₅ 1_σ5 fS Sojafeolmenmehlj Nr, 8: 2~$ Iaktose₉ 1,5 f5 Efeisflüssigk®it§' Mr₀ 91 1 ^ Glukose, 1 $ Laktose, O₈75 f Flsiscsbestsaktp O₃75 fS ϊ^ρΐοΐι^ Hr₀ 10s 1 j6 Glukose 5 1 fi Isktöiseg 1 $ ^g-UsIa₅ O₀ 2 ^ Hefeextrakt5 Nr. 11s 1 $ SIuIiOSe₉ 1 ?S S@,ktc«s®₉ ί_ΰ5 fo Söjs'fotoienmehl^ Hr₀ 12s

1 9t Glukose, 1 # Iaktoee₉ t„5 0 &3sis£!üssigkeitg Ir₀ 15s

2 *C Glukose, 1,0 fS N-Z-imia_e 0_ff2 |S Hsfsextrakt^Tr. 14 s 2 ji Glukose, 1,0 $ N-Z-Amin, O₀ 2 fS Hef©©3StE@,Ist^ ife_o 15 s 2-Ji Glukose,, 1,5 $ Sojafeotoaesisaiilg iSc_o H6g 2 |S Glukose, 1,5 $>

.Maisflüssigkeit_o

Zur Herstellung toö Pepstatin ä'areli ß-äruiig- kann man auf die üblichen Metlieclea smrlicl£grelf©ri_s die %>vx Hersislluag tüd Antibiotika verwendet i»/©Ed©J3_o Bsl-spi@lsifeis8 können 100 1 eines Mediums in eine rostfe®!© Säieiingseinrichtung mit eiriem Fassungsvermögen von 200 1 ©iageteaelat.Tmd sterilisiert werden» worauf der PepstatiK-erseixgeB^e Osgasisraiis aufgeimpft wird, Das Garens wird daaa mutes feimte yoss 100 1 steriler Luft pro Minute durehgefütet» laeli 45 -=· 60 Stunden erreicht die Erzeugung an Pepsstetin

sgeaiäsa ^erüeia £Q-Jsnex- Meilmüem zur Isolierung und Reinigung τοη Pepstetia^ seiasB Ssls©ai soifie seiaeii Estern zur Verfügung gestallt» " -

PtpatetSn ist bei einem pH von 2*0 - '9,0 stabil; wenn die .

Äsiiiflit bei diese» verschiedenta pH-Werten mif 6¹O¹¹¹G während. ^! •l&ar Sftltspann* .von 30 MixmtM f äiitst wtrlti. Pepstatin '

Äirtei keinerlei Ätlfi'ttf» ...

Pepstatin» das ' in Wasser nur neig löslich let» liegt nicht nur -in' de* Eultuxbrtthe» sondern euch, in der lyjsölisasse vor.. Ist die fiSruagsausbeute- nioltt gwei, dann liegt das aeiste Pepstatin la'dem flüssige» feil vor· let die Ausbeute jedoch-'-hoch, äana findet man eine grosse Menge eingeschlossen in der ■Myzelmasee, Pepstatlo in äer MjBeiaiBBae.Tflrä alt LSsungsmittein "J extrahiert» In welches pepstatin IQallch let.^Beispielswelse erfolgt €i# Extraktion mit MethaaoX· Pepstatin¹ weist Carboxylgruppen elf und bildet Salaej, feftlSplAlswoise Salze von Ia⁺, fe⁺, SH₊ ⁺, M⁺, Gm⁴"*, Ig^H*> Cu¹^t In*¹"¹*» lo""*» Mn⁺"¹* oder·. . ■ dergleichen« Ätrinii- oder fattnaaaßlac von Pepstatin "besitzen ■■ ähnliche Xusllchkeiten wie Pepstatin »wobei jcdocii die Salze '; von Caleimii} Kagnesium und Schvermetallen in Wasser.-■ und Methanol veniger löslich sind. DahtilT ist es zweclcnäasig^ Pepstatin aus der Myae:masse in tie Lösungsmittel in sauren Sustand zu ■ extrahieren» Pepetatin ist la Htthanol, das Calciumchlorid ent-hält, löslicher. ■ Datier besteht eine geeignete Methode aiir . ■Extraktion von Pepstatin'ame einer Kyzelmasse darin»' die Extraktion unter Verwendung eines sauren Methanols dttrcliae,-fUhren, .das OaCl₂ enthält. Pepstatin in dem'flüssigen leil wird mit mit Wasser nicht misclilbaren I»8sungsmitteln extrahiert» in \ welchen Pepstatin löslicher ist ale in Wasser« Beispielsweise erfolgt-die Extraktion mit Bataiiel» Die' Siadampfimg einer ' Pepstatin-Lösung liefert ein roli.es Pulver," das. Peps tatin'-oder ," Peps tatin-Kristallei enthält. Ist die Gäruagsausbeute hoch,, äann .] liefert die Uiadampfung ies Butanolextrakts aus öer 'Kulturbrühe Pepstatin-Kristalle,

008885/224

BAD ORJOiNAL.

j ' κ ^(VJ /«/.A¹ V

IJI	«J*	fit! *	U/V
aiii	K ft"	"ti °
0 ,,	I	J γ) ι

«. "°?.> w> 1""^c ifev j, too c^lui»?« ! ·) ~ / j ι \ tie "2ο ι r 3« ι ^Γ ι ^rao?

I»J τι I I % jig	t r	»1	..Γ
β titi	ΙΓ_Λ
not ι
< t
Hit ί
)* "ϋ f<
β ι U ι
Wf t ·Ί9

12,

,1 υ

υ,

»If»«)

ltH3f3il!

rbca. AictÄv

werten.

2,0 ^ Eug

οα

©lae >ιπ*

¹ α ο

fvilir SO $ feQtrl raer; nacfe €i;iaer AclSia

J lc¹

«ΙΙ Ε®!«=

Ι ©ä@s> wäi

mw ίeXg®, fift

i^Eal t..it *>ώ

üg ?e>n fspsts^ija«.

ist tef£j gilt 40

Imsa

BAD ORlOJNM.

»σ! (Hettenol 4OtHgO 60) atns Pepstatin-'ÖteoiifttosieaiAie mtta$ Vevüeadung τοϊϊ 80 ^igsis wäeeriges fletteaol (methanol 8OsHgO 20) durchführen» Me Verwendung iron Aktivkohle '-eignet slob fen» «he? Entfernung, von gaffirbtöii Verunreinigungen, Me SieseAeel-» (Sivoma.tograpKiie iat ebenfalls aur Heialguag iron !Pepstatin . geeignet„ Beispielsweie® eignet eieh eine Hleoteag eue a-Bat·.-nol» Essigsäure, Waseier und Batylacetat (4i1:U4t teaogea auf das VoluiiG») oder, eine Bieoimag.aw itlnylaeefat niä ÄetliaaÄ■'. C3itj tmzQgm auf äae Voliimsa) als üösumgamittelByeteB jsäp ReiJiigung von Pepstatin mittels Meeelgel-OtaOuatoipsipliie«, Sine Aliimi&irao^d^öhromtogmpliie 2εα»η elbesafalle stur B»liil- » heresigezo^mn werden» £@iepieleweis@ wis&.eine dexfi3?tige Emtographie unter Yermndmig το» Hettoaol, ltlias©l_$ Bata- oder einer Hisclmng aus diesen Alkoholen iiit Esteaai.

Pepstatin weist eine Carboxylgruppe auf. Als folge Säuregruppe werden starke oder aclrwaoli tesisclt© Ionenaus-tausclierlaarss ssur Extraktion uad Reinigmsg von Pepstatin verwendet.

Pepstatin läset sich.selbst in sehr einfacher Weise kristallisieren. 'Ein üi5i3-t?J2gS2nitt.el, in -vrolcfesa Pepstatin löslioia ist, eignet sich sur Evis-'callisation. "Ώίη Beispiel Iat MatliS

Die Carboxy lgnippe des Peps tat.-jib lfisst olofe in- si Weise in eiaea Ester uniwandeln, tuad'Hifar durch /»iinbalimig lib« lichar KetJiodan'zur Herstelluas'von Ssto^a, 'beispiaisweise duroh Erliitssan mit dem öntaprseliencloa Allcokol nach der Säureöder DiasoffistbÄii-i-IethodQ. Bstar sind ebsnfalle zwe £oMbieriiQg Ton Pepsin geeignet. lter Methylester ist aktiver ala das Bapstatin.

001111/2140

ORIGINAL fNSPEC5TE£>

- zz -

Ist die Ausbeute an Pepstatin 1» äem IStefflgiaeäiiM werden JPapa tatin-Iris talXa a&Q& .timer iÄfgiliea iettoie er« ^:fcaXt#n· Beispielsweise erfolgt ©iae Sxtsndc&OJi von- Sepstati« mit Butaiaol vad eine !«»etratioü φββ Qutaxiolextralctes waten Talouui, wotoei kristattluee pep8"totl3S-arh£atea" wird, ' das m» Methanol umkristsllielerv ¥irä_e Αϊ©1 werde» veisse

Kaclifolgeiid werden die EigeaiclSÄiten voa Sögöfetin "besclirie-"ben, Pepö'latiB locistallisiert JUi foum welseer uadelartiger Kristalle aus, 3)as am 'meisten gepeinigte Se^statiu schmilzt bei 22S « 229«0, Eb ist optiscti aktiT./Sear^fprt, M^^{7 1}^⁶"* trägt in einer 0,288 ^igeu Metteaollöswiig *90°. Die Elementaranalyse liefert folgende Ergebnisse; Berechnet für °34.^H63?W ° ⁵⁹»^{55y K 9}*²⁵» ^S 10*21, 0 20,99. Gefunden: C '59,02, 60,27, H 9,2?, 9,37» H 10,11, 9,90, 0 21,41, 21,15 Auf der Basis der Analyseergfttasisse können die 3?ormeln C3-Hgc%0₁₀; (die bereclmetea Werte sind wie folgt: G 58,72, H 9,15, IT 9,78, O 22,35) unß. C₃₅H₆₅ITt₃O₉ (die "berechneten Werte Bind wie folgts G 60,06,, H 9^36, N 10,01, 0 20,57) nicht ausgeschlossen werden. Jedoch wird die Formel ^34**63^5⁰9 ^{durcil äas} Kassenspektrum "bestätigt. Der Hauptpeak des Methylesters von Diacety!pepstatin liegt bei 783 und derjenige des Methylesters von Pepstatin bei 699. Die Bestimmung des !iolelm.largewioh.ts nach der A'kiya-Berger-Methode unter Yerv/eiidiing einer Pyridinlösung von Pepstatin ergibt ein" Mülekiiiargewieht von 600 - 730.

Das Infrarotspektrum wird in figur 1 gezeigt. Bei den nachstehend angegebenen Wellenzahlen werden Banden beobachtetι 3320, 3090, 2955, 1710, 1635, 1545, 1470, 1450, 1420, 1390, 1370, 1300, 1220, 1178, 1070 und 710 cm"¹. Das Infrarot spektrum des MethyXesters von Pepstatin wird in Pigur 2 gezeigt. Das HMH-Spektrum des Methylesters von Diacetyl-

00888572240 - badoriqinal

■ - 25 - ■ ■ .■;.■'.'

pepstatin wiri unter Verwendung der Varian ΠΔ.-109-VorrIch in Sletxadeuteromethanol unter Verwend'dng von Txlae thy !«Jilt „ als. interner Standard aufgenommen. Es wjutl Jmrcli Γα,η,ϊΐΓ '^f wiedergegeben. - . . / ' ^;

Die Hydrolyse von Pepstatin in fin HCl bei IGO⁰C walirend ei: Zeitspa'nne iron 18 Stunden liefert i-41ai;iii und L-YaIIn, und '«war» wie eine Amixiosäureanalyae ergibt, In eitlen

von 1i2. Pepstatin liefert* eine positive ii;,^Puo::»-

Diese Ergebnisse sowie die Banden in dem Infrare« ^S

"bei 1635 und 1545 ca*"¹¹ weisen auf Peptidbin^aiigen :1k 3?©^.rutin

■■if* hin. - ..-;.....

Die Bande in dem .Infrarotepektrum bei 171Cl m r.-.»fit Torliegen einer Carboxylgruppe in Pcpctafja. .fllts^ dart^, "J .gruppe gilbt eich ferner durch c xnc Adsorption -'"2H ainuc .Bio nenaustauscherharz zu nrköimen. Bit. Bchonc¹ 11 jijl vaa Pepstatin .mit Diazomethan'oder ein Erhitzen alt Seliwefelsäura und einem Alkohol liefert ien entsprechenden Ssterl 2er l-Iethylester ψοέι Pepstatin zei^t eine Esterbr.j;de bei 1730 cm anstelle der Bande you 1710 cm" . Die Elementaranaly.se des He thy !esters liefert folgende Wertes"Berechnet für G₅₅HgEHcOg: G 6O_sC5_f H 9,36, H 10,00, 0 20,57. Gefunden:' 0 59_tö8, H 9,35» I 9»74, 0 20,69. "* . ■ ■ . ■-

Pepstatin,. das-eine Carboxylgruppe aufweist, bildet. Salze« Die Salze lassen sich in einfacher Weise-durch Neutralisation oder durch Zugabe einer berechneten Kenge einer Base zu. der Hethanollösiang des Pepstatins herstellen. .Beispielsweise können folgende Yerbindtmgen hergestellt werden: Natriumpepstatln (5. 250 - 252⁰C₉ Zersetzung,, berechnet für C₃₄H₆₂H₅O₉MaS C 57,58/ H 8,82, N 9,89,-0 20,34, Ha 3,24»

009885/2240 ORtGINAL INSPECTED

Gefundene 57,97_f H 8,92, N 9,96, O 20,26, Na 2,98), Magnesiumpepstatin (P. 262 - 263⁰G, Zersetzung, berechnet fürr C₃₄H₆₂N₅O₉i/2Mg: G 58,58, H 8,06, N 10,04, 0 20,65, Mg 1j,fr4. Gefunden: C 58,30, H 9,05, N 9,94, O 20,84, Mg 1,49).iund CaIciumpepstatin (F. 262 - 263°C, Zersetzung, berechnet für; C₃₄H₆₂N₅O₉1/2Ca: C 57,93, H 8,86, N 9,93, 0 20,42, Ca 2,84. ,Gefunden; C 57,92, H 8,98, N 9,62, 0 20,07, Ca 2,62) .']Calciumpepstatin ist weniger löslich in Wasser und Methanol als Pepstatin, während Pepstatin in Methanol mit CaCl₂ löslicher ist als ohne .CaCl₂. Pepstatin, das eine Carboxylgruppe aufweist, ' liefert ferner ein Amid. Beispielsweise ergibt, die Behandlung , des Methylesters von Pepstatin in Methanol daö^eps'tatinamid.

Eine Behandlung von Pepstatin mit Essigsäureanhydrid in Pyridin liefert Diacetyl- und Monoacetyl-Pepstatin. Diese Verbindungen werden durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Kieselgel und Methanol/Aceton/Chloroform (5:25:7Qj, bezogen auf das Volumen) abgetrennt. ~* .

Bei der Dünnochichtchromatographie unte::· Verwendung von Kieselgel G werden die folgenden Rf-Werte für Pepstatin in den folgenden Lösungsmitteln festgestellt: 0,78 für Butylacetat/ Butanol/Essigsäure/Wasser (6:6:1:1, bezogen auf das Volumen), 0,73 für Butylacetat/Butanol/Essigsäure/Wasser (6:4:1:1), ■0,76 fUr Butylacetat/Butanol/Essigsäure/Wasser (4:4:1:11 bezogen auf das Volumen).

. Bei einer Hochspannungselektrophorese unter Verwendung eines sauren Lösungsmittels, wie beispielsweise einer Mischung aus Ameisensäure, Essigsäure und Wasser (25:75:900,- bezogen auf das Volumen) unter einer Spannung von 3500 Volt während einer Zeitspanne von 15 Minuten bewegt sich Pepstatin nicht, woraus

009885/2240

Hervorgeht, dass keine basische Gruppe in Pepstatin vorliegen* kann.

Die folgende Struktur wird für Pepstatin anhand von Atibauuntersuchungen, des NMR-Spektrums sowie der Massemsipektrometrie von Pepstatin und seinen Derivaten vorgeschlagen:

CH₃ OH₃ CH, CH₃

"CH CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ ^NCH^/

CH₀ CH CH CH₉OH CH, CO-HH-CH-CO-NH-CH-CO-HH-CH-CH-CHp-CO-MH-CH-

(D

CH_x CH

GH ' χ

CH₀OH

C 0-1TH-CH-CH-CH₂-C 0OH

Pepstatin "besitzt eine geringe !Doxizität. Mäuse, Hunde, Ratten und Kaninchen vertragen eine orale Verabreichung von 2000 mg/kg des Pepstatins ohne irgendwelche toxische Anze.ichen. Die 3JDc₀ g^eg^enüber !Dieren "bei intraperitonealer Verabreichung ist etwa wie folgt: Mäuse: 1000 mg/kg, Hatten: 880 mg/kg, Kaninchen 820 mg/kg, Hunde 450 mg/kg. Eine tägliche orale Verabreichung von 250 mg/kg an Ratten während einer Zeitspanne von 90 Tagen hat keinerlei"loxizitätserscheinungen zur Folge. Die Ratten wachsen mit ihrer normalen Wachstumsgeschwindigkeit. , - · .

009885/2240

Oral verabreichtes Pepstatin wird nicht Absorbiert. Werden beispieleweise oral 50 mg/kg verabreicht» dann findet man kein Pepstatin im Blut und im Urin 24 Standen nach der Verabreichung. Ungefähr 90 % laasen sich in den Exkrementen nachweisen, die 72 Stunden c&ch der Verabreichung ausgeschieden werden. ·

Die Ester, das Amid sowie di« AcetyIderivate von Pepstatin zeigen eine 50 #ige Inhibierung von Pepsin nach der vorstehend beschriebenen Methode bei den folgenden Konzentrationen: Pepstation 0,01 jig/mlj der Methylester 0,008 der A'thylester 0,01 jig/mlj der p-Bromphenacyiester 0,01 das Amid 0,027 ug/ml; das MonoacetyIderivat 1,1 ug/ml; das Diacetylderivat 4_f2 ug/ml; der Methylester des Diacetyl- . derivate 4»26 yg/ml. Jedoch 86igt Pepstatin keine Inhibierung gegenüber Thrombokinase, Plasmin, Trypsin, Kallikrein, i a-Chymotrypsin und Papain, und zwar auch nicht in einer Menge von 250 jig/ml» Daher ist Pepetatin ejn starker speisifischer Pepsininhibitor, Proctase.ist eine Art von Pepsin, die aus Aspergillus niger erhalten wird (vergleiche Agricultural Biological Chemistry (Japan), Band 28, Seiten 216-223, 1964). In der Rsaktionsmischung, wie sie vorstehend beschrieben wor den ist, mit der Ausnahme, dass die gleiche Menge Proctase anstelle des Pepsins eingesetzt wird, sind die Konzentrationen für eine 50 #ige Inhibierung wie folgt ι 0,02 ug/ml gegen eine .Easeinhydrolyse. ' .

Ein starker Pepsininhitotor war bisher noch nicht bekannt. Wenn auch Schwefelsäureester von Polysacchariden dafür be-.kannt waren, dass sie Pepsin inhibieren, so ist die Wirkung dennoch sehr schwach, wobei ausserdem ferner eine Blutkoagulierung inhibiert wird. Pepstatin ist ein starker Pepsin-

009885/22AG

inhibitor, wie aus der 50 #igen Inhibierung hervoi|gjeht. Ausserdem übt es keinen Einfluss auf die Blutkoagulierung aus. Die starke Inhibierende Wirkung gegenüber Pepsin zeigt, dass Pepstatin gegenüber Magengeschwüren wirksam ist. Dies wurde auch durch klinische Untersuchungen bestätigt. "[

Ein Magengeschwür von Rattea, Aaa nach der Methode erzeugt worden ist, wie sie von Takagi et al in "Japanese Journal of Pharmacology", 18, 9 - 18, 1968, beschrieben wird, d.h. durch Einbringen männlicher Ratten in einen Käfig bei einer Temperatur von 23°l während einer Zeitspanne von. 22 Stunden, kann therapeutis ih durch Pepstatin behandeltvwerde'n. 50 mg/kg des PepstatiUs v/erden oral 30 JUmitoa vor dem Stress verabreicht. Die Eatten werden 48 Sttmäcn nach dem Stress geschlachtet. Das Heilungsausmaß des Geschwürs beträgt 76,3 #* Beträgt die Dosis 10 mg/kg, dann wird das Heilungsausnaß des Geschwürs ssu 65>6 # ermittelt, flach der Verabreichung von 50 mg/kg Pepstatin unmittelbar nach dem Stress, wobei die Verabreichung einmal täglich "Während einer Zeitspanne von 4 Tagen erfolgt, werden die Batten geschlachtet. Dabei ist eine schnelle Heilung von Geschwüren bei der Behandlung mit Pepstatin zu erkennen.

Die Wirkung gegenüber Magengeschwüren von Hatten, welche durch eine Magenausgangsreizung verursacht wird, konnte ebenfalls sicher-geeteilt werden. Es vird die von Watanabe und Kasuya~in "Chemical Pharmaceutical Bulletin¹¹, 11., 1282.*' 1963, beschriebene Methode -angewendet. Bei Eatten, denen < 2 mg/kg oder grössere D>sen 30 Minuten und 14 Stunden nach einer Magenausgangsreizung verabreicht wurden, konnte kein Geschwür festgestellt werden.. Die 50 56-Inhibierungsdosis beträgt 0,5 mg/kg. Die.Pepsinaktivität im Magensaft liegt

009885/2240

etwa 10 $ unterhalb derjenigen einer Tergleichsprobe« Pepstatin besitzt daher eine gut schütaeade und heilende Wirkung gegenüber Shay-Eattengeschiiüresao Mae orale Terabreichung von pepstatin oder dessen Esttiea ma Patientes mit Magen= oder Suodenumgeecliwürexi, wobei 1 <=> 4 Tabletten zwischen den ι , Mahlzeiten,, die 25 - 100 ng Pepstatin' enthalten d_sh. 3 bis 4 x pro, Tag, verabreicht xferiexij, Eeigea eine heilende Wirkung, Nach der Verabreichung verschwlBden die Schmerzen schnell. ":

Pepstatin i&hlbiert aieht¹ Papain _si das ©ine SuIf hy dry !gruppe als aktive Stelle aufweist«, Jedoch zeigt Pepstatin eine in- ' hibierende Wirkung gegenüber Karrageenin-indycaierten Ödemen (O.A. Winter^ E₀I. Eisley and G.W. Husss Pr-oc.Soc.Exp.Biol. & Medeji 11I₉ 544, 1962). Pepstatin wird intraperitoneal injiziert, woratsf Karrageenin (0^1 ml "einer 1'^igen lösung) in die Eatteiiliinterpfoten eingespritzt werden ₀ Mach 1,, 3, 5 imd 24 Stunden wird das Ödem gemessen_o Man stellt fest, dass eine aeiir ale 50 ffege Ialii"bierimg bei Verwendung von nicht weniger -^Is 1,25 mg/kg Pegstatia eintritt„ . "

100 ml eines Mediums, das I₀O $ Glukose", 15,0 $ Stärke j, O₅ 75 $ Peptoiij, Oj75° ^ Fleischextrakt,, 0^3 % KaCl, O₅1 $ MgSO₄ .7HpO,. .! 0,1$ K₂^°4 ^{und eine} Ketallionenlösung (700 mg CuSO₄^EpO, 100 mg FeS0_A.7H₉0, 800 mg MnCl₉^H₉O und 200 mg Zn30„.7H₉0, gelöst in 100 ml destilliertem Wasser) enthält, werden verwendet. 0,1 ml -werden in einen Schüttelkolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml gegeben und bei 12O⁰C während einer Zeitspanne you 20 Minuten sterilisiert. Der pH wird auf 7₉O

009888/2240

- ■' ■ - \- ■ ■■■ ■■; ' .' ■ ■ ■ ■■■ ' ' 2028403 ■

nach der Sterilisierung eingestellt. Bann werden Sporen und Myzeln des. Stammes M0144-G1 auf einem Agarmediiua aufgeimpft_f worauf bei 2?°G auf einer Schttttelmaschine gezüchtet wird-.. - (130 Hin- und Herbewegungen pro Mitmte I)Qi einer Schwingungs--"breite von S cm). Der pH "beträgt am dritten lag des Züchtens 5y7 und am vierten Tag 6,3, Die Bestimmung der Reduktion von •Zucker nach der Juthronmethode ergibt eine optische Dichte von 0,9/0,005 ml am ersten !Dag, 0,3/0.005' ml am vierteil-,lag und praktisch Iceine'am fünften f ag·-Di« Kulturbrühe wird .am · fünften Tag filtriert, worauf ö»05 ml des.100-fach verdünnten Piltrats eine 64 $»ige Inhibiertosg Yoa Pepsin zeigen» .im fünften Tag wird die- Kulturbrühe von 29 SohUttelkQll>ei£,yereiitiet "and filtriert, hm Pepstatin in..,dem RLltrat wirdt mit· 240Q ml . und 2000 mln-Butanol nachei^aaderfolgeiid extrahiert, 3Die Butanolextrakte werden vereinigt md inter reduziertem Bnacfc· eingedampft» Dabei werden 4-g eines■braunen rohen Pulvers erhalten ».Die 50 SÄ-Inhibierüng von Pepsin gibt sich durch Zugabe von 0.13 y.g dieses_Pulvers su der.Iestlösmng zu erkennen«

Beispiel 2 . "

¹¹ " ^ll " s

Pepstatin wird aus einem Rohpulver'gereinigt, das nach einer ähnlichen Methode, wie sie in Beispiel 1 gezeigt wird,, hergestellt worden ist. Dieses Rohpulver zeigt eine 50 $ige Inhibierung von Pepsin bei einer.Zugabe von 0,16 ug zu der Testlösung. Das Pulver wird in einer Menge von 2,1 g in 5O"ml destilliertem Wasser, aufgelöst, worauf diese lösung durch eine Säule mit einer Länge von 72 cm aus 18g Aktivkohle mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/Minute geschickt wird, 400 ml eines destillierten Wassers und 300 ml eines 40 $igen vässrigen Methanols werden zum Waschen der Kolonne dureilgeschickt, worauf das Pepstatin aμf der. Kolonne mit 80 $igem wässrigen Methanol (Methanol 80:Wasser 20)-eluiert wird. ' '

0 0 9 8 8 5/2240

Das JSlmat wird in Iraktionen gesaimelig wobei gei®

5 g wiegt, Fraktionen, die Pepstatia ©nttelteü₀ weröeu vereinigt und unter einen Vakuiam ©ingedaapf t„ Bafeei erhält w&n O₉ 7 g eines weissen Pulvers, Bisses Balver geigt eine 50 folg® Xnhlbierung yob Peps is bei eiaejj aug©s©taten Menge tob

Oj 54 Bg au äer Testlösmigc |

Beispiel 3 .... "

4000 ml des" EuIturfil.trats ueri©B n&oh ä®i? gi©ielä©2S Methode, wie sie in Beispiel 1 Ibeaeinleben worden Ist₈ Jaes-ge-stellt. Man stellt ©ine 53 <jßige TntoLbiQtnn&jroii «Pepsin fest, wenn O₉ 05 hlL der 100-Xac& Terdilmitea löswig äen Bspssininliilbierungstest unterzogen'werden, 80 g ikt'ivkohl© werden angeisetzt, worauf, während eia@r ZeitspaBiie iron 20 Elnuten gerührt wird. Ansöhliessend ist alles Pepstatim Ib dem KuIturfiltrat adsorbiert. Ber Kohlenstoffs) welcher durch !Filtration aTbgetrennt wor.d@a ist₈ wird mit 2000 ial Wasser gewaschen, worauf das Pepstatin auf der KoKLe aufeinanderfolgend, mit 2000 ml' und 1500 ml Methanol tsei 40⁰C ©luiert wird. Die MethaBoleluate" werden vereinigt wiä. rarter ¥akuma eingedampft«, Dabei werden' 15 g eines taaraeB rolaea TuLybts erhalten. Me 50 ^ige iHiiiMerung tob Pepsia wird im der Weise festgestellt, dass 0,6 jag dieses Pulvers sn der Testlösung zugesetzt werden. Dieses Bil¥er wird in 1000 ml Wasser aufgelöst und dtoreti eine Säule geschickt,- die 100 g Aktivkohle (Durchmesser"3 'cm) enthält. Die Chromatographie ■ wird in ähnlicher Weise in Beispiel 2 durchgeführt:, wobei 1,5 g eines weissen Pulvers erlialtea werden» Die 50 #- Inhibierung von Pepsin wird diirch Zugabe von O₉ 06 mg dieses Pulvers zu der Testlösung gezeigt.

0098 8 5/2240

Beispiel 4

Die vollständige Reinigung wird ausgehend von O₈38 g eines Pulvers gestartet, das nach einer ähnlichen Methode, wie sie in Beispiel 3 gezeigt worden 'ist, .erhalten worden ist« Bei einer Zugabe von 0,06 $ig zu der Sestlösimg wird eiae 50 Stege Inhibierung festgestellt.;Die Substanz wird in 5_s0 ml einer Lösungsmittelmischung aufgelöst, die aus Butanol,- Essigsäure₉ Wasser und-Butylacetat (4:1:1:4t bezogen auf das Volumenverhaltnis) besteht«, Die Lösung wird durch eine Kieselgelsäule (90 jS Kieselgel» .Durchmesser 2,2 ca) geschickt. Biese Säule ist mit der gleichen Lösungsmittelmischung^gewaschen worden. Die. gleiche Lö3UBgsmittelmischung wird aaschiiessend durchgesch.ic&$> worauf das Eluat in Fraktionen von.-jeweils 5 g gesaamelt' wird» Pepstatin erscheint in den Fraktioaen 9-15. Bie Eindarapfimg dieser Fraktionen in vereinigter Form liefert 0,27 g eines weissen Pulvers. O„04 jag seigre» eine 50 sC-Inhibieruiig. Die ümkristallisierung dieses Pulvers aus Methanol liefert 0., 13 g· nadelartiger-Pepstatin-Kristalle. Die Zugatie tob O_fO2 fig der* Kristalle zu'der Testlösung ergibt eine"50'^-Inhibierung von Pepsin,

Ein nach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode hergestelltes weisses Pulver as igt eine 50 Ja-Inhibierung von Pepsin bei einer Zugabe von 0,06 ing au der Testlösung» 0,4 g des Pulvers werden in 5s.O ml einer Lösungsmittelmieahung (Ithylacetat/l'fetliaiiol, 3s 1) aufgelöst.' Es wird die in Beispiel'4 "beschriebene Silikagel-Chronatographienethode' angewendet, wobei jedoch als Lösungsmittelmischung Ithylacetat/ -Methanol- (3:1) verwendet wird» Das Eluat wird in jeweils 5 g wiegenden Fraktionen gesammelt., Bas Pepstatin, erscheint

009885/22

in den Fraktionell 10 - 20. BIe lißdampfufig d'er vereinigten Fraktionen liefert 0,29 g eines weissen Pulvers, das eine 50 #-Inhibierung durch Zugabe von O₉ 03 Jag ssu der Sestlösung zeigt. Me limkristallisation aus Methanol liefert 0,14 g " ' nadelavtlger ^epetatia-Eeiötalle-(S¹.'224 - 226 ⁰O). .]

Beispiel 6

• " ■ -

150 Idee. Meüimss, das gemägs Beispiel 1 beschrieben worden ißt, werden in eine Gärungsvorrichtung aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 200 1 gegeben und bei 115⁰O während einer Zeitspanne Ton 30 Hinutesi aierilisiert. 1 1 der unter Schftttela. gesiichteten Erlihe dee Stasm^*'MGi'44-01 wird aufgeimpfte Me Schlittelkultur wird nach der gleichen Methode wie in Beispiel 1 während einer Zeitspanne voii 72' Stunden hergestellt. Die öääinmg In des? (Jäi^gs einrichtung erfolgt* unter Rühre» "bei 200 UpIi₀ 200 1 ©xuot sterilisierten Iiuft/ Minute werden bei 24°0 während einer Zeitspanne von 72 Stunden eingeleitet. Inschliessend beträgt der pH 7»42.; 0,0j5 ml des 2i3Ü-±ach verdünnten lultui'filtrats neigen eine 51,5 $-> Intol*3ierii?3g vöZh Pepisäii» 4^5 ^g Mataii^eiie^äe werden sugege- ■ hen? worauf filtriert und der Kuchen mit 12 1 destillierten! Wasser gewaschen wird. Das gewaschene Mltrat wird dem KuI-turfiltrat zugeoetzt, wobei das Gesamtvolumen 133 1 beträgt. Dieses FiItrat wird unter Verwendung von 3b NaOH auf einen pH von 8,2 gebracht und aufeinanderfolgend mit 60 1 und 30 1 n-Butanol extrahiert. Die Butanblextrakte werden vereinigt und mit 111 und 9 1 Wasser nacheinanderfolgend gewaschen. Dann erfolgt eine Konzentrierung durch Destillation unter vermindertem Druck. Der niederschlag wird gesammelt und getrocknet. Dabei werden 33,4 g eines braunen Pulvers erhalten. Ea sseigt eine 50 ^Inhibierung von Pepsin durch Zugabe von 0,10 ug zu der Sestlösung. Die überstehende Flüssigkeit

009885/22 AO

vjird weiter zur Trockne eingedampft, wobei 13» O g eines braunen Rohpulvers erhalten werden. Ils zeigt eine 50 „ S^-In- - hibierung von Pepsin durch. Zugabe von 0,17 ^g dieses fest-Materials zu der !Destlösung, Die Ausbeute aus de» I»Itu»- filtrat beträgt 70 $, . · .

Beispiel 7 · ■

3Q00 1 des in Beispiel 1 beschriebenen Mediums werden in eine 6000 l-^Gärungseinrichtuug gegeben, lach einer Steril!- βierung.werden 110 1 einer 28 Stunden lang gezüchteten Brühe (die Süohtang erfolgt in. einer 200 ltung, wie. sie in BeispieiE 3 besotoiebes wird}* worauf die Gärung unter EUhren mit 190.Upm sowie unter Be~ lüften (2500 1 einer sterilen Xfuft/Miimtö bei 24*0} festgesetzt wird. Die Brühe wird nach 65 Stunden dauernder 0ärnBg gesammelt. Der pH beträgt '7,5, Ss werden 77,5 kg Dicalit© ■ zugesetzt, worauf durch eine !Filterpresse filtriert .wird, . Der Filterkuchen- wird mit 200 1 Waeser geieasciieB,, Das Se-. samtvolumen des Filtrate sowie des,zum Wasche» verwendeten Wassers beträgt 2790 1, Der pH wird unter Verwendung you 3h ITaOH auf 8,2 eingestellt; dann erfolgt eine Extraktion mit 1 400.1 n-Butanol, Der Pepsin-Inhibierungstest zeigt, dass das Pil trat 423 g Pepstatin enthäit,_Der Bu tanolextrakt enthält 362 g Pepstatin, Der Butanolextrakt wird, unter ver- ' minder tem Druck auf I05 1 konzentriert. Der !fiederschlag wird abgetrennt (das Nettogewicht des Medersclilags beträgt 3670 g)„ Die konzentrierte Lösung wird weiter auf 10 1 _Ί konzentriert, worauf der liederschlag (ilettogewicht 1540 g) gesammelt wird. Die Niederschläge werden vereinigt und in 16 1 Methanol bei ungefähr 40°0 aufgelöst. Die Methanollösung enthält 297 g Pepstatin» Aktivkohle wird in einer Menge von 1500 g der warmen lösung zugesetzt-, worauf filtriert

8 8 6/2240

wird. Die Methanollösung wird atoge&tttilt,, worauf Kristalle in einer letiOMSMga von 400 g OTSc&@i2i©2s. Bles© felstell© werde» afcgetrexmt* Me Ifefel© wifä mit &eis@ep ifettsssoX in ©is©s Meng© von" 8 1 dreimal gewaschen. Dies© Meth&nolliSsungen werden der ■ überstehenden Flüssigkeit der Kristall© »gesetstp worauf auf 1 1 koneentvlect uaä a!$g@MtM"l wirft«'''S&i&i tföstäen 63 glep-

. Sie Ääaiißfiasig ¥ob MettasiQl Ms auf 1 1 Kristallen in einer Menge vom

548 mg Pepstatin werden is nagefite 50 ml Ifethaaol gelöst«, Eine Itherlösmig, Sie Biasometlia» in-'einer lleage voa 3 g/200 ml enthält» wiri aaMnga augssatst, Ms siat geltoe Bi

unter Valoiiun. Dafoei werden 560 mg eines kissen Pulvers t©n. Die Umkriätsllisatioa aus Möthamel liefert weijase nadel« förciige Eriatall© mit eiiiem F₀ von 249 - 251 ^eö_o "Bs"wird eine

—1 ·

Baterbande Tbei 1730 cm in dsm Infiiarotspektnrai festge^l)stellt₀

Biese Bande löst die Ibei 1710 cm liegende Garboxylljande des' PepstatiriS al·«, Eine gugalbe vob O₁₁OiS Jig "dieses Esters zu der . !Destlösung ergibt eine 50 ^

Beispiel 9

- 35 - ■ ■ *

aufgeiiopft, -das 2,5' # Olyserin, G|5 # SielBahextxakt, 0,5 J* PeptonJ, 1,0 > Hefeextrakt, 0,2 % NaGl, 0,05 $ MgSO^fTJH₂O, 0,05 S^ KglWÖ. und 0,32 fi CaCO, enthält. 100 ml dieses Mediums -werden j__B einen gelilit-teilciaXibeti mit eine» Ässtmgsveraögen von 500 al" gegeben und yoj? der Beiopfung (sterilisiert» Data» er- " folgt ein Züchten unter Schütteln "bei .27°0. während einer Zeitspanne von 7 Tagen. Der pH beträgt am fünften !ag 7,5 unfi am siebten Tag 7,7. Die Zugabe von 0,1 ml dee.auf.das 25-fache verdünnten KuIturfilträte zu der SestlÖsung zeigt eine 32 $ige Inhibierung von Pepsin. Die XuXturfilträte von 50 Kolben werden vereinigt, worauf das Pepstatin in dem vereinigten FiItrat mit 2000 1 n-Bütanol extrahiert wird. Die Verdampfung unter vermindertem Druck des Extrakts liefert 2,0 g eines braunen Pulvers. Eine Zugabe von 1,5 ug dieses Pulvers au der Testlösung ergibt eine 50 ^lnnitoierting νου Pepsin. Sas< Rohpulvex wird In JQ ml- Waeetr buapeb&iert. «nH durch eine mit Aktivkohle gefüllte Säule (18 g_f 1,5 cm im Durchmesser) geschickt. 300 ml einer 30 $igen wässrigen Methanollösung werden durchgeschickt, worauf das Pepstatin auf der Säule mit einem 80 $igen wässrigen Methanol eluiert wird. Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt, wobei jede'. Fraktion 5g wiegt. Das Pepstatin erscheint in den Fraktionen 20 - 45. Diese Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum eingedampft, wobei 0,35 g eines weissen Pulvers erhalten werden, üas eine 50 '/—Inhibierung von Pepsin bei einer Zugabe von 0,3 ug zu der Sestlösung zeigt. Die Reinigung von Pepstatin unter Verwendung dieses Pulvers erfolgt nach der in Beispiel 4 beschriebenen Methode. Dabei v/erden Peps tatin-Kristalle erhalten, die anhand des Infrarotspektrums sowie einer Mnnschichtchromatographie identifiziert werden.

QO 9'B 8.5/2.2 AO

Beispiel 10

Es wird in einer Weise verfahren, die der in Beispiel 9 beschriebenen Weise ähnlich ist,'wobei anstelle, des Stamms MC210-A1 der Stamm MC284-C1 unter Schütteln gezüchtet wird. Der pH beträgt am dritten Tage 6,2 und am siebten Tage 7,8." Werden 0,05 ml des 50-fach verdünnten KuI turfliJltrats der Testlösung zugesetzt, dann wird eine 29 $ige Inhibierung von· Pepsin beobachtet. Aus 3000 ml des KuIturfiltrats wird Pepstatin in n-Butanol in einer Menge von 150U ml extrahiert, worauf die Eindampfung unter Vakuum 1,5 g liefert. Die Zugabe von 0,35 Ug dieses Pulvers zu der Testlösung"ergibt eine 50 #-Inhibierung von Pepsin. Die Dünnschicht Chromatographie zeigt den gleichen Fleck wie Pepstatin. 5 mg werd'en₍ aus dem ■· Dünr.schichtchromatograam kristallisiert. Die Identität mit Pepstatin wird anhand des Infrarotspektrums soid.e anhand der biologischen Aktivität bestätigt;. ^!

Beispiel 11

114 mg Pepstatin werden in 40 ml Äthanol gelöst und mit 40 ml Benzol sowie einigen Tropfen konzentrierter Schwefelsäure während einer Zeitspanne von 4 Stunden am Rückfluss gekocht. Dann erfolgt eine neutralisation unter Verwendung von ITatrium bicarbonat. Nach der Filtration wird das Filtrat uniter einem verminderten Druck zur Trockne konzentriert. Dabei v/erden 75 mg eines-weissen Pulvers erhalten. Dieses Pulver wird mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält 48 mg des Äthylesters von Pepstatin (F. 190 - 193⁰C). Berechnet für C₇^-Hg₇N₅ G 60,56, H 9,45, K 9,80, 0 20,16. Gefunden: C 60,96, H 9,65, H 9,43, 0-19,70. Eine Zugabe von 0,02 ug zu der Testlösung ergibt eine 50 #ige Inhibierung von Pepsin.

009885/2240

.Beispiel 12

405 mg des Methylesters von Pepstatin werd'en in Methanol gelöst, worauf Ammoniakgas während einer Zeitspanne von 14 Stunden eingeleitet wird. Während dieser Reaktion tritt ein Niederschlag auf. Dieser Niederschlag wird nach der Reaktion abfiltriert und fällt in einer Menge von 324 mg an. Er besteht aus einem weissen Pulver aus Pepstatinamid, das mit dem Methylester von Pepstatin verunreinigt ist. Dieses Pulver wird unter Verwendung-einer Mischung aus Chlorofor^m], Iceton und Methanol (5:3:2, "bezogen auf das Volumen) einer Kieselgel-Chromatographie-unterzogen. Die Fraktionen bestehen aus jeweils 5 g. Das Pepstatinamid erscheint in^d'en Fraktionen Nr. 101 - 350. Eine Verdampfung dieser ]?raktionen liefert 260 mg des reinen Pepstatinamids (F. 229 - 231°C). Analyse: Berechnet für G₃₄H₆₄NgO₈J C 59,62, H 9,41, N 12,27, 0 18,68. Gefunden: G 59,69, H 9,45, N 12,17, O 18,24. Eine Zugabe von 0,054 y-g.zu der Testlösung ergibt eine 50 $ige Inhibierung von Pepsin. '■

In den Rahmen der Erfindung fallen Pepstatin, Additio^ssalze von Pepstatin mit anorganischen Basen und organischen Basen, beispielsweise Natrium, Kalium, Ammoniak, Gallciiuii), Magnesium, Glucosamin, Mannosamin, Galactosamin, Eisen(ll)-Verbindungen, Eisen(III)-Verbindungen, Kupfer(II)-Verbindungen, Kupfer(I)-Verbindungen oder dergleichen, sowie Ester von Pepstatin, beispielsweise der Methylester, Ithylester, ' Propylester,- Butylester, Isobutylester, Pentylesterj Isopentylester, Benzylester oder dergleichen. Für therapeutische Zwecke eigenen sich Salze nicht-toxischer Basen. Salze mit toxischen Basen können für Isolations'zwecke verwendet werden, beispielsweise können toxische Basen als Ausfällungsmittel aus Lösungen eingese_tz.t werden.

00988-6/2240

Gegebenenfalls können rait den erfindungsgemässen Verbindungen auch andere Arzneimittel vermischt werden, beispielsweise Antihistamine, Sulfadrogen, Antibiotika, Pufferungsmittel, wie . beispielsweise natriumcarbonat, Calciumcarbonat, .Aluminiuirj- < silikat, Magnesiumcarbonat oder dergleichen, ITervenberuhigungsmittelj'wfe beispielsweise Methochropromid_r OxazepajnJ oder dergleichen «"

O0988B/2240

Claims

Patentansprüche

1. Pepsininhibitor, der als Pepstatin bezeichnet wird, und Pepsin zu inhibieren vermag, jedoch nicht Trypsin, Plasmin und Papain inhibiert, wobei diese Verbindung in Methanol, Äthanol, Essigsäure, Pyridin und Dimethylsulfoxyd löslich und in Äthylacetat, Äther, Benzol, Chloroform und Waajser nur wenig oder unlöslich ist, kein Absorptionsmaximum des UV-Liohts zwischen 220 und 350 mu besitzt, positive Rydon-Sraith- und Permanganat-Reaktionen liefert und negative ll-nhydrin-, Sakaguchi- und Ehrlieh-Iestreaktiojßen zeigt, eine Carboxylgruppe enthält und Metallsalze und fester bildet, und wobei das kristalline Pepstatin der Formel ^C34^H63^N5°q entspricht und einen V.'ert [a^° = -90° (C = 0,288 in Methanol) zeigt, bei 223 - 229°C unter Zersetzung schmilzt, Adsorptionsbanden im Infrarotbereich des Spektrums in pelletisierter Form in Kaliumbroiaid bei folgenden Wellenzahlen zeigt: 3320, 3090, 2955, 1635, 1545, 1470, 1450, 1420, 1390, 1370, 1300, 1220, 1178, 1070, 710, !-Alanin und L-Valin in einen Verhältnis von 1:2 zusammen mit Isovaleriansäure und einer anderen Aminosäure, die sehr schwach bei der Durchführung der Hinhydrin-Reaktion ist, liefert und folgende Struktur besitzt, wobei die Struktur durch die Isolierung von vier Hydrolyseprodukten, die in der Struktur gezeigt werden, sowie durch Massen'spektrometrie des periaethylierten Pepstatinmethylesters erhalten worden ist:

009885/22^0

- CH, OH₅

CH CH_x CH, CH* CH, CH , _χ3 / 3 _Ν3 _/ 1 ,

CH₉ CH GH CH₉OH CH, CO-Im-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CH-CH₂-CO-Im-CH-" ' (L) -(E)

CH*

GO-NH-CH-CH-CH₂-C 0OH

2. Äthylester von Pepstatin geraäss Anspruch'».· 1.

3. Verfahren zur Herstellung von Pepstatin geinäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Stamm von Pepsfcatin-erzeugenden Streptooyces in einem Nährraedium unter aeroben Bedingungen solange gezüchtet wird, bis das Kulturmedium eine merkliche Aktivität zur Inhibierung von Pepsin besitzt, und das Pepstatin von dem Kulturmedium abgetrennt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Organismus aus Streptomyces testaceus besteht.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Organismus aus Streptomyces argenteolus var. toyokensis besteht.

009885/2240

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ' der verwendete Organismus aus Streptomyces caespitosus besteht, ■

7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Pepstatin aus einer wässrigen Lösung abgetrennt wird, die Pepstatin enthält, und zwar durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, in welchem Pepstatin löslicher als in Wasser ist. .

8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Pepstatin aus einem festen Material extrahiert wird, das Pepstatin enthält, wobei ein Lösungsmittel verwendet wird, in welchem Pepstatin löslich ist.

9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ' das Pepstatin aus einer wässrigen Lösung, die Pepstatin enthält, durch Adsorption an Kohlenstoff und anschliessende Eluierung abgetrennt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 3₉ dadurch gekennzeichnet, dass das Pepstatin aus einer wässrigen Lösung, die Pepstatin enthält, durch Adsorption an einem Anionenaustauscherharz und anschliessende Eluierung abgetrennt wird.

11. Verfahren zur Herstellung von Pepstatinestern, dadurch gekennzeichnet, dass eine Veresterungsmethode durchgeführt wird, v/ie sie zur Herstellung von Estern von Carbonsäuren angewendet wird.

00988 5/22 40

Vl

Leerseite