DE2035814B2 - Pleuromutilin-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung - Google Patents
Pleuromutilin-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und VerwendungInfo
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Description
O—C—CH2—R
O CH
CH=CH,
worin R für eine
CH3
oder für Wasserstoff steht,
sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und Isolierung.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man
a) zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, worin R obige Bedeutung besitzt, einen Organismus der Spezies Ciitopilus passeckerianus (Pil.)
Sing. (NRRL 3100) bzw. dessen Variante (NRRL 3279), der Spezies Ciitopilus prunulus (Scop, ex Fr.)
Kummer (NRRL 3473) sowie der Spezies Ciitopilus
pinsitus (Fr.) ss. Romagn. joss. (NRRL 3474) bzw.
deren Varianten oder Mutanten in einer wäßrigen, eine Stickstoff- und eine Kohlenstoffquelle enthal
tenden Nährlösung in Gegenwart pflanzlicher oder
tierischer öle züchtet und zur Isolierung aus dem
gewonnenen Rohprodukt die Verbindungen in an
sich bekannter Weise abtrennt oder
b) zur Herstellung von 14-Desoxy-14-acetoxymutilin
4·) der Formel Ia
O—C—CH,
O CH
(la)
Mutiiin mit Hilfe eines Organismus der Spezies Ciitopilus passeckerianus (Pil.) Sing. (NRRL 3100)
bzw. dessen Variante (NRRL 3279), der Spezies Ciitopilus prunulus (Scop, ex Fr.) Kummer (NRRL
3473) sowie der Spezies Ciitopilus pinsitus (Fr.)
ss. Romagn. Joss. (NRRL 3474) bzw. deren Varianten oder Mutanten oder mit Enzymextrakten bzw.
Trockenmycelen dieser Mikroorganismen in einer wäßrigen, eine Stickstoff- und eine Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährlösung enzymatisch ace-
tyliert und zur Isolierung aus dem gewonnenen Rohprodukt die Verbindung in an sich bekannter
Weise abtrennt
Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen gehören zur Familie Tricholomataceae, der
Ordnung Agricales und Klasse Basidiomycetes. Kulturen dieser Organismen sind bei der Fermentations
Division of the Northern Regional Research Laboratories (NRRL), Peoria, Illinois, unter den oben angegebenen
Nummern hinterlegt.
Die in Verfahrensvariante a) beschriebene Fermentation erfolgt üblicherweise nach dem Submersverfahren,
wenn gleich such die Anwendung des Oberflächenverfahrens möglich ist Als Kohlenstoffquellen sind Zucker,
insbesondere Glucose, Lactose oder Stärke, und als Stickstoffquellen anorganische oder organische Stickstoffverbindungen,
wie Natriumnitrat, Ammoniumsulfat, Hefeautolysat oder Cornsteepliquor, brauchbar. Diese
decken in ihren unreinen Fornr^n gleichzeitig den üblichen Mineralstoffbedarf. Der Fermentationsverlauf
ist bezüglich pH-Änderung, Sauerstoffaufnahme, Nährstoffumsatz und Bildung der gewünschten Produkte mit
einer Penicillinfermentation vergleichbar. Gärtemperaturen zwischen 25 und 28° C führen unter gutem
Wachstum zu hohen Ausbeuten. Zusätze von Maisöl, Sonnenblumenöl, Olivenöl, Spermöl und anderen ölen
tierischer und pflanzlicher Herkunft werden zur Bildung der erfindungsgemäßen Pleuromutilinderivate vorzugsweise
in Mengen zwischen 0,05 und 5% (Vol.-°/o) angewendet. Die Fermentationsdauer hängt entscheidend
von den angewendeten Bedingungen ab. Normalerweise liegt sie bei 3 — 5 Tagen; sie kann jedoch
auch darunter oder darüber liegen. Die gewünschten Produkte werden teils in das umgebende Medium
abgeschieden, teils auch in den Zellen akkumuliert. Ihre Isolierung kann daher aus dem Kulturfiltrat und/oder
aus dem abgetrennten, gegebenenfalls getrockneten, Mycel erfolgen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der in Verfahrensvariante a) beschriebenen Fermentation besteht darin,
daß man den Mikroorganismus der Spezies Clitopilus passeckerianus (Pil.) Sing. (NRRL 3100) zuerst in einer
Vorkultur, die als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, Malzextrakt und ferner Bohnenmehl, Hefeextrakt,
Agar, Pepton sowie Mineralsalze enthält, züchtet und den dabei erhaltenen Fermentationsbrei anschließend
zur weiteren Züchtung in eine Fermentationslösung einträgt, die als Kohlehydratquelle Glucose und als
Stickstoffquelle Bierhefeautolysat sowie Mineralsalze enthält. Der dabei erhaltene Fermentationsbrei wird
gegebenenfalls erneut in eine Fermentationslösung der letztgenannten Art zur weiteren Züchtung eingetragen.
Nach beendeter Züchtung werden die so erhaltenen Pleuromutilinderivate in bekannter Weise isoliert.
Gegebenenfalls erfolgt eine Auftrennung des Substanzgemisches in ein Pleuromutilinfettsäureestergemisch
und das H-Desoxy-H-acetoxymutilin.
Eine weitere Ausführungsforrr. der obigen Verfahrensvariante a) kann jedoch auch darin bestehen, daß
man eine analog zu oben gezüchtete Vorkultur in eine Fermentationslösung einbringt, die als Kohlenstoffquelle
Glucose und als Stickstoffquelle Preßhefeautolysat sowie Mineralsalze enthält. Der dabei erhaltene
Mycelbrei wird erneut in eine Fermentationslösung obiger Art überführt. Nach Beendigung dieser Züchtung
bringt man den so gewonnenen Fermentationsbrei schließlich in eine weitere Fermentationslösung, die als
Kohlenstoffquelle Glucose und als Stickstoffquelle Sojabohnen-Stickstoff sowie Mineralsalze enthält Nach
Beendigung dieser letzten Züchtung wird das dabei erhaltene Substanzgemisch in bekannter Weise isoliert,
wobei eine zu dem erstgenannten Verfahren analoge Aufarbeitung erfolgen kann.
Bei der enzymatischen Acetylierung von Mutilin zu
14- Desoxy- 14-acetoxymutilin gemäß Verfahrensvariante
b) kann als Enzymträger das durch Submers- oder Oberflächenverfahren gewonnene Mycel der Mikroorganismen
dienen. Trockenmycel oder Enzymextrakte der beschriebenen Fungi können jedoch ebenfalls
verwendet werden. Die Umwandlungsrate ist von der angebotenen Belüftung abhängig. Für große Umwandlungsraten
liegt die Substratkonzentralion beispielsweise zwischen 0,5 und 5,0 g Mutilin pro Liter. Die
Acetylierung erfolgt mit Vorteil in einem gepufferten Medium bei pH-Werten zwischen 4,5 und 8,0 unter
Zusatz einer Kohlenstoffquelle und guter Belüftung. Als Kohlenstoffquelle kommen Zucker, wie Glucose oder
Lactose, in Frage. Es lassen sich jedoch auch Maisöl, Spermöl, Sonnenblumenöl, Oelsäuremethylester, Palmitinsäure.
Glycerin, Aethanol oder Aminosäuren verwenden. Die Konzentrationen hierfür liegen beispielsweise
zwischen 0,5 und 5 Gew.-%. Durch Zusatz von Cu-Jonen in geringer Konzentration, vorzugsweise 10 ppm, wird
die Acetylierung stimuliert.
Eine bevorzugte Ausführungsform der obigen enzymatischen Acetylierung von Mutilin zu 14-Desoxy-14-acetoxymutilin
besteht darin, daß man die gemäß der
jo Verfahrensvarianten a) erhaltene Vorkultur des Mikroorganismus
NRRL 3100 von Clitopilus passeckerianus in eine Fermentationslösung bringt die als
Kohlenstoffquelle Glucose und als Stickstoffquelle Preßhefeautolysat sowie Mineralsalze enthält Der
j5 dabei erhaltene Mycelbrei wird in einer Fermentationslösung, die unter anderem Cornsteepliquor und Spermöl
enthält, gezüchtet und die so gewonnene Züchtung endlich in einem Replacementmedium suspendiert das
mit Phosphat gepuffert ist und Maisöl als Kohlenstoffquelle enthält Die Substratkonzentration beträgt
hierbei 3 g Mutilin pro Liter Kultur. Die Aufarbeitung der Ansätze zu dem gewünschten 14-Desoxy-14-acetoxymutilin,
welches nach 48stündiger Belüftung in hoher Ausbeute erhalten wird, erfolgt in bekannter Weise.
Die Struktur der erfindungsgemäß hergestellten Pleuromutilinfensäureester ist durch UV- und IR-Spektren,
Abbaureaktionen, Papier-, Dünnschicht- und Gaschromatographie gesichert Die Dünnschichtchromatographie
der durch Umesterung der Pleuromutilinfettsäureester
erhaltenen Fettsäuremethylester ergibt auf AgNO3-imprägnierten Kieselgelplatten, auf denen
eine Trennung der verschiedenen Isomeren möglich ist, den Hinweis auf Oelsäure, Linolsaure und Gadoleinsäure.
Die Struktur des H-Desoxy-H-acetoxymutilins ist
durch IR-Spektren, Abbaureaktionen und Synthese von Pleuromutilin ausgehend gesichert
Die erfindungsgemäß erhaltenen Pleuromutilin-Derivate
stellen wertvolle Antibiotika dar und bilden einen hervorragenden Zusatz zu Fertigfuttermischungen.
Infolge der geringen Dosierung im Fertigfutter und wegen ihrer schlechten Resorption im tierisehen
Organismus besteht beim Verzehr damit behandelter Tiere keine Gefahr einer Resistenzentwicklung von
Krankheitserregern im Menschen. Außerdem werden die erfindungsgemäßen Pleuromutilin-Derivate nicht im
Humanbereich eingesetzt, so daß die dort üblichen Antibiotika ihre volle Wirksamkeit behalten.
Die zu verabreichende Dosis an Pieuromutilin-Deri-
vaten der Formel I beträgt für Geflügel zweckmäßigerweise 2,5 bis 90 mg pro kg Fertigfuttermischung. Für
Schweine liegt die entsprechende Dosis bei 10 bis 180 mg pro kg Fertigfuttermischung. Bei Kälbern und
Mastrindern sollen die Verbindungen der Formel I in solchen Dosen verfüttert werden, daß vom Tier täglich
etwa 25 bis 120 mg Wirkstoff aufgenommen werden.
Die erfindungsgemäß hergestellten Pleuromutilin-Derivate zeigen ferner eine günstige Wirkung gegen
tierpathogene Keime, so daß sie in der Tierheilkunde verwendet werden können.
Beispiel 1
Fermentation
Fermentation
Zwei Kulturen von Clitopilus passeckerianus (NRRL 3100) auf Agar-Nährböden werden mit steriler,
physiologischer Kochsalzlösung abgespült, worauf man mit je 3 ml der erhaltenen Suspension jeweils 60 ml
steriler Fermentationsnährlösung beimpft, die sich in zwei 500-ml-Erlenmeyer-Weithalskolben befinden.
Nährboden für Schrägagar | Glucose | 10,0 g |
Bohnenmehl | Bierhefeautolysat-Stickstoff | 0,5 g |
KH3PO4 | KH2PO4 | 1,0 ml |
FeCIj(I %ige Lösung) | MgSO4 ■ 7 H2O | 0,1g |
Hefeextrakt | Ca(NO3J2 | 50,0 g |
Malzextrakt | NaCl | 1,0 g |
Pepton | FeSO4 · 7 H2O | 15,0 g |
Agar | mit Aqua dest auf 1000 ml | |
mit Aqua dest. auf 1000 ml | auffüllen; | |
auffüllen; | pH vor der Sterilisation: 6,0 | |
natürliches pH. | ||
Fermentationsnährlösung | 50,0 g/l | |
1,0 g/l | ||
1,0 g/l | ||
0,5 g/l | ||
0,5 g/l | ||
0,1 g/l | ||
0,05 g/l | ||
Nach 120 Stunden Fermentation bei 25° C auf einer Rundschüttelmaschine mit 40 mm Hub und 250 U/min
wird der Inhalt der zwei 500-ml-Erlenmeyer-Weithalskolben
dickbreiig. Je 10 ml davon werden zur Beimpfung von zehn 2-Liter-Erlenmeyer-Weithalskolben
verwendet, die mit je 200 ml der obigen sterilen Fermentationsnährlösung gefüllt sind. Die Bebrütung
erfolgt unter denselben Bedingungen wie bei der Heranführung der Vorstufe. Nach 72 Stunden wird mit
dem in den zehn 2-Liter-Erlenmeyerkolben enthaltenen
Fermentationsbrei (jeder Kolben enthält 200 ml) ein mit 40 Liter obiger steriler Fermentationsnährlösung
gefülltes Fermentationsgefäß beimpft, das mit den Einrichtungen für eine Submersfermentation nach dem
Schikanensystem ausgestattet ist Man fermentiert 120
Stunden bei 25° C unter Rühren und Belüften, worauf der dickbreiige Inhalt in einen größeren Fermenter
überführt wird, der mit 140 Liter der gleichen sterilen
Nährlösung versehen ist Danach wird Spermöl in einer Konzentration von 2VoL-% (2,81) zugesetzt Nach
72stündigem Rühren und Lüften bei einem Gegendruck von 0.8 atü wird die Fermentation abgebrochen. Das
Erntegut wird über eine Druckfilternutzsche abgepreßt und der Mycelkuchen in einem Hordentrockner bei ca.
400C getrocknet. Auf diese Weise erhält man 3,8 kg Trockenmycel, aus dem später die gewünschten
Substanzen isoliert werden.
Beispiel 2
Fermentation
Fermentation
Von einer auf gebrochenem Mais herangeführten Kultur von Clitopilus passeckerianus (NRRL 3100) wird
das Mycel mit steriler, physiologischer Kochsalzlösung abgespült. Mit je 5 ml der erhaltenen Suspension
werden 4 Stück 500-ml-Erlenmeyer-Weithalskolben
beimpft, die mit je 50 ml folgender steriler Fermentationsnährlösung beschickt sind.
Preßhefeautolysat-Stickstoff | 1,5 g/l |
Glucose | 30,0 g/l |
Dextrin | 10,0 g/l |
KH2PO4 | 4,0 g/l |
(NH4J2SO4 | 5,0 g/l |
mit Aqua dest. auf 1000 ml | |
auffüllen; | |
pH vor der Sterilisation: 6,0 |
Die Kolben werden 100 Stunden auf einer Längsschüttelmaschine mit 10 cm Ausladung und 90 Bewegungen
pro Minute bei 25°C geschüttelt, worauf mit dem Inhalt je 6 Stück 2-Liter-Erlenmeyerkolben
beimpft werden, die mit je 400 ml der gleichen sterilen Fermentationsnährlösung beschickt sind. Nach 36stündigem
Schütteln unter den obigen Bedingungen wird der erhaltene Mycelbrei in ein 100 Liter fassendes
Submersgefäß überführt, das 50 Liter folgender steriler Fermentationsnährlösung enthält:
Sojabohnen-Stickstoff | 2,0 g/l |
Rohrzucker | 20,0 g/l |
Glucose | 20,0 g/l |
mit Aqua dest. auf 1000 ml | |
auffüllen; | |
pH vor der Sterilisation: 6,5 | |
CaCÜ3 (getrennt sterilisiert) | 5,0 g/I |
Nach 120stündiger Fermentation wird mit dem Inhalt dieses Gefäßes ein Submerstank beimpft, der 1000 Liter
der letztgenannten Fermentationsnährlösung enthält. Es wird 96 h belüftet und gerührt (0,5 Liter Luft/Liter
Nährlösung/min; 210 Umdrehungen/min.) Danach wird Spermöl in einer Konzentration von 2,5 Vol.-% (2,51)
zugesetzt Nach einem anfänglichen Absinken des pH-Wertes auf 5,5 steigt dieser nach 48 Stunden auf 6,8
an, hat nach 72 Stunden einen Wert von 6,5 und erreicht gegen Fermentationsende 7,0. Das Mycelgewicht
beträgt nach 48 Stunden 18 g/l. Das Mycel wird über einen Saugzellenrundfilter abfiltriert und in einem
Hordentrockner bei ca 40° C getrocknet Auf diese Weise erhält man 193 kg getrocknetes Mycel, welches
den Hauptanteil der gewünschten biologisch aktiven Verbindungen enthält
Beispiel 3
Fermentation
Fermentation
Von einer auf gebrochenem Mais herangeführten Kultur von Clitopilus passeckerianus (NRRL 3279) wird
das Mycel mit physiologischer Kochsalzlösung abgespült Mit je 7 ml der erhaltenen Suspension werden 2
Stück 500-ml-Erlenmeyerkolben beimpft, die mit je
50 ml der im Beispiel 2 beschriebenen Fermentationslösung für die Vorstufe beschickt sind.
Die Kolben werden auf einer Rundschüttelmaschine mit 40 mm Hub und 260 U/Minute bei 25°C während
120 Stunden geschüttelt, worauf mit dem Inhalt 4 Stück 2-Liter-Erlenmeyerkolben beimpft werden, die mit je
500 ml der gleichen sterilen Fermentationslösung beschickt sind. Nach 48stündigem Schütteln unter den
obigen Bedingungen wird der erhaltene Mycelbrei in einen 12 Liter fassenden Glasfermenter überführt, der
mit 7,5 Liter folgender steriler Nährlösung gefüllt ist;
mit Aqua dest. auf 1000 ml
auffüllen,
pH vor Sterilisation 6,5,CaCO3
(getrennt sterilisiert)
Nach 120stündiger Fermentation unter Belüftung und
Rührung bei 250C beträgt das Trockenmycelgewicht ca.
12 g/Liter. Das Mycel wird über einer Drucknutsche abfiltriert, mit Wasser nachgewaschen und in einem
Hordentrockner getrocknet Das so erhaltene Produkt wird in der nachfolgend beschriebenen Weise für die
Isolierung der ungesättigten Pleuromutilinfettsäureester eingesetzt.
Beispiel 4
Fermentation
Von einer auf gebrochenem Mais herangeführten Kultur von Clitopilus prunulus (Scop, ex Fr.) Kummer y,
(NRRL 3473) werden analog Beispiel 3 2 Liter Mycelbrei als Impfgut für einen 12 Liter fassenden
Glasfermenter bereitet Die Nährlösung für die Hauptstufe hat folgende Zusammensetzung:
Enzymatische Acetylierung von Mutilin zu
14-Desoxy-14-acetoxymutilin
r) Mit einer auf gebrochenem Mais herangeführten
Kultur von Clitopilus passeckerianus (NRRL 3100) werden 120 ml der in Beispiel 2 genannten Fermentationsnährlösung in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben
beimpft und 72 Std. bei 24° C unter guter belüftung
κι geschüttelt. Mit dieser Impfgutstufe werden 20 Stück
500-ml-Erlenmeyerkolben beschickt, welche mit je 50 ml folgender Nährlösung gefüllt sind:
N als Cornsteep solids | 1,2 g/l |
Glucose | 50,0 g/l |
MgSO4 -7H2O | 2,0 g/l |
mit Aqua dest. auf 1000 ml | |
auffüllen; | |
pH vor der Sterilisation: 6,0 |
10
mit Aqua dest auf 1000 ml
auffüllen,
pH vor Sterilisation 6,5,
Nach 144stündiger Fermentation analog Beispiel 3 wird ein Trockenmycelgewichl von 14,5 g/Liter erreicht Nach der Ernte des Mycels werden aus diesem
die ungesättigten Pleuromutilinfettsäureester in nachfolgend beschriebener Weise isoliert
Beispiel 5
Fermentation
Es wird anstelle von Clitopilus prunulus der Stamm
Clitopilus pinsitus (Fr.) ss. Romagn. Joss. (NRRL 3474)
eingesetzt und analog Beispiel 4 vorgegangen.
Nach 144st0ndiger Fermentation in der Hauptstufe
wird ein Trockenmycelgewicht von 12J5 g/Liter erreicht Aus dem getrockneten Mycel werden die
ungesättigten Pleuromutilinfettsäureester in nachfolgend beschriebener Weise isoliert
3,0 g/Liter 2« Die auf dieser Nährlösung bei 24° C und guter Belüftung während 72 Stunden herangeführte Hauptstufe wird steril über Glasfilternutschen abgesaugt und
das Mycel jedes Kolbens in je 50 ml Replacementmedium suspendiert das aus Phosphatpuffer mit pH-Wert 6,5
25 (0,066 molar) und einer Kohlenstoffquelle besteht Als
Kohlenstoffquelle wird Maisöl in einer Konzentration von 2% verwendet. Die Substratkonzentration beträgt
3 g Mutilin pro Liter Kultur. Nach 48stündiger Belüftung der Ansätze bei 24° C ist das eingesetzte
Mutilin zu 95% in 14-Desoxy-14-acetoxymutilin umgewandelt
gebildet durch enzymatische Acetylierung von
Der Inhalt von 5 Kolben (ca. 230 ml), die (entsprechend Beispiel 2) zu 95% acetyliertes Mutilin enthalten,
wird homogenisiert und dreimal mit je 115 ml Essigsäureäthylester extrahiert Die vereinigten und
entwässerten Extrakte werden mit 03 Gew.-% Aktivkohle behandelt auf ca. 5 ml Vakuum eingeengt mit
15 ml Diisopropyläther versetzt und in den Eisschrank gestellt Kurz darauf fällt das H-Desoxy-H-acetoxymutilin in kristalliner Form aus. Es wird anschließend
zweimal umkristallisiert Die Ausbeute beträgt 401 mg Kristallisat mit einem Smp. von 183°C(unkorr.).
Isolierung der ungesättigten Pleuromutilinfettsäureester und des 14-Desoxy-14-acetoxymutilins
1 kg Trockenmycel, hergestellt gemäß Beispiel 1 oder
2, wird fünfmal mit je 5 Liter 60%igem Methanol extrahiert worauf man den Methanolextrakt zweimal
mit je 2^ Liter Petroläther entfettet Nach Entwässern
und weitgehendem Einengen der Petrolätherphase wird der dickflüssige Rückstand über 10 Stufen zwischen
95%igem Methanol und Petroläther (Verhältnis 1:1) verteilt Die 3. bis 8. Stufe enthält die Pleuromutilinfettsäureester, die 9. und 10. Stufe das ^Desoxy-l^acetoxymutilin. Die 3. bis 8. Stufe wird vereinigt entwässert,
soweit als möglich eingeengt mit der lOfachen Menge
Hexan versetzt, gekühlt und von ausgeschiedenem Material abfiltriert Nach abermaligem Einengen bleibt
ein gelbes, dickflüssiges öl zurück. Dieses wird in
Diisopropyläther aufgenommen und mit 10 Gew.-%
40
45
60
65
r>
Aktivkohle behandelt. Hierbei erhält man ein dünnschichtchromatographisch
reines Gemisch der verschiedenen Fettsäureester des Pleuromutilins. Die Ausbeute
beträgt 5,3 g.
Um Näheres über die prozentuelle Zusammensetzung zu erfahren, wird 1 g des Substanzgemisches in
20 ml Petroläther gelöst, mit 10 ml methanolischer Kalilauge überschichtet und eine Stunde unter ständigem
Schütteln und Lichtausschluß bei -50C gehalten.
Die Petrolätherphase wird mit l%iger Salzsäure sowie mit Wasser gewaschen und getrocknet, worauf man die
Methylester der jeweiligen Fettsäuren erhält. Ein Teil der Methylester wird gaschromatographisch analysiert,
wobei sich folgende Zusammensetzung ergibt:
40-45% ölsäuremethylester
45—50% Linolsäuremethylester
ca. 5% Gadoleinsäuremethylester
45—50% Linolsäuremethylester
ca. 5% Gadoleinsäuremethylester
200 mg Estergemisch werden in 20 ml Essigester mit 2,0 g Palladiumkohle hydriert. Die Wasserstoffaufnahme
kommt bereits nach 30 Minuten zum Stillstand. Eine IR-Aufnahme der hydrierten Ester zeigt, daß die
Verbindungen durchhydriert sind. Die Ester werden anschließend gespalten und die entstandenen Säuren
papierchromatographisch untersucht. Das Gemisch 2r>
besteht zu über 90% aus einer Qs-Säure, der Rest aus
einer C2o-Säure.
Das bei einer Umesterung der Fettsäureester entstandene Pleuromutilin wird aus der Methanolphase
isoliert und mit einem durch Fermentation gewonnenen j<> Material im Snip., Ir und UV verglichen. Die
Verbindungen sind identisch. Auch liefert eine alkalische
Verseifung in jedem Fall Mutilin.
Die 9. und 10. Stufe der Verteilung, welche das 14-Desoxy-14-acetoxymutilin enthält, wird entwässert
und im Vakuum stark eingeengt. Die weitere Reinigung erfolgt durch Chromatographie an einer Kieselgelsäule.
Das Verhältnis von aufgegebenem Material zu Adsorbens beträgt 1 :100. Man eluiert mit Chloroform und
erhält nach Einengen der aktiven Fraktionen und Zugabe von Diisopropyläther die gewünschte Verbindung
in kristalliner Form. Sie wird zweimal aus Diisopropyläther umkristallisiert und getrocknet. Ausbeute:
1,23 g mit einem Smp. von 183cC(unkorr.).
Vergleichsversuch
Die biologische Aktivität von 14-Desoxy-14-acetyl-mutilin
Die Untersuchungen der biologischen Aktivität von 14-Desoxy-14-acetyl-mutilin im Vergleich zu den
bekannten Verbindungen erfolgt im üblichen Reihenverdünnungstest mit dem Faktor 0,5 bei einer
Anfangskonzentration von 100 j>/ml in der Bouillon der
jeweiligen Substanz. Die Einsaat beträgt jeweils etwa 105 Keime/ml.
Die Ergebnisse der Untersuchung können der nachfolgenden Versuchstabelle entnommen werden, in
welcher jeweils die minimale Hemmdosis in μg/ml
angegeben ist.
Testorganismus | Minimale Hemmdosis | in |xg/ml | 14-Desoxy- |
Pleuromutilin | Mutilin | 14-acetylmutilin | |
0,08 | |||
Staph. aureus SG 511 | 0,8 | >100 | 0,16 |
Staph.aureus 209 P | 1,6 | >100 | 0,8 |
Staph. aureus R 1 | 3,1 | >100 | 0,06 |
Staph. aureus R Il | 0,8 | >100 | 0,12 |
Staph. aureus R III | 3,1 | >100 | 0,12 |
Staph. aureus 2595 | 0,8 | >100 | |
Claims (1)
11
Q-C-CH2-R
/ CH3
/\
CH=CH,
CH3 OH
worin R für eine
CH3 - (CH2)/- CH=CH - (CHz)7 - COO-.
CH3-(CH2)4-CH=CH-CH2-CH=CH-(CH2)7-COO->
CH3-(CH2J9-CH=CH -(CH2J7 -COO-Gruppe
oder für Wasserstoff steht
2. Verfahren zur Herstellung und Isolierung von Pleuromutilin-Derivaten der Formel I,
CH=CH2
CH,
OH
worin R für eine
CH3 - (CH2)? - CH=CH - (CHi)7 - COO-,
CH3- (CH2), - CH=CH - CH2 - CH = CH - (CH2), - COO-,
CH3 - (CH2H - CH - CH - (CH2J7 - COO-Gruppe
oder für Wasserstoff steht,
dadurch gekennzeichnet, daß man
a) zur Hersteiiung von Verbindungen der Formel I, worin R obige Bedeutung besitzt, einen
Organismus der Spezies Clitopilus passeckerianus (PiL) Sing. (NRRL 3100) bzw. dessen
Variante (NRRL 3279), der Spezies Clitopilus prunulus (Scop, ex Fr.) Kummer (NRRL 3473)
sowie der Spezies Clitopilus pinsitus (FR). ss. Romagn. Joss. (NRRL 3474) bzw. deren Varianten oder Mutanten in einer wäßrigen, eine
Stickstoff- und eine Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährlösung in Gegenwart pflanzlicher
und tierischer öle züchtet und zur Isolierung aus dem gewonnenen Rohprodukt die Verbindungen in an sich bekannter Weise abtrennt
oder
55
t,o
b) zur Herstellung von H-Desoxy-M-acetoxymutilin der Formel Ia
Q-C -CH,
O CH
CH, (la)
CH = CH2
CH3 OH
Mutiiin mit Hilfe eines Organismus der Spezies Ciitopilus passeckerianus (PiL) Sing. (NRRL
3100) bzw. dessen Variante (NRRL 3279), der
Spezies Ciitopilus prunulus (Scop, ex Fr.) Kummer (NRRL 3473) sowie der Spezies
Ciitopilus pinsitus (Fr.) ss. Romagn. Joss. (NRRL 3474) bzw. deren Varianten oder Mutanten oder
mit Enzymextrakten bzw. Trockenmycelen
dieser Mikroorganismen in einer wäßrigen, eine
Stickstoff- und eine Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährlösung enzymatisch acetyliert, und
in Isolierung aus dem gewonnenen Rohprodukt die Verbindung in an sich bekannter Weise
abtrennt
3. Tierarzneimittel enthaltend mindestens ein Pleuromutilin-Derivat nach Anspruch 1.
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