AT222272B

AT222272B - Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclin

Info

Publication number: AT222272B
Application number: AT669154A
Authority: AT
Inventors: Alexander Dr Gourevitch; Joseph Dr Lein
Original assignee: Bristol Lab Inc
Priority date: 1953-12-04
Filing date: 1954-12-03
Publication date: 1962-07-10

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclin 
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclin durch Züchtung eines
Chlortetracyclin erzeugenden Streptomycetenstammes in Gegenwart eines Hemmstoffes, der die fermen-   tative   Chlorierung zu hemmen vermag. 



   Während der letzten Jahre wurde eine Reihe   von Stoffwechselprodukten von Bakterien   und Pilzen auf- gefunden, die wertvolle therapeutische Eigenschaften aufweisen und als antibiotische Wirkstoffe in dem
Arzneischatz Aufnahme gefunden haben. Von diesen Wirkstoffen haben sich Chlortetracyclin, Oxytetra- cyclin und Tetracyclin wegen ihres breiten Wirkungsspektrums als besonders wertvoll erwiesen. Die wirksamste Substanz dieser Verbindungsreihe ist Tetracyclin, da bei seiner Verabreichung höhere Blutspiegel- werte als mit den andern beiden Antibioticis erzielt werden können und weniger unerwünschte Nebenreak- tionen auftreten ; ausserdem besitzt es eine grössere Stabilität im alkalischen Bereich. 



   Bei der üblichen Gewinnung von Tetracyclin durch aerobe submerse Kultur von Streptomycetenstäm- men bietet die Isolierung aus der Gärlösung und seine Reinigung grosse Schwierigkeiten und erhebliche Kosten, da neben Tetracyclin gleichzeitig Chlortetracyclin gebildet wird, wobei in vielen Fällen Chlortetracyclin das vorherrschende Stoffwechselprodukt darstellt. 



   Das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung vermeidet die bisherigen Nachteile bei der fermentativen Gewinnung von Tetracyclin und ermöglicht es, in einfacher Weise Gärflüssigkeiten zu erhalten, die erhebliche Mengen an Tetracyclin, aber praktisch kein Chlortetracyclin enthalten. Die beim erfindungsgemässen Verfahren verwendete Nährlösung enthält normale Mengen an Chlorionen. Wie aus den Ausführungsbeispielen zu entnehmen ist, enthält das Nährmedium Bestandteile, wie Maisweichwasser, lösliche Anteile der Gär-und Destillationsschlempe und auch Leitungswasser, das mit Chlor behandelt ist und demnach Chlorionen enthält. Es ist bekannt, dass durch 1% Maisweichwasser   (50zig)   etwa 30 Teile je Million Chorion und durch das mit Chlor behandelte Wasser   5 - 15   Teile je Million Chlorion in das Medium eingebracht werden.

   Dadurch enthält eine typische Nährlösung Chlorionen in einer Menge von wenigstens 35 Teile je Million oder 0, 035 g/l. Ein typisches Nährmedium, wie es im Rahmen der Erfindung verwendet wird, enthält somit wenigstens 200mal so viel Chlorid wie ein Nährmedium, das zwecks Entfernung oder Verringerung der Menge an Chlorionen besonders behandelt worden ist. 



   Die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens erfolgt durch Züchtung eines Streptomycetenstammes, der erhebliche Mengen an Chlortetracyclin zu bilden vermag, z. B. Streptomyces aureofaciens (NRRL 2209) oder Streptomyces viridifaciens (ATCC 11989), unter aeroben Bedingungen im Submersverfahren in einer Chlorionen enthaltenden wässerigen Nährlösung üblicher Zusammensetzung in Gegenwart einer Verbindung, die unter den Verfahrensbedingungen Bromid-, Jodid- oder Rhodanidionen zu liefern vermag, oder eines Gemisches solcher Verbindungen, wobei die Gärung so lange fortgesetzt wird, bis die Lösung optimale anti. bakterielle Wirksamkeit aufweist, worauf das so gebildete Tetracyclin aus der Gärflüssigkeit in üblicher Weise gewonnen wird. 



   Die Hemmstoffe werden zweckmässig in Form von   Alkali-oder Erdalkalibromiden,-jodiden   und - rhodanien der Nährlösung zugesetzt. Vorzugsweise werden Natriumbromid, Kaliumbromid, Calciumbromid,   Ammoniumbr9mid, oder   auch Bromwasserstoffsäure verwendet. Gute Resultate werden durch Zusatz von Natriumbromid in Mengen von 0,01 bis   5, 0 Gew.-%,   vorzugsweise von 0,1 bis 2, 0%, berech- 

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 net auf die   Nährlösung.   erzielt. Von den andern Substanzen werden zweckmässig etwa äquivalente Mengen verwendet. 



   Die Wirkung der die fermentative Chlorierung unterdrückenden Hemmstoffe dürfte darin bestehen, dass die Hemmstoffe vermutlich störend in die enzymatischen Vorgänge während des Wachstums eingreifen, vielleicht in der   als "konkurrierende Hemmung" bekannten   Art und Weise. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren wird in den folgenden Beispielen näher erläutert. 



   Beispiel 1 : Zur Gewinnung von Tetracyclin werden 2500 cm3 einer Nährlösung folgender Zusammensetzung : 
 EMI2.1 
 
<tb> 
<tb> 1,0 <SEP> Gew.-% <SEP> Maisquellwasser <SEP> (50% <SEP> ig) <SEP> 
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> Gew. <SEP> -"/0 <SEP> Rohrzucker <SEP> 
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> Gew.-% <SEP> Diammoniumphosphat <SEP> (NH) <SEP> HPO <SEP> 
<tb> 1,5 <SEP> Gew.- <SEP> % <SEP> Monokaliumphosphat <SEP> KH2PO4
<tb> 0,2 <SEP> Gew.-% <SEP> Magnesiumsulfat <SEP> MgSO4. <SEP> 7H2O
<tb> 0,5 <SEP> Grew.-% <SEP> Natriumbromid,
<tb> 
 die auf einen pH-Wert von 6,2 bis 6,4 eingestellt ist, in einer 10 1-Flasche 1 Stunde bei   118-120 C   im Dampf sterilisiert.

   Nach dem Abkühlen wird die Nährlösung mit etwa 0,5   Vol.-*%)   einer wässerigen Sporensuspension von Streptomyces aureofaciens (NRRL 2209) oder eines andern Tetracyclin und Chlortetracyclin erzeugenden Stammes, die einer Schrägagarkultur entnommen ist, beimpft und dann bei   26-280C   48 Stunden lang auf einer hin-und hergehenden Schüttelmaschine geschüttelt, wobei sterile Luft über die Oberfläche der Flüssigkeit geblasen wird. Die so erhaltene Kultur kann entweder als Impfmaterial verwendet werden oder sie kann, wenn erwünscht, in üblicher Weise aufgearbeitet und Tetracyclin daraus isoliert werden. 



   Zur Gewinnung von Tetracyclin im Grossbetrieb haben sich stationäre Gärbottiche, die mit geeigneten Rührvorrichtungen und Belüftungsanlagen versehen sind, als brauchbar erwiesen. Eine geeignete Nähr-   lösens   enthält z. B. in rund 6000   l   Flüssigkeit :

   
 EMI2.2 
 
<tb> 
<tb> 56, <SEP> 8 <SEP> l <SEP> Maisque. <SEP> l1wasser <SEP> (50%ig) <SEP> 
<tb> 56,8 <SEP> kg <SEP> Rohrzucker
<tb> 24, <SEP> 4 <SEP> kg <SEP> Diammoniumphosphat
<tb> 85, <SEP> 2 <SEP> kg <SEP> Monokaliumphosphat
<tb> 11, <SEP> 3 <SEP> kg <SEP> Magnesiumsulfat <SEP> und
<tb> 28, <SEP> 4 <SEP> kg <SEP> Natriumbromid.
<tb> 
 Die Nährlösung wird zweckmässig in einem mit Glas ausgekleideten Gärbottich von 8000   l   Inhalt, der einen Wassermantel zur Temperaturregelung, eine Rührvorrichtung aus rostfreiem Stahl sowie eine Belüftungsanlage aufweist, bereitet, darin durch Erhitzen mit Dampf unter Druck sterilisiert und dann abgekühlt. Nach der Sterilisierung soll die Wasserstoffionenkonzentration der Nährlösung ungefähr 6,2 betragen.

   Die so erhaltene sterile   Nährlösung   wird dann mit 15   Vol. -0 ; 0   einer vegetativen Vorkultur oder mit einer im Laboratorium gewonnenen Impfkultur beimpft und bei ungefähr   280C   44 Stunden lang vergoren. 



  Während der Gärung wird mit einer Geschwindigkeit von 90 Umdr/min gerührt und sterile Luft in einer Menge von ungefähr 2, 8 m3/min in die Nährlösung durch die Belüftungsdüse eingeleitet. Gegen Ende der Gärung enthält die Nährlösung gewöhnlich beträchtliche Mengen an Tetracyclin, die jene an Chlortetracyclin übertreffen. 



   Nach beendeter Gärung wird zunächst das Mycel abfiltriert. Darauf wird das Gärfiltrat, vorzugsweise nach Einstellung auf einen pH-Weit von 8, 5, mit   organischen Lösungsmitteln, wie Butanol   oder Methylisobutylketon, extrahiert. Nach dem Absetzen und Abtrennen der wässerigen Schicht wird die Lösungmittelschicht, die das Tetracyclin enthält, durch Destillation auf ein kleines Volumen eingedampft und mit einem niedrig-siedenden Kohlenwasserstoff, z. B. Skellysolve C, einer   85 - 1000C   siedenden Ligroinfraktion, versetzt. Dabei fällt festes Tetracyclin entweder als Base aus, wenn das Gärfiltrat alkalisch reagierte, oder als Hydrochlorid, wenn das Gärfiltrat vor der Extraktion mit Salzsäure angesäuert worden war. Das so gewonnene feste Rohprodukt enthält mindestens 19 Teile Tetracyclin auf je 1 Teil Chlortetracyclin.

   Die weitere Reinigung des Rohproduktes kann in der Weise erfolgen, dass man es entweder mit Ammoniak anteigt oder durch ein chromatographisches Adsorptionsverfahren, indem man die freie Base aus ihrer Lösung an Kieselerde, wie Florisil, adsorbiert, die chromatographische Säule zwecks Entfernung der Verunreinigungen mit Aceton oder Methanol wäscht und das Tetracyclin aus dem Adsorptionsmittel durch Behandlung mit einer Säure in Form des entsprechenden Salzes eluiert. Das gereinigte Tetracyclinsalz wird aus dem Eluat durch Kristallisation, Fällung, Gefriertrocknung od. dgl, gewonnen. 



   Ausserdem lassen sich nicht nur   Tetracyclinsalze   mit Mineralsäuren und mit organischen Säuren, 

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 sondern wegen des amphoteren Charakters des Tetracyclins auch Salze mit Metallen herstellen. 



   Die Eigenschaften von Tetracyclin, Chlortetracyclin und Oxytetracyclin sind aus der Literatur bekannt. Besonders bemerkenswert ist, dass Tetracyclin im alkalischen Milieu ganz wesentlich stabiler ist als die beiden andern Verbindungen Chlortetracyclin und Oxytetracyclin. Durch Prüfung ihrer bakteriostatischen Wirksamkeit auf alkalischem (PH 8, 0) und saurem (PH 6, 2) Nährboden lassen sich die drei Antibiotika leicht voneinander unterscheiden. Chlortetracyclin und Oxytetracyclin sind auf alkalischem Nährboden wesentlich weniger wirksam als Tetracyclin. 



   Die grössere Beständigkeit des Tetracyclins im alkalischen Milieu kann auch zu seiner Reinigung benutzt werden. Zu diesem Zwecke lässt man eine Lösung des mit Chlortetracyclin oder Oxytetracyclin verunreinigten Tetracyclins bei einem PH-Wert von etwa 8, 0 so lange stehen, bis alles Chlortetracyclin oder Oxytetracyclin zersetzt ist und isoliert dann das unzersetzte Tetracyclin. Ein solches Reinigungsverfahren ist von besonderer Bedeutung beim Verfahren gemäss vorliegender Erfindung, da durch dieses die gebildeten und im Rohtetracyclin vorhandenen Mengen von Chlortetracyclin auf ein Minimum herabgesetzt werden können. 



   Verwendet man an Stelle der vorstehend beschriebenen Nährlösungen eine der nachstehend angegebenen Nährlösungen und arbeitet in der gleichen Weise wie oben beschrieben, so erhält man Gärfiltrate, die auf 2 Teile Tetracyclin nicht mehr als höchstens 1 Teil Chlortetracyclin enthalten. 
 EMI3.1 
 
<tb> 
<tb> a) <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Weizengluten
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Glycerin <SEP> 
<tb> 0, <SEP> 05 <SEP> lösliche <SEP> Anteile <SEP> der <SEP> Gar-und <SEP> Destillationsschlempe <SEP> (distillers <SEP> solubles)
<tb> 0,1 <SEP> % <SEP> Calciumcarbonat
<tb> 0,5 <SEP> % <SEP> Natriumbromid
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> 100 <SEP> Teile.
<tb> b) <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Baumwollsamenmehl
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Glucose <SEP> 
<tb> 0,

  05 <SEP> % <SEP> lösliche <SEP> Anteile <SEP> der <SEP> Gär- <SEP> und <SEP> Destillationsschlempe <SEP> (distillers <SEP> solubles)
<tb> 0,1 <SEP> % <SEP> Calciumcarbonat <SEP> 
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Natriumbromid
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> 100 <SEP> Teile.
<tb> c) <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> lu <SEP> Maisquellwasser <SEP> (50% <SEP> zig) <SEP> 
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> Glucose <SEP> (Cerelose)
<tb> 0,1 <SEP> % <SEP> Calciumcarbonat
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Natriumbromid
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> 100 <SEP> Teile.
<tb> d) <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Sojabohnenmehl
<tb> 1,0 <SEP> % <SEP> Glucose <SEP> (Cerelose)
<tb> 0, <SEP> 05"/0 <SEP> Hefeextrakt <SEP> 
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> Calciumcarbonat
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> Natriumbromid <SEP> 
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> 100 <SEP> Teile.
<tb> e) <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> D/o <SEP> Sojabohnenmehl <SEP> 
<tb> 0,

  5 <SEP> % <SEP> Maisstärke
<tb> 0,1 <SEP> % <SEP> enzymatisch <SEP> abgebautes <SEP> Kasein <SEP> (N-Z-Amine <SEP> B)
<tb> 0, <SEP> 3 <SEP> % <SEP> Natriumnitrat <SEP> 
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Kaliumbromid
<tb> 0,5 <SEP> "/0 <SEP> Calciumcarbonat <SEP> 
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> 100 <SEP> Teile.
<tb> f) <SEP> 1, <SEP> enzymatisch <SEP> abgebautes <SEP> Kasein <SEP> (N-Z-Amine <SEP> B)
<tb> 1,0 <SEP> % <SEP> Glucose <SEP> (Cerelose)
<tb> 0,5 <SEP> % <SEP> Hefeextrakt <SEP> 
<tb> 0,1 <SEP> % <SEP> Calciumcarbonat <SEP> 
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Calciumbromid <SEP> 
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> 100 <SEP> Teile.
<tb> g) <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Rohrzucker
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Sojabohnenmehl
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> D/o <SEP> Sojapepton <SEP> 
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 4> 

 
 EMI4.1 
 
<tb> 
<tb> 1, <SEP> 5 <SEP> Ufo <SEP> Monokaliumphosphat
<tb> 0,

   <SEP> 5 <SEP> Ufo <SEP> Diammoniumphosphat <SEP> 
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> Ufo <SEP> Natriumbromid <SEP> 
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> 100 <SEP> Teile.. <SEP> 
<tb> 
 



   Beispiel 2 : Unter Verwendung von Streptomyces viridifaciens (ATCC 11989) wird in gleicher Weise und mit der gleichen   Nährlösung   wie im Beispiel 1 gearbeitet. Gleichzeitig wird ein Kontrollversuch durchgeführt, bei dem unter gleichen Bedingungen eine Nährlösung ohne Zusatz von Natriumbromid verwendet wird. 



   Nach Beendigung der Gärung wird der Gehalt an Tetracyclin und Chlortetracyclin mit Hilfe der Papierchromatographie bzw. dem vorstehend geschilderten biologischen Untersuchungsverfahren bestimmt Dabei ist festzustellen, dass die Kulturflüssigkeit mit   0, 50/0   Natriumbromid nach 20-bzw. 44stündiger 
 EMI4.2 
 



   Die hemmende Wirkung der Bromidionen auf die chlorierende Gärung ist aus diesen Vergleichsversuchen eindeutig ersichtlich. 



   Beispiel 3 : Je zweimal 200   cm 3 einer   Nährlösung nachstehender Zusammensetzung werden in einem 1 1 fassenden Erlenmeyerkolben   15   Minuten im Dampf bei ungefähr 1, 05 atü sterilisiert, abgekühlt und mit 1 cm3 einer vegetativen 24 Stunden-Kultur von Streptomyces viridifaciens (ATCC 11989) beimpft ; die beimpften Kolben werden auf einer sich hin-und herbewegenden Schüttelmaschine 48 Stunden lang geschüttelt, wonach die Gärlösung zwecks Bestimmung des Tetracyclin- und Chlortetracylingehaltes vom Pilzmycel abgetrennt wird. 



   Die Gärfiltrate werden zentrifugiert und papierchromatographisch untersucht. Die nachstehende Tabelle zeigt die Mengen an Chlortetracyclin und Tetracyclin, die bei der Vergärung in verschiedenen Nährlösungen mit und ohne Zusatz von Natriumbromid erhalten werden. 



   Tabelle 
 EMI4.3 
 
<tb> 
<tb> Probe <SEP> Nr. <SEP> : <SEP> l <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5
<tb> Rohrzucker <SEP> % <SEP> 1,0 <SEP> 1,0 <SEP> 1,0 <SEP> 1,0 <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> KHPO <SEP> % <SEP> 1. <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 1,5
<tb> (NHHPO <SEP> % <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 5
<tb> MgSO4 <SEP> % <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> Maisquellwasser <SEP> % <SEP> 1,0 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 1,0 <SEP> 1,0
<tb> NaBr <SEP> % <SEP> 0 <SEP> 0,5 <SEP> 0 <SEP> 0,5 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 
<tb> PH <SEP> des <SEP> erhaltenen <SEP> Gärfiltrates <SEP> 5,4 <SEP> 5,

   <SEP> 3
<tb> Chlortetracycli <SEP> ! <SEP> i <SEP> % <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> 95 <SEP> < 5 <SEP> < 5 <SEP> 
<tb> Tetracyclin <SEP> 0 <SEP> 90 <SEP> 5 <SEP> > 95 <SEP> > 95 <SEP> 
<tb> 
 
Probe Nr. 2 enthält etwa 100   pg   Tetracyclin pro   cm'.   



   Beispiel 4 : Ersetzt man in Beispiel 3 das Natriumbromid durch Kaliumbromid, Calciumbromid, Ammoniumbromid,   Kaliumjodid   (von dem weniger als 0,   5   verwendet wird) oderNatriumrhodanid, so wird die Tetracyclinmenge auf Kosten des Chlortetracyclins in etwa gleichem Verhältnis erhöht. 



   Beispiel 5: Verwendet man in Beispiel 3 Streptomyces aureofaciens   (NRRL 2209) an Stelle von   Streptomyces viridifaciens (ATCC 11989), so bewirkt der Zusatz von Bromid-, Jodid- oder Rhodanidionen zur Nährlösung ebenfalls eine Erhöhung der Tetracyclinausbeute auf Kosten der Bildung von Chlortetracyclin. Dies ist besonders dann der Fall, wenn eine für diesen Streptomycetenstamm besonders geeignete Nährlösung,   z. B.   wie sie in der USA-Patentschrift Nr. 2, 482, 055 beschrieben ist, verwendet wird.

Claims

PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclin durch Züchtung eines Chlortetracyclin erzeugenden Streptomycetenstammes, insbesondere Streptomyces viridifaciens (ATCC 11989) oder Streptomyces aureofaciens (NRRL 2209) in einer Chlorionen enthaltenden Nährlösung üblicher Zusammensetzung unter submersen Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fermentation, zwecks Hemmung der fermentativen Chlorierung, in Gegenwart einer Verbindung, die unter den Verfahrensbedingungen Bromid-, Jodid- oder Rhodanidionen zu liefern vermag, oder eines Gemisches solcher Verbindungen, durchführt und so lange fortsetzt, bis die Garflüssigkeit eine optimale bakteriostatische Wirksamkeit aufweist, worauf man das so gebildete Tetracyclin in üblicher Weise isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verbindung, die unter den Verfahrensbedingungen Bromid-, Jodid- oder Rhodanidionen zu liefern vermag oder das Gemisch sokher Verbindungen in Mengen von 0, 01 bis 5,0 Grew.-%, berechnet als Natriumbromid und bezogen auf die Nährlösung, zusetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Verbindung, die unter den Verfahrensbedingungen Bromid-, Jodid- oder Rhodanidionen zu liefern vermag, ein Alkali- oder Erd- alkalibromid,-jodid oder-rhodanid, insbesondere Natriumbromid, Kaliumbromid oder Calciumbromid, verwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Verbindung, die unter den Verfahrensbedingungen Bromidionen zu liefern vermag, Ammoniumbromid oder Bromwasserstoffsäure, verwendet.