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Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums WG 696
EMI1.1
EMI1.2
<tb>
<tb> Glycerin <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Maisquellwasser <SEP> 50% <SEP> 2, <SEP> 5- <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Peptone <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> MgSq <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> g
<tb> KH <SEP> : <SEP> lq <SEP> 0, <SEP> 06 <SEP> g
<tb> Fes4 <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> g
<tb> Cusp. <SEP> 0. <SEP> 004g <SEP>
<tb> Agar <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> auf <SEP> 1000 <SEP> ml,
<tb> PH <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
gekennzeichnet, auf welchen sich nach Animpfen innerhalb von 48 h bei einer Temperatur von 250C Kolonien von etwa 2 cm im Durchmesser entwickeln.
Das Mycel ist in den beiden ersten Tagen weiss und niedrig, dann entwickelt sich ein wollartiges seriales Mycel und nach 96 h beginnt die Bildung von Konidien, wobei sich die ganze Kolonie dunkelgrun färbt.
Eine mikroskopische Untersuchung zeigt, dass das Mycel hyalin und septiert ist und 3, 2 mg breite Hyphen hat. Die Konidienträger sind aufrecht und verzweigt. Die Phialiden treten getrennt oder in Quirln
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auf und sind flaschenförmig, 6-10 my lang und 2, 5-3, 5 m breit. Die Konidien sind hyalin, einzellig, glatt und blass grün. Sie sind kugelförmig oder schwach eiförmig und von gleichmässiger Grösse, etwa einer Grösse von 3, 0 bis 3, 2 mJ !. im Durchmesser. Die Konidien liegen in Form von Ketten vor, die im vorgeschrittenen Wachstumsstadium kugelförmige, klebrige Klumpen bilden, von welchen jeder etwa 10 bis 20 Konidien enthält.
Wenn der Pilz in einem flüssigen Kulturmedium gezüchtet wird, werden im Verlauf von 48 bis 144 h beträchtliche Mengen von WG 696 gebildet, die durch einen Agarschalentest unter Verwendung von Candida albicans als Testorganismus nachweisbar sind. Die Fähigkeit zur Bildung von WG 696 wurde in einer Reihe von Versuchen nachgewiesen, bei welchen der Pilz in verschiedenen Kulturmedien bebrütet wurde.
Bei diesen Versuchen wurden 75 ml eines flüssigen Kulturmediums in einen Schüttelkolben mit einem Inhalt von 500 ml eingebracht und nach dem Sterilisieren mit einer vegetativen Kultur des Pilzes angeimpft und hierauf wurde die Fermentation bei einer Temperatur von 270C in einer hin-und hergehenden Schüttelvorrichtung durchgeführt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind aus der nachstehend angeführten Tabelle ersichtlich, in der in der ersten Spalte das verwendete Substrat und in der zweiten und dritten Spalte die Hemmungszone angegeben ist, die bei dem erwähnten Agarschalentest nach einer Bebrütungszeit von 2 bzw. 6 Tagen bestimmt wurde.
EMI2.1
<tb>
<tb> i <SEP> n <SEP> in <SEP>
<tb> S-200 <SEP> 22mm <SEP> 23mm <SEP>
<tb> S-25 <SEP> 47mm <SEP> 41mm <SEP>
<tb> S-45 <SEP> 33mm <SEP> 33mm <SEP>
<tb> S-205 <SEP> 33mm <SEP> 30mm <SEP>
<tb>
Die Zusammensetzung der verwendeten Substrate war wie folgt :
S - 200 :
EMI2.2
<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> 50% <SEP> 20 <SEP> g
<tb> KH2PO4 <SEP> 10 <SEP> g
<tb> MgS04 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Saccharose <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> auf <SEP> 1000 <SEP> ml,
<tb> pH <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP>
<tb>
S-25 :
EMI2.3
<tb>
<tb> Glycerin <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Maisquellwasser <SEP> 50% <SEP> 2,5 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Staley's <SEP> Nährstoff <SEP> (Sojabohnenmehl) <SEP> 15, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> MgS04 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> g
<tb> KH <SEP> : <SEP> 104 <SEP> 0, <SEP> 06 <SEP> g
<tb> FeS04 <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> g
<tb> CuSO4 <SEP> 0, <SEP> 004 <SEP> g <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> auf <SEP> 1000 <SEP> ml,
<tb> PH <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
S - 45 :
EMI2.4
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> NH4NO3 <SEP> 3,0 <SEP> g
<tb> KH2PO4 <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> Glycerin <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> MgS04 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> KCl <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> FeS04 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> g <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 3>
EMI3.1
<tb>
<tb> VAS04 <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP> g
<tb> Biotin <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> mg
<tb> Tierisches <SEP> Öl <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> Leitungswasser <SEP> auf <SEP> 1000 <SEP> ml,
<tb> PH <SEP> 6, <SEP> 9 <SEP>
<tb>
S-2052
EMI3.2
<tb>
<tb> Fleischextrakt <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Fischmehl <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Maisquellwasser <SEP> 50% <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Ammonacetat <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> Saccharose <SEP> 36 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> 9 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> auf <SEP> 1000 <SEP> ml,
<tb> PH <SEP> 7,
<SEP> 0 <SEP>
<tb>
Die nach dem Verfahren gemäss der Erfindung erhaltene Verbindung WG 696 ist ein neutraler Stoff, der in Wasser nur in geringem Umfang löslich ist, aber in den meisten organischen Lösungsmitteln, wie Kohlenwasserstoffen, chlorierten Kohlenwasserstoffen, Alkoholen, Ketonen, Estern u. dgl., leicht löslich ist.
Die Verbindung enthält 69, 52% Kohlenstoff und 8,30go Wasserstoff und daneben nur mehr Sauerstoff, entsprechend der Formel C17H24O4, die auch mit den Ergebnissen der Molekulargewichtsbestimmung dieser Verbindung übereinstimmt.
Der Schmelzpunkt der kristallinen Verbindung liegt bei 46 C, der Siedepunkt bei 110 - 1120C pro 0,05mmHg.
Die Verbindung WG 696 ist optisch aktiv und hat eine spezifische Drehung [a. ] von -110 in Chloroform (loco). Sie ist ferner durch ihr UV-Spektrum in Äthanol, das ein Absorptionsmaximum bei etwa 205 mu (E = 2400) zeigt, und durch ihr Spektrum im UR-Bereich gekennzeichnet, in welchem es, wie aus der Zeichnung hervorgeht, charakteristische Absorptionsbanden bei den in reziproken Zentimetern ausgedrückten Frequenzen v = 960, 970,1032, 1084,1224, 1245,1376 und 1735 cm' aufweist, wenn diese Bestimmung mit Hilfe einer Lösung der Verbindung in Tetrachlorkohlenstoff (lao) erfolgt.
Die spezifischen Aktivitäten der Verbindung WG 696 wurden mit Hilfe von Reihenverdünnungsversuchen bestimmt. Die Ergebnisse dieser mikrobiologischen Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle
EMI3.3
mung der Aktivität gegen Pilze Sabouraud's Nährlösung, zur Bestimmung der Aktivität gegen Bakterien Fleischwasser verwendet.
EMI3.4
<tb>
<tb>
IC <SEP> in
<tb> Organismus <SEP> g/ml <SEP>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> ATCC <SEP> 10231 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> LSH <SEP> Z <SEP> 248 <SEP> 0,32
<tb> Candida <SEP> parakrusei <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP>
<tb> Candida <SEP> parakzusei <SEP> 0, <SEP> 40 <SEP>
<tb> Candida <SEP> utilis <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Aspergillus <SEP> fumigatus <SEP> CBS <SEP> 16
<tb> Trichophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> CBS <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP>
<tb> Trichophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> CBS <SEP> 0, <SEP> 40 <SEP>
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> 0,10
<tb> Gliocladium <SEP> deliquescens <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Verticillium <SEP> sp. <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Cephalosporium <SEP> sp. <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Fusarium <SEP> sp.
<SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
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Tabelle (Fortsetzung)
EMI4.1
<tb>
<tb> In <SEP> 50 <SEP> in <SEP>
<tb> Organismus <SEP> IL <SEP> gl <SEP> ml <SEP>
<tb> Fusarium <SEP> sp. <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Fusarium <SEP> sp. <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Mucor <SEP> flavus <SEP> 3,2
<tb> Cunninghamella <SEP> elegans <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP>
<tb> CunningnamellÅa <SEP> blakesleana <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Absidia <SEP> cylindrpspora <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> l, <SEP> 3
<tb> Penicillium <SEP> sp. <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Penicillium <SEP> sp. <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Aspergillus <SEP> sp.
<SEP> 12, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Aspergillus <SEP> flavus <SEP> 12,5
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 100
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 100
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> FDA <SEP> 1001 <SEP> 100
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> NCTC <SEP> 6175 <SEP> 100
<tb> Corynebacterium <SEP> xerosis <SEP> NCTC <SEP> 9755 <SEP> 100
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 100
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> NCTC <SEP> 5710 <SEP> 100
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 100
<tb> Vibrio <SEP> comma <SEP> BCTC <SEP> 8367.
<SEP> 100
<tb>
Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, dass die Verbindung WG 696 in den angewendeten Konzentrationen nur eine geringe antibakterielle Wirkung hat, wogegen ihre Aktivität sowohl gegen pathogene als auch gegen nicht-pathogene Pilze, einschliesslich solcher Pilze, die in der Landwirtschaft und Industrie als Schädlinge auftreten, ganz hervorragend ist.
Es ist jedoch verständlich, dass die bei den oben angeführten Versuchen festgestellte niedrige antibakterielle Aktivität die Möglichkeit einer Verwendung der Verbindung WG 696 zur Bekämpfung von bestimmten Bakterien, wenn diese Verbindung in höheren Konzentrationen verwendet wird, nicht ausschliesst, und dass ferner auch eine Verwendung dieser Verbindung in Hinblick auf ihre allgemeine cytostatische Aktivität in Betracht gezogen werden muss. So haben beispielsweise Versuche gezeigt, dass die Verbindung WG 696 in niedrigen Konzentrationen das Wachstum von gewissen Tumorzellen, wie im Falle von Epidermis-Karzinomen des Nasen-Rachen-Raumes von Menschen in einer Gewebekultur, hemmt. Die spezifische Aktivität dieser Verbindung gegen Pilze ist jedoch, was ihre Verwendung in der Human- und Veterinärmedizin betrifft, besonders vorteilhaft.
In dieser Hinsicht ist auch ihre niedrige Toxizität bemerkenswert. So konnte bei Tierversuchen, wenn die Verbindung Mäusen subkutan in Form einer Lösung in einem pflanzlichen Öl verabreicht wurde, ein LD50 -Wert von 500 bis 1000 mg/kg beobachtet werden, und wenn die Verbindung in der gleichen Form oral verabreicht wurde, betrug die LD50 über 1000 mg/kg.
Ferner zeigten sich bei topischer Anwendung auf der Haut keine nachteiligen Wirkungen und die Verbindung erwies sich bei der topischen Behandlung von Mykosen bei Mensch und Tier als sehr nützlich. So zeigte sie sich z. B. bei der klinischen Behandlungvon durch den Pilz Candida albicans verursachten Hautinfektionen bei Menschen besonders brauchbar und es konnten sogar schwere, durch diesen Pilz hervorgerufene Infektionen, die bei Anwendung anderer, bekannter Verbindungen mit einer Aktivität gegen Pilze nicht angegriffen werden, bei einer Behandlung mit der Verbindung WG 696 geheilt werden.
Das Verfahren gemäss der Erfindung umfasst die Verfahrensschritte, die darin bestehen, dass der Organismus Trichoderma viride Leo ND 8 oder eine natürliche oder künstliche Mutante oder Variante davon, die WG 696 bildet, in einem wässerigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird, bis die Lösung eine wesentliche Aktivität gegen Pilze aufweist, und dann das auf diese Weise gebildete WG 696 isoliert wird.
Bei Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung wird die Bildungsgeschwindigkeit der Verbindung WG 696 während der gesamten Fermentationsdauer durch routinemässige Bestimmung der Aktivität des Kulturfiltrats festgestellt, wobei für diesen Zweck der Agarschalentest, beispielsweise unter Ver-
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wendung von Candida albicans als Testorganismus, angewendet wird.
Nach den bei der Herstellung der Verbindung WG 696 in einem halbtechnischen Massstab erhaltenen
Ergebnissen wurde die optimale Ausbeute an diesem Stoff in einem Zeitraum von 48 bis 96 h erzielt, wenn das Fermentationsverfahren bei einer Temperatur von 20 bis 30 C. vorzugsweise einer Temperatur von etwa 27 C, durchgeführt wurde. Der Temperaturbereich ist jedoch nicht kritisch, da die zum Erhalt die- ser Ausbeuten erforderliche Zeit in einem gewissen Umfang von der mechanischen Beschaffenheit bzw.
Art des Fermentationsgefässes und von der Type der verwendeten Rühreinrichtung abhängt.
Bei Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung hat sich eine grosse Anzahl der bekannten Kulturmedien, u. zw. sowohl der vollständigen, als auch der minimalen Medien, als brauchbar erwiesen.
Als Kohlenstoff-und Energiequelle werden Zucker Fetten vorgezogen und von den Zuckern werden Glucose, Fructose, Galactose, Sorbose und Xylose vorzugsweise verwendet, wogegen Saccharose und Lactose von dem Pilz nicht assimiliert werden.
Als besondere Bestandteile, die an der Zusammensetzung eines geeigneten Kulturmediums beteiligt sind, können Hefeextrakt, Glycerin, Caseinhydrolysate oder Amminosäuren und bestimmte wasserlösliche Vitamine erwähnt werden, und der pH-Wert des Substrates wird vorzugsweise auf etwa 4, 5-6, 5 eingestellt, bevor das Fermentationsverfahren begonnen wird.
Wenn die Bildung der Verbindung WG 696 beim Fermentationsverfahren aufhört oder wenn eine zufriedenstellende Ausbeute erreicht ist, wird die Verbindung abgetrennt, aber vorzugsweise nicht bevor dab Mycel von dem Kulturmedium, z. B. durch Filtration, getrennt ist. Die Verbindung WG 696 wird von der Kultur am besten durch Extraktion derselben mit einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nicht mischbar oder nur teilweise mischbar ist, wie Methyl-isobutylketon, Hexan, Chloroform, Leichtpetroleum od. dgl., isoliert.
Der nach Eindampfen des Extraktionsmediums erhaltene Rückstand ist die rohe Verbindung WG 696.
Wenn dieses Produkt einer fraktionierten Destillation im Vakuum unterworfen oder chromatographiert wird, wird die reine Verbindung in flüssiger Form erhalten. Als geeignete Adsorbentien für die Chromatographie sind beispielsweise neutrales Tonerde- oder Kieselsäuregel, und als Lösungsmittel für diesen Zweck insbesondere Kohlenwasserstoffe oder Mischungen von Kohlenwasserstoffen und Äther zu nennen.
Das auf diese Weise erhaltene flüssige Produkt behält, selbst wenn es rein ist, bei einer Temperatur in der Nähe der Raumtemperatur die erwähnte physikalische Form auf Grund einer ausgeprägten Kristalli - sationsträgheit eine gewisse Zeit lang bei und kann gewünschtenfalls in dieser Form verwendet werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäss der Erfindung wird jedoch auf einfache Weise die Verbindung WG 696 in kristalliner Form erhalten, indem der oben erwähnte Rückstand statt einer fraktionierten Destillation einem Kristallisationsverfahren unterworfen wird, was im Falle einer Herstellung in technischem Massstab ein Vorteil sein kann, da die Verbindung WG 696 bei erhöhten Temperaturen mehr oder minder instabil ist und selbst dann instabil ist, wenn sie längere Zeit auf die Temperaturen, die für eine Vakuumdestillation erforderlich sind, beispielsweise Temperaturen von 110 bis 120 C, erhitzt wird.
Bei dieser günstigen Ausführungsform wird das die Verbindung WG 696 enthaltende Kulturmedium mit einem aliphatischen Kohlenwasserstoff, wie Leichtpetroleum, extrahiert und die erhaltene organi-
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WG 696 in kurzer Zeit kristallisiert.
Im allgemeinen ist es aber vorteilhaft, die Kristallisation in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels, wie eines Kohlenwasserstoffes, vorzugsweise eines aliphatischen Kohlenwasserstoffes, in dem die Verbindung WG 696 bei niedrigen Temperaturen schwer löslich ist, wie Leichtpetroleum mit einem Kp. von 40 bis 50 C, durchzuführen. Nach dem Kristallisieren wird die ausgefallene Verbindung WG 696 abgetrennt und bei Raumtemperatur getrocknet.
In gewissen Fällen, beispielsweise wenn der oben erwähnte Rückstand nicht genügend rein ist, kann es sich als vorteilhaft erweisen, diesen Rückstand vor Durchführung des erwähnten Kristallisationsprozesses einer mehr oder weniger wirksamen fraktionierten Destillation zu unterwerfen oder zu chromatographieren.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel l : 300 ml eines Substrates der Zusammensetzung
EMI5.2
<tb>
<tb> Glycerin <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> 50% <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Staley's <SEP> Nährstoff <SEP> (Sojabohnenmehl) <SEP> 15, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> MgS04 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> g
<tb> KH2P04 <SEP> 0, <SEP> 06 <SEP> g
<tb> FeS04 <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> g
<tb> CUSO4 <SEP> 0, <SEP> 004 <SEP> g
<tb>
EMI6.2
pH-Wert von 6, 5 eingestellt und 30 min lang bei einer Temperatur von 1200C sterilisiert.
Nach dem Abkühlen wurde der Inhalt des Kolbens mit einer vegetativen Kultur von Trichoderma viride Leo ND 8, die aus dem Sporenbildungsstadium entwickelt worden war, angeimpft und dann in einer hin-und hergehenden Schütteleinrichtung in einem mit einem Thermostaten ausgestatteten Raum auf einer Temperatur von 270C gehalten. Die Bildung der Verbindung WG 696 wurde durch Bestimmung der Hemmungszone beim Agarschalentest auf filtrierten Proben des Kulturmediums, wobei Candida albicans als Testorganismus verwendet wurde, verfolgt. Nach einer Fermentationszeit von 48 h betrug die Gesamtausbeute 300 J1. g/ml des Kulturmediums.
Beispiel 2 : 10001 Substrat der oben erwähnten Zusammensetzung, wobei jedoch die Glucosekonzentration auf 5% erhöht war, wurden in einen Tank aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsraum von 1500 l eingebracht und bei einer Temperatur von 1200C 30 min lang sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde der Inhalt des Tanks mit 2, 5 1 einer vegetativen Kultur von Trichoderma viride Leo ND 8 angeimpft, die durch Bebrüten des Pilzes in einem Medium der gleichen Zusammensetzung, wie sie in Beispiel 1 angegeben ist, während eines Zeitraumes von 48 h in einer hin-und hergehenden Schütteleinrichtung bei einer Temperatur von 270C erhalten worden war.
Das Fermentationsverfahren in dem Gefäss von halbtechnischem Massstab wurde 72 h lang bei einer Temperatur von 270C unter Rühren und Belüftung
EMI6.3
6 m3/h8 l der geklärten Kulturflüssigkeit wurden auf einen pH-Wert von 8, 0 eingestellt und zweimal mit Leichtpetroleum (Kp. 40 - 500C) extrahiert ; die vereinigten Auszüge (3 l) wurden mit 500 ml Wasser gewaschen, getrocknet und bis zur Sirupkonsistenz eingeengt und der erhaltene Sirup wurde anschliessend im Vakuum destilliert. Die Fraktion mit einem Kp. von 110 bis 1120C/0, 05 mm Hg lag in einer Menge von 2, 1 g vor und stellte die reine Verbindung WG 696 dar
EMI6.4
5 g der auf die oben angeführte Weise erhaltenen Verbindung WG 696 wurden in 50 ml Pentan gelöst und die erhaltene Lösung wurde unter Rühren langsam auf eine Temperatur von -700C abgekühlt, wobei - die Verbindung in Form von farblosen Kristallen ausfiel.
Die Kristalle wurden abfiltriert, mit kaltem Pentan (Temperatur -50 bis -70 C) gewaschen und getrocknet ; es wurde die gewünschte kristalline Ver- bindung in einer Ausbeute von 4,6 g mit einem Fp. von 460C erhalten.
Die Elementaranalyse, die optische Drehung und das UR-und UV-Spektrum waren identisch mit den entsprechenden Daten für das vorhin genannte ölige Produkt.
Beispiel 3 : 100 1 eines Substrates der Zusammensetzung
EMI6.5
<tb>
<tb> Glycerin <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Maisquellwasser <SEP> 50% <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Staley's <SEP> Nährstoff <SEP> (Sojabohnenmehl) <SEP> 15, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Mis04 <SEP> 0,05 <SEP> g
<tb> KHZP04 <SEP> 0, <SEP> 06 <SEP> g
<tb> FeS04 <SEP> 0, <SEP> 005 <SEP> g
<tb> CuSO4 <SEP> 0, <SEP> 004 <SEP> g
<tb>
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pro Liter Leitungswasser wurden in einem Fermenter einer Versuchsanlage mit einem Fassungsraum von 200 1 auf einen pH-Wert von 6, 5 eingestellt und 30 min lang bei einer Temperatur von 120 C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde der Inhalt des Fermenters mit 0,5 l einer vegetativen.
Kultur von Trichoderma viride Leo ND 8 angeimpft, die durch Bebrüten des Pilzes in einem Kulturgefäss während eines Zeitraumes von 48 h auf einer hin-und hergehenden Schütteleinrichtung bei einer Temperatur von 270C erhalten worden war, wobei das bei diesem Keimverfahren verwendete Substrat die gleiche Zusammensetzung, die oben angegeben ist, aufwies, mit der Abweichung, dass die Konzentration an Glucose nur 1% betrug.
In dem Fermenter der Versuchsanlage wurde ein Fermentationsverfahren 72 h lang bei einer Temperaturvon 270C unter Rühren und Belüftung durchgeführt. Am Ende des Fermentationsprozesses lag ein Gehalt von 250 bug an der Verbindung WG 696 pro ml des Kulturmediums vor, wie sich beim Agarschalentest unter Verwendung von Candida albicans als Testorganismus zeigte.
25 1 der geklärten Brühe wurden auf einen pH-Wert von 8, 0 eingestellt und zweimal mit Leichtpetroleum (Kp. 40-50 C) extrahiert. Die vereinigten Auszüge (6 l) wurden mit Wasser (l l) gewaschen, getrocknet und auf eine sirupartige Konsistenz eingedampft ; der erhaltene Sirup wurde in 50 ml Pentan gelöst. Diese Lösung wurde langsam unter Rühren auf eine Temperatur von -700C abgekühlt, wobei sich die Verbindung WG 696 in Form von farblosen Kristallen ausschied, die abfiltriert, mit kaltem Pentan gewaschen und getrocknet wurden. Es wurden 5,2 g der Verbindung mit einem Fp. von 44 bis 460C erhalten.
Die auf diese Weise gewonnene Verbindung wurde neuerlich in Pentan (50 ml) gelöst und die Kristallisation unter Kühlen der Lösung auf eine Temperatur von -200C unter Rühren wiederholt. Die ausge-
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den.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums WG 696, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus Trichoderma viride Leo ND 8 (ATCC. Nr. 14910) oder eine die Verbindung WG 696 bildende natürliche oder künstliche Mutante oder Variante dieses Organismus in einem wässerigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff-und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen bebrütet wird, bis die Lösung nach etwa 48 - 144 h eine wesentliche Aktivität gegen Pilze aufweist, und dann die auf diese Weise gebildete Verbindung WG 696 aus dem Kulturmedium, vorzugsweise mit einem organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, extrahiert wird, die Lösungsmittelphase bzw. organische Phase abgetrennt und die Verbindung WG 696 daraus isoliert wird.
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