Verfahren zur Herstellung von Distamycin und Distaein Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von neuen Antibiotica, welche im folgenden als Distamycin und Distacüi bezeichnet werden. Das erfindungsgemässe Verfahren ist daduTch gekennzeichnet, dass man Streptomyces distallicus in einer Nährlösung kultiviert, welche min- de,stens eine Quelle für assitnilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff sowie Mineralsalze enthält.
Die genannten Antibiotica sind bisher nicht be schrieben worden. Präparate, welche diese neuen Antibiotica enthalten, sind hochwirksarn gegenüber mehreren pathogenen Pilzen und Schizomyceten.
Von der neuen Streptomyces-Art wurde --in Stamm aus einer Bodenprob-- aus Campania (Provinz Neapel) isoliert.
Es hat sich gezeigt, dass der isolierte Stamm der genannten Species keiner der Arten entspricht, welche in Bergeys Handbuchoder durch Wasksman-Leche- velier in Actinomycetes and their Antibiotics <B>(1953)</B> klassifiziert worden sind.
Diese neue Art wurde als <B> </B> Streptomyces distallicu,s bezeichnet und eine Kultur davon im Commonwealth Mycological Institute Ferry Lane, Kew, Surrey (England) unter der Nummer IMI <B>72672</B> hinterlegt.
Der genannte Mikroorganismus zeigt folgende Eigenschaften: Unter dem Mikroskop zeigen sich ziemlich gerade, kaum verzweigte, lange Hyphen. Auf Hefeagar erscheinen lange und gestreckte Hyphen mit Wirb,-In aus kurzen gestreckten sympodischen Hyphen. Auf Kartoffelagar, Rübenagar und Aspara- ginagar bildet sich ein vegetabiles Mycelium,
dessen Farbe auf der einen Seite bzDim Altem von honiggelb auf braun, auf der entgegen-gesetzten Seite von blass- braun auf kastanienbraun wechselt. Das Luftraycelium ist bei den genannten Zuchtmedien nur schwach aus gebildet und hat ein staubiges, satinartiges Aussehen und in den ersten Tagen des Wachstums eine grau weisse und später eine schwach cremegraue Farbe; auf Asparaginagar zeigt es eine schwach violettbraune Tönung.
Auf Stärkeagar und Czapekagar ändert sich die Farbe des vegetativen Myceliums von farblos zu honiggelb, während die Rückseite gelb ist. Auf Czapek ist das Ltiftmycclitim gräulichweiss und auf Stärke- aigar schwach wein- bis rosarot, stets staubig und satinartig.
In Fleischbrühe und Pepton-Glukose-Brühe wird ein reichliches vegetatives Mycelium erzeugt, das in Form von Flocken meistens vollständig untergetaucht ist. Bei Fleischbrühe wächst es auch an der Ober fläche in Ringforin, wobei eine Seite honiggelb, die entgegengesetzte Seite gelb ist. Ein Luftmycelium fehlt.
Auch auf Gelatine er-folgt ein reichliches Wachstum; das vegotative Mycelium ist braun bis honiggelb mit gelbbrauner Rückseite; das Luftmyce- lium ändert sich von gräulich-weiss zu grau; es zeigt sich ein diffuses braunschwarzes Pigment, während auf andern Substraten keine Pigmentierung auftritt. Es verflüssigt die Gelatine nach<B>25</B> Tagen ziemlich stark und hydrolysiert Stärke beträchtlich.
Das ge eignetste Kulturmedium, zur Erzielung eines guten Wachstums an Mycelium und einer entsprechend höheren antibiotischen Wirkung enthält als Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff Kohlehydrate.
Als Kohlehydratquelle können Glukose, Saccha- rose, Maltose, Stärke und auch die in der Getreide weiche enthaltenen Kohlehydrate benutzt werden.<B>Als</B> Stickstoffquelle können dienen: Getreideweiche, Soja bohnenmehl sowie Ammoniumsalze. Ausserdem wer den NaC1, CaCO <B>33</B> K2HPOP Mgs04, FeS04 <B>USW.</B> zugesetzt.
Der pH-Wert der Brühe beträgt etwa<B>6,6.</B> Die Fermentierung kann in einem 300-cm3-Erlen- mayer-Kolben unter guter Belüftung bei<B>280 C</B> erfol gen. Die höchste Aktivität ergibt sich nach<B>100</B> bis 120 Stunden bei einem pH von etwa<B>7,6.</B>
Die Kultivierung des Mikroorganismus kann aerob und submers unter Rühren und Belüftung erfolgen. Um ein gutes Wachstum der Kulturen zu erzielen, kann man eine Zuchtbrühe verwenden, welche mehrere Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält.
Die erfindungsgemäss erhaltenen Antibiotica wer den in der Regel isoliert. Im allgemeinen erfolgt die Isolierung der aktiven Produkte aus den Kulturen dadurch, dass man das von der Zuchtflüssigkeit abge trennte Mycelium mit Lösungsmitteln, z. B. Alko holen, insbesondere Methyl-, Äthyl- und n-Butyl- alkohol, extrahiert.
Am besten bewährt hat sich die Verwendung von Butylalkohol. Die Extraktion wird im allgemeinen so ausgeführt, dass man das Mycelium nacheinander mit kleinen Mengen des Lösungsmittels schüttelt, die Auszüge durch Zentrifugieren oder Fil trieren abtrennt, mit Wasser wäscht und im Vakuum eindampft, wobei man aus dem so, erhaltenen öligen Konzentrat durch Behandeln mit Äther einen gelben oder gelbbraunen Niederschlag gewinnt, welcher ge trocknet wird. Dieses Produkt (Distamycin) Zeigt ein Ultraviolett-Absorpt-ionsspektrum, wie es für ein kon jugiertes Polyen charakteristisch ist.
Die Maxima im Ultraviolett-Spektrum finden sich bei<B>235, 290, 305,</B> <B>318, 333, 350, 380</B> und 405 ma. Die Maxima beJ <B>318, 333</B> und<B>350</B> mu sind typisch für ein Chromo- phor mit fünf DoppelAindungen im Molekül. Mit kon zentrierter Schwefelsäure ergibt das Produkt eine tief violette Färbung. Es enthält Stickstoff.
Das Produkt ist in niedrigen Alkoholen, Äthyl- cellosolve, Pyridin und andern aliphatischen oder aromatischen Basen sowie auch in Eisessig löslich. Teilweise löst es sich in Chloroform, verdünnten Säuren und Basen, während es in Äther unlöslich ist. Es ist thermolabil, insbesondere bei saurem und ba sischem pH, in methanolischer Lösung hingegen stabil.
Chromatographische Ri-Werte: Wässriges Butanol <B>0,15;</B> mit Butanol gesättigtes Wasser<B>0,3;</B> Butanol- Pyridin-Wasser <B>(1 : 0,6: 1) 0,6;</B> Butanol-Essigsäure- Wasser (2:1:1) 0,73; 3%ige Anmioniumchlorid- lösung 0,04;
6011/oiges Aceton<B>0,8;</B> Benzol-Essig- säure-Wasser (2:2:<B>1) 0,00</B> (bioautographisch ent wickelt auf Candida albicans).
Das Infrarot-Absorptionsspektrtim zeigt ein Maxi mum bei 2,94 u mit Wendepunkten bei<B>3,00</B> und <B>3,05</B> p, zwei scharfe Maxima bei 6,04 und<B>6,33</B> /,t mit Wendepunkten bei<B>6,10,</B> 6,24,<B>6,52</B> und<B>6,58</B> u, eine weniger ausgeprägte Bande bei<B>5,82</B> it und eine hohe Absorptionsbande zwischen<B>6,8</B> und<B>7,3</B> #j.
Als Extraktionsmittel zur Isolierung von Dist- amycin und Distacin aus der Nährlösung kommen ausser den bereits genannten Alkoholen z. B. auch Chloroform, Aceton, Lösungen von aliphatischen, aromatischen oder heteroeyclischen Basen usw. in Betracht. Die erfindungsgemäss erhaltenen Produkte zeigen alle eine bemerkenswerte Hemmungswirkung gegenüber verschiedenen pathogenen Pilzen und Bak terien.
Insbesondere ist das durch Extraktion mit Butanol erhaltene Produkt mit den oben erwähnten Eigenschaften aktiv gegenüber<B>S.</B> lutea, B. subtilis, Mycobaeterium tuberculosis Stamm<B>607,</B> Actin. boströmi, <B>0.</B> albieans, Trich, mentagrophites, Sab. gypseus, Epid. floccosum und Deb. Hudeloi (siehe später).
Aus Distamycin lassen sich verschiedene Kompo nenten mit bemerkenswerter antibiotischer Wirkung erhalten. Diese neuen Verbindungen können aus dem Rohprodukt isoliert werden. Man kann auch durch Umwandlung desselben sehr aktive Verbindungen erhalten. Wenn man eine methanolische Distamycin- lösung durch eine Tonerdesäule filtriert,
gewinnt man das neue Produkt Distamycin <B>A .</B> Sein Ultraviolett- Spektrum zeigt Maxima bei 304 und 204 rap. Das Produkt er-gibt beim Behandeln mit konzentrierter Schwefelsäure eine weinrote Färbung. Es ist unlöslich in Chloroform, Äthylacetat, Aceton, Äther und ver dünnten Basen; kaum löslich ist es in einem Methanol- Äther-Gemisch <B>1 : 3.</B>
Distamycin <B>A</B> ist wirksamer als Distamycin. Es zeigt eine besondere Hemmungswirkung gegenüber gewissen Schizomyceten sowie gegenüber Actin. bo- strömi, <B>0.</B> albicans, Trich. mentagrophites, Sab. gyp- seus, Gl. graphii,
Epid. floccosum und Deb. Hudeloi (siehe später).
Durch Fraktionierung mit geeigneten Lösungs- mitteln (Chloroform, Alkohole, Alkohol-Äther-Ge- mische) kann man weitere aktive Produkte erhalten. Wird beispielsweise -eine methanolische Lösung eines Distamycin-Produktes mit Äther ausgefällt, so erhält man zwei neue Produkte, nämlich Distamycin B, wel ches in Methanol-Äther unlöslich ist, dessen Ultra- violett-Spektrum Maxima bei<B>230, 318, 333, 350, 380</B> und 405 m<B>C</B> ,u zeigt und das mit konzentrierter Schwe felsäure eine violette Färbung ergibt,
sowie Distamycin <B>C,</B> das im Methanol-Äther-Gemisch löslich ist und dessen Ultraviolett-Absorptionsspektrum durch ein bedeutendes Maximum bei<B>236</B> in <I>a</I> und durch eine im Vergleich zu den andern Produkten geringere Absorption bei<B>300-350</B> ma gekennzeichnet ist. Dieses Produkt ergibt mit kGnzentrierter Schwefel säure eine weinrote Färbung. Es ist in Chloroform und verdünnten Basen mit gelber Farbe fast vollständig löslich.
Alle Komponenten des Distamycins zeigen eine antibakterielle und fungieide Wirkung, welche der jenigen von Distamycin gleichkommt oder sie über trifft.
Die Distamycine <B>A,</B> B und<B>C</B> erweisen sich auf Grund ihrer Eigenschaften als verschieden von allen andern beim Stoffwechsel von Actinomyceten ent stehenden fungiciden Produkten, welche bisher iso liert oder genügend charakterisiert worden sind. Insbe sondere sind sie verschieden von Fungichromin und Philipin, das heisst Substanzen, welche ein Chromo- phor mit fünf Doppelbindungen im Molekül enthalten.
Aus der ätherischen Mutterlösung der Distamycin- Ausfällung lässt sich ein weiteres Produkt mit fungi- cider Wirkung erhalten, welches als Distacin be zeichnet wird. Dieses Produkt kann durch Kristalli sation aus wässrigem Aceton gereinigt werden.
Es handelt sich um eine gelbe kristalline Substanz, die in Wasser unlöslich, jedoch in vielen organischen Lösungsmitteln löslich ist, Schmelzpunkt 154-156o <B>C,</B> trum von Distacin zeigt Maxima bei<B>255</B> my
EMI0003.0012
= <B>- 17</B> (in Methanol). Das Ultraviolett-Spek- (EI% <B>=</B> 640) und 340 my (EI% = 470); seine Analysenwerte entsprechen einer Verbindung mit der Bruttoformel C,2H2,0.N.
Die UV-Absorptionsspektra der obengenannten Antibiotica sind im Diagramm der angefügten Zeich- nung angegeben;<B>A</B> bedeutet die Kurve für Distamycin und B diejenige für Distacin,- während<B><I>A', All</I></B> und <B>All'</B> die Kurven für die Fraktionen der Distaraycine <B><I>A,</I></B><I> B</I> und<B>C</B> darstellen.
Es wurde ferner festgestellt, dass auch das Filtrat der Kulturen von Streptomyces distallicus eine Hern- mungswirkung gegenüber Schizomyceten und Pilzen besitzt. Die antibiotische Wirksamkeit des Filtrats ist proportional der Produktion von Distamycin durch den Mikroorganismus. Nachfolgend sei das antibiotische Spektrum, von Distarnycin und seinen Derivaten wiedergegeben zur Darstellung von deren Aktivität gegenüber verschie denen Bakterien.
EMI0003.0035
<I>Antibiotisches <SEP> Spektrum <SEP> von <SEP> Distamycin <SEP> und <SEP> den <SEP> daraus <SEP> gewonnenen <SEP> Fraktionen <SEP> <B>A,</B> <SEP> B <SEP> und <SEP> <B>C</B></I>
<tb> Minimale <SEP> Hemmungsdosis <SEP> in <SEP> ug/cm3; <SEP> Verdünnung <SEP> in <SEP> Hefebrühe
<tb> Stämme <SEP> Distaraycin <SEP> Fraktion <SEP> <B>A</B> <SEP> Fraktion <SEP> B <SEP> Fraktion <SEP> <B>C</B>
<tb> Staph. <SEP> 114 <SEP> <B><I>>50 <SEP> 50 <SEP> >50 <SEP> 50</I></B>
<tb> <B>S.</B> <SEP> lutea <SEP> <B><I>50</I> <SEP> < <SEP> 10 <SEP> <I>50</I> <SEP> 10</B>
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> <B><I>50</I> <SEP> < <SEP> 10 <SEP> <I>50 <SEP> 50</I></B>
<tb> Mycob. <SEP> <B>607 <SEP> <I>>50 <SEP> <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 50 <SEP> 50</I></B>
<tb> <B>E.</B> <SEP> coli <SEP> <B><I>>50 <SEP> >50 <SEP> >50 <SEP> >50</I></B>
<tb> Ps.
<SEP> aeraginosa <SEP> <B><I>50 <SEP> >50 <SEP> >50 <SEP> > <SEP> 50</I></B>
<tb> Actin. <SEP> boströmi <SEP> <B>A <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> <SEP> 10 <SEP> 10</B>
<tb> <B>0.</B> <SEP> albicans <SEP> <B> < <SEP> 10 <SEP> <SEP> 10 <SEP> < 10 <SEP> 10</B>
<tb> Tr. <SEP> mentagrophytes <SEP> <B> <SEP> 10 <SEP> <SEP> 10 <SEP> <SEP> 10 <SEP> 10</B>
<tb> Sab. <SEP> gypseus <SEP> <B> < <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10</B>
<tb> <B>Gl.</B> <SEP> graphii <SEP> <B><I>50</I> <SEP> <SEP> 10 <SEP> <I>50 <SEP> 50</I></B>
<tb> Epid. <SEP> floccosum <SEP> <B> < <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10</B>
<tb> Deb.
<SEP> hudeloi <SEP> <B> <SEP> 10 <SEP> <SEP> 10 <SEP> <SEP> 10 <SEP> <SEP> 10</B> Distacin hat in einer Dosis von<B>100</B> ug/cm3 in Agar-Sabouraud-Kultur eine Hemmungswirkung gegenüber Epidermophyton floccosum, Trichophyton mentagrophytes, Glenospora graphii und Sabourau- dites gypseus,
sowie eine subinhibitorische Wirkung gegenüber Pseudomonas iaeruginosa und Sareina lutea.
<I>Beispiel<B>-1</B></I> Zu<B>3000</B> cm3 eines flüssigen Mediums, enthaltend 2 % Dextrose, 2 "/o Com Steep Liquor (Getreide- weichflüssigkeit), z.
B. Cs-Fragda der Fima Fragda, <B>1</B> 11/o CaCO., <B>0,3 %</B> (NH4)2S04 und<B>0,3</B> Oh, NaC1, gibt man eine Sporensuspension von Streptomyces distallicus (gewonnen durch Spülung oder Waschung eines den Mikroorganisraus enthaltenden festen Nähr bodens).
Die Fermentierungsdauer beträgt 40 Stun den, wobei das Kulturmedium mit<B>150-250</B> Umdre hungen pro Minute gerührt und mit einer Strömungs geschwindigkeit von 1-2 Liter/Minute und pro Liter Kulturmedium belüftet wird.
Zur Impfung von<B>6000</B> cm3 eines gleichartigen sterilen Kulturmodiums für die Produktionsphase verwendet man<B>300</B> cm3 vegetatives Mycelium. Diese Produktionsphase dauert<B>85-100</B> Stunden, wobei mit einer Geschwindigkeit von 350-400 Umdrehungen/ M.üiute gerührt und mit einer Strömungsgesch::windig- keit von<B>1</B> Liter/Minute und pro Liter Kulturmedium belüftet wird.
Dieses enthält Distamycin und das Distacin. <I>Beispiel 2</I> Zu<B>17</B> Liter einer wie in Beispiel<B>1</B> durch Tauch- fermentierung erhaltenen Kultur gibt man eine Hilfs substanz, z. B. Kieselgur, und filtriert das Ganze. Das Gemisch aus Mycelium. und Kieselgur wird<B>1</B> Stunde lang mit<B>2500</B> cm3 Butanol geschüttelt. Diese Behand lung wird zweimal wiederholt.
Die butanolischen Auszüge werden vereinigt, mit Wasser gewaschen, zu öliger Konsistenz konzentriert und mit Äther behandelt. Man erhält<B>8,9 g</B> eines gelbbraunen Produktes (Distaraycin). Die ätherische Mutterlösung wird<B>5-6</B> Tage langstehengelassen. Der kristalline Niederschlag (Distacin) wird gesammelt und aus<B>75</B> 0/eigem Aceton kristallisiert, Schmelzpunkt 154-156o <B>C.</B> <I>Beispiel<B>3</B></I> Man löst<B>1,0 g</B> des gemäss Beispiel 2 erhaltenen Dista#mycins in<B>70</B> cm,3 Methanol und trennt Trübun gen durch Filtrieren ab.
Die gelborange Lösung wird auf einer Säule filtriert, welche<B>100 g</B> angesäuerte Tonerde enthält (nach Wieland), und mit Metha-nol gewaschen. Die Eluierung erfolgt mit dem gleichen Lösungsmittel. Die ersten<B>100</B> cm3 des nach dem Erscheinen der gelben Farbe im Ausfluss gesammel ten Eluates ergeben nach dem Trocknen durch Ein dampfen 0,2<B>g</B> Distamycin <B>A.</B> <I>Beispiel 4</I> <B>1,0 g</B> des gemäss Beispiel 2 erhaltenen Distamycins werden<B>30</B> Minuten lang mit zwei Portionen von<B>je</B> <B>50</B> cm3 Methanol gerührt.
Es tritt eine sozusagen voll ständige Auflösung ein (Rest<B><I>50</I></B><I> mg).</I> Die Auszüge werden auf<B>25</B> cm3 konzentriert, von einem gering fügigen Niederschlag (20 mig) abgetrennt und mit dem dreifachen Volumen Äther behandelt. Der Nieder schlag (Distamycin B) wird getrocknet. Die Ausbeute beträgt 0,4<B>g.</B> Die ätherische Mutterlösung wird voll ständig eingedampft und wiederum mit Äther aufge nommen. Das verbleibende Produkt wird gesammelt und getrocknet; Ausbeute<B>0,33,g</B> (Distamycin <B>C).</B>
Das Produkt Distaraycin besitzt beispielsweise eine starke Schutzwirkung auf Blättern von Bohnen pflanzen, welche mit Uromyces appendiculatus infi ziert sind. Bei einer Konzentration des Schutzmittels von 200 Teilen pro Million erzielt man eine <B>9 6</B> %, ige Herabsetzung der Krankheit.