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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung von Papulacandin A-, B-, C-, D- oder E-Äthern, dadurch gekennzeichnet, dass man Papulacandin A, B, C, D oder E veräthert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man phenolische Äther herstellt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens eine phenolische Gruppe veräthert.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man Äther von Niederalkanolen herstellt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man Methyläther herstellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von antibiotisch wirksamen Papulacandin-Derivaten, und zwar von Äthern des Papulacandins A, B, C, D und E, die infolge ihrer guten antibiotischen Wirkung gegen Pilze und auch als Zwischenprodukte zur Darstellung anderer antibiotisch wirksamer Verbindungen von Interesse sind.
Im Schweizer Patent No. 606 426 ist das neue wasserunlösliche Antibiotikum Papulacandin beschrieben, das durch Züchtung eines Stammes der Mikroorganismen-Art Papularia sphaerosperma (Pers.) Höhnel, früher als Arthrinium phaeosperum (Corda) Ellis bezeichnet (Ordnung Moniliales), und zwar des Stammes A 32283, das beim Northern Regional Research Lab. US-Department of Agnculture, Peoria, Illinois, unter der Nr. NRRL 8086 deponiert ist, erhalten wird. Die Art ist von Ellis M. B. Dematiaceous Hyphomycetes 1971, p. 569 unter Arthrinium phaeospermum eingehend beschrieben. Der neue Stamm wurde 1969 am Sustenpass (Schweiz) als Saprophyt auf abgefallenen Blättern einer nicht bestimmten Pflanzenart gefunden.
Im oben genannten Patent ist die Herstellung des Antibiotikums Papulacandin durch Fermentation und der Komponenten A und B beschrieben. Die Komponenten C, D und E können aus dem Fermentationsprodukt, unter Berücksichtigung ihrer physikalischen Eigenschaften und ihrer in der untenstehenden Tabelle angeführten dünnschichtchromatographischen Daten nach denselben Methoden, die schon bei der Isolierung der Hauptkomponenten A und B verwendet wurden, und wie im genannten Patent beschrieben, isoliert werden. Die Isolierung der Komponenten C, D und E wird überdies in einem der nachfolgenden illustrativen Beispiele gezeigt.
Rf-Werte im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel:
Tabelle Substanz System l System 2 Komponente A 0,35 0,41 Komponente B 0,27 0,32 Komponente C 0,24 0,28 Komponente D 0,45 0,74 Komponente E 0,47 0,51 System I bezeichnet: Chloroform-Methanol (4:1), zweimaliges Durchlaufen, System 2 bezeichnet: Essigester-Aceton-Wasser (72:24:4), zweimaliges Durchlaufen.
Ca. 75% des Antibiotikums besteht aus der Hauptkomponente B, ca. 10% aus der Komponente A.
Zum Testieren der Antibiotikawirkung in den einzelnen Isolierungsstufen - wie auch im Kulturmedium - eignet sich als Testorganismus besonders gut Candida albicans.
Das Antibiotikum besteht - der Elementaranalyse der Hauptkomponenten A, B, D und E zufolge - nur aus den Elementen C, H und 0.
Die Komponente C des Antibiotikums Papulacandin weist folgende chemische und physikalische Eigenschaften auf: es ist eine in Pulverform weisse, schwach saure Substanz. Sie ist löslich in Alkoholen, Niederalkanolen, wie Methanol, Äthanol, n-Propanol, in Ketonen, Dimethylformamid und Pyridin. Die Verbindung ist, wie Papulacandin B, in den oben genannten Lösungsmitteln wenig löslich oder unlöslich.
Smp. 140-150" (unter Zersetzung) Elementaranalyse: C gefunden 62,65% Hgefunden 7,16% Bruttoformel: C47H46017 Molekulargewicht: 900 [o:]2j= = +33'+1 (in Methanol) UV-Spektrum in Äthanol: Xmax 232 nm (± = 29700) 240 nm (e = 29400)
268 nm (E = 34200)
297 nm (Schulter) (e = 27900)
Das Antibiotikum Papulacandin Komponente D weist folgende chemische und physikalische Eigenschaften auf. Es ist eine schwach saure, in Pulverform weisse Substanz, die ähnliche Löslichkeitseigenschaften wie die Komponente B hat.
F. 127-1300C.
Elementaranalyse C gefunden 62,32%
Hgef. 7,59%.
UV-Spektrum (in Äthanol) Xmax 230 nm (Emas = 340)
235 nm Schulter
261 nm (mal = 320) [a]c +7+1 (c = 0,250 in Chloroform) Das IR-Spektrum in KBr ist in Beispiel 9 angegeben.
Das Antibiotikum Papulacandin Komponente E weist folgende chemische und physikalische Eigenschaften auf: Es ist eine schwach saure, in Pulverform weisse Substanz, die ähnliche Löslichkeitseigenschaften wie die Komponente B hat.
Elementaranalyse C gefunden 64,71% H gefunden 8,43% UV-Spektrum (in Äthanol) Bmax: 230 nm (Emax = 270)
237 nm (Schulter)
267 nm (Em.x = 300)
292 nm (Schulter) Das IR-Spektrum in Methylenchlorid ist in Beispiel 9 angegeben.
Für die Komponenten A, B, C und D konnten aufgrund spektroskopischer Daten ihre Konstitutionsformeln ermittelt werden:
EMI1.1
<tb> Papulacandin <SEP> B <SEP> Zur
<tb> <SEP> cc,
<tb> <SEP> 0 <SEP> oCHa
<tb> <SEP> vC <SEP> v <SEP> 8 <SEP> X <SEP> OH
<tb> <SEP> on
<tb> <SEP> H
<tb> <SEP> JCIIH6I011 <SEP> Mai <SEP> 900
<tb>
EMI2.1
<tb>
Papulacandin <SEP> A
<tb> <SEP> ClIs
<tb> <SEP> ffo > CH
<tb> <SEP> HO <SEP> Q/O <SEP> iCH,
<tb> <SEP> H, <SEP> o= < <SEP> < OH
<tb> <SEP> ItO < k <SEP> O <SEP> g
<tb> <SEP> Ott
<tb> Papulacandin <SEP> C
<tb> <SEP> CHI
<tb> <SEP> Ho.
<tb> <SEP> *40 <SEP>
<tb> <SEP> Rw <SEP> 8
<tb> <SEP> aFte <SEP> \ <SEP> > <SEP> Ott
<tb> <SEP> HO <SEP> aCFt\ <SEP> OH
<tb> <SEP> l <SEP> C47He4Olz <SEP> MW <SEP> 900
<tb> Papulacandin <SEP> D
<tb> <SEP> Fan,
<tb> <SEP> HO <SEP> > <SEP> CH,
<tb> <SEP> OH
<tb> <SEP> 0 <SEP> 90 <SEP> oFt
<tb> <SEP> OH
<tb> <SEP> LrnjI{201o <SEP> 57tb <SEP> 574
<tb>
Die vorliegende Erfindung betrifft nun die Herstellung von Äthern der Komponenten A, B, C, D und E des Papulacandins, und insbesondere von Äthern, in denen zumindest eine phenolische Hydroxylgruppe veräthert ist.
Die Äther leiten sich insbesondere von Niederalkanolen, insbesondere von Methanol, ab.
Die Äther der vorliegenden Erfindung besitzen, wie die Grundsubstanzen Papulacandin A, B, C, D und E neben ihrer antifungischen Wirkung auf Fadenpilze (Hyphomyceten) wie z. B. Trichoderma mentagrophytes, vor allem eine sehr gute spezifische Wirkung gegenüber verschiedenen Arten hefearti ger Pilze, wie Candida albicans, Torulopsis dattila, Torulopsis famata und Hansenula anomala. Sie zeichnen sich durch sehr geringe Toxizität im Vergleich zu bekannten antifungisch wirksamen Antibiotika aus. Die neuen Antibiotika können deshalb zur Bekämpfung von Infektionen, die durch die genannten Pilze, insbesondere Candida albicans, hervorgerufen werden, verwendet werden.
Die Herstellung der Äther der Papulacandine A, B, C, D und E erfolgt gemäss der vorliegenden Erfindung durch Ver ätherung dieser Verbindungen. Die Verätherung erfolgt z. B.
in an sich bekannter Weise. So können z. B. phenolische Hydroxylgruppen mit nieder-Diazoalkanen in üblicher Weise umgesetzt werden.
Wird in den Ausgangsstoffen (durch geeignete Dosierung des Verätherungsmittels) nur eine phenolische Gruppe ver äthert, so ist dies in der Regel die Gruppe in 12-Stellung der genannten Papulacandine, von denen die Struktur bekannt ist.
Bei erschöpfender Verätherung der phenolischen Gruppen wird auch die zweite OH-Gruppe in 10-Stellung veräthert und man erhält so die 10,12-Diäther.
Die Herstellung der Monomethyläther des Papulacandins A und Papulacandins B ist in den nachfolgenden Beispielen 1 und 4 illustriert. In der gleichen Weise können auch Papulacandin C, D und E zu den entsprechenden Monomethyläthern umgesetzt werden.
Die Papulacandin A-, B-, C-, D- und E-Äther können, wie erwähnt, als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die topische, enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Betracht, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, pflanzliche Öle, Benzylalkohole oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Cremen oder Salben vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und/oder enthalten Hilfsstoffe wie Konservierungsmittel, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel.
Sie können auch noch andere therapeutische wertvolle Stoffe enthalten. Auch Futtermittelzusätze, Konservierungs- und Desinfektionsmittel können mit den neuen Äthern hergestellt werden.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel I
Das Antibiotikum Papulacandin B wird wie folgt methyliert: 200 mg Komponente B, gelöst in 2 ml Methanol wird bei 0OC während 30-45 Minuten mit einer Lösung von Diazomethan in Äther stehen gelassen. Nach Eindampfen werden 210 mg Rückstand erhalten. Das Methylätherderivat wird durch präparative Dünnschichtchromatographie auf Silicagel-Dickschichtplatten im System Chloroform-Methanol (5:1) erhalten.
Es werden 106 mg farbloser, amorpher Papulacandin B Monomethyläther erhalten, welcher aus Aceton/Äther/Hexan gefällt wird. Im IR-Spektrum (in KBr) sind folgende Banden vorhanden: 3450, 2950, 1700, 1640 (Schulter), 1610, 1460, 1440, 1345, 1300, 1260, 1155, 1070, 1030, 1010 cm-l. Das UV-Spektrum in Äthanol weist folgende Maxima auf: kmax (Emax): 235 (37 600), 267 (39 000), 295 (Schulter). Aufgrund des jH-NMR-Spektrums ist eine phenolische Methalgruppe vorhanden.
Als weiteres Produkt wird auch Papulacandin B-dimethyl äther erhalten, in welchem aufgrund des iH-NMR-Spektrums beide phenolischen Hydroxylgruppen methyliert worden sind.
Beispiel 2 Papulacandin B-Äthyläther wird auf folgende Weise hergestellt:
Man lässt eine Lösung von 1050 mg Papulacandin B in 30 ml Dioxan zusammen mit einer Lösung von Diazoäthan in Äther bei 00C für 12 Minuten stehen. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand auf einer Silicagelsäule (70 g) unter Verwendung von Chloroform und steigenden Mengen Methanol (2 bis 20 %) als Eluiermittel chromatographiert. Durch Fällen aus Aceton/Äther/Hexan erhält man amorphen farblosen Papulacandin B-Monoäthyläther. Das IR Spektrum (in KBr) zeigt die folgenden Banden: 3500, 2970, 2950,1710,1620,1465.1380,1345,1305,1265,1150,1070, 1035, 1010 cm-'.
Im UV-Spektrum sind folgende Maxima festzustellen: Xmi, (± max): 235 (40 000), 265 (40 000), 294 (Schulter). Das 13-C-NMR-Spektrum zeigt die Anwesenheit einer Äthylgruppe an. Als weiteres Produkt erhält man Papulacandin B Diäthyläther, in dessen l3-C-NMR-Spektrum zwei Äthylgruppen festgestellt werden können.
Beispiel 3 Papulacandin B-Propyläther wird in folgender Weise hergestellt:
Man lässt eine Lösung von 1 g Papulacandin B in 30 ml Dioxan zusammen mit einer Lösung von Diazopropan in Äther bei OoC für 12 Stunden stehen. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand auf einer Silicagel Säule (70 g) mit Chloroform und steigenden Mengen von Methanol (2 bis 20%) als Eluiermittel chromatographiert, Man erhält farblosen amorphen Papulacandin B-Monopropyl äther durch Fällen aus Aceton/Äther/Hexan. Im IR-Spektrum sind folgende Banden zu sehen: 3500, 2970,2950, 2900, 2705, 1610, 1465, 1380, 1345, 1305, 1265, 1145, 1075, 1035,
1010, 875 cm-l. Im UV-Spektrum (in Äthanol) sind folgende Maxima festzustellen: Xmax X (e max) 233 (36 800), 267 (36 000), 294 (Schulter).
Das l3-C-NMR-Spektrum zeigt die Anwesenheit einer Propylgruppe an. Als weiteres Produkt erhält man den Papulacandin B-Dipropyläther, in dessen 13-C- NMR-Spektrum zwei Propylgruppen festzustellen sind.
Beispiel 4 Papulacandin A wird in folgender Weise methyliert:
Eine Lösung von 2 g Papulacandin A in 100 ml Dioxan wird zusammen mit einer Lösung von Diazomethan in Äther bei 00C 30 Minuten lang stehen gelassen. Nach dem Eindampfen wird der Rückstand an einer Silicagel-Säule (200 g) unter Verwendung von Chloroform und steigenden Mengen Methanol (5-20%) als Elutionsmittel chromatographiert. Man erhält farblosen, amorphen Papulacandin A-Monomethyläther durch Fällen aus Aceton/Äther/Hexan. Das IR-Spektrum (in KBr) weist die folgenden Banden auf: 3500, 2970, 2950, 1710, 1645, 1625, 1466, 1445, 1350, 1270, 1155, 1065, 1035, 1010 cm-l. Das UV-Spektrum in Äthanol weist die folgenden Maxima auf: mal (e max): 237 (34 000), 263 (41 600). Das l3-C-NMR-Spektrum zeigt die Anwesenheit einer Methylgruppe an.
Man isoliert auch Papulacandin A Dimethyläther, in dessen l3-C-NMR-Spektrum zwei Methylgruppen festzustellen sind.
In den nachstehenden Beispielen wird die Herstellung der als Ausgangsstoffe zu verwendenden Papulacandine A, B, C, D und E illustriert.
Beispiel 5
Ein gut bewachsenes Schrägagarröhrchen des Papularia sphaerosperma A 32283 wird mit 5 ml 0,2-m-Phosphatpuffer pH 7 aufgeschwemmt. 3 Erlenmeyerkolben mit 1 Schikane (Einbuchtung) mit je 100 ml Nährlösung, welche pro Liter Leitungswasser 20 g Sojabohnenmehl und 20 g Mannit enthält und deren pH vor der Sterilisation mit 1-n. Natronlauge auf 8,5 eingestellt wurde, werden mit je 5 ml der Papularia-Suspension beimpft und 48 Stunden auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 250 ipm bei 230 inkubiert. Je 25 ml der so gewonnenen Kultur werden in 62-Liter Erlenmeyerkolben mit 4 Schikanen und 500 ml der obigen Nährlösung geimpft. Die Kolben werden anschliessend bei 23"C auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 120 upm 48 Stunden inkubiert.
1,5 Liter der Kultur aus den 2 Liter-Kolben werden in einen 50-Liter Fermenter, der 30 Liter der obigen Nährlösung enthält, übertragen und 48 Stunden bei 230 inkubiert. Dann werden 15 Liter der Kultur in einen Fermenter mit 300 Liter der obigen Nährlösung übertragen. Dieser Fermenter weist ein Totalvolumen von 500 Liter auf und besitzt einen 6-blättrigen Turbinenrührer und 4 Schikanen (Prallbleche). Die Züchtungsbedingungen im Fermenter sind: Druck 1 atü, Rührgeschwindigkeit 450 upm, Temperatur 230C, Luftdurchsatz 1 Liter V/V/Min. Die Bedingungen entsprechen einer in Sulfitlösung gemessenen Sauerstoffabsorptionsrate von 200 mM 02/ 1/h. Die optimale Bildung des Antibiotikums Papulacandin erfolgt nach ca. 60 Stunden Inkubation. Die Kulturlösung wiest dann ein pH von 6,7 auf.
Sie hat eine Aktivität von 1012 mm Hemmhof im Agardiffusionstest mit Candida albicans unter Verwendung von Whatman A discs 6 mm.
Beispiel 6 600 Liter der nach Beispiel 5 erhaltenen Kulturlösung werden unter Zugabe von 2% Filterhilfsmittel Decalite (Diatomenerde) filtriert. 560 Liter Kulturfiltrat werden mit Natronlauge auf pH 8,6 eingestellt und auf einem kontinuierlichen Extraktor zweimal mit Essigester im Verhältnis 2:1 extrudiert. Das inaktive wässrige Raffinat wird verworfen. 600 Liter Essigesterphase werden im Vakuum konzentriert. Es resultiert ein Konzentrat von 45 Litern.
91 kg Mycel aus obiger Filtration werden 1 mal mit 200 Litern und 1 mal mit 100 Litern Methanol verrührt und jeweils filtriert. Das inaktive Mycel wird verworfen, 300 Liter Methanolextrakt werden im Vakuum konzentriert. Es resultiert ein wässriger Mycel-Extrakt in 33 Litern, der mit NaOH auf pH 8,4 gestellt und 2 mal mit je 66 Litern Essigester extrahiert wird. Das inaktive wässrige Raffinat wird verworfen.
120 Liter Mycel-Essigesterextrakt werden mit obigen 45 Liter Kulturfiltrat-Essigester-Extrakt vereinigt und im Vakuum konzentriert. Es resultieren 1,85 Liter Essigesterextrakt-Konzentrat, die mit 2 Liter 85 %igem Methanol versetzt und drei mal mit je 2 Liter Petroläther extrahiert werden.Die inaktiven Petrolätherphasen werden verworfen und die Methanolphase wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Es resultieren 51 g dunkelgrauer, zähflüssiger Rückstand, der in 200 ml 85 %igem Methanol gelöst und 2 mal mit je 300 ml Heptan extrahiert wird. Die inaktiven Heptanphasen werden verworfen. Die Methanolphase wird eingedampft und im Hochvakuum getrocknet. Es resultieren 41,8 g Extrakt-Rückstand.
Beispiel 7
Von dem nach Beispiel 6 erhaltenen Extrakt-Rückstand werden 18 g auf einer Säule (0 5,4 cm, h = 140 cm), welche aus einer (95:5 Gew.:Gew.) Mischung von 1000 g Silicagel (Merck Korngrösse 0,05-0,2 mm) und 50 g Aktivkohle Norits besteht, chromatographiert. Die Mischung von Silicagel-Aktivkohle wurde vorher 3 mal mit Methanol und anschliessend 3 mal mit Chloroform aufgeschlämmt und filtriert. Die 12,3 g Extrakt-Rückstand werden in 50 ml Methanol gelöst, mit 50 g Silicagel vermischt und das Gemisch wird zur Trockne eingedampft. Der getrocknete pulverige Rück stand wird auf die Säule gegeben. Die Elution erfolgt in Fraktionen zu je 1 Liter mit Chloroform-Methanolmischungen unter stufenweiser Steigerung der Konzentrationen von Methanol.
Man beginnt mit einem Methanolgehalt von 4% und hört auf mit 50% Methanol. Die Durchlaufgeschwindigkeit beträgt 500 ml/Std. Die Fraktionen werden im Vakuum eingedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Die Fraktionen werden dann aufgrund dünnschichtchromatographischer und bioautographischer Prüfung vereinigt. Die Fraktionen 116 (eluiert mit 1-4% Methanol) sind nur schwach aktiv und werden verworfen. Die Fraktionen 17-23 (eluiert mit 4 bis 7% Methanol) enthalten Papulacandin D und E (weitere Reinigung siehe Beispiel 9). Die Fraktionen 24-27 (eluiert mit 7% Methanol) enthalten Papulacandin A. Die Fraktion 28 (eluiert mit 10% Methanol) enthält ein Gemisch von Papulacandin A und B. Die Fraktionen 29-31 (eluiert mit 10% Methanol) enthalten Papulacandin B.
Die Fraktionen 32 und 36 (eluiert mit 10-20% Methanol) enthalten neben Papulacandin B auch
Papulacandin C mit kleinerem Rf-Wert, das durch wiederholte
Chromatographie an Silicagel unter Verwendung von Chloroform-Methanol-Mischungen mit 10-20% Methanolgehalt als Elutionsmittel reingewonnen werden kann. Die restlichen
Fraktionen (eluiert mit 20-50% Methanol) enthalten noch weitere aktive Substanzen in kleinen Mengen.
Zur Isolierung von Papulacandin B wird der Rückstand der
Fraktionen 29-31 (1,86 g) aus Aceton/Äther gefällt. Es resul tieren 1,5 g reines Papulacandin B als farbloses Pulver vom F.
193-197"C (Zersetzung). Zur Isolierung von reinem Papula candin A wird der Rückstand der Fraktionen 24-27 (1,5 g) aus
Aceton/Äther kristallisiert. Es resultieren 1,2 g reines Papula candin A als farbloses Pulver vom F. 171-1730C.
Papulacandin B
Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte: C: 60,45 % H = 6,99% 0 = 32,62%. Das Antibiotikum zeigt im IR-Spek trum in Kaliumbromid Banden bei 3450, 2975, 2925, 2875,
1690, 1640 (Schulter), 1615, 1465, 1380, 1345, 1300, 1260, 1180, 1150, 1070, 1035, 1005,970,865 und 845 cm-t. Im UV
Spektrum in Äthanol sind folgende Maxima vorhanden: hmas 232 nm (e = 42000), 240 nm (E = 400), 268 nm (E = 44 800),
300 nm (E = 31 200).
Die optische Drehung beträgt [a]20 = + 50 + 1 (c = 0,458 in Methanol).
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel (Kieselfertigplatten F254 der Fa. Merck) im System Chloroform-Methanol (4:1) ist der RF-Wert = 0,4 bei dreimaligem Durchlaufen.
Nachweis mit UV, Jod oder konz. Schwefelsäure und Erhitzen Bei der Microhydrierung werden 7 Äquivalente Wasserstoff verbraucht.
Papulacandin A
Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte: C = 62,98%, H = 7,45%, 0 = 29,09%.
Das Antibiotikum zeigt im IR-Spektrum in Kaliumbromid Banden bei 3450, 2950, 2870, 1690, 1630, 1610, 1465, 1410, 1380, 1340, 1300, 1265, 1155, 1075, 1035, 1010, 975, 860 und 845 cm-1. Im UV-Spektrum in Äthanol sind die folgenden Maxima vorhanden: e.mllx (E l {n): 232 nm (Schulter).
242 nm (E = 425) und 265 nm (E = 520).
Die Verbindung zeigt eine optische Drehung [al?; = 31+1" (c = 0,451 in Methanol). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel (Kieselgelfertigplatten F254 der Fa. Merck) im System Chloroform-Methanol (4:1) ist derRf-Wert = 0,50 bei dreimaligem Durchlaufen. Nachweis mit UF. Jod oder konz.
Schwefelsäure und Erhitzen. Bei der Microhydrierung werden 67 Aequ. Wasserstoff verbraucht.
Beispiel 8
Von den nach Beispiel 7 erhaltenen Fraktionen 67-70, die Papulacandin B enthalten, werden 2,1 g auf eine Säule ( = 4 cm, h = 50 cm), gefüllt mit Sephadex-LH-20 (5,5 Liter) chromatographiert. Sephadex-LH-20 (alkyliertes vernetztes Dextran) wurde vorher 4 Stunden in Methanol gequollen. Die 2,1 g Papulacandin B werden in 5 1 Methanol gelöst und auf die Säule gegeben. Die Elution erfolgt in Methanol in Fraktionen von 22 ml. Die Geschwindigkeit beträgt 90 ml/Stunde.
Die Fraktionen werden im Vakuum vom Lösungsmittel befreit und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Die Eluate der Fraktionen 1-15 (120 mg) sind nur schwach aktiv und werden verworfen. Die Fraktionen 16-27 enthalten 1,9 g reines Papulacandin B, die aus Aceton/Äther gefällt wird.
Eigenschaften siehe Beispiel 7.
Beispiel 9
Die nach Beispiel 8 erhaltenen Fraktionen 17-23 (1,5 g), die in kleinen Mengen Papulacandin D und E enthalten, werden in Aceton gelöst. Nach längerem Stehen bei 0 C kristallisiert eine inaktive Substanz aus. Die Mutterlauge enthält angereichertes Papulacandin D und E. Durch präparative Dickschichtchromatographie auf Kieselplatten (100 cm x 20 cm, 1 mm Schichtdicke) im System Essigester-Aceton-Wasser-(72:24:4) können die beiden Komponenten voneinander getrennt werden. Papulacandin D und E wird aus Aceton/Äther/Hexan als farblose Substanz gefällt.
Papulacandin D
Das IR-Spektrum in KBr zeigt u. a. Banden bei 3500, 2950, 2870, 1705, 1675, 1640, 1620, 1465, 1385, 1350, 1300, 1260, 1205, 1150, 1070, 1035, 1005, 975 cm-l. Weitere phys.chem. Eigenschaften, siehe im allgemeinen Teil der Beschreibung.
Papulacandin E
Das IR-Spektrum in CH2Cl2 weist u. a. folgende Banden auf: 3500, 2950, 2870, 1710, 1640 (Schulter), 1615, 1465, 1385, 1350, 1300, 1240, 1185 (Schulter), 1150, 1070, 1040, 1010, 975 cm-'. Weitere phys.-chem. Eigenschaften, siehe im allgemeinen Teil der Beschreibung.
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PATENT CLAIMS
1. A process for the preparation of papulacandin A, B, C, D or E ethers, characterized in that papulacandin A, B, C, D or E is etherified.
2. The method according to claim 1, characterized in that phenolic ethers are produced.
3. The method according to claim 2, characterized in that at least one phenolic group is etherified.
4. The method according to claim 3, characterized in that ethers of lower alkanols are produced.
5. The method according to claim 4, characterized in that methyl ether is produced.
The present invention relates to the production of antibiotic papulacandin derivatives, namely of ethers of papulacandins A, B, C, D and E, which are of interest due to their good antibiotic action against fungi and also as intermediates for the preparation of other antibiotically active compounds .
In the Swiss patent no. 606 426 describes the new water-insoluble antibiotic papulacandin, which is produced by breeding a strain of the microorganism species Papularia sphaerosperma (Pers.) Höhnel, formerly known as Arthrinium phaeosperum (Corda) Ellis (order Moniliales), of the strain A 32283, which was used in Northern Regional Research Lab. US Department of Agnculture, Peoria, Illinois, deposited under No. NRRL 8086. The species is from Ellis M.B. Dematiaceous Hyphomycetes 1971, p. 569 described in detail under Arthrinium phaeospermum. The new strain was found in 1969 on the Susten Pass (Switzerland) as a saprophyte on fallen leaves of an undetermined plant species.
The above-mentioned patent describes the production of the antibiotic papulacandin by fermentation and components A and B. Components C, D and E can be extracted from the fermentation product, taking into account their physical properties and their thin-layer chromatographic data listed in the table below, using the same methods that were already used for isolating the main components A and B, and as described in the patent mentioned, to be isolated. The isolation of components C, D and E is also shown in one of the following illustrative examples.
Rf values in the thin layer chromatogram on silica gel:
Table Substance System l System 2 Component A 0.35 0.41 Component B 0.27 0.32 Component C 0.24 0.28 Component D 0.45 0.74 Component E 0.47 0.51 System I denotes: Chloroform-methanol (4: 1), run-through twice, system 2 designated: ethyl acetate-acetone-water (72: 24: 4), run-through twice.
Approx. 75% of the antibiotic consists of the main component B, approx. 10% of the component A.
Candida albicans is particularly suitable as a test organism for testing the antibiotic effect in the individual isolation stages - as well as in the culture medium.
According to the elemental analysis of the main components A, B, D and E, the antibiotic consists only of the elements C, H and 0.
Component C of the antibiotic papulacandin has the following chemical and physical properties: it is a white, slightly acidic substance in powder form. It is soluble in alcohols, lower alkanols such as methanol, ethanol, n-propanol, in ketones, dimethylformamide and pyridine. Like Papulacandin B, the compound is sparingly soluble or insoluble in the solvents mentioned above.
M.p. 140-150 "(with decomposition) Elemental analysis: C found 62.65% H found 7.16% Gross formula: C47H46017 Molecular weight: 900 [o:] 2j = = + 33 '+ 1 (in methanol) UV spectrum in ethanol : Xmax 232 nm (± = 29700) 240 nm (e = 29400)
268 nm (E = 34200)
297 nm (shoulder) (e = 27900)
The antibiotic papulacandin component D has the following chemical and physical properties. It is a weakly acidic substance, white in powder form, which has similar solubility properties to component B.
F. 127-1300C.
Elemental analysis C found 62.32%
Hgef. 7.59%.
UV spectrum (in ethanol) Xmax 230 nm (Emas = 340)
235 nm shoulder
261 nm (times = 320) [a] c + 7 + 1 (c = 0.250 in chloroform) The IR spectrum in KBr is given in Example 9.
The antibiotic papulacandin component E has the following chemical and physical properties: It is a weakly acidic, powdery white substance that has similar solubility properties to component B.
Elemental analysis C found 64.71% H found 8.43% UV spectrum (in ethanol) Bmax: 230 nm (Emax = 270)
237 nm (shoulder)
267 nm (Em.x = 300)
292 nm (shoulder) The IR spectrum in methylene chloride is given in Example 9.
For components A, B, C and D, their constitutional formulas could be determined on the basis of spectroscopic data:
EMI1.1
<tb> Papulacandin <SEP> B <SEP> Zur
<tb> <SEP> cc,
<tb> <SEP> 0 <SEP> oCHa
<tb> <SEP> vC <SEP> v <SEP> 8 <SEP> X <SEP> OH
<tb> <SEP> on
<tb> <SEP> H
<tb> <SEP> JCIIH6I011 <SEP> May <SEP> 900
<tb>
EMI2.1
<tb>
Papulacandin <SEP> A
<tb> <SEP> ClIs
<tb> <SEP> ffo> CH
<tb> <SEP> HO <SEP> Q / O <SEP> iCH,
<tb> <SEP> H, <SEP> o = <<SEP> <OH
<tb> <SEP> ItO <k <SEP> O <SEP> g
<tb> <SEP> Ott
<tb> Papulacandin <SEP> C
<tb> <SEP> CHI
<tb> <SEP> Ho.
<tb> <SEP> * 40 <SEP>
<tb> <SEP> Rw <SEP> 8
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<tb> <SEP> l <SEP> C47He4Olz <SEP> MW <SEP> 900
<tb> Papulacandin <SEP> D
<tb> <SEP> fan,
<tb> <SEP> HO <SEP>> <SEP> CH,
<tb> <SEP> OH
<tb> <SEP> 0 <SEP> 90 <SEP> oFt
<tb> <SEP> OH
<tb> <SEP> LrnjI {201o <SEP> 57tb <SEP> 574
<tb>
The present invention now relates to the production of ethers of components A, B, C, D and E of papulacandin, and in particular of ethers in which at least one phenolic hydroxyl group is etherified.
The ethers are derived in particular from lower alkanols, in particular from methanol.
The ethers of the present invention have, like the basic substances Papulacandin A, B, C, D and E in addition to their antifungal effect on thread fungi (hyphomycetes) such. B. Trichoderma mentagrophytes, especially a very good specific action against various types of yeast-like fungi, such as Candida albicans, Torulopsis dattila, Torulopsis famata and Hansenula anomala. They are characterized by very low toxicity compared to known antifungal antibiotics. The new antibiotics can therefore be used to combat infections caused by the fungi mentioned, in particular Candida albicans.
The ethers of the papulacandins A, B, C, D and E are produced according to the present invention by etherification of these compounds. The etherification takes place z. B.
in a manner known per se. So z. B. phenolic hydroxyl groups are reacted with lower diazoalkanes in the usual way.
If only one phenolic group is etherified in the starting materials (by suitable dosage of the etherifying agent), this is usually the group in the 12-position of the above-mentioned papulacandins, of which the structure is known.
If the phenolic groups are exhaustively etherified, the second OH group in the 10-position is also etherified and the 10,12 diether is thus obtained.
The preparation of the monomethyl ethers of papulacandin A and papulacandin B is illustrated in Examples 1 and 4 below. Papulacandin C, D and E can also be converted into the corresponding monomethyl ethers in the same way.
The Papulacandin A, B, C, D and E ethers can, as mentioned, as remedies, e.g. B. in the form of pharmaceutical preparations, use. These contain the compounds mentioned in a mixture with a pharmaceutical, organic or inorganic carrier material suitable for topical, enteral or parenteral administration. For the same, such substances come into consideration that do not react with the new compound, such as. B. gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, vegetable oils, benzyl alcohols or other known excipients. The pharmaceutical preparations can e.g. B. as tablets, dragees, powders, suppositories or in liquid form as solutions, suspensions, emulsions, creams or ointments. If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers.
They can also contain other therapeutically valuable substances. Feed additives, preservatives and disinfectants can also be produced with the new ethers.
The invention is described in the following examples. The temperatures are given in degrees Celsius.
Example I.
The antibiotic papulacandin B is methylated as follows: 200 mg of component B, dissolved in 2 ml of methanol, is left to stand at 0OC for 30-45 minutes with a solution of diazomethane in ether. After evaporation, 210 mg of residue are obtained. The methyl ether derivative is obtained by preparative thin-layer chromatography on silica gel thick-layer plates in the chloroform-methanol (5: 1) system.
106 mg of colorless, amorphous papulacandin B monomethyl ether are obtained, which is precipitated from acetone / ether / hexane. The following bands are present in the IR spectrum (in KBr): 3450, 2950, 1700, 1640 (shoulder), 1610, 1460, 1440, 1345, 1300, 1260, 1155, 1070, 1030, 1010 cm-l. The UV spectrum in ethanol shows the following maxima: kmax (Emax): 235 (37,600), 267 (39,000), 295 (shoulder). A phenolic methal group is present on the basis of the jH-NMR spectrum.
Papulacandin B-dimethyl ether is also obtained as a further product, in which both phenolic hydroxyl groups have been methylated on the basis of the 1 H-NMR spectrum.
Example 2 Papulacandin B ethyl ether is prepared in the following way:
A solution of 1050 mg papulacandin B in 30 ml dioxane together with a solution of diazoethane in ether is left to stand at 00C for 12 minutes. After evaporation of the solvent, the residue is chromatographed on a silica gel column (70 g) using chloroform and increasing amounts of methanol (2 to 20%) as the eluent. Amorphous, colorless papulacandin B monoethyl ether is obtained by precipitation from acetone / ether / hexane. The IR spectrum (in KBr) shows the following bands: 3500, 2970, 2950, 1710, 1620, 1465.1380, 1345, 1305, 1265, 1150, 1070, 1035, 1010 cm- '.
The following maxima can be determined in the UV spectrum: Xmi, (± max): 235 (40,000), 265 (40,000), 294 (shoulder). The 13 C-NMR spectrum indicates the presence of an ethyl group. Another product obtained is Papulacandin B diethyl ether, in whose 13 C-NMR spectrum two ethyl groups can be determined.
Example 3 Papulacandin B propyl ether is prepared in the following way:
A solution of 1 g of papulacandin B in 30 ml of dioxane together with a solution of diazopropane in ether is left to stand at OoC for 12 hours. After evaporation of the solvent, the residue is chromatographed on a silica gel column (70 g) with chloroform and increasing amounts of methanol (2 to 20%) as the eluent. Colorless amorphous papulacandin B-monopropyl ether is obtained by precipitation from acetone / ether / hexane . The following bands can be seen in the IR spectrum: 3500, 2970, 2950, 2900, 2705, 1610, 1465, 1380, 1345, 1305, 1265, 1145, 1075, 1035,
1010, 875 cm-l. The following maxima can be determined in the UV spectrum (in ethanol): Xmax X (e max) 233 (36 800), 267 (36 000), 294 (shoulder).
The 13 C-NMR spectrum indicates the presence of a propyl group. Another product obtained is Papulacandin B dipropyl ether, whose 13 C-NMR spectrum shows two propyl groups.
Example 4 Papulacandin A is methylated in the following way:
A solution of 2 g of papulacandin A in 100 ml of dioxane is left to stand together with a solution of diazomethane in ether at 00C for 30 minutes. After evaporation, the residue is chromatographed on a silica gel column (200 g) using chloroform and increasing amounts of methanol (5-20%) as the eluent. Colorless, amorphous papulacandin A monomethyl ether is obtained by precipitation from acetone / ether / hexane. The IR spectrum (in KBr) has the following bands: 3500, 2970, 2950, 1710, 1645, 1625, 1466, 1445, 1350, 1270, 1155, 1065, 1035, 1010 cm-1. The UV spectrum in ethanol has the following maxima: mal (e max): 237 (34,000), 263 (41,600). The 13 C-NMR spectrum indicates the presence of a methyl group.
Papulacandin A dimethyl ether, whose 13 C-NMR spectrum shows two methyl groups, is also isolated.
The following examples illustrate the preparation of the papulacandins A, B, C, D and E to be used as starting materials.
Example 5
A well-overgrown slant of the Papularia sphaerosperma A 32283 is floated with 5 ml of 0.2 M phosphate buffer pH 7. 3 Erlenmeyer flasks with 1 baffle (indentation) with 100 ml nutrient solution each, which contains 20 g soybean meal and 20 g mannitol per liter of tap water and whose pH is 1-n before sterilization. Sodium hydroxide solution has been adjusted to 8.5, are inoculated with 5 ml of the Papularia suspension and incubated for 48 hours on a rotating shaker at 250 ipm at 230. 25 ml each of the culture obtained in this way are inoculated into 62 liter Erlenmeyer flasks with 4 baffles and 500 ml of the above nutrient solution. The flasks are then incubated at 23 ° C. on a rotating shaking machine at 120 rpm for 48 hours.
1.5 liters of the culture from the 2 liter flasks are transferred to a 50 liter fermenter containing 30 liters of the above nutrient solution and incubated at 230 for 48 hours. Then 15 liters of the culture are transferred to a fermenter with 300 liters of the above nutrient solution. This fermenter has a total volume of 500 liters and has a 6-blade turbine stirrer and 4 baffles (baffle plates). The cultivation conditions in the fermenter are: pressure 1 atm, agitation speed 450 rpm, temperature 230C, air throughput 1 liter V / V / min. The conditions correspond to an oxygen absorption rate of 200 mM 02/1 / h measured in sulphite solution. The optimal formation of the antibiotic papulacandin takes place after approx. 60 hours of incubation. The culture solution then had a pH of 6.7.
It has an activity of 1012 mm inhibition zone in the agar diffusion test with Candida albicans using Whatman A discs 6 mm.
Example 6 600 liters of the culture solution obtained according to Example 5 are filtered with the addition of 2% filter aid Decalite (diatomaceous earth). 560 liters of culture filtrate are adjusted to pH 8.6 with sodium hydroxide solution and extruded twice with ethyl acetate in a ratio of 2: 1 on a continuous extractor. The inactive aqueous raffinate is discarded. 600 liters of ethyl acetate phase are concentrated in vacuo. The result is a concentrate of 45 liters.
91 kg of mycelium from the above filtration are stirred once with 200 liters and once with 100 liters of methanol and each filtered. The inactive mycelium is discarded, 300 liters of methanol extract are concentrated in vacuo. The result is an aqueous mycelium extract in 33 liters, which is adjusted to pH 8.4 with NaOH and extracted twice with 66 liters of ethyl acetate each time. The inactive aqueous raffinate is discarded.
120 liters of mycelium-ethyl acetate extract are combined with the above 45 liters of culture filtrate-ethyl acetate extract and concentrated in vacuo. The result is 1.85 liters of ethyl acetate extract concentrate, to which 2 liters of 85% methanol are added and extracted three times with 2 liters of petroleum ether each time. The inactive petroleum ether phases are discarded and the methanol phase is evaporated to dryness in vacuo. 51 g of dark gray, viscous residue result, which is dissolved in 200 ml of 85% strength methanol and extracted twice with 300 ml of heptane each time. The inactive heptane phases are discarded. The methanol phase is evaporated and dried in a high vacuum. 41.8 g of extract residue result.
Example 7
18 g of the extract residue obtained according to Example 6 are poured onto a column (0 5.4 cm, h = 140 cm), which consists of a (95: 5 weight: weight) mixture of 1000 g of silica gel (Merck grain size 0 , 05-0.2 mm) and 50 g activated charcoal Norits, chromatographed. The mixture of silica gel-activated carbon was previously slurried 3 times with methanol and then 3 times with chloroform and filtered. The 12.3 g extract residue are dissolved in 50 ml of methanol, mixed with 50 g of silica gel and the mixture is evaporated to dryness. The dried powdery residue is placed on the column. Elution takes place in fractions of 1 liter each with chloroform-methanol mixtures with a gradual increase in the concentration of methanol.
One starts with a methanol content of 4% and ends with 50% methanol. The throughput speed is 500 ml / hour. The fractions are evaporated in vacuo and the residue is dried in a high vacuum. The fractions are then combined on the basis of thin-layer chromatographic and bioautographic testing. Fractions 116 (eluted with 1-4% methanol) are only weakly active and are discarded. Fractions 17-23 (eluted with 4 to 7% methanol) contain papulacandin D and E (for further purification see Example 9). Fractions 24-27 (eluted with 7% methanol) contain papulacandin A. Fraction 28 (eluted with 10% methanol) contains a mixture of papulacandin A and B. Fractions 29-31 (eluted with 10% methanol) contain papulacandin B. .
Fractions 32 and 36 (eluted with 10-20% methanol) also contain papulacandin B as well as
Papulacandin C with smaller Rf value that repeated through
Chromatography on silica gel using chloroform-methanol mixtures with 10-20% methanol content as eluent can be purified. The remaining
Fractions (eluted with 20-50% methanol) contain other active substances in small amounts.
To isolate Papulacandin B, the residue is the
Fractions 29-31 (1.86 g) precipitated from acetone / ether. The result is 1.5 g of pure papulacandin B as a colorless powder from F.
193-197 "C (decomposition). To isolate pure Papula candin A, the residue from fractions 24-27 (1.5 g) is removed
Acetone / ether crystallized. 1.2 g of pure Papula candin A result as a colorless powder with a temperature of 171-1730C.
Papulacandin B
The elemental analysis gives the following values: C: 60.45% H = 6.99% 0 = 32.62%. The antibiotic shows in the IR spectrum in potassium bromide bands at 3450, 2975, 2925, 2875,
1690, 1640 (shoulder), 1615, 1465, 1380, 1345, 1300, 1260, 1180, 1150, 1070, 1035, 1005,970,865 and 845 cm-t. In the UV
The spectrum in ethanol has the following maxima: hmas 232 nm (e = 42000), 240 nm (E = 400), 268 nm (E = 44 800),
300 nm (E = 31,200).
The optical rotation is [a] 20 = + 50 + 1 (c = 0.458 in methanol).
In the thin-layer chromatogram on silica gel (ready-to-use silica plates F254 from Merck) in the chloroform-methanol (4: 1) system, the RF value = 0.4 when run three times.
Detection with UV, iodine or conc. Sulfuric acid and heating Micro-hydrogenation consumes 7 equivalents of hydrogen.
Papulacandin A
The elemental analysis gives the following values: C = 62.98%, H = 7.45%, 0 = 29.09%.
In the IR spectrum, the antibiotic shows bands in potassium bromide at 3450, 2950, 2870, 1690, 1630, 1610, 1465, 1410, 1380, 1340, 1300, 1265, 1155, 1075, 1035, 1010, 975, 860 and 845 cm- 1. The following maxima are present in the UV spectrum in ethanol: e.mllx (E l {n): 232 nm (shoulder).
242 nm (E = 425) and 265 nm (E = 520).
The connection shows an optical rotation [al ?; = 31 + 1 "(c = 0.451 in methanol). In the thin-layer chromatogram on silica gel (F254 silica gel plates from Merck) in the chloroform-methanol (4: 1) system, the Rf value = 0.50 when run three times. Detection with UF Iodine or conc.
Sulfuric acid and heating. In the case of microhydration, 67 equiv. Hydrogen consumed.
Example 8
2.1 g of the fractions 67-70 obtained according to Example 7, which contain papulacandin B, are chromatographed on a column (= 4 cm, h = 50 cm) filled with Sephadex-LH-20 (5.5 liters). Sephadex-LH-20 (alkylated crosslinked dextran) was previously swollen in methanol for 4 hours. The 2.1 g of Papulacandin B are dissolved in 5 l of methanol and applied to the column. Elution takes place in methanol in fractions of 22 ml. The rate is 90 ml / hour.
The fractions are freed from the solvent in vacuo and the residue is dried in a high vacuum. The eluates from fractions 1-15 (120 mg) are only weakly active and are discarded. Fractions 16-27 contain 1.9 g of pure papulacandin B, which is precipitated from acetone / ether.
Properties see example 7.
Example 9
Fractions 17-23 (1.5 g) obtained according to Example 8, which contain small amounts of papulacandin D and E, are dissolved in acetone. After prolonged standing at 0 ° C., an inactive substance crystallizes out. The mother liquor contains enriched Papulacandin D and E. The two components can be separated from each other by preparative thick layer chromatography on silica plates (100 cm x 20 cm, 1 mm layer thickness) in the system ethyl acetate-acetone-water (72: 24: 4). Papulacandin D and E are precipitated as a colorless substance from acetone / ether / hexane.
Papulacandin D
The IR spectrum in KBr shows u. a. Bands at 3500, 2950, 2870, 1705, 1675, 1640, 1620, 1465, 1385, 1350, 1300, 1260, 1205, 1150, 1070, 1035, 1005, 975 cm-l. More phys.chem. Properties, see the general part of the description.
Papulacandin E
The IR spectrum in CH2Cl2 shows u. a. the following bands on: 3500, 2950, 2870, 1710, 1640 (shoulder), 1615, 1465, 1385, 1350, 1300, 1240, 1185 (shoulder), 1150, 1070, 1040, 1010, 975 cm- '. Further phys.-chem. Properties, see the general part of the description.