Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen wasserunlöslichen Antibiotikums A 32204 und seiner Derivate. Der Ausdruck Antibiotikum A 32204 bezeichnet die Gesamtheit der antibiotisch wirksamen Stoffe, die bei der Züchtung des Aspergillus-Stammes A 32204 gebildet werden.
Das Antibiotikum A 32204 besteht aus mindestens 2 antibiotisch aktiven Substanzen, die als Komponente A und B des Antibiotikums A 32204 bezeichnet werden.
Der neue Aspergillus-Stamm A 32204 wird in unseren Laboratorien unter der genannten Bezeichnung aufbewahrt, er ist von Buchenblättern (Fagus silvatica L.) isoliert worden.
Nach Raper und Fennell (1965) (siehe: Raper, K. B. und Fennell D.I.: The genus Aspergillus: Williams & Wilkins Co., Baltimore (1965), 686 p.)) lässt sich der Stamm A 32204 der Art Aspergillus nidulans zuordnen. In seinen wesentlichen morphologischen Merkmalen entspricht er völlig der von Fennell und Raper (1955) (Fennell, D.I. and Raper, K.B.: Mycologia 47 (1), 79-80, 1955) beschriebenen Varietät von Aspergillus nidulans (Eidam) Wint., Aspergillus nidulans (Eidam) Wint. var. echinulatus Fennell und Raper. Er ist deshalb als Stamm dieser Varietät von Aspergillus nidulans identifiziert. Der Typus-Stamm WB 2395 von Aspergillus nidulans (Eidam) Wint. var. echinulatus Fennell mit den l.c.
angegebenen morphologischen Merkmalen ist in der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 16825 hinterlegt. Stamm A 32204 wurde beim Northern Regional Research Lab.. US-Departement of Agriculture, Peoria, Illi- nois unter der Nummer NRRL 3860 deponiert.
Das Antibiotikum A 32204 wird bei der Züchtung des Stammes A 32204 gebildet. Das Verfahren gemäss der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm A 32204 oder eine das Antibiotikum A 32204 bildende Mutante dieses Stammes in einer wässrigen, eine Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltenden Nährlösung aerob züchtet, bis die Nährlösung eine wesentliche antibiotische Wirkung zeigt und das Antibiotikum A 32204 hierauf isoliert. Das Antibiotikum A 32204 bildende Mutanten können z. B. unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden.
Als Kohlenstoffquelle sind beispielsweise zu nennen: assimilierbare Kohlehydrate, z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Mannit, Stärke, ferner Glycerin. Als stickstoffhaltige Nährstoffe seien genannt: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen der Alko holherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze usw., aber auch Ammoniumsalze und Nitrate.
Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride,
Carbonate, Sulfate, Phosphate von Alkali- oder Erdalkalimetallen, von Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten
Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächen kultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelkolben oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40 C. vorzugsweise ca. 28oC. Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 1'l. bis 5 Tagen. Vorzugsweise kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in flüssigem Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, z.
B. im Ver hältnis 1:20, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man beispielsweise, indem man ein durch ca. 14tägiger Wachstum auf einem festen Nährboden erhaltenes versportes Mycel in ein flüssiges Medium überimpft und 48 Stunden wachsen lässt.
Die Isolierung des Antibiotikums aus dem Kulturmedium erfolgt nach an sich bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften des Antibiotikums.
So kann das Antibiotikum beispielsweise aus der unfiltrierten Kulturbrühe mit einem mit Wasser wenig mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Essigester, extrahiert werden.
Dieses sogenannte whole-broth -Verfahren wird vorzugsweise angewendet, weil sich das Antibiotikum sowohl im Mycel als auch, in geringer Menge, im Kulturfiltrat befindet.
Das Antibiotikum sammelt sich in der wasserhaltigen organischen Phase, z. B. im Essigester, an und diese Phase wird von der extrahierten Kulturflüssigkeit und dem Schlamm (extrahiertes Mycel und Nährlösungsfestbestandteile) abgetrennt.
Der bei der Extraktion erhaltene Rückstand kann einer oder mehreren erneuten Extraktionen mit dem gleichen oder einem anderen Lösungsmittel unterworfen werden.
Man kann auch das z.B. mit Filterhilfsmitteln abfiltrierte Mycel allein extrahieren und das nur wenig aktive Kulturfiltrat verwerfen. Das mit Wasser gewaschene Mycel (mitsamt dem Filterhilfsmittel) wird vorzugsweise mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. einem Niederalkanol mit 1-4 Kohlenstoffatomen, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol, ferner Dimethylsulfoxid, Formamid, Dimethylformamid, oder mit Mischungen dieser Lösungsmittel mit Wasser, insbesondere mit waaserhaltigem Methanol, extrahiert.
Zur Reinigung des nach Abdampfen des Lösungsmittels erhaltenen Rohproduktes kann man sich z. B. der Extraktion, der Fällung, der Verteilung zwischen nicht-mischbaren Lösungsmittelphasen oder der Chromatographie, bedienen. So können aus dem Rohprodukt, z.B. Essigesterextrakt der Kul turbrühe, erhebliche Anteile an Begleitstoffen durch aufeinanderfolgende einfache Reinigungsprozesse wie Extraktion des getrockneten, pulverisierten Rohproduktes mit Lösungsmitteln, in denen das Antibiotikum unlöslich ist, z. B. wasserfreiem Essigester oder Kohlenwasserstoffen wie Petroläther, Cyclohexan, oder wasserfreien halogenierten Kohlenwasserstoffen wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, entfernt werden. Man kann auch das Rohprodukt lösen.
z.B. in Methanol. und durch Absorptionsmittel wie Aktivkohle, Kieselgel, Magnesiumsilikat oder Mischungen davon oder Adsorptionsharze, z. B. vernetzte Dextrane wie Sephadex (der Fa. Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala) von Begleitstoffen abtrennen. Beispielsweise kann das Rohprodukt durch wiederholte Säulenchromatographie unter Verwendung von Kieselgel, zweckmässig mit geringen Zusätzen von Aktivkohle, gereinigt werden. Das Antibiotikum wird vorzugsweise nach dem Gradientverfahren mit Mischungen von Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff und Methanol eluiert, wobei der prozentuale Gehalt des stärker polaren Lösungsmittels stufenweise gesteigert wird.
Wenn man den durch Extraktion der Kulturbrühe gewonnenen Extrakt an einer Mischung von Kieselgel mit 5 Gew. % Aktivkohle und Chloroform/Methanol als Elutionsflüssigkeit chromatographiert, findet man nahezu die gesamte Menge des aus der Kulturbrühe extrahierten Antibiotikums auf die Eluate der Methanolkonzentrationen 25-35Wo verteilt.
Die oben erwähnte Verteilung zwischen nicht-mischbaren Lösungsmittelphasen wird zweckmässig als Gegenstromverteilung mit einer Craig-Apparatur vorgenommen, Als Lösungsmittelsystem dient beispielsweise eine Mischung von Essigester, Cyclohexan, Methanol und Wasser.
Zur Entfernung noch vorhandener farbiger Verunreinigungen unterwirft man das Produkt vorzugsweise einer Chromatographie an Magnesiumsilikat.
Zur Gewinnung der einzelnen einheitlichen Komponenten des Antibiotikums kann ihre Trennung und Isolierung nach der Methode der präparativen Dünnschichtchromatographie unter den für den analytischen Nachweis beschriebenen Bedingungen erfolgen. Vorteilhafter ist die Trennung mittels Säulenchromatographie, wobei als Adsorptionsmittel z. B. Kieselgel mit einem Gehalt von 1 Prozent Aktivkohle benutzt und die Elution vorzugsweise nach dem Gradientverfahren mit einer Mischung von Tetrachlorkohlenstoff und Methanol bewirkt wird. Die Steigerung der Konzentration des polareren Lösungsmittels erfolgt zweckmässig in kleineren prozentualen Abstufungen, oder man arbeitet nach der kontinuierlichen Gradientenelutionsmethode. Die Komponenten erschienen im Eluat in der Reihenfolge zunehmender Laufstreckenlängen.
Das Verfahren kann gegebenenfalls wiederholt werden.
Bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel (mit Chloroform-Methanol (3:1) als Elutionsmittel) und Bioautographie kann man zwei antibiotisch aktive Hauptkomponenten nachweisen: ca. 95 % des Antibiotikums besteht aus den Komponenten A und B, die restlichen ca 5% aus mehreren Neben komponenten (bioautographische Testierung mit Candida albicans).
Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel nach dem multiplen Verfahren mit Zwischentrocknung und Laufstrecken der Lösungsmittelfront von 8, 10 und 15 cm zeigen die Komponenten im System Chloroform-Methanol (75:25) folgende Laufstrecken: Komponente A: 93 mm; Komponente B:
72 mm.
Eine Auftrennung in die Komponenten erfolgt auch bei der oben erwähnten Chromatographie an Sephadex und bei der
Gegenstromverteilung nach Craig, z. B. in dem oben erwähnten System.
Für solche nach diesen Verfahren gewonnene einheitliche
Komponenten des Antibiotikums wurde im Reihenverdün nungstest mit Candida albicans als Testorganismus eine MIC zwischen 0,02 und 0,05 y/ml gefunden.
Zum Testieren der Antibiotikawirkung in den einzelnen
Isolierungsstufen - wie auch im Kulturmedium - eignet sich als Testorganismus besonders gut Candida albicans.
Das Antibiotikum besteht - der Elementaranalyse der Hauptkomponenten A und B zufolge - nur aus den Elementen C,H,OundN.
Das Antibiotikum A 32204, Komponente B weist folgende chemische und physikalische Eigenschaften auf:
Es ist eine neutrale, farblose, in Pulverform weisse Substanz, die in Wasser und wässrigen Säuren praktisch unlöslich ist und die in Niederalkanolen wie Methanol, Äthanol, n-Propanol, ferner in Dimethylsulfoxid, Formamid und Dimethylform amid leicht löslich ist. In wasserfreiem Essigester, Aceton,
Methylisobutylketon, Äther, Petroläther und chlorierten Koh lenwasserstoffen wie Methylenchlorid, Chloroform und Tetra chlorkohlenstoff ist das Antibiotikum schwer löslich (10
100 mg/Liter). Das Antibiotikum ist in methanolisch-wässrigem Medium von pH 3 bis 7 stabil, bei alkalischem pH, beson ders bei einem pH 9, zersetzt sich das Antibiotikum unter
Verlust der Aktivität.
Das Antibiotikum, Komponente B, gibt folgende Farbreak tionen: mit Kaliumferricyanat-Eisen(III)chlorid: blau; nach Folin-Ciocalteau: blau; nach Reindel-Hoppe: blau; mit Tetramethyldiamino-diphenylmethan: blau; mit Tetrazoliumblau: violett; nach Pauly: gelb-orange; mit Ammoniummoybdat-Perchlorsäure: blau; mit konz. Schwefelsäure: schwarz-violett.
Bei der Elementaranalyse findet man die folgenden Werte:
C H N Gefunden 55,48% 7,38% 8,52% [a]20 = -44,4O (c = 0,54 in Methanol).
Aufgrund von Dampfdruck-osmometrischen Molekulargewichtsbestimmungen von Derivaten (Acetylderivat, p-Brombenzoat) kann das Molekulargewicht zu etwa 100 geschätzt werden. Im Massenspektrum sind nur kleinere Fragmente erkennbar. Ein Molekülion fehlt. Im IR-Spektrum in Kaliumbromid sind u. a. folgende Banden vorhanden: 3350, 2930, 2860, 1650, 1440, 1230, 1085, 1000 (Schulter), 975 (Schul ter), 928 (Schulter), 873 (Schulter), 840 cm-l. Das Antibiotikum besitzt keine freien Amino- und Carboxylgruppen. Eine N-Acetylierung mit Essigsäureanhydrid in Methanol ergab kein N-Acetylderivat.
Hingegen konnten mit Essigsäureanhydrid und Pyridin verschiedene Hydroxylgruppen acetyliert werden. Für das Acetylderivat wurden folgende Analysenwerte erhalten: C = 57,06; 58,44%, H = 6,92; 6,95; N = 6,99; 6,37%. Das Molekulargewicht wurde osmometrisch zu 1188 bestimmt. Das IR-Spektrum im Kaliumbromid zeigt u. a. Banden bei 3360, 3060 (Schulter), 3000 (Schulter), 2950 (Schulter), 2930, 2850, 1750, 1680 (Schulter), 1640, 1525 (Schulter), 1505, 1430, 1370, 1225, 1165, 1045, 1015, 980 (Schulter), 910, 840 cm-l.
Im NMR-Spektrum sind in der 2-ppm-Gegend zahlreiche Acetylsignale erkennbar, die teilweise überlappen. Die Anzahl der Acetylgruppen lässt sich nur grob abschätzen. Es sind mindestens 5, wahrscheinlich aber 6-7 Acetylgruppen vorhanden. Die A2B2-Signalgruppe mit J ca. 8 Hz im 7 ppm-Gebiet deutet auf einen p-Hydroxyphenylrest hin. Mit der Anwesenheit einer p-Hydroxyphenylgruppe sind auch die UV-Spektren des Antibiotikums und seiner Derivate vereinbar, die auffallend Tyrosinderivaten (z. B. von Tyrosin-haltigen Peptiden) gleichen. Im UV-Spektrum sind Maxima bei 284 nm, E's6m = 5,6 und 211 nm, Elss = 220, vorhanden.
Bei der p-Brombenzoylierung wurde ein kristallines Derivat vom F. 1611650C (aus Essigester + Methanol kristallisiert) erhalten. Die Elementaranalyse ergab: C = 51,53%, H = 4,41%, N = 4,16%, Br = 22,79%. Das Molekulargewicht, osmometrisch in Methylenchlorid bestimmt, betrug 1926. Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt u.a. Banden bei 3410 (Schulter) 3350, 3060, 3000 (Schulter), 2960 (Schulter), 2930, 2850, 1725, 1690 (Schulter) 1640, 1590, 1525 (Schulter), 1505, 1485, 1450, 1400, 1260, 1205, 1170, 1110 (Schulter), 1100, 1070, 1010, 965, 870 (Schulter), 845, 755 cm-'. Das NMR-Spektrum und das Molekulargewicht sind mit 6-7 veresterbaren OH-Gruppen vereinbar.
Durch saure Hydrolyse wurden als Abbauprodukte Linolsäure, L-Threonin, L-4-Hydroxyprolin und 1-Amino-3-(phydroxyphenyl)-aceton gefunden. Bei dem letztgenannten Produkt muss es sich um ein sekundäres Zerfallprodukt handeln, da das intakte Antibiotikum keine Ketogruppe enthält.
Bei der Hydrierung des Antibiotikums, Komponente B, wurden ca 3 Mol Wasserstoff aufgenommen, doch konnte im NMR-Spektrum nur das Verschwinden der Signale der 4 olefinischen Wasserstoffatome des Linolsäurerestes beobachtet werden. Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt u. a. Banden bei 3350, 2930, 2854, 1631, 1516, 1440, 1265, 1082, 1000 (Schulter), 968 (Schulter), 930(Schulter), 875 (Schulter), 839, 796 cm-1.
Im UV-Spektrum sind Maxima bei 284 nm (Schulter), E,lecm = 12,6; 278 nm,E'mcem = 14,7; 224 nm (Schulter), El;;, = 151; und 214 nm, Ei;;, = 184, sichtbar.
Die Elementaranalyse ergibt
C H N
59,15% 8,22% 8,27%
Unter Derivaten des Antibiotikums sind im vorangehenden wie im folgenden einerseits Ester des Antibiotikums, andererseits Hydrierungsprodukte und deren Ester zu verstehen. Ester sind beispielsweise solche, in denen die alkoholischen und/ oder phenolischen Hydroxylgruppen mit Carbonsäuren oder Thiocarbonsäuren mit 1-20 Kohlenstoffatomen verestert sind.
Solche Säuren sind vor allem gegebenenfalls substituierte Niederalkansäuren mit 1-6 Kohlenstoffatomen wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Pivalinsäure, ferner gegebenenfalls substituierte mono- oder bicyclische aromatische oder aliphatische Säuren wie Benzoesäure, Thiobenzoesäure, Naphthalinsäure, Phenylniederalkansäuren wie Phenylessigsäure, Phenylpropionsäure, Substituenten der Säuren sind beispielsweise Halogen wie Fluor, Chlor, Brom, Jod, Trifluormethyl, Nitro, freie, veresterte oder verätherte Hydroxylgruppen, z. B.
Niederalkanoyloxy wie Acetoxy, Niederalkoxy wie Methoxy, Niederalkylmercapto wie Methylmercapto, freie oder funktionell abgewandelte Carboxylgruppen, z. B. Niederalkoxycarbonyl wie Methoxycarbonyl, Carbamoyl, Cyan, gegebenenfalls substituierte Aminogruppen, z. B. mono- oder di-niederalkylierte oder N-acylierte Aminogruppen, z. B. Methylamino, Dimethylamino, Niederalkanoylamino, z. B. Acetylamino.
Das Antibiotikum A 32204 und seine Derivate weisen eine sehr gute spezifisch antifungische Wirkung gegenüber verschiedenen Arten hefeartiger Pilze wie Candida albicans, Candida utilis, Torulopsis dattila, Torulopsis sphaerica, Endomyces bispora oder Hansenula californica auf. So beträgt z. B. bei de in vitro-Prüfung im Gradienten-Platten-Strichtest (W. Szibalski, Science 116,46 [1952]) gegenüber ca. 20 verschiedener klinisch vorkommenden Stämmen von Candida albicans die minimale Hemmkonzentration 0,2 bis 0,3 y/ml. Antibiotikum A 32204 zeichnet sich durch sehr geringe Toxizität imVergleicE zu bekannten antifungisch wirkenden Antibiotika aus.
Das neue Antibiotikum und seine Derivate können daher zur Bekämpfung von Infektionen, die durch hefenartige Pilze, insbesondere Candida albicans, hervorgerufen werden, ferner als Futtermittelzusatz, zur Konservierung von Nahrungsmitteln oder als Desinfektionsmittel verwendet werden.
Das Antibiotikum A 32204 und seine Derivate können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche in Betracht, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, pflanzliche Öle, Benzylalkohol, oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Cremen oder Salben vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und/oder enthalten Hilfsstoffe wie Konservierungsmittel, Stabilisierungs Netz- oder Emulgiermittel.
Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1
Ein gut bewachsenes Schrägagarröhrchen des Aspergillus nidulans var. echinulatus-Stammes A 32204 wird mit 5 ml 0,2m. Phosphatpuffer pH 7 aufgeschwemmt. 3 Erlenmeyerkolben mit 4 Schikanen mit je 100 ml Nährlösung, welche pro Liter Leitungswasser 20 g Sojabohnenmehl, 10 g Trypticase (Baltimore Biological Laboratories), 10 g Glucose und 5 g Natriumchlorid enthält und deren pH vor der Sterilisation mit 1-n.
Natronlauge auf 7,8 eingestellt wurde, werden mit je 1 ml der Aspergillus-Suspension beimpft und 48 Stunden auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 250 upm bei 28 inkubiert.
Je 25 ml der so gewonnenen Kultur werden in 6 2-Liter Erlenmeyerkolben mit 4 Schikanen und 500 ml der obigen Nährlö sung geimpft. Die Kolben werden anschliessend bei 280C auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 120 upm 48 Stunden inkubiert.
1,5 Liter der Kultur aus den 2-Liter-Kolben werden in einen 50-Liter Fermenter, der 30 Liter der obigen Nährlösung enthält, übertragen und 36 Stunden bei 28 inkubiert. Dann werden 15 Liter der Kultur in einen Fermenter mit 300 Liter der obigen Nährlösung übertragen. Dieser Fermenter weist ein
Totalvolumen von 500 Liter auf und besitzt einen 6-blätteri gen Turbinenrührer und 4 Schikanen. Die Züchtungsbedin gungen im Fermenter sind: Druck 1 atü, Rührgeschwindigkeit
450 upm, Temperatur 28oC, Luftdurchsatz 1 Liter V/V/Min.
Die Inkubationszeit beträgt 36 Stunden.
Je 150 Liter Kultur aus dem 500 Liter-Fermenter werden in
2 Fermenter mit je 300 Liter der obigen Nährlösung übertra gen. Das Gesamtvolumen dieser Fermenter ist je 5000 Liter,
Sie besitzen je einen 6-blätterigen Turbinenrührer und 4 Schi kanen. Die Züchtungsbedingungen im Fermenter sind: Rühr geschwindigkeit 210 upm, Druck 1 atü, Temperatur 29C, 1Luftdurchsatz 1 Liter V/V/Min. Die Bedingungen entsprechen einer in Sulfitlösung gemessenen Sauerstoffabsorptionsrate von
200 mM O2/l/h. Die optimale Bildung des Antibiotikums A
32204 erfolgt nach ca. 60 Stunden Inkubation. Die Kulturlö sung weist dann ein pH von 7,7 auf. Sie hat eine Aktivität von
10 mm Hemmhof im Agardiffusionstest mit Candida albicans unter Verwendung von Whatmann AA discs 6 mm.
Beispiel 2
6000 Liter der nach Beispiel 1 erhaltenen Kulturlösung werden portionenweise mit Essigester im Verhältnis 3:2 eine
Stunde verrührt und in einem Schlammseparator mit Phasen trenneinrichtung separiert. Das inaktive wässrige Raffinat und der Schlamm werden verworfen. 4000 Liter Essigesterphase werden schonend im Vakuum eingeengt. Es resultiert ein aus
Wasser und Essigester bestehendes Konzentrat von 97 Liter.
Die wässrige Phase wird abgetrennt 3 x mit Essigester nachextrahiert und anschliessend verworfen. 102 Liter Essig esterextrakt werden mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und schonend eingeengt. 23 Liter Extrakt-Konzentrat werden zwischen 85 %igem wässrigem Methanol und Petroläther ver teilt. Die inaktive Petrolätherphase wird verworfen. 43 Liter
Methanolphase werden im Vakuum zur Trockne eingeengt.
Der harzige Rückstand wird in 4 Liter Methanol gelöst und der unlösliche inaktive Rückstand verworfen. Der Methanol
Extrakt wird wiederum im Vakuum eingedampft. 395 g harzi ger Rückstand werden mit Äther verrührt und der Nieder schlag abgenutscht. Die inaktive Äther-Mutterlauge wird verworfen. Die Fällung wird im Hochvakuum getrocknet und ergibt 132 g aktiven Rückstand.
44 g des so erhaltenen Rückstandes werden in 1 Liter trok kenem Essigester suspendiert. Man schüttelt den Ansatz 30
Minuten, filtriert den unlöslichen Anteil von der gelbbraun gefärbten Essigesterlösung ab, wäscht den Filterrückstand zweimal mit je 200 ml Essigester und trocknet ihn im Hochva kuum über Phosphorpentoxid bei Raumtemperatur (23,9 g).
Die Essigesterextrakte zeigen nur geringe Aktivität und wer den verworfen.
Zu dem erhaltenen Produkt gibt man 70 g Norit (Aktivkohle) und schüttelt die Mischung unter Stickstoff dreimal nacheinander mit je 800 ml trockenem Methanol während 30
Minuten. Die Methanolextrakte (I, II und III) werden separat unter Zusatz von Celite 545 filtriert. Sie weisen nach Abdampfen des Lösungsmittels minimale Hemmkonzentratio nen von ca. 0,1 y/ml auf.
Beispiel 3
Von dem nach Beispiel 2 erhaltenen Methanolextrakt I (12,6 g) werden 5,1 g auf einer Säule, welche aus einer (95:5, Gew.:Gew.)-Mischung von Kieselgel (Merck, Korngrösse 0,05-0,2 mm) und Norit besteht, chromatographiert ( = 5,5 cm, h = 26 cm). Die Säule war während 6 Stunden mit insgesamt 3 Liter trockenem Methanol und dann während 15 Stunden mit 4 Liter trockenem Chloroform vorbehandelt worden. Die 5,1 g Methanolextrakt I werden in 3 ml trockenem Methanol gelöst, die Lösung mit 3 ml Chloroform verdünnt und auf die Säule gegeben. Die Elution erfolgt in Fraktionen von je 320 ml nach dem Gradientenverfahren mit Chloroform-Methanolmischungen unter stufenweiser Steigerung der Konzentration des polareren Lösungsmittels um 3 %, 2% und dann um je 5 Prozent.
Die Operation wird mit reinem Chloroform begonnen und beim Gehalt der Mischung von 50 Prozent Methanol beendet. Die Durchlaufzeit einer Eluatfraktion ist auf 150 Minuten eingestellt.
Die Eluate werden bei 500 Badtemperatur im Rotationsverdampfer vom Lösungsmittel befreit und der Rückstand im Hochvakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.
Die Eluate von 0 bis 20 % Methanolgehalt sind wenig aktiv.
Die Eluate höherer Methanolkonzentration sind weisslich mit orangegelber Tönung. Eluat 8 (30% Methanol; 1,83 g) weist die höchste Aktivität auf.
Bioautographisch untersucht, setzt sich das Eluat 8 im wesentlichen aus den beiden Hauptkomponenten des Antibio tikums, A und B, zusammen.
Beispiel 4
Zur Entfernung des orangeroten Pigments sowie weiterer
Verunreinigungen in dem nach Beispiel 3 aus Eluat 8 gewon nenen rohen Antibiotikum wird eine Lösung von 0,50 ml
Methanol auf einer Säule von 1,9 cm Durchmesser und einer
Höhe von 10,0 cm von Magnesiumsilikat (Woelm, Aktivitäts stufe I) chromatographiert. Das Adsorptionsmittel wird in 4
Stunden mit 300 ml Methanol, danach 12 Stunden mit 500 ml frisch destilliertem Tetrachlorkohlenstoff gewaschen. Analog
Beispiel 3 eluiert man nach dem Gradientenverfahren mit
Mischungen von Tetrachlorkohlenstoff und Methanol unter stufenweiser Steigerung der Konzentration des polareren
Lösungsmittels um je 5 %, wobei die Operation mit reinem
Tetrachlorkohlenstoff begonnen und bei einem Gehalt der
Mischung von 50% Methanol beendet wird.
Die Eluationsge schwindigkeit wird auf 15 ml Eluat/Stunde eingestellt, und es werden Fraktionen von 20 ml gesammelt.
Aus den Eluaten werden die Trockenpräparate gemäss
Beispiel 3 isoliert. Die Eluate 1 bis 5 (0 bis 20% Methanols ergeben zusammen nur 0,005 g inaktiven Rückstand. Die völlig farblosen Eluate 6 und 7 (Methanolgehalt 25 bzw. 30%; zusammen 0,166 g) zeigen die höchste antibiotische Aktivität
Laut Dünnschichtchromatographie bestehen die Eluate 6 und 7 im wesentlichen aus den Komponenten A und B.
Beispiel 5
2,96 g eines nach Beispiel 4 erhaltenen, von Pigmenten befreiten Antibiotikumpräparats (Eluate 6 und 7) werden auf einer Säule von 3,5 cm Durchmesser und einer Höhe von
46,0 cm chromatographisch in die Komponenten zerlegt. Als
Adsorptionsmittel verwendet man Kieselgel, das man mit einem Gewichtsprozent Aktivkohle (Norit) auf der Maschine homogen vermischt. Diese Säule wäscht man 6 Stunden mit insgesamt 2 Liter Methanol, anschliessend 10 Stunden mit 3
Liter einer Mischung von frisch destilliertem Tetrachlorkoh lenstoff mit 5 Volumenprozenten Methanol.
Die Elution erfolgt in Fraktionen von je 150 ml mit
Mischungen von Tetrachlorkohlenstoff und Methanol nach dem Gradientenverfahren mit stufenweiser Erhöhung der
Methanolkonzentration um je 2 Prozent. Die Elutionsge schwindigkeit ist 200 ml/Stunde. Man beginnt mit einer Elu tionslösung von 5 Prozent Methanolgehalt und beendigt die Operation bei 30 prozentiger Methanolkonzentration.
Die Eluate werden bei 50O Badtemperatur im Rotationsverdampfer vom Lösungsmittel befreit, der Rückstand im Hochvakuum über Phosphorpentoxid getrocknet und hierauf dünnschichtchromatographisch auf die Komponentenzusammensetzung untersucht. Die Eluate mit 25 % Methanol enthalten die Komponente A, die Eluate mit 27% Methanol die Komponente B. In den letzten Eluaten mit 25 % Methanol ist teilweise Komponente B enthalten.
Beispiel 6
3200 Liter einer nach Beispiel 1 erhaltenen Kulturbrühe vom pH 7,7 werden mit 32 kg Filterhilfsmittel Decalite (Diatomeenerde) versetzt und unter Verwendung einer Filterpresse filtriert. 742 kg feuchter Filterkuchen wird 30 Minuten mit 1500 Liter Methanol verrührt. Die Feststoffe werden mittels einer Zentrifuge abgetrennt und mit 350 Liter 80 %igem wässrigem Methanol extrahiert. Es resultieren insgesamt 2000 Liter methanolische Extrakte. Sie werden in einem Zirkulationsverdampfer im Vakuum schonend auf 400 Liter eingeengt. Das trübe Konzentrat wird unter Verwendung eines Schlammseparators geklärt. Das Zentrifugat wird im Volumenverhältnis 1:3 mit Essigester unter Verwendung eines Dreistufenzentrifugalextraktors extrahiert. Der Extrakt wird zur Trockne eingedampft.
Der mittels des Schlammseparators abgetrennte wässrige Schlamm (44 Liter) wird mit 60 Liter Methanol und 1 kg Decalite versetzt und die Mischung eine Stunde gerührt. Dann werden die Feststoffe abfiltriert, mit 70 Liter 80%igem wässrigem Methanol extrahiert. Die beiden Filtrate werden zur Trockne eingedampft. Man erhält insgesamt 2,85 kg Trockenrückstände. Diese löst man in 5 Liter 85 %igem wässrigem Methanol und extrahiert die Lösung dreimal mit je 15 Liter Heptan. Nach Waschen mit 85 %igem Methanol werden die Heptanphasen verworfen. Die vereinigten wässrigen Methanolphasen werden zur Trockne eingedampft und im Vakuum getrocknet. Es resultiert 813 g brauner Rückstand. Dieser wird zweimal mit je 2 Liter wasserfreiem Essigester intensiv vermischt und abgenutscht. Das Filtrat wird verworfen, der Nutschrückstand wird im Vakuum bei 50O getrocknet.
Das braune Pulver (660 g) enthält das Antibiotikum A 32204.
Beispiel 7
Das gemäss Beispiel 6 erhaltene Pulver wird durch Craig Verteilung gereinigt und in die Komponenten A und B des Antibiotikums aufgeteilt. Zu diesem Zweck bedient man sich einer automatischen Craig-Maschine mit je 500 ml Phasenvolumen und 80 Stufen. Das Verteilungssystem wird erhalten, indem man 3 Vol.-Teile Essigester, 1 Vol.-Teil Cyclohexan,
1,5 Vol.-Teile Methanol und 2 Vol.-Teile entionisiertes Wasser vermischt, bei 200 equilibriert und die Phasen trennt. 100 g des obigen braunen Pulvers werden in je 2,5 Liter unterer und oberer Phase gelöst. Die leicht trübe Lösung wird über eine mit Filterhilfsmittel belegte Glasfilternutsche filtriert. Es resultieren 2,5 Liter klare, rotbraune untere Phase und 2,5 Liter klare, schwach gefärbte obere Phase.
Diese Lösungen werden in Portionen von je 500 ml in die Stufen 2-6 der Craig Maschine eingefüllt (in die erste Stufe wird reine untere und obere Phase eingefüllt). Die Verteilung wird über 180 Stufen laufen gelassen, wobei nach der 75. Stufe der Überlauf in
Fraktionen von je 15 Stufen aufgefangen wird. Aufgrund von bioautographischen Prüfungen werden die Fraktionen 38-70 vereinigt; sie enthalten die Komponente B des Antibiotikums (23,5 g); die Fraktionen 28-37 (4,5 g) sind schwach aktiv, sie enthalten Komponente B und eine weitere Substanz mit etwas kleinerem Rf-Wert. Die Fraktionen 71-73 und 144-180 (4,5 g) enthalten neben der Komponente B die Komponente
A; in den Fraktionen 114-143 ist hauptsächlich Komponente A neben etwas B vorhanden, in den Fraktionen 84-113 ist neben Komponente A und Komponente B eine weitere Substanz mit grösserem Rf-Wert als A vorhanden.
Die Fraktionen 0-12 sind inaktiv, die Fraktionen 13-27 und 74-83 enthalten nur Spuren aktiver Substanzen.
Zur Isolierung der Komponente B des Antibiotikums werden die Fraktionen 38-70 zur Trockne eingedampft, der Rückstand wird in 4,7 Liter eines Gemisches von 30 Vol.-Teilen Methanol und 70 Vol.Teilen Tetrachlorkohlenstoff gelöst und durch 240 g Magnesiumsilikat ( Woelm I), das in einer Glassäule mit dem Lösungsmittel klimatisiert ist, perkoliert.
Die Säule wird mit 1,9 Liter des Gemisches gewaschen. Das hellgelbe Perkolat wird im Vakuum schonend vom Lösungsmittel befreit. Man erhält 18 g antibiotisch aktives helles Pulver, während auf dem Magnesiumsilikat eine rote (inaktive) Zone zurückbleibt.
Beispiel 8
Das rohe Antibiotikum A 32204, Komponente B, wird durch Chromatographie an Sephadex LH-20 (alkyliertes vernetztes Dextran der Fa. Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala) weiter gereinigt. 218 mg des obigen Pulvers werden in 2 ml Methanol gelöst und über eine Kolonne (1,5 X 40 cm) von in Methanol gequollenem Sephadex LH-20 laufen gelassen. Das Antibiotikum wird als völlig farbloses amorphes Pulver erhalten. Es kann aus Methanol + Äther umgefällt werden.
Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte:
C H N O 55,48Uc 7,38etc 8,52sec 28,62nu Das Antibiotikum zeigt u. a, im IR-Spektrum in Kaliumbromid Banden bei 3350, 2930, 2860, 1650, 1515, 1440, 1230,
1085 und 840 cm-l. Aufgrund dieses Spektrums muss auf Anwesenheit von Amidgruppen geschlossen werden.
Im UV-Spektrum in Athanol sind die folgenden Maxima vorhanden: ismax = 284 nm (Schulter), E,cm = 15,2; iLmax = 278 nm, E,cz = 16,5; hmai = 227 nm (Schulter), Ei;;, = 191;; marx= 211 nm, EI 757.
Die Verbindung zeigt eine optische Drehung [a]D = -44,4 (c = 0,54 in Methanol). Im Dünnschichtchromato gramm an Silicagel (Kieselgel-Fertigplatten F 254 der Fa.
Merck) im System Chloroform-Methanol (3:1, V:V) ist Rf =
0,25 bei einmaligem Durchlaufen, Rf = 0,4 bei zweimaligem Durchlaufen. Nachweis mit Jod; konz. Schwefelsäure und
Erhitzen. Zur Prüfung auf freie NH2-Gruppen wurde versucht, ein N-Acetylderivat herzustellen. Zu diesem Zweck wurden
100 mg der gemäss Beispiel 6 erhaltenen Verbindung in 5 ml eines Gemisches von Essigsäureanhydrid-Methanol (1:4, V:V) gelöst und während 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dünnschichtchromatographie und NMR-Spektrum zeigten. dass die Substanz unverändert geblieben war. Auch ein N-2,4-Dinitrophenylderivat konnte durch Reaktion mit 2,4 Dinitrofluorbenzol nicht hergestellt werden.
Zur Prüfung auf alkoholische und phenolische OH-Gruppen wurde Komponente B acetyliert. 128 mg Komponente B wurden mit je 1 ml Essigsäureanhydrid und Pyridin während 25 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurde das Reaktionsgemisch unter Vakuum eingedampft, wobei 173 mg eines gelblichen Öles erhalten wurden. Dieses Öl wurde an 15 g Kieselgel mit Chloroform, welches 5% Methanol enthielt, chromatographiert. Es wurden 150 mg farbloses, amorphes Acetat erhalten, Die Anzahl der Acetylgruppen liess sich nicht bestimmen; aufgrund des NMR-Spektrums (in COCls) muss man annehmen, dass es mindestens 5, wahrscheinlich aber 6-7 Acetylgruppen sind.
Das IR-Spektrum des Acetylderivates in Kaliumbromid zeigt Banden bei 3360, 3060 (Schulter), 3000 (Schulter), 2950 (Schulter), 2930, 2850, 1750, 1680 (Schulter), 1640, 1525(Schulter), 1505, 1430, 1370, 1225 1165, 1045, 1015, 910 und 840 cm-l. Das UV-Spektrum in Äthanol weist Maximabei 284 nm (Ei;;, = 5,6) und 211 nm (Elltm = 220) auf. Die Elementaranalyse ergab:
C H N Berechnet: 57,06sec 6,929 6,99/c Gefunden: 58,44% 6,95 in 6,37cd Osmometrisch wurde ein Molekulargewicht von 1403 gefunden.
Bei der Veresterung der Komponente B des Antibiotikums mit p-Brombenzoesäure wurde ein kristallines Derivat erhalten. 150 mg Antibiotikum 32204 wurden in 1 ml Pyridin gelöst und mit 400 mg p Brombenzoylchlorid versetzt. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde mit 40 ml Äther verdünnt, vom Unlöslichen abfiltriert und eingedampft. Das erhaltene Rohprodukt wurde an 30 g Kieselgel mit Chloroform, welches 2% Methanol enthielt, chromatographiert. Es konnten 184 mg farbloses, amorphes Produkt erhalten werden. Zur Kristallisation wurde in warmem Äthylacetat gelöst und in der Wärme tropfenweise Methanol zugefügt, bis sich die Lösung eben trübte. Beim langsamen Abkühlen fielen sehr feine farblose Kristalle aus, die bei 161-165 schmolzen.
Die Elementaranalyse ergab: C = 51,53%, H = 4,41%, N = 4,16sec, Br = 22,79%. Das IR Spektrum in Kaliumbromid zeigt u. a. Banden bei 3410 (Schulter), 3350, 3060, 3000 (Schulter), 2960 (Schulter), 2930, 2850, 1725, 1690 (Schulter), 1640, 1590, 1525 (Schulter), 1505, 1485, 1400, 1260, 1205, 1170, 1110 (Schulter), 1100, 1070, 1010, 965, 845, 755 cm-l. Gemäss dem NMR Spektrum in CDCl3, 100 MHZ sind 6-7 p-Brombenzoylgruppen vorhanden. Osmometrisch wurde das Molekulargewicht des Derivates zu 1926 bestimmt.
Die Komponente B des Antibiotikums 32204 wurde der sauren Hydrolyse unterworfen. Dabei wurden mehrere ninhydrinpositive Produkte erhalten. 1,5 g von Komponente B wurden mit 30 ml 6N Salzsäure im zugeschmolzenen Bombenrohr während 24 Stunden auf 110 erhitzt. Anschliessend wurde mit 150 ml auf das sechsfache Volumen verdünnt und dreimal mit 250 ml Äther extrahiert. Die Ätherextrakte wurden zweimal mit 25 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der wasserlösliche Teil wurde unter Vakuum eingedampft.
Der ätherlösliche Teil ergab bei der Aufarbeitung ein Abbauprodukt, das durch Veresterung, Spektrographie, oxydativen Abbau und Gaschromatographie des erhaltenen Azelainsäure-dimethylesters als Linolsäure, C17H31COOH, identifiziert wurde.
Der wasserlösliche Teil enthielt mehrere ninhydrinpositive Produkte, teils mit gelber, teils mit violetter Farbreaktion. Bei der Chromatographie an Cellulose im System n-Butanol Eisessig-Wasser (4:1:1) wurden die Abbauprodukte I (520 mg), II (690 mg) und III (560 mg) mit den Rf-Werten für I = 0,56 (gelb mit Ninhydrin) für II = 0,28 (violett mit Ninhydrin) und für III = 0,27 (gelb mit Ninhydrin) isoliert. In Hydrolysat befinden sich wahrscheinlich noch weitere Hydrolyseprodukte.
Aus den 520 mg des Hydrolyseproduktes I liessen sich durch Craig-Verteilung im System n-Butanol-Wasser 238 mg eines Öles isolieren, das mit Pyridin-Essigsäureanhydrid 1:1 acetyliert wurde. Man erhielt ein aus Methylenchlorid-Petrol äther kristallisierbares Di-acetylderivat vom F. 114-115 . Aus der Elementaranalyse (C = 62,64, 62,49%; H = 6,02,6,04io N = 5,62, 5,56%) ergibt sich die Bruttoformel C13H15NO4.
Aufgrund der Spektren wird folgende Struktur angenommen: CH3 - CO - OC6H4CH4 - CO - CH2 - NHCO - CH3.
Für das Hydrolyseprodukt I lässt sich daraus die Struktur HO - GH4 -CH2 - CO - CH2NH2, 1-Amino-3 -(p-hydroxyphenyl)-aceton, ableiten. Dieses Produkt ist sehr wahrscheinlich ein sekundäres Zerfallsprodukt eines primären Hydrolyseproduktes, denn im Antibiotikum ist eine Ketogruppe nicht vorhanden, vgl. das oben angegebene IR-Spektrum.
Aus den 690 mg des Hydrolyseproduktes II konnte durch Chromatographie an Dowex 50W-X4 (sulfoniertes Polystyrol, mit 4% Divinylbenzol vernetzt, der Fa. Dow Chem. Co.
Midland, Mich.) eine aus Wasser + Äthanol kristallisierende Verbindung vom F. 265-2680 (Zers.) erhalten werden. Aus der Elementaranalyse, optischen Drehung und Spektren ergab sich, dass die Verbindung L-Threonin ist.
Aus den 560 mg des Hydrolyseproduktes III konnten nach
Chromatographie an Dowex 50W-X4 mit 1N Salzsäure aus Äthanol unter Zugabe von etwas Pyridin hellbraune Kristalle isoliert werden. Diese wurden durch Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie, optische Drehung, NMR-Spektrum und Farbreaktion mit Ninhydrin und Isatin als L-4 Hydroxyprolin identifiziert. Als Hydrolyseprodukte von Antibiotikum 32204 werden demnach Linolsäure, 1-Amino-3-(phydroxyphenyl)-aceton, L- Threonin und L-4-hydroxyprolin erhalten. Diese würden, falls 2 Mol L-Threonin vorhanden sind, ein Molekulargewicht von 742 ergeben. Da das Molekulargewicht aufgrund der osmometrisch bestimmten Molekulargewichte der Derivate zu ca. 1000 angenommen werden muss, ist ein Teil der Abbauprodukte noch nicht erfasst.
Beispiel 9
Komponente B des Antibiotikums A 32204 wird wie folgt hydriert: Zu 100 mg Platinoxid, die in 15 ml Methanol in einer
Hydrierapparatur vorhydriert wurden, gibt man 1,9 g der
Komponente B. In 20 Stunden bei Raumtemperatur wurden
146 ml Wasserstoff aufgenommen Nach Filtration und Ein dampfen des Filtrates wurden 1870 mg farblose amorphe
Substanz erhalten. Die Elementaranalyse ergibt: C = 59,15%,
H = 9,22%, N = 8,27%. Im UV-Spektrum in Äthanol sind
Maxima vorhanden bei A =284 nm (Schulter), Ei = 126;Ä= 278 nm, Elzm = 14,7;
A = 224 nm (Schulter), Ei;;, = 15,1; X = 214 nm, Elcm= 184.
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums A
32204, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Asper gillus nidulans var. echinulatus A 32204 oder eine das Anti biotikum A 32204 bildende Mutante in einer wässrigen, eine
Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltenden Nährlösung aerob züchtet, bis diese eine wesent liche antibiotische Wirkung aufweist, und das Antibiotikum A
32204 hierauf isoliert.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeich net, dass man das Antibiotikum durch Behandlung mit ver esternden Mitteln in Ester überführt.
2. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man das rohe Antibiotikum durch Extraktion aus dem Kulturmedium isoliert.
3. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man das Mycel mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel oder einer Mischung davon mit Wasser extrahiert.
4. Verfahren nach Patentanspruch I und Unteranspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das Rohprodukt durch nochmalige Lösungsmittelextraktion, durch Verteilung zwischen nicht mischbaren Lösungsmitteln und/oder durch Chromatographie reinigt.
5. Verfahren nach Patentanspruch I und Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum durch Chromatographie an Kieselgel, gegebenenfalls in Mischung mit Aktivkohle, gereinigt wird.
6. Verfahren nach Patentanspruch I und Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum durch Chromatographie an Magnesiumsilikat, gegebenenfalls in Mischung mit Aktivkohle, gereinigt wird.
7. Verfahren nach Patentanspruch I und Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum durch Chromatographie an Adsorptionsharzen gereinigt wird.
8. Verfahren nach Patentanspruch I und Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum durch Chromatographie an vernetzten Dextranen gereinigt wird.
9. Verfahren nach Patentanspruch I und Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Reinigung des Antibiotikums durch Chromatographie zur Elution Mischun gen gen von Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff mit Methanol verwendet.
10. Verfahren nach Patentanspruch I und Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum durch Gegenstromverteilung und/oder Chromatographie in die Komponenten A und B und gegebenenfalls weitere Komponenten zerlegt wird.
11. Verfahren nach Patentanspruch I und Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum durch Chromatographie an Kieselgel, gegebenenfalls in Mischung mit Aktivkohle, in die Komponenten A und B und gegebenenfalls weitere Komponenten aufgetrennt wird.
12. Verfahren nach Patentanspruch I und einem der Unteransprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Prüfung auf Anwesenheit des Antibiotikums im Kulturmedium oder bei den einzelnen Isolierungsstufen Candida albicans verwendet.
PATENTANSPRUCH II
Verwendung der nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1 erhaltenen Verbindungen zur Herstellung von Hydrierungsprodukten, dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibiotikum oder seine Ester mit hydrierenden Mitteln behandelt.
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The invention relates to a process for the production of the new water-insoluble antibiotic A 32204 and its derivatives. The term antibiotic A 32204 denotes the entirety of the antibiotically active substances that are formed during the cultivation of the Aspergillus strain A 32204.
Antibiotic A 32204 consists of at least 2 antibiotically active substances, which are referred to as components A and B of antibiotic A 32204.
The new Aspergillus strain A 32204 is stored in our laboratories under the name mentioned; it has been isolated from beech leaves (Fagus silvatica L.).
According to Raper and Fennell (1965) (see: Raper, K. B. and Fennell D.I .: The genus Aspergillus: Williams & Wilkins Co., Baltimore (1965), 686 p.)), Strain A 32204 can be assigned to the species Aspergillus nidulans. In its essential morphological characteristics it corresponds completely to the variety of Aspergillus nidulans (Eidam) Wint., Aspergillus nidulans described by Fennell and Raper (1955) (Fennell, DI and Raper, KB: Mycologia 47 (1), 79-80, 1955) (Eidam) Wint. var. echinulatus Fennell and Raper. It is therefore identified as a strain of this variety of Aspergillus nidulans. The type strain WB 2395 from Aspergillus nidulans (Eidam) Wint. var.echinulatus Fennell with the l.c.
specified morphological characteristics is deposited in the American Type Culture Collection under the number ATCC 16825. Strain A 32204 was deposited with the Northern Regional Research Lab. US Department of Agriculture, Peoria, Illinois under the number NRRL 3860.
The antibiotic A 32204 is produced when the strain A 32204 is grown. The method according to the invention is characterized in that the strain A 32204 or a mutant of this strain forming the antibiotic A 32204 is cultured aerobically in an aqueous nutrient solution containing a carbon or nitrogen source and inorganic salts until the nutrient solution shows a significant antibiotic effect and the antibiotic A 32204 isolated thereupon. The antibiotic A 32204 forming mutants can e.g. B. obtained under the action of ultraviolet or X-rays or nitrogen mustard oils.
Examples of carbon sources include: assimilable carbohydrates, e.g. B. glucose, sucrose, lactose, mannitol, starch, and also glycerine. Nitrogen-containing nutrients that may be mentioned are: amino acids, peptides and proteins and their breakdown products such as peptone or tryptone, also meat extracts, water-soluble parts of cereal grains such as maize and wheat, of distillation residues from alcohol production, of yeast, beans, especially the soy plant, of seeds, for example the cotton plant, etc., but also ammonium salts and nitrates.
For example, the nutrient solution can contain chlorides,
Contains carbonates, sulfates, phosphates of alkali or alkaline earth metals, of magnesium, iron, zinc and manganese
The cultivation takes place aerobically, for example in static surface culture or preferably submerged with shaking or stirring with air or oxygen in shake flasks or the known fermenters. A suitable temperature is between 18 and 40 C., preferably around 28oC. The nutrient solution generally shows a significant antibacterial effect after 1 liter. up to 5 days. Cultivation is preferably carried out in several stages, i. H. you first produce one or more precultures in liquid nutrient medium, which are then transferred to the actual production medium, e.g.
B. in the ratio 1:20, be vaccinated. The preculture is obtained, for example, by inoculating a sporadic mycelium that has been grown on a solid nutrient medium for around 14 days into a liquid medium and allowing it to grow for 48 hours.
The antibiotic is isolated from the culture medium according to methods known per se, taking into account the chemical, physical and biological properties of the antibiotic.
For example, the antibiotic can be extracted from the unfiltered culture broth with an organic solvent which is not very miscible with water, e.g. B. ethyl acetate, are extracted.
This so-called whole-broth method is preferably used because the antibiotic is located both in the mycelium and, in small quantities, in the culture filtrate.
The antibiotic collects in the water-containing organic phase, e.g. B. in ethyl acetate, and this phase is separated from the extracted culture fluid and the sludge (extracted mycelium and nutrient solution solids).
The residue obtained in the extraction can be subjected to one or more renewed extractions with the same or a different solvent.
You can also e.g. Extract the mycelium filtered off with filter aids alone and discard the little active culture filtrate. The mycelium washed with water (together with the filter aid) is preferably mixed with a water-miscible organic solvent, e.g. B. a lower alkanol with 1-4 carbon atoms, such as methanol, ethanol, propanol, isopropanol, also dimethyl sulfoxide, formamide, dimethylformamide, or with mixtures of these solvents with water, in particular with water-containing methanol.
To purify the crude product obtained after evaporation of the solvent you can z. B. extraction, precipitation, distribution between immiscible solvent phases or chromatography. Thus, from the raw product, e.g. Acetic ester extract of the culture broth, significant proportions of accompanying substances through successive simple cleaning processes such as extraction of the dried, powdered crude product with solvents in which the antibiotic is insoluble, eg. B. anhydrous ethyl acetate or hydrocarbons such as petroleum ether, cyclohexane, or anhydrous halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, carbon tetrachloride, can be removed. You can also solve the crude product.
e.g. in methanol. and by absorbents such as activated carbon, silica gel, magnesium silicate or mixtures thereof or adsorption resins, e.g. B. Separate crosslinked dextrans such as Sephadex (from Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala) from accompanying substances. For example, the crude product can be purified by repeated column chromatography using silica gel, expediently with small additions of activated carbon. The antibiotic is preferably eluted by the gradient process with mixtures of chloroform or carbon tetrachloride and methanol, the percentage content of the more polar solvent being increased in stages.
If the extract obtained by extraction of the culture broth is chromatographed on a mixture of silica gel with 5% by weight of activated carbon and chloroform / methanol as the elution liquid, almost the entire amount of the antibiotic extracted from the culture broth is found distributed over the eluates of the methanol concentrations 25-35Wo.
The above-mentioned distribution between immiscible solvent phases is expediently carried out as countercurrent distribution using a Craig apparatus. A mixture of ethyl acetate, cyclohexane, methanol and water, for example, serves as the solvent system.
In order to remove any colored impurities that are still present, the product is preferably subjected to chromatography on magnesium silicate.
To obtain the individual, uniform components of the antibiotic, they can be separated and isolated using the preparative thin-layer chromatography method under the conditions described for analytical detection. The separation by means of column chromatography is more advantageous, where the adsorbent z. B. silica gel with a content of 1 percent activated carbon is used and the elution is preferably effected according to the gradient method with a mixture of carbon tetrachloride and methanol. The concentration of the more polar solvent is expediently increased in smaller percentage increments, or the continuous gradient elution method is used. The components appeared in the eluate in the order of increasing running distance.
The procedure can be repeated if necessary.
In thin-layer chromatography on silica gel (with chloroform-methanol (3: 1) as eluent) and bioautography, two main antibiotic components can be detected: approx. 95% of the antibiotic consists of components A and B, the remaining approx. 5% consists of several minor components components (bioautographic testing with Candida albicans).
In the thin-layer chromatogram on silica gel using the multiple method with intermediate drying and distances of 8, 10 and 15 cm on the solvent front, the components in the chloroform-methanol (75:25) system show the following distances: component A: 93 mm; Component B:
72 mm.
A separation into the components also takes place in the above-mentioned chromatography on Sephadex and in the
Craig countercurrent distribution, e.g. B. in the above-mentioned system.
For those obtained by this method uniform
Components of the antibiotic was found in the serial dilution test with Candida albicans as the test organism a MIC between 0.02 and 0.05 y / ml.
To test the antibiotic action in the individual
Isolation stages - as well as in the culture medium - Candida albicans is particularly suitable as a test organism.
According to the elemental analysis of the main components A and B, the antibiotic consists only of the elements C, H, O and N.
The antibiotic A 32204, component B has the following chemical and physical properties:
It is a neutral, colorless substance, white in powder form, which is practically insoluble in water and aqueous acids and which is easily soluble in lower alkanols such as methanol, ethanol, n-propanol, and also in dimethyl sulfoxide, formamide and dimethylformamide. In anhydrous ethyl acetate, acetone,
Methyl isobutyl ketone, ether, petroleum ether and chlorinated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform and carbon tetrachloride, the antibiotic is sparingly soluble (10
100 mg / liter). The antibiotic is stable in methanolic-aqueous medium from pH 3 to 7, at an alkaline pH, especially at pH 9, the antibiotic decomposes
Loss of activity.
The antibiotic, component B, gives the following color reactions: with potassium ferricyanate iron (III) chloride: blue; according to Folin-Ciocalteau: blue; according to Reindel-Hoppe: blue; with tetramethyldiamino-diphenylmethane: blue; with tetrazolium blue: violet; according to Pauly: yellow-orange; with ammonium molybdate perchloric acid: blue; with conc. Sulfuric acid: black-purple.
The following values are found in elemental analysis:
C, H, N Found 55.48% 7.38% 8.52% [a] 20 = -44.4O (c = 0.54 in methanol).
On the basis of vapor pressure osmometric molecular weight determinations of derivatives (acetyl derivative, p-bromobenzoate), the molecular weight can be estimated at about 100. Only smaller fragments can be seen in the mass spectrum. One molecular ion is missing. In the IR spectrum in potassium bromide are u. a. the following bands are available: 3350, 2930, 2860, 1650, 1440, 1230, 1085, 1000 (shoulder), 975 (shoulder), 928 (shoulder), 873 (shoulder), 840 cm-l. The antibiotic has no free amino and carboxyl groups. N-acetylation with acetic anhydride in methanol did not give an N-acetyl derivative.
In contrast, various hydroxyl groups could be acetylated with acetic anhydride and pyridine. The following analytical values were obtained for the acetyl derivative: C = 57.06; 58.44%, H = 6.92; 6.95; N = 6.99; 6.37%. The molecular weight was determined to be 1188 osmometrically. The IR spectrum in the potassium bromide shows u. a. Bands at 3360, 3060 (shoulder), 3000 (shoulder), 2950 (shoulder), 2930, 2850, 1750, 1680 (shoulder), 1640, 1525 (shoulder), 1505, 1430, 1370, 1225, 1165, 1045, 1015 , 980 (shoulder), 910, 840 cm-l.
In the NMR spectrum, numerous acetyl signals can be seen in the 2 ppm region, some of which overlap. The number of acetyl groups can only be roughly estimated. There are at least 5, but probably 6-7, acetyl groups present. The A2B2 signal group with J approx. 8 Hz in the 7 ppm range indicates a p-hydroxyphenyl residue. The presence of a p-hydroxyphenyl group is also compatible with the UV spectra of the antibiotic and its derivatives, which are strikingly similar to tyrosine derivatives (e.g. of peptides containing tyrosine). In the UV spectrum there are maxima at 284 nm, E's6m = 5.6 and 211 nm, Elss = 220.
In the p-bromobenzoylation, a crystalline derivative of F. 1611650C (crystallized from ethyl acetate + methanol) was obtained. Elemental analysis gave: C = 51.53%, H = 4.41%, N = 4.16%, Br = 22.79%. The molecular weight, determined osmometrically in methylene chloride, was 1926. The IR spectrum in potassium bromide shows i.a. Bands at 3410 (shoulder) 3350, 3060, 3000 (shoulder), 2960 (shoulder), 2930, 2850, 1725, 1690 (shoulder) 1640, 1590, 1525 (shoulder), 1505, 1485, 1450, 1400, 1260, 1205 , 1170, 1110 (shoulder), 1100, 1070, 1010, 965, 870 (shoulder), 845, 755 cm- '. The NMR spectrum and the molecular weight are compatible with 6-7 esterifiable OH groups.
Acid hydrolysis found linoleic acid, L-threonine, L-4-hydroxyproline and 1-amino-3- (hydroxyphenyl) -acetone as degradation products. The latter product must be a secondary decay product because the intact antibiotic does not contain a keto group.
During the hydrogenation of the antibiotic, component B, about 3 mol of hydrogen were absorbed, but in the NMR spectrum only the disappearance of the signals of the 4 olefinic hydrogen atoms of the linoleic acid residue could be observed. The IR spectrum in potassium bromide shows u. a. Bands at 3350, 2930, 2854, 1631, 1516, 1440, 1265, 1082, 1000 (shoulder), 968 (shoulder), 930 (shoulder), 875 (shoulder), 839, 796 cm-1.
In the UV spectrum there are maxima at 284 nm (shoulder), E, lecm = 12.6; 278 nm, E'mcem = 14.7; 224 nm (shoulder), E1 ;;, = 151; and 214 nm, Ei ;;, = 184, visible.
The elemental analysis shows
C H N
59.15% 8.22% 8.27%
In the foregoing and in the following, derivatives of the antibiotic are understood to mean on the one hand esters of the antibiotic and on the other hand hydrogenation products and their esters. Esters are, for example, those in which the alcoholic and / or phenolic hydroxyl groups are esterified with carboxylic acids or thiocarboxylic acids having 1-20 carbon atoms.
Such acids are above all optionally substituted lower alkanoic acids with 1-6 carbon atoms such as formic acid, acetic acid, propionic acid, pivalic acid, further optionally substituted mono- or bicyclic aromatic or aliphatic acids such as benzoic acid, thiobenzoic acid, naphthoic acid, phenyl-lower alkanoic acids such as phenylacetic acid, phenylpropionic acids are for example halogen such as fluorine, chlorine, bromine, iodine, trifluoromethyl, nitro, free, esterified or etherified hydroxyl groups, e.g. B.
Lower alkanoyloxy such as acetoxy, lower alkoxy such as methoxy, lower alkyl mercapto such as methyl mercapto, free or functionally modified carboxyl groups, e.g. B. lower alkoxycarbonyl such as methoxycarbonyl, carbamoyl, cyano, optionally substituted amino groups, e.g. B. mono- or di-lower alkylated or N-acylated amino groups, e.g. Methylamino, dimethylamino, lower alkanoylamino, e.g. B. acetylamino.
The antibiotic A 32204 and its derivatives have a very good specific antifungal action against various types of yeast-like fungi such as Candida albicans, Candida utilis, Torulopsis dattila, Torulopsis sphaerica, Endomyces bispora or Hansenula californica. So z. B. in the in vitro test in the gradient plate line test (W. Szibalski, Science 116, 46 [1952]) against approx. 20 different clinically occurring strains of Candida albicans the minimum inhibitory concentration 0.2 to 0.3 y / ml. Antibiotic A 32204 is characterized by its very low toxicity compared to known antifungal antibiotics.
The new antibiotic and its derivatives can therefore be used to combat infections caused by yeast-like fungi, in particular Candida albicans, and also as a feed additive, to preserve food or as a disinfectant.
Antibiotic A 32204 and its derivatives can be used as remedies, e.g. B. in the form of pharmaceutical preparations, use. These contain the compounds mentioned in a mixture with a pharmaceutical, organic or inorganic carrier material suitable for enteral or parenteral administration. For the same, those who do not react with the new connection come into consideration, such as B. gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, vegetable oils, benzyl alcohol, or other known excipients. The pharmaceutical preparations can e.g. B. as tablets, dragees, powders, suppositories or in liquid form as solutions, suspensions, emulsions, creams or ointments. If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliaries such as preservatives, stabilizing wetting agents or emulsifying agents.
They can also contain other therapeutically valuable substances.
The invention is described in the following examples. The temperatures are given in degrees Celsius.
example 1
A well-overgrown slant of the Aspergillus nidulans var. Echinulatus strain A 32204 is filled with 5 ml of 0.2 m. Phosphate buffer pH 7 suspended. 3 Erlenmeyer flasks with 4 baffles each with 100 ml nutrient solution, which contains 20 g soybean meal, 10 g trypticase (Baltimore Biological Laboratories), 10 g glucose and 5 g sodium chloride per liter of tap water and whose pH is 1-n before sterilization.
Sodium hydroxide solution has been adjusted to 7.8, are inoculated with 1 ml of the Aspergillus suspension and incubated for 48 hours on a rotating shaker at 250 rpm at 28.
25 ml each of the culture thus obtained are inoculated in 6 2-liter Erlenmeyer flasks with 4 baffles and 500 ml of the above nutrient solution. The flasks are then incubated at 280C on a rotating shaker at 120 rpm for 48 hours.
1.5 liters of the culture from the 2 liter flasks are transferred to a 50 liter fermenter containing 30 liters of the above nutrient solution and incubated at 28 for 36 hours. Then 15 liters of the culture are transferred to a fermenter with 300 liters of the above nutrient solution. This fermenter instructs
Total volume of 500 liters and has a 6-blade turbine stirrer and 4 baffles. The breeding conditions in the fermenter are: pressure 1 atm, agitation speed
450 rpm, temperature 28oC, air throughput 1 liter V / V / min.
The incubation time is 36 hours.
Each 150 liters of culture from the 500 liter fermenter are in
Transfer 2 fermenters with 300 liters of the above nutrient solution each. The total volume of these fermenters is 5000 liters each,
They each have a 6-blade turbine stirrer and 4 Schi kanen. The cultivation conditions in the fermenter are: stirring speed 210 rpm, pressure 1 atm, temperature 29C, 1 air throughput 1 liter V / V / min. The conditions correspond to an oxygen absorption rate of measured in sulfite solution
200 mM O2 / l / h. The optimal formation of the antibiotic A
32204 takes place after approx. 60 hours of incubation. The culture solution then has a pH of 7.7. She has an activity of
10 mm zone of inhibition in the agar diffusion test with Candida albicans using Whatmann AA discs 6 mm.
Example 2
6000 liters of the culture solution obtained according to Example 1 are mixed in portions with ethyl acetate in a ratio of 3: 2
Stirred hour and separated in a sludge separator with phase separation device. The inactive aqueous raffinate and sludge are discarded. 4000 liters of ethyl acetate phase are gently concentrated in vacuo. It results in a
97 liter concentrate of water and ethyl acetate.
The aqueous phase is separated off, re-extracted 3 times with ethyl acetate and then discarded. 102 liters of vinegar ester extract are dried with anhydrous sodium sulfate and gently concentrated. 23 liters of extract concentrate are distributed between 85% aqueous methanol and petroleum ether. The inactive petroleum ether phase is discarded. 43 liters
The methanol phase are concentrated to dryness in vacuo.
The resinous residue is dissolved in 4 liters of methanol and the insoluble inactive residue is discarded. The methanol
The extract is again evaporated in vacuo. 395 g of resinous residue are stirred with ether and the precipitate is suction filtered. The inactive ether mother liquor is discarded. The precipitate is dried in a high vacuum and gives 132 g of active residue.
44 g of the residue thus obtained are suspended in 1 liter of dry ethyl acetate. The batch 30 is shaken
Minutes, filtered off the insoluble fraction from the yellow-brown colored ethyl acetate solution, washed the filter residue twice with 200 ml of ethyl acetate each time and dried it in a high vacuum over phosphorus pentoxide at room temperature (23.9 g).
The ethyl acetate extracts show only little activity and who discarded the.
70 g of Norit (activated carbon) are added to the product obtained, and the mixture is shaken under nitrogen three times in succession with 800 ml of dry methanol each time for 30 minutes
Minutes. The methanol extracts (I, II and III) are filtered separately with the addition of Celite 545. After evaporation of the solvent, they have minimal inhibitory concentrations of approx. 0.1 y / ml.
Example 3
5.1 g of the methanol extract I (12.6 g) obtained according to Example 2 are poured onto a column which consists of a (95: 5, weight: weight) mixture of silica gel (Merck, particle size 0.05-0 , 2 mm) and Norit consists, chromatographed (= 5.5 cm, h = 26 cm). The column had been pretreated for 6 hours with a total of 3 liters of dry methanol and then for 15 hours with 4 liters of dry chloroform. The 5.1 g of methanol extract I are dissolved in 3 ml of dry methanol, the solution is diluted with 3 ml of chloroform and applied to the column. The elution takes place in fractions of 320 ml each using the gradient method with chloroform-methanol mixtures with a gradual increase in the concentration of the more polar solvent by 3%, 2% and then by 5 percent each time.
The operation is started with pure chloroform and terminated when the mixture contains 50 percent methanol. The passage time of an eluate fraction is set to 150 minutes.
The eluates are freed from the solvent in a rotary evaporator at a bath temperature of 500 and the residue is dried over phosphorus pentoxide in a high vacuum.
The eluates with a methanol content of 0 to 20% are not very active.
The eluates of higher methanol concentrations are whitish with an orange-yellow tint. Eluate 8 (30% methanol; 1.83 g) has the highest activity.
Bioautographically examined, the eluate 8 consists essentially of the two main components of the antibiotic, A and B, together.
Example 4
To remove the orange-red pigment and others
Impurities in the crude antibiotic obtained from eluate 8 according to Example 3 is a solution of 0.50 ml
Methanol on a 1.9 cm diameter column and one
Height of 10.0 cm of magnesium silicate (Woelm, activity level I) chromatographed. The adsorbent is in 4
Washed for hours with 300 ml of methanol, then for 12 hours with 500 ml of freshly distilled carbon tetrachloride. Analogous
Example 3 is co-eluted by the gradient method
Mixtures of carbon tetrachloride and methanol, gradually increasing the concentration of the more polar
Solvent by 5% each, with the operation with pure
Carbon tetrachloride started and at a content of
Mixture of 50% methanol is terminated.
The elution speed is adjusted to 15 ml of eluate / hour and fractions of 20 ml are collected.
The dry preparations are made from the eluates according to
Example 3 isolated. Eluates 1 to 5 (0 to 20% methanol together give only 0.005 g of inactive residue. The completely colorless eluates 6 and 7 (methanol content 25 and 30%; together 0.166 g) show the highest antibiotic activity
According to thin layer chromatography, eluates 6 and 7 essentially consist of components A and B.
Example 5
2.96 g of an antibiotic preparation obtained according to Example 4 and freed from pigments (eluates 6 and 7) are placed on a column with a diameter of 3.5 cm and a height of
46.0 cm broken down into the components by chromatography. When
Adsorbent is used silica gel, which is mixed homogeneously with one percent by weight of activated carbon (Norit) on the machine. This column is washed for 6 hours with a total of 2 liters of methanol, then for 10 hours with 3
Liters of a mixture of freshly distilled carbon tetrachloride with 5 percent by volume of methanol.
Elution takes place in fractions of 150 ml each
Mixtures of carbon tetrachloride and methanol according to the gradient method with gradual increase in the
Methanol concentration by 2 percent each time. The elution speed is 200 ml / hour. One starts with an elution solution with 5 percent methanol content and ends the operation at 30 percent methanol concentration.
The eluates are freed from the solvent in a rotary evaporator at a bath temperature of 50 °, the residue is dried over phosphorus pentoxide in a high vacuum and then examined for the component composition by thin-layer chromatography. The eluates with 25% methanol contain component A, the eluates with 27% methanol contain component B. The last eluates with 25% methanol contain component B in part.
Example 6
3200 liters of a culture broth of pH 7.7 obtained according to Example 1 are mixed with 32 kg of filter aid Decalite (diatomaceous earth) and filtered using a filter press. 742 kg of moist filter cake is stirred with 1500 liters of methanol for 30 minutes. The solids are separated off using a centrifuge and extracted with 350 liters of 80% aqueous methanol. A total of 2000 liters of methanolic extracts result. They are gently reduced to 400 liters in a circulation evaporator. The cloudy concentrate is clarified using a sludge separator. The centrifugate is extracted in a volume ratio of 1: 3 with ethyl acetate using a three-stage centrifugal extractor. The extract is evaporated to dryness.
The aqueous sludge (44 liters) separated by means of the sludge separator is mixed with 60 liters of methanol and 1 kg of decalite and the mixture is stirred for one hour. Then the solids are filtered off, extracted with 70 liters of 80% aqueous methanol. The two filtrates are evaporated to dryness. A total of 2.85 kg of dry residue is obtained. This is dissolved in 5 liters of 85% aqueous methanol and the solution is extracted three times with 15 liters of heptane each time. After washing with 85% methanol, the heptane phases are discarded. The combined aqueous methanol phases are evaporated to dryness and dried in vacuo. 813 g of brown residue result. This is intensively mixed twice with 2 liters of anhydrous ethyl acetate each time and sucked off. The filtrate is discarded, and the residue on the Nutsch is dried in vacuo at 50 °.
The brown powder (660 g) contains the antibiotic A 32204.
Example 7
The powder obtained according to Example 6 is purified by Craig partitioning and divided into components A and B of the antibiotic. For this purpose, an automatic Craig machine with a 500 ml phase volume and 80 stages is used. The distribution system is obtained by adding 3 parts by volume of ethyl acetate, 1 part by volume of cyclohexane,
1.5 parts by volume of methanol and 2 parts by volume of deionized water are mixed, equilibrated at 200 and the phases are separated. 100 g of the above brown powder are dissolved in 2.5 liters each of the lower and upper phases. The slightly cloudy solution is filtered through a glass suction filter covered with filter aid. 2.5 liters of clear, red-brown lower phase and 2.5 liters of clear, slightly colored upper phase result.
These solutions are poured into stages 2-6 of the Craig machine in portions of 500 ml each (pure lower and upper phases are poured into the first stage). The distribution is run over 180 stages, after the 75th stage the overflow in
Fractions of 15 levels each is collected. Fractions 38-70 are combined on the basis of bioautographic tests; they contain component B of the antibiotic (23.5 g); The fractions 28-37 (4.5 g) are weakly active, they contain component B and another substance with a slightly lower Rf value. Fractions 71-73 and 144-180 (4.5 g) contain component B as well as component
A; in fractions 114-143 mainly component A is present alongside some B, in fractions 84-113 there is another substance with a higher Rf value than A in addition to component A and component B.
Fractions 0-12 are inactive, fractions 13-27 and 74-83 contain only traces of active substances.
To isolate component B of the antibiotic, fractions 38-70 are evaporated to dryness, the residue is dissolved in 4.7 liters of a mixture of 30 parts by volume of methanol and 70 parts by volume of carbon tetrachloride and replaced with 240 g of magnesium silicate (Woelm I) , which is conditioned in a glass column with the solvent, percolated.
The column is washed with 1.9 liters of the mixture. The light yellow percolate is gently freed from the solvent in vacuo. 18 g of antibiotically active light-colored powder are obtained, while a red (inactive) zone remains on the magnesium silicate.
Example 8
The crude antibiotic A 32204, component B, is further purified by chromatography on Sephadex LH-20 (alkylated crosslinked dextran from Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala). 218 mg of the above powder are dissolved in 2 ml of methanol and passed through a column (1.5 × 40 cm) of Sephadex LH-20 swollen in methanol. The antibiotic is obtained as a completely colorless amorphous powder. It can be reprecipitated from methanol + ether.
The elemental analysis gives the following values:
C H N O 55.48Uc 7.38etc 8.52sec 28.62nu The antibiotic shows u. a, in the IR spectrum in potassium bromide bands at 3350, 2930, 2860, 1650, 1515, 1440, 1230,
1085 and 840 cm-l. Based on this spectrum, the presence of amide groups must be concluded.
The following maxima are present in the UV spectrum in ethanol: ismax = 284 nm (shoulder), E, cm = 15.2; iLmax = 278 nm, E, cz = 16.5; hmai = 227 nm (shoulder), egg ;;, = 191 ;; marx = 211 nm, EI 757.
The compound shows an optical rotation [a] D = -44.4 (c = 0.54 in methanol). In thin-layer chromatography on silica gel (silica gel prefabricated plates F 254 from
Merck) in the chloroform-methanol (3: 1, V: V) system, Rf =
0.25 with one pass, Rf = 0.4 with two passes. Detection with iodine; conc. Sulfuric acid and
Heat. To test for free NH2 groups, an attempt was made to produce an N-acetyl derivative. For this purpose were
100 mg of the compound obtained according to Example 6 are dissolved in 5 ml of a mixture of acetic anhydride-methanol (1: 4, V: V) and left to stand for 3 hours at room temperature. Thin layer chromatography and NMR spectrum showed. that the substance had remained unchanged. An N-2,4-dinitrophenyl derivative could also not be produced by reacting with 2,4-dinitrofluorobenzene.
Component B was acetylated to test for alcoholic and phenolic OH groups. 128 mg of component B were left to stand with 1 ml each of acetic anhydride and pyridine for 25 hours at room temperature. The reaction mixture was then evaporated in vacuo to give 173 mg of a yellowish oil. This oil was chromatographed on 15 g of silica gel with chloroform containing 5% methanol. 150 mg of colorless, amorphous acetate were obtained. The number of acetyl groups could not be determined; on the basis of the NMR spectrum (in COCls) one must assume that there are at least 5, but probably 6-7 acetyl groups.
The IR spectrum of the acetyl derivative in potassium bromide shows bands at 3360, 3060 (shoulder), 3000 (shoulder), 2950 (shoulder), 2930, 2850, 1750, 1680 (shoulder), 1640, 1525 (shoulder), 1505, 1430, 1370, 1225 1165, 1045, 1015, 910 and 840 cm-l. The UV spectrum in ethanol shows a maximum of 284 nm (Ei ;;, = 5.6) and 211 nm (Elltm = 220). The elemental analysis showed:
C H N Calculated: 57.06sec 6.929 6.99 / c Found: 58.44% 6.95 in 6.37cd Osmometrically, a molecular weight of 1403 was found.
The esterification of component B of the antibiotic with p-bromobenzoic acid gave a crystalline derivative. 150 mg of antibiotic 32204 were dissolved in 1 ml of pyridine, and 400 mg of p-bromobenzoyl chloride were added. After 2 hours at room temperature, the mixture was diluted with 40 ml of ether, the insolubles were filtered off and the mixture was evaporated. The crude product obtained was chromatographed on 30 g of silica gel with chloroform which contained 2% methanol. 184 mg of colorless, amorphous product could be obtained. For crystallization, it was dissolved in warm ethyl acetate and methanol was added dropwise while warm until the solution became cloudy. On slow cooling, very fine colorless crystals precipitated which melted at 161-165.
Elemental analysis gave: C = 51.53%, H = 4.41%, N = 4.16sec, Br = 22.79%. The IR spectrum in potassium bromide shows u. a. Bands at 3410 (shoulder), 3350, 3060, 3000 (shoulder), 2960 (shoulder), 2930, 2850, 1725, 1690 (shoulder), 1640, 1590, 1525 (shoulder), 1505, 1485, 1400, 1260, 1205 , 1170, 1110 (shoulder), 1100, 1070, 1010, 965, 845, 755 cm-l. According to the NMR spectrum in CDCl3, 100 MHz, there are 6-7 p-bromobenzoyl groups present. The molecular weight of the derivative was determined osmometrically to be 1926.
Component B of antibiotic 32204 was subjected to acid hydrolysis. Several ninhydrin positive products were obtained. 1.5 g of component B were heated to 110 with 30 ml of 6N hydrochloric acid in a sealed tube for 24 hours. It was then diluted to six times its volume with 150 ml and extracted three times with 250 ml of ether. The ether extracts were washed twice with 25 ml of water, dried over sodium sulfate and evaporated. The water-soluble part was evaporated in vacuo.
During work-up, the ether-soluble part gave a degradation product which was identified as linoleic acid, C17H31COOH, by esterification, spectrography, oxidative degradation and gas chromatography of the azelaic acid dimethyl ester obtained.
The water-soluble part contained several ninhydrin-positive products, some with a yellow, some with a purple color reaction. In the chromatography on cellulose in the n-butanol glacial acetic acid-water system (4: 1: 1), the degradation products I (520 mg), II (690 mg) and III (560 mg) with the Rf values for I = 0, 56 (yellow with ninhydrin) for II = 0.28 (violet with ninhydrin) and for III = 0.27 (yellow with ninhydrin) isolated. There are probably other hydrolysis products in hydrolyzate.
From the 520 mg of the hydrolysis product I, 238 mg of an oil could be isolated by Craig partitioning in the n-butanol-water system, which was acetylated 1: 1 with pyridine-acetic anhydride. A di-acetyl derivative with a melting point of 114-115 which could be crystallized from methylene chloride-petroleum ether was obtained. The gross formula C13H15NO4 results from the elemental analysis (C = 62.64, 62.49%; H = 6.02.6.04io N = 5.62, 5.56%).
Based on the spectra, the following structure is assumed: CH3 - CO - OC6H4CH4 - CO - CH2 - NHCO - CH3.
For the hydrolysis product I, the structure HO - GH4 - CH2 - CO - CH2NH2, 1-amino-3 - (p-hydroxyphenyl) acetone can be derived from this. This product is very likely a secondary decomposition product of a primary hydrolysis product, because there is no keto group in the antibiotic, cf. the IR spectrum given above.
From the 690 mg of hydrolysis product II, chromatography on Dowex 50W-X4 (sulfonated polystyrene, crosslinked with 4% divinylbenzene, from Dow Chem. Co.
Midland, Mich.) A compound crystallizing from water + ethanol of F. 265-2680 (decomp.) Can be obtained. Elemental analysis, optical rotation, and spectra revealed that the compound is L-threonine.
From the 560 mg of the hydrolysis product III could after
Chromatography on Dowex 50W-X4 with 1N hydrochloric acid from ethanol with the addition of a little pyridine, light brown crystals can be isolated. These were identified as L-4 hydroxyproline by paper chromatography, thin layer chromatography, optical rotation, NMR spectrum and color reaction with ninhydrin and isatin. Linoleic acid, 1-amino-3- (hydroxyphenyl) acetone, L-threonine and L-4-hydroxyproline are accordingly obtained as hydrolysis products of antibiotic 32204. If 2 moles of L-threonine were present, this would give a molecular weight of 742. Since the molecular weight of the derivatives has to be assumed to be around 1000 due to the osmometrically determined molecular weights, some of the degradation products have not yet been recorded.
Example 9
Component B of antibiotic A 32204 is hydrogenated as follows: To 100 mg of platinum oxide, which is dissolved in 15 ml of methanol in a
Hydrogenation apparatus were prehydrogenated, 1.9 g of the
Component B. In 20 hours at room temperature were
146 ml of hydrogen taken up. After filtration and evaporation of the filtrate, 1870 mg were colorless amorphous
Preserve substance. The elemental analysis gives: C = 59.15%,
H = 9.22%, N = 8.27%. In the UV spectrum in ethanol are
Maxima present at A = 284 nm (shoulder), Ei = 126; Ä = 278 nm, Elzm = 14.7;
A = 224 nm (shoulder), egg ;;, = 15.1; X = 214 nm, Elcm = 184.
PATENT CLAIM 1
Process for the preparation of the new antibiotic A.
32204, characterized in that the strain Asper gillus nidulans var. Echinulatus A 32204 or a mutant forming the anti biotic A 32204 in an aqueous, a
A nutrient solution containing carbon and nitrogen sources and inorganic salts is cultured aerobically until it has an essential antibiotic effect, and antibiotic A.
32204 insulated on this.
SUBCLAIMS
1. The method according to claim I, characterized in that the antibiotic is converted into esters by treatment with esterifying agents.
2. The method according to claim I, characterized in that the crude antibiotic is isolated from the culture medium by extraction.
3. The method according to claim I, characterized in that the mycelium is extracted with a water-miscible organic solvent or a mixture thereof with water.
4. The method according to claim 1 and dependent claim 2, characterized in that the crude product is purified by repeated solvent extraction, by partitioning between immiscible solvents and / or by chromatography.
5. The method according to claim I and dependent claim 4, characterized in that the antibiotic is purified by chromatography on silica gel, optionally in a mixture with activated carbon.
6. The method according to claim I and dependent claim 4, characterized in that the antibiotic is purified by chromatography on magnesium silicate, optionally in a mixture with activated carbon.
7. The method according to claim I and dependent claim 4, characterized in that the antibiotic is purified by chromatography on adsorption resins.
8. The method according to claim I and dependent claim 4, characterized in that the antibiotic is purified by chromatography on crosslinked dextrans.
9. The method according to claim I and dependent claim 4, characterized in that in the purification of the antibiotic by chromatography for elution, mixtures of chloroform or carbon tetrachloride with methanol are used.
10. The method according to claim I and dependent claim 4, characterized in that the antibiotic is broken down into components A and B and optionally further components by countercurrent distribution and / or chromatography.
11. The method according to claim 1 and dependent claim 4, characterized in that the antibiotic is separated into components A and B and optionally further components by chromatography on silica gel, optionally mixed with activated carbon.
12. The method according to claim I and one of the dependent claims 1-11, characterized in that Candida albicans is used to test for the presence of the antibiotic in the culture medium or in the individual isolation stages.
PATENT CLAIM II
Use of the compounds obtained according to claim 1 or dependent claim 1 for the preparation of hydrogenation products, characterized in that the antibiotic or its esters are treated with hydrogenating agents.
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