DE2659180C2 - Antibiotisches Derivat der Substanz SF-1540 und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Derivat der antlbiolischen Substanz SF-1540 mit den folgenden Eigenschaften: optische Drehung von IxY₁I' = + 21 .n Chloroform, einer Elementaranalyse von 66,69% Kohlenstoff, 8,62% Wasserstoff, 1,68% Stickstoff und 23,96% Sauerstoff, einem Ultraviolettabsorplionsspektrum gemäß Fig. 1, einem Infrarotabsorptionsspektruni gemäß Flg. 2 und einem kernmagnetischen Resonanzspektrum gemäß Fig. 3, einer gegenüber Kaliumpermanganat und Schwefelsäure positiven und gegenüber Ninhydrin negativen Farbreaktion, weniger löslich in Wasser und löslich In Methanol,

H Äthanol, Aceton, Chloroform und Äthylacetat.

; Das Derivat der antibiotlschen Substanz SF-1540 erhält

man aus der Substanz SF-1540 durch Behandlung mit

h Methanol.

F Erfindungsgemäß erfolgt die Herstellung des antibiotlschen Derivates der Substanz SF-1540 dadurch, daß man

ι Streptomyces hyroscopicus ATCC 31 257 unter aeroben

₍ Bedingungen bei 25 bis 35⁰C während 2 bis 5 Tagen

]'_t kultiviert, die wäßrige Lösung, die durch Entfernen des

Methanols aus einem wäßrigen Methanolextrakt des Myceliums gewonnen wurde, mit Äthylacetat extrahiert,

, den Extrakt unter verringertem Druck zu einer slrupösen

Substanz konzentriert, mit Cyclohexan das rohe SF-1540 ausfällt und dieses, so oder nach säulenchromatographlscher Reinigung, mit Methanol unter Bildung des Derivates der Substanz SF-1540 behandelt.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der vorstehend angeführte Stamm in einem Kulturmedium kultlviert, das solche Nährmittel enthält, die üblicherweise durch andere Mikroorganismen ausgenutzt werden können. Als Nährmittelquellen können die bekannten Materialien, die üblicherweise zur Kultivierung von Organlsmen, die der Gattung Streptomyces angehören, verwendet werden. Beispielsweise kann als Kohlenstoffquelle Glucose, Stärke, Glyzerin, Dextrin, Saccharose, Stärkesirup, Melassen, Sojabohnenöl, etc., angewandt werden. Als Stickstoffquelle kann Sojabohnenmehl, Malsquellwasser, Weizenkeime, Baumwollsamenmehl, Ammoniumsulfat oder Natriumnitrat angewandt werden. Darüber hinaus können anorganische Salze, wie Kaliumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, ein Phosphat etc., sowie organische und anorganische Materialien, die das Wachsturn dieses Stammes fördern und die Erzeugung der Substanz SF-1540 erhöhen können, sofern dies erforderlich ist, eingebracht werden.

Bei Durchführung der Kultivierung in der Praxis kann die flüssige Kultur In der gleichen Weise hergestellt werden, wie dies im allgemeinen be! der Herstellung von Antibiotika der Fall ist, wobei Insbesondere die Submerskultur am stärksten bevorzugt ist. Die Kultivierung kann üblicherweise unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden und es werden üblicherweise Kultlvierungstemperaturen von 25 bis 35° C angewandt, wobei jedoch in den meisten Fällen eine Temperatur von etwa 28° C angewandt werden kann. Die Maximalprcduktion der Substanz SF-1540 wird In zwei bis fünf Tagen sowohl bei Schütte!- als auch bei Tankkulturen erreicht.

JO Beispielswelse wird die Kulturbrühe von Streptomyces hygroscopicus ATCC 31 257 und die wäßrige Lösung, die durch Entfernung des Methanols aus einem wäßrigen Methanolextrakt des Myceliums gewonnen wird, mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, ζ. Β. Äthylacetat, extrahiert, wodurch die Substanz SF-1540 in die organische Lösungsmittelschicht übergeführt wird. Der Extrakt wird unter verringertem Druck unter Erhalt einer Sirupösen Substanz konzentriert, aus der die Rohsubstanz SF-1540 durch Zufügung von Cyciohexan ausgefällt wird. Die Rohausfällung, die die Substanz SF-1540 enthält, kann durch Säulenchromatografie, ζ. Β. Slllkagelsäulenchromaiografie unter Verwendung von Benzol-Aceton (20: 1) als Entwicklungsmittel oder Sephadex LH 20 unter Verwendung eine?

organischen Lösungsmittels, wie Methanol, Äthylacetat, etc., als Entwicklungsmittel gereinigt werden.

Die physikochemischen Eigenschaften der Substanz SF-1540, einem schwach gelben Pulver, das zunächst im Laufe des erfindungsgemäßen Verfahrens erzeugt wird, sind nachstehend angeführt:

1) Elementaranlyse:

Kohlenstoff 65,16% Wasserstoff 8,24%
Stickstoff 2,17% Sauerstoff 23,79%
2) Molekulargewicht (gemessen durch die Dampfdruckmethodik) 600

3) Schmelzpunkt 131 bis 133⁰C

4) Optische Rotation

[χ$ + 31,6° (C=I, Methanol)

5) Ultraviolettabsorptionsspektrum in methanolischer Lösung

Maximale Absorption 249 nm (EMMl* ⁶⁰⁵>
Schulter 280 nm (EMMu_n,

6. Löslichkeit In Lösungsmitteln:

Löslich in Methanol, Äthanol, n-Butanol, Äthylacetat, Benzol, Aceton, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und Äthyläther.
Unlöslich In Wasser und Cyclohexan

7) Stabilität

Die antibakterielle Aktivität nahm um annähernd 70% in 0,02 η HCl und 0,02 η NaOH ab. Etwas instabil gegenüber Säure und Alkali.

8) Rf-Werte bei Chromatografie Ein einziger Fleck mit einem Rf-Wert von 0,68 bei Kieselgel-Dünnschichtchromatografie bei Entwicklung mit Chloroform-Methanol (5 : 1), Rf-Wert von 0,35 bei der Chromatografie, entwickelt mit Benzol-Aceton (2:1), Rf-Wert von 0,31, entwickelt mit m Äthylacetat.

Die Substanz SF-1540 selbst weist eine relativ hohe Toxizität auf.

Diese wird durch Behandlung mit Methanol auf wenigstens '/>< > oder weniger verringert, wobei die antiblotische Aktivität der Mutterverbindung in unveränderter Welse beibehalten wird.

Hierzu kann die Substanz SF-1540 im reirsn Zustand oder als Rohmaterial, das die Substanz enthält, in Methanol oder einem methanolhaltigen Gemisch aufgelöst werden und die Lösung wird bei einer Temperatur von 5 bis 60° C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, während mehreren Stunden bis mehreren Tagen unter Erhall des Derivates der Substanz SF-1540 (nachstehend als »erfindungsgemäßes Derivat« bezeichnet) stehengelassen. Beispielsweise wird eine Lösung der Substanz SF-1540 in Methanol bei Raumtemperatur während 2 Tagen stehengelassen, wodurch sich eine im wesentlichen vollständige Reaktion unter quantitativer Erzeugung des erfindungs- m gemäßen Derivates ergibt. Darüber hinaus ist es möglich, als Ausgangsmaterial die Rohsubstanz SF-1540 in unterschiedlichem Reinheitsgrad einzusetzen, die während der Isolierungsslufe aus der Kulturbrühe erhältlich ist. Jedoch je niedriger die Reinheit des Ausgangsmaierials ist, um so langsamer gehl die Reaktion vonstatten. Wird als Rohsubstanz SF-1540 eine solche mit einer Reinheit von 80% eingesetzt, so kann die Reaktion etwa zu 80".. bei Behandlung mit Methanol bei Raumtemperatur während eines Tages erfolgen, geht jedoch nicht weiter, wes- -ό halb 20% des Ausgangsmaterials unumgesetzt verbleiben.

Das erfindungsgemäße Derivat, das durch Behandlung der Substanz SF-1540 mit Methanol erhältlich ist, kann, sofern erforderlich, welter gereinigt werden. Um das erfindungsgemäße Derivat von der unumgesetzten Substanz SF-1540 zu trennen, ist es insbesondere günstig, eine Sephadex LH-20-Säule anzuwenden und die Säule anschließend mit Methanol zu entwickeln.

Die physikochemischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Derivates sind nachstehend angeführt.

Das erfindungsgemäße Derivat stellt ein schwach gelbliches Pulver dar, welches bei 114 bis 116° C in seiner amorphen Form schmilzt. Die Verbindung ist relativ stabil unter Neutralbedingungen, unter sauren und alkalischen Bedingungen jedoch instabil.

Das Infrarotabsorptionsspektrum bei der KBr-Tablettenmethodik ist In F i g. 2 gezeigt.

Kernresonanzspektrum:

Das NMR-Spektrum in CDCl₃, 100 MHz, ist in Fig. 3 gezeigt.

Löslichkeit in Lösungsmitteln:

Löslich in Methanol, Äthanol, Butanol, Äthylacetat, Benzol, Aceton, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und Äthyläther und kaum löslich in Wasser.

Farbreaktion:

Positiv gegenüber Kaliumpermanganat und Schwefelsäure und negativ gegenüber Ninhydrin.

Die antibakteriellen Spektren des erfindungsgemäßen Derivates gegenüber verschiedenartigen Mikroorganismen sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt.

tabelle 1

Optische Rotation:
[*]#' +21° (C = K, CHCI₁)

Elementaranalyse:
C, 66,69: H 8,62: N 1,68, O 23,96 (%) bO

Molekulargewicht:
etwa 700 (gemessen durch Dampfdruckmethodik)

U V-Absorptionsspektrum:

Das Uliravioleuabsorptlonsspektrum in methanolischer Lösung (10 meg./ml) ist in Fig. 1 gezeigt. Die maximale Absorption in neutralem Methanol beträgt 249 nm (Eu_n, 585)

Infrarotabsorptlonsspeklium:

Versuchsorganismen	MIC (mcg/ml)	Medium
	erfindungs-
	gem. Derivat
Bacillus sublitis ATCC 6633	12,5	1
Staphylococcus aureus 209p	12,5	1
Escherichia coli	> 100	1
Mycobacterium smegmatis 607	25	2
Candida albicans	>100	3
Saccharomyces cerevisiae	100	3
Saccharomyces chevalieri	< 0,39	3
Saccharomyces sake	> 100	3
Alternaria kikuchiana	12,5	4
Botrytis cinerae	6,25	4
Pellicularia sasakii	3,1	4
Mucccr angulisporus	> 100	4
Leptosphaeri salvinii	0,1	4
Trichophyton asteroides	100	4
Piricularia orizae	0,1	4
Colletotrichum lagenarium	0,1	4
Fusarium oxysporum	> 100	4

Anmerkung

1: Boullion-Medium

2: Glyzerin-Boullion-Medium

3: Sabouraud's-Medium

4: KarlolTel-Glucose-Agar-Medium

Wie sich aus den vorstehenden Ergebnissen zeigt, besitzt das erfindungsgemäße Derivat Eigenschaften dahingehend, daß es eine geringe antibakterielle Wirkung gegenüber Gram-negativen Bakterien aufweist, jedoch Aktivitäten gegenüber Gram-positiven Bakterien, Hefen und Schimmelpilzen zeigt.

Bei inlraperltonealer Verabreichung des erfindungsgemäßen Derivates an Mäusen überlebten alle Tiere bei 25 mg/kg und 50 mg/kg, während bei Verabreichung der Mutijrsubstanz SF-1540 alle Tiere bei 5 mg/kg starben und bei 2 mg/kg überlebten.

Beispiel 1

Die Sporen von Streptomyces hygroscoplcus ATCC 31 257 wurden In 1 Liter Flüssiekeltsmedlum. welches

1% Stärke, 3'V Sojabohnenmehl (pll 7) (unter Verwendung von IO Sakaguchi-Kolben) enthielt, inokuliert. Die Schüttelkultur wurde bei 28⁰C wahrend 40 Stunden unter Erhalt einer Impfkultur durchgeführt. 35 1 des flüssigen Mediums, welches 2,5% Glukose, 2% Weizenkeim, 0,5% lösliches Pflanzenproteln, 0,25% Natriumchlorid (pH 7.0) enthielt, wurden mit der Impfkultur beimpft. Die Kultivierung wurde bei 28° C wahrend 76 Stunden unter belüfteter Rührung (unter Verwendung von zwei 50-Liier-Gefäßlermentatoren) fortgesetzt.

Die Kulturbrühe wurde auf pll 3 bis 4 mit 6n Chlorwassersloflsäure eingestellt, wonach die Substanz SF-1540 in die Myceliumfraklionen übergeführt wurde. Zu der Brühe wurde eine Kilterhllfc hinzugegeben und die Mycelia wurden durch Filtration gesammelt und anschließend mit 9! Methanol extrahiert. Die Mycelia wurden unter Erhalt von 11 I wäßriger Methanollösung abl'illrlcrt.

Die wäßrige Methanollösung, die hierdurch erhalten wurde, wurde unter verringertem Druck auf 2,5 I wäßrige Lösung konzentriert. Die Lösung wurde drei Mal mit Athylacetai (2,5 I) extrahiert, wodurch die Substanz SF-1540 in die Äthylacetatphasc übergeführt wurde, welche sodann mit wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert und unter verringertem Druck unter Erhall von 30 g gelblich-braunem Pulver konzentriert wurde.

Das gelblich-braune Pulver, das die Substanz SF-1540 enthielt, wurde mit Cyclohexan unter Erhalt von 9,3 g eines braunen Pulvers extrahiert, das die rohe Substanz SF-1540 in Cvclohcxanunlöslichen Teilen enthielt. Das hierdurch erhaltene braune Pulver wurde in einer kleinen Menge Aceton aufgelöst und die resultierende Lösung wurde über eine Sillkagel-(800 ml)-Säule, die mit Benzol gefüllt war, unter Verwendung von Benzol-Aceton (20:1) als Entwicklungsmittel chromatografie«. Die Fraktionen Nr. 387 bis 470, die eine Aktivität gegenüber Plrlcularia oryzae besaßen, wurden gesammelt, wobei jede Fraktion 15 g ausmachte. Die gesammelten Fraktionen wurden unter verringertem Druck unter Erhalt von 728 mg der Substanz SF-1540 einer Reinheit von 80% als schwach gelbe Pulver konzentriert.

500 mg der Rohsubstanz SF-1540 (mit einer Reinheit von 80%) wurden In 10 ml Methanol aufgelöst und die Lösung wurde bei Raumtemperatur während 24 Stunden stehengelassen. Das Gemisch wurde konzentriert, in eine Sephadex LII-20-(300 ml)-Säule gefüllt und mit Methanol eluiert. Die ausP.ießenden Stoffe wurden in einem jeweils 10 g Anteil gesammelt, wobei die Fraktionen Nr. 20 bis 30 gewonnen und zur Trockene konzentriert wurden, wobei sich 184 mg des erfindungsgemäßen Derivates ergaben. Schmelzpunkt 114 bis 116^C C.

Beispiel 2

500 mg der Substanz SF-1540, die durch Säulenchromatographie auf eine Reinheit von 99% gebracht worden war. wurden in 10 ml Methanol aufgelöst und die Lösung wurde bei Raumtemperatur während 2 Tagen stehengelassen. Das Gemisch wurde zur Trockene eingedampft und nach Zufügung von 20 ml frischem Methanol erneut zur Trockene unter Erhalt von 490 mg eines Pulvers konzentriert, das im wesentlichen allein aus dem erfindungsgemäßen Derivat zusammengesetzt war.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Derivat der antlblotischen Substanz SF-1540 mit den folgenden Eigenschaften: optische Drehung von [α)ο' = + 2Γ In Chloroform, einer Elementaranalyse von 66,69% Kohlenstoff 8,62% Wasserstoff, 1,68% Stickstoff und 23,96% Sauerstoff, einem Ultraviolettabsorptionsspektrum gemäß Flg. 1, einem Infrarotabsorptionsspektrum gemäß Fig. 2 und einem kernmagnetischen Resonanzspektrum gemäß F i g. 3, einer gegenüber Kaliumpermanganat und Schwefelsäure positiven und gegenüber Ninhydrin negativen Farbreaktion, weniger löslich in Wasser und löslich In Methanol, Äthanol, Aceton, Chloroform und Äthylacetat, wobei die Fig.!, 2 und 3 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

2. Verfahren zur Herstellung des Derivats der antiblotischen Substanz SF-1540 des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces hygroscoplcus ATCC 31 257 unter aeroben Bedingungen bei 25 bis 35" C wahrend 2 bis 5 Tagen kultiviert, die wäßrige Lösung, die durch Entfernen des Methanols aus einem wäßrigen Methanolextrakt des Myceliums gewonnen wurde, mit Äthylacetal extrahiert, den Extrakt unter verringertem Druck zu einer Sirupösen Substanz konzentriert, mit Cyclohexan das rohe SF-1540 ausfällt und dieses, so oder nach säulenchromatographlscher Reinigung, mit Methanol unter Bildung des Derivates der Substanz SF-1540 behandelt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung mit Methanol bei einer Temperatur von 5 bis 60⁰C während mehreren Stunden bis Tagen durchführt.