DE2818544A1

DE2818544A1 - Antibiotikum sf-1942, verfahren zu dessen herstellung und pharmazeutische zusammensetzung, die das antibiotikum sf-1942 enthaelt

Info

Publication number: DE2818544A1
Application number: DE19782818544
Authority: DE
Inventors: Takashi Hisamatsu; Shigeharu Inouye; Michio Kojima; Yasuaki Ogawa; Kazunori Ohba; Takashi Shomura; Takashi Tsuruoka; Shingo Uchida; Hiroshi Watanabe
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1977-05-02
Filing date: 1978-04-27
Publication date: 1978-11-09
Also published as: FR2389638A1; GB1554628A; US4202886A; FR2389638B1; JPS6015318B2; JPS53135901A

Description

HOFPMANN · EITLE & PARTNER

PATENTANWÄLTE £ Q I 0 5 4

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) · DIPL.-ING. W.EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN

DIPL.-ING. K. FÖCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERNHAUS) · D-8000 MD N CH EN Gl · TELEFON (089) 911087 . TELEX 05-29019 (FATHE)

30 580 o/wa

MEIJI SEIKA KAISHA LTD., TOKYO/JAPAN

Antibiotikum SF-1942, Verfahren zu dessen Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzung, die das Antibiotikum SF-1942 enthält

Es ist bekannt, dass zahlreiche Mikrobenarten des genus Streptomyces in der Lage sind, beim Kultivieren in einem Nährmedium, welches assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, Antibiotika zu bilden.

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum, das als SF-1942 bezeichnet wird, und ein Verfahren zur Herstellung dieses Antibiotikums aus einem Stamm des genus Streptomyces.

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άοt obhA

Es wurde gefunden, dass ein Stamm vom genus Streptomyces zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, das als SF-1942 bezeichnet wird, in der Lage ist, und dass man die erhaltene SF-1942-Substanz aus der Fermentationsbrühe isolieren kann.

Die SF-1942-Substanz gemäss der vorliegenden Erfindung und deren physikalischen und chemischen Eigenschaften sind bisher nicht in der Literatur beschrieben worden, so dass es sich um eine neue Substanz handelt.

Gemäss einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums SF-1942 gezeigt, indem man einen SF-1942 produzierenden Stamm in einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert, bis eine wesentliche Menge des Antibiotikums SF-1942 sich in dem Nährmedium angesammelt hat, worauf man die so erhaltene SF-1942-Substanz aus der erhaltenen Fermentationsbrühe isoliert. Die Erfindung betrifft auch Anticancer- und Antitumormittel, welche das Antibiotikum SF-1942 enthalten.

Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Antibiotikum SF-1942 zur Verfügung gestellt, das die physikalischen und chemischen Eigenschaften, wie sie nachfolgend beschrieben werden, aufweist.

Fig. 1 stellt ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum der SF-1942-Substanz dar und wurde in 1 %-iger Konzentration der SF-1942-Substanz in Methanol bestimmt, und

Fig. 2 zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum der SF-1942-Substanz, bestimmt auf einer KBr-Tablette.

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Ein Beispiel für den SF-1942-substanzbildenden Stamm, der gemäss der Erfindung verwendet wird, ist ein SF-1942-Stamm, der aus einer Bodenprobe isoliert wurde, die in Onomichi-Shi, Hiroshima, Japan, isoliert wurde.

Der SF-1942-Stamm hat die folgenden Eigenschaften:

(I) Morphologische Eigenschaften An der Oberfläche wachsendes Mycel, das auf Stärkeagar, Tyrosinagar und anderen Medien mit guter Sporenbildung wächst. Die Verzweigung des Oberflächenmycels ist einfach und eine radförmige Verzweigung wird nicht festgestellt. Das oberflächliche Mycel ist verhältnismässig kurz und linear, aber manchmal werden Windungen an den Enden festgestellt. Ein spirales Mycel wird nicht gefunden.

Mikroskopische Untersuchungen zeigen, dass die Sporen eine glatte Oberfläche, eine zylindrische Form und eine Grosse von 0,5 bis 0,7 χ 1,0 bis 1,2 um aufweisen und dass sie im allgemeinen eine Kette von mehr als etwa 10 Sporen bilden.

(II) Kultivierungseigenschaften

Die Kultivierungseigenschaften des SF-1942-Stammes wurden auf verschiedenen Medien, wie in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt, bei 28 C beobachtet. Die in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigte Farbe wird nach dem Farbstandard des Color Harmony Manual,von der Container Corporation of America herausgegeben, identifiziert.

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	Tabelle	mittleres Wachstum, schwach braun gelb	1	Lösliches Pigment
		mittleres Wachstum, schwach grau gelb		schwach rosa
Kulturmedium	Wachstum und Umkehrfarbe	einwandfreies Wachstum, rötliches grau braun	Oberflächen- mycel	nicht gebildet
Sucrose-Nitrat-mittleres Agar Wachstum, schwach rosa· gelb-braun	einwandfreies Wachstum, schwach braun	keines	nicht gebildet
Glukose-Aspa- ragin-Agar	schwaches bis mittleres Wachstum, gerunzelt, hellgelb	grau {e. -d/	nicht gebildet oder schwach grau rosa
Glyzerin- Asparagin- Agar	einwandfreies Wachstum, braun	grau ^e/	rötliches grau braun
Stärke-Agar	schwaches Wachstum, gerunzelt, farblos bis hellgelb	übermässig,_ grau ^e-3ig/	nicht gebildet
Hafermehl- Ag ar	grau /e-2ih7	nicht gebildet
Hefemalz- Agar	keines	nicht gebildet
Tyrosin- Agar	übermässig, grau ^e/
Närmittel- Agar	keines

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(III) Physiologische Eigenschaften

(1) Wächst auf Stärkeagarmedium bei einem Temperaturbereich von 20 bis 37°C

(2) Verflüssigung von Gelatine: ' positiv(bei 20°C)

(3) Hydrolyse von Stärke: positiv(bei'28°C)

(4) Peptonisierung von Magermilch: positiv(bei 28°C) Koagulierung von Magermilch: negativ(bei 28°C)

(5) Bildung von melaminahnliehen Pigmenten: negativ

(IV) Verwendung von Zuckern (Pridham & Gottlieb Agar Medium bei 28°C)

(1) Brauchbar: D-Glucose, D- Fructose,

D-Xylose, D-Mannitol, D-Inositol, L-Arabinose, Sucrose, Raffinose

(2) Unbrauchbar: Rhamnose

Fasst man diese Eigenschaften zusammen, so gehört der erfindungsgemäss verwendete SF-1942-Stamm zum genus Streptomyces und das Oberflächenmycel ist hauptsächlich linear und die Oberflächenstruktur der Sporen ist glatt. Bei der Kultivierung hat das Oberflächenmycel eine graue Farbe und die Umkehrfarbe ist im allgemeinen gelblich braun bis grau-braun, aber manchmal rosa, je nach der Art des Mediums. Es wird kein melaminähnliches Pigment gebildet, sondern auf Sucrose-Nitratagarr Hafermehlagar-und Stärkeagarmedium werden lösliche Pigmente mit einer hellgelben bis grau-rosa Farbe gebildet.

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Der SF-1942-Stamm wurde als "Streptomyces sp. SF-1942" bezeichnet und eine Probe dieser Kultur wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology/ Ministry of International Trade and Industry of Japan, unter der Nummer FERM-P Nr. 3939 hinterlegt und beim American Type Culture Collection (ATCC) unter der Nr. ATCC 31368.

Als Ergebnis von Vergleichsuntersuchungen hinsichtlich der vorher erwähnten mikrobiellen Eigenschaften im Vergleich zu solchen, die im Internationalen Streptomyces Project (ISP) ^International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 18, Seiten 69-189, ibid. Bd. 18, Seiten 279-392 (1968), ibid. Bd. 19, Seiten 391-512 (1969) und ibid. Bd. 22, Seiten 265-394 (1972}_7und hinsichtlich der Veröffentlichungen von Waksman (S.A. Waksman, The Actinomycetes, Bd. 2 (1961))und von Hütter (R. Hütter, Systematik der Streptomyceten, (1967)) wurde festgestellt, dass der vorerwähnte SF-1942-Stamm als eng verwandt zum Streptomyces griseoluteus angesehen werden kann. Ein Direktvergleich der Kultureigenschaften durch Nebeneinanderkultivieren von SF-1942-Stamm und Streptomyces griseoluteus ISP 5392 Stamm, einem typischen Stamm von £5. griseoluteus, wurde, durchgeführt und die erzielten Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 2 gezeigt.

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Tabelle 2

SF-1942-Stamm

Streptomyces griseoluteus ISP 5392

Morphologie:

Ende des Oberflä- Linear chenmycels,

Sporenoberfläche Kultureigenschaften:

Glyzerin-Asparagin-Agar

Stärke-Agar

He f ema1ζ-Agar

Tyrosin-Agar

Glatt

Massiges Wachstum. Umkehrfarbe ist schwach gelbliches grau. Oberflächenmycel ist grau ^e/. Keine Sporenbildung.

Einwandfreies Wachstum. Umkehrfarbe ist rosa graubraun. Oberflächenmycel stark entwiekelt und grau /_e-3±g/.Keine Sporenbildung oder schwach grau rosa.

dürftiges bis massiges Wachstum. Umkehrfarbe ist hellgelb. Kein Oberflächenmyvel. Keine Sporenbildung.

Einwandfreies Wachstum. Umkehrfarbe ist braun. Oberflächenmycel ist stark entwik- und grau /e/. Keine Sporenbildung.

Hauptsächlich linear, aber einige Mycele sind hakenförmig

Glatt

Massiges Wachstum. Umkehrfarbe ist schwach gräuliches gelb. Oberflächenmycel ist weiss bis grau-weiss. Keine Sporenbildung.

Einwandfreies Wachstum. Umkehrfarbe ist rosa gelb-braun. Oberflächenmycel stark entwickelt und grau ^e-3ig/. Keine Sporenbildung oder schwach rötlich graugelb.

Massiges Wachstum. Umkehrfarbe ist graugelb. Oberflächenmycel ist grau /3ig/. Keine Sporenbildung.

Einwandfreies Wachs-Umkehrfarbe ist braun. Oberflächenmycel ist stark entwickelt und grau /e/. Keine Sporenbildung.

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Tabelle 2 (Fortsetzung)

SF-1942-Stamm Streptomyces griseo-

luteus ISP 5392

Bildung von melamin-

artigen Pigmenten Negativ Negativ

Verwendung von Kohlenstoff quellen

D-Fructose + +

D-Xylose + +

D-Mannitöl + +

D-Inositol + -

L-Arabinose + +

Rhamnose - -

Sucrose . +

Raffinose + -

Antibiotikum-Bildung SF-1942-Substanz Griseolutein *

Griseolutein ist eine gelb bis orangegelbe Substanz, die - sich hinsichtlich der physikalischen und chemischen Eigenschaften deutlich von der SF-1942-Substanz unterscheidet.

Aus dem Vergleich in der obigen Tabelle 2 wird deutlich, dass der SF-1942-Stamm vergleichbar ist mit Streptomyces griseoluteus, obwohl diese Stämme hinsichtlich der Kultureigenschaften und der Verwendung von einigen Kohlenstoffquellen geringe Unterschiede zeigen.

In ähnlicher Weise wie andere Stämme vom genus Streptomyces zeigt der in der vorliegenden Erfindung verwendete SF-1942-Stamm

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gewisse Unterschiede in seinen Eigenschaften. Die Unterschiede können künstlich verursacht werden durch Bestrahlung mit beispielsweise UV-Licht., Röntgenstrahlen, Hochfrequenzwellen oder radioaktiven Strahlen oder durch Chemikalien. Beim erfindungsgemässen Verfahren können alle Varianten und Mutanten verwendet werden, solange solche Varianten und Mutanten vom genus Streptomyces die Fähigkeit haben, die SF-1942-Substanz zu bilden.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren können die oben erwähnten Stämme in einem Medium kultiviert werden, welches Nährstoffe enthält, die durch bekannte Mikroorganismen assimiliert werden. Die Nährstoffquellen können bekannte Materialien, wie Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Mineralien und dergleichen sein, wie sie üblicherweise zur Kultivierung von Stämmen vom genus Streptomyces verwendet werden. Beispiele für Kohlenstoff quellen, die man hier verwenden kann, sind Glukose, Sucrose, Stärke, Glyzerin, Hirsegallerte, Melasse, Sojabohnenöl und dergleichen. Beispiele für Stickstoffquellen, die verwendet werden können, sind Sojabohnenpulver, Weizenkeime, Fleischextrakt, Pepton, Trockenhefe, Maismaische, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat und dergleichen. Zusätzlich können anorganische Salze, wie Kaliumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphate und dergleichen, und auch solche organischen und anorganischen Materialien, welche das mikrobielle Wachstum und die Bildung der gewünschten SF-1942-Substanz fördern, gegebenenfalls mit Vorteil dem Kulturmedium zugegeben werden.

Für die Kultivierung sind, wie bei der üblichen Herstellung von Antibiotika, Flüssigkulturen, insbesondere untergetauchte Kulturen, besonders geeignet. Die Kultivierung kann unter

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Belüftungsbedingungen bei einer Optimaltemperatur von etwa bis etwa 32°C, vorzugsweise etwa 28°C, durchgeführt werden. Die Bildung der SF-1942-Substanz erreicht ein Maximum in etwa 2 bis etwa 6 Tagen und zwar sowohl in einer Schüttelkultur wie bei einer Tankkulture.

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene SF-1942-Substanz ist eine neutrale antibiotische Substanz, welche keinen Stickstoff enthält. Beim Isolieren der SF-1942-Substanz aus der Fermentationsbrühe muss man die chemischen und physikalischen Eigenschaften der SF-1942-Substanz,die nachfolgend detailliert beschrieben werden, beachten. Die Isolierung der SF-1942-Substanz kann unter Anwendung üblicher Isolierungsund Reinigungsmethoden erfolgen, beispielsweise durch Filtrieren der Fermentationsbrühe, Extraktion des Filtrates, Reinigung durch Säulenchromatografie unter Verwendung von Ionenaustauschharzen, wie Amberlite XAD-2 (Handelsname der Rohm & Haas Co., USA), Diaion HP-20 (Handelsname, hergestellt von Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Japan) und dergleichen, Adsorbentien, wie Aktivkohle, Aluminiumoxid und dergleichen, Gelfilterhilfen, wie Sephadex G-10 and Sephadex LH-20 (Handelsname, hergestellt von der Pharmacia Co., Schweden), Ausfällen mittels Hexan, Lösungsmittelextraktion unter Verwendung von Äthylacetat, Kieselgelchromatografie und dergleichen.

Eine typische Ausführungsform, die man vorteilhaft bei der Isolierung und Reinigung der SF-1942-Substanz anwenden kann, wird nachfolgend ausführlich beschrieben.

Der pH der Fermentationsbrühe wird zunächst auf einen pH von 2,0 mittels Chlorwasserstoffsäure eingestellt und die mikrobiellen

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Zellen und alles feste Material, das in der Brühe enthalten ist, werden durch Filtrieren entfernt unter Anwendung von Filterhilfen, wie Diatomeenerde. Der aktive Bestandteil im FiI-trat wird dann mit einem Lösungsmittel, wie Äthylacetat, extrahiert und das Extrakt wird unter vermindertem Druck konzentriert bis zur Trockene, unter Entfernung von Äthylacetat. Zu dem Rückstand wird Diäthyläther zugegeben und alles unlösliche Material wird entfernt. Dann gibt man η-Hexan zu der ätherischen Lösung in einer Volumenmenge, die etwa 15 mal dem Volumen der ätherischen Lösung entspricht, und die Mischung wird eisgekühlt, wobei die aktive Substanz ausfällt. Die ausgefällte aktive Substanz wird in einer geringen Menge Äthylacetat gelöst und die erhaltene Lösung wird auf eine Säule gegeben, die mit Aktivkohle gepackt ist und dann wird Äthylacetat auf die Säule gegeben. Die Säule wird mit Äthylacetat eluiert, wobei man aktive Fraktionen, welche die SF-1942-Substanz enthalten, erhält. Die aktiven Fraktionen werden dann gereinigt unter Anwendung einer geeigneten Kombination von säulenchromatografischen Reinigungsverfahren unter Anwendung von Kieselgel (eluiert mit einer Mischung aus Chloroform-Methanol, 50:1 Vol/Vol und dann einer Mischung aus Benzol-Aceton, 15:1 Vol/Vol), Sephadex LH-20, Sephadex G-10 und dergleichen, wobei man die SF-1942-Substanz in hoher Reinheit erhält.

Die biologische Bewertung der SF-1942-Substanz kann in der nachfolgend angegebenen Weise durchgeführt werden.

Das Untersuchungsmedium (pH 7.0) setzte sich aus 0,5 % PoIypepton, 0,3 % Fleischextrakt und 1,5 % Agar zusammen. Bacillus subtilis PCI-219-Stamm wurde als Versuchsorganismus verwendet. Das erzielte Ergebnis zeigt an, dass in einem Konzentrationsbereich von 12 mcg/ml bis 3 mcg/ml der SF-1942-Substanz

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eine lineare Beziehung besteht zwischen dem Logarithmus der Konzentration und dem Durchmesser der Inhibierungszone, die einen Durchmesser von 22,8 bis 12,4 mm (Papierscheibenverfahren) hat. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der SF-1942-Substanz werden nachfolgend angegeben:

(1) Aussehen:

Weisses amorphes Pulver.

(2) Zersetzungspunkt:

unbestimmt, aber das Volumen der Probe bedingt sich zu zersetzen bei etwa 122°C und wird bei etwa 134°C braun und dann zersetzt sich die Probe allmählich.

(3) Elementaranalyse:

C: 65,57.%; H; 7,80 %; 0:26,38 %;

ν: ο %.

(4) UV-Absorptionsspektrum:

Das in Methanol gemessene Spektrum wird in Fig. 1 gezeigt; man findet kein charakteristisches Absorptionsmaximum innerhalb der Wellenlängen von 350 bis 210 mm.

(5) IR-AbsorptionsSpektrum:

Das Absorptionsspektrum, das unter Verwendung der KBr-Tablettenmethode bestimmt wurde, wird in Fig. 2 gezeigt, wobei Absorptionsbanden bei 3400, 2960, 1780, 1710, 1630, 1450, 1390, 1020, 780 cm"¹ gefunden werden.

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(6) Molekulargewi cht:

(7) Optische Drehung

(8) Löslichkeit:

350 bis 400,nach der Dampfdruckmethode.bestimmt.

-21,8, 1 %-ige methanolische Lösung.

Löslich in Äthylacetat, niedrigen Alkoholen.(C -C-), Benzol, Diäthyläther, Aceton und Chloroform und unlöslich in Wasser und Hexan.

(9) Farbreaktion:

Positive Farbreaktion mit Lemieux, Schwefelsäure und 2,4-Di'nitrophenylhydrazin und negative Farbreaktion mit Ninhydrin und Greig-Rayback-Reagenz.

(10) Stabilität:

Stabilität im sauren pH-Bereich, verhältnismässig unstabil im neutralen pH-Bereich und sehr unstabil im alkalischen pH-Bereich.

(11) Rf-Werte bei der Dünnschichtchromatografie über Kieselgel: (Färbung mit Lemieux);

Elutions-Lösungsmittel-System Rf-Wert

Benzol-Methanol (5:1 v/v) Chloroform-Methanol (10:1 v/v) Benzol-Aceton (2:1 v/v) 0,52 0,46 0,41

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(12) Hochspannungselektrophorese unter Verwendung von Filterpapier (3000 V, 15 min., Pyridin-Acetat-Puffer, pH 6,4):

Alanin (Vergleichsverbindung) wanderte 2,1 cm zur Anode und die SF-1942-Substanz wanderte 1,4 cm zur Anode. Daher ist die SF-1942-Substanz elektrisch neutral.

Die antibiotische Aktivität der SF-1942-Substanz gegenüber verschiedenen Organismen wird in Tabelle 3 nachfolgend gezeigt:

Tabelle 3

ANTIMIKROBISCHES SPEKTRUM VON SF-1942-SUBSTANZ

Test Organismus . M.I.C. (mcg/ml)*

Bacillus subtilis PCI-219 0,1

Staphylococcus aureus 2O9P 0,2

Sarcina lutea 0,05

Escherichia coli 6,25

Escherichia coli K-12-R . 6,25

Pseudomonas aeruginosa 6,25

Klebsiella pneumoniae 12,5 Vibrio percolens 0,78

Salmonella typhi 1,56

Proteus vulgaris 1,56

Mycobacterium smegmatis 607 (Km-R) 12,5

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* Die minimale Inhibierungskonzentration (M.I.C.) wurde mittels eines Herzinfusions-Agarmediums bestimmt.

Aus dem Ergebnis der Tabelle 3 wird ersichtlich, dass die SF-1942-Substanz breite und wirksame antimikrobielle Aktivitäten gegenüber grampositive und gramnegative Bakterien entwickelt.

Die akute Toxizität der SF-1942-Substanz wurde bei Mäusen bestimmt (5 Mäuse pro Gruppe) und als Ergebnis einer 7-tägigen
Beobachtung nach intraperitonealer Verabreichung der SF-1942-Substanz in einer Dosis von 3 mg/kg starben 2 Mäuse.

Die Antitumoraktivität der SF-1942-Substanz wurde unter Verwendung von Sarcoma 180 bestimmt. Sarcoma 180 Tumorzellen
(11,4 χ 10 /0,06 ml) wurden intraperitoneal in Mäuse transplantiert (ICR-Stämme, etwa 8 Wochen alt, 5 Mäuse pro Gruppe)
und 24 Stunden nach der Transplantation wurde die SF-1942-Substanz intraperitoneal jeder Maus an drei aufeinanderfolgenden Tagen in einer Dosis von 4 mg/kg, 2 mg/kg, 1 mg/kg oder
0,5 mg/kg verabreicht. Daraufhin wurde die durchschnittliche
Überlebenszeit (Tage), die durchschnittliche Verlängerung des Lebens und die Menge der abdominalen Ödeme bestimmt und die
Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 4 gezeigt.

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Tabelle 4

ANTITUMORAKTIVITÄT DER SF-1942-SUBSTANZ GEGEN SARCOMA 180

Dosis (mg/kg)	Durchschnitt liche Überle benszeit (Tage)	Lebensver längerung	Menge der abdominalen Ödeme (ml)	überlebens- zahl (nach 60 Tagen)
4	26,4	8,2	0	0/5
2	53,0	>117,2	4,6	4/5
1	48,8	:>100,0	10,8	3/5
0,5	45,0	> 84,4	1,0	3/5
O	24,4	—	20,8	0/5

Wie aus den Ergebnissen der obigen Tabelle 4 hervorgeht, weist die SF-1942-Substanz gemäss der Erfindung eine Antitumoraktivität gegen Sarcoma 180 bei verhältnismässig niedrigen Konzentrationen (4 bis 0,5 mg/kg) auf und die obigen Ergebnisse zeigen an, dass die SF-1942-Substanz ein wirksames Anticancer-Mittel ist bei entweder intramuskulärer oder subkutaner Verabreichung.

Im nachfolgenden Beispiel wird die Erfindung weiter erläutert, aber das Beispiel soll nicht limitierend für die Erfindung ausgelegt werden. Wenn nicht anders angegeben, sind alle Teile, Prozente, Verhältnisse und dergleichen, auf das Gewicht bezogen.

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Beispiel

(1) Kultivierung des SF-I942-Stammes

Die Kultivierung wurde unter Verwendung von Streptomyces sp. SF-1942-Stamm (FERM-P 3939) als Saatkultur in einem Saatmedium aus 2,0 % löslicher Stärke, 1,0 % Polypepton, 0,3 % Rinderextrakt und 0,05 % K₃HPO₄ (pH vor der Sterilisierung: 7,0) durchgeführt.

Jedes von 5 Saatmedien (100 ml) der oben genannten Zusammensetzung in einem 500 ml Sakaguchi-Kolben wurde mit einer Platinspitze-Menge der oben genannten Saatkultur inokuliert und die Kultivierung erfolgte bei einer Temperatur von 28⁰C während 48 Stunden. Dann wurden 20 1 eines Saatmediums der gleichen Zusammensetzung wie oben in einem 30 1 Glasfermentator mit der entstandenen Saatkultur (500 ml) inokuliert und die Kultivierung wurde bei einer Temperatur von 28⁰C während 24 Stunden unter Belüftung und Rühren durchgeführt.

200 1 eines Mediums aus einem Grossansatz aus 2,5 % Glukose, 2,5 % Fermamedia (Handelsname, hergestellt von der Traders Oil Mill Co.)/ 0,25 % Natriumchlorid (pH vor der Sterilisierung 7,0) in einem 300 1 Fermentator wurden dann mit der entstandenen Saatkultur (20 1) inokuliert und die Kultivierung wurde bei 28⁰C während 4 8 Stunden unter Belüftung und Rühren durchgeführt.

Nach Beendigung der Kultivierung wurde der pH der Fermentationsbrühe auf 2,0 mit 6 η Chlorwasserstoffsäure eingestellt und die Fermentationsbrühe wurde unter Verwendung von Diatomeenerde

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als Filterhiife filtriert, wobei man etwa 170 1 eines Filtrats erhielt.

(2) 100 1 Äthylacetat wurden zu 170 1 des nach dem vorher beschriebenen Verfahren erhaltenen Filtrats zugegeben und die Mischung wurde etwa 2 Stunden zum Extrahieren der aktiven Substanz in die Äthylacetatschicht gerührt. Die abgetrennte Äthylacetatschicht wurde auf ein Volumen von 2 1 unter vermindertem Druck konzentriert, mit Wasser (pH 2,0) gewaschen und dann konzentriert, bis man etwa 65 g eines Sirups erhielt.

Zu dem erhaltenen Sirup wurden 500 ml Diäthyläther gegeben und alles unlösliche Material wurde unter Verwendung eines Glasfilters entfernt, worauf man anschliessend das Filtrat auf ein Volumen von etwa 100 ml konzentrierte. Zu dem Konzentrat wurden 1,5 1 η-Hexan gegeben und die Mischung wurde mit Eis gekühlt, wobei ein Produkt ausfiel (32 g, Reinheit 2 bis 3 %)

Das erhaltene Produkt wurde dann auf eine Säule, die mit Aktivkohle gefüllt war, mit Äthylacetat mitgegeben und die Säule wurde mit Äthylacetat eluiert, wobei die aktive Substanz eluiert wurde in einer Fraktion, die bei etwa dem 1,5-bis 6-fachen Volumen der Aktivkohle (500 ecm) lag. Die aktive Fraktion wurde unter vermindertem Druck konzentriert und das Konzentrat wurde auf eine mit 800 ml Kieselgel gepackte Säule gegeben. Die Säule wurde mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol (50:1 v/v) eluiert, wobei man aktive Fraktionen 60 bis 158 (18 ml in jeder Fraktion) erhielt.

Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegeben und unter vermindertem Druck konzentriert, und das erhaltene Konzentrat

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wurde auf eine mit 600 ml Kieselgel gepackte Säule gegeben. Die Säule wurde dann mit einer Mischung aus Benzol und Aceton (15:1 v/v) eluiert, wobei man aktive Fraktionen 30 bis 145 (18 ml in jeder Fraktion) erhielt. Die vereinten aktiven Fraktionen wurden unter vermindertem Druck konzentriert, wobei man 9,4 g eines braunen Sirups erhielt, der die SF-1942-Substanz enthielt (Reinheit etwa 7 bis 8 %).

(3) 4g der vorstehend erhaltenen rohen SF-1942-Substanz wurden in 4 ml Methanol gelöst und die Lösung wurde auf eine Säule gegeben, die mit 800 ml Sephadex LH-20 gepackt war. Die Säule wurde dann mit einer 20 %-igen wässrigen Methanollösung eluiert, wobei man die aktiven Fraktionen 74 bis 192 (10 g in jeder Fraktion) erhielt.

Die vereinten Fraktionen wurden dann unter vermindertem Druck zur Entfernung des Methanols konzentriert und nachdem das ausgefallene unlösliche Material entfernt worden war, wurde die aktive Substanz mit Äthylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert, wobei man etwa 900 mg eines rohen gelb-braunen Pulvers erhielt, welches die SF-1942-Substanz enthielt. Das erhaltene Pulver wurde in Methanol gelöst und die Lösung wurde in der gleichen Weise wie vorher angegeben, durch eine Säule, die mit 800 ml Sephadex LH-20 gepackt war, geschickt.

Die Säule wurde mit einer 20 %-igen wässrigen Methanollösung eluiert, wobei man aktive Fraktionen 56 bis 72 (15 ml in jeder Fraktion) erhielt. Die vereinten Fraktionen wurden unter vermindertem Druck konzentriert und das Konzentrat wurde gefriergetrocknet, wobei man 110 mg der SF-1942-Substanz als weisses Pulver erhielt.

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Die Erfindung wurde hier ausführlich und hinsichtlich spezifischer Ausführungsformen beschrieben, aber es ist für den Fachmann offensichtlich, dass zahlreiche Änderungen und Modifizierungen möglich sind, ohne vom Geist und umfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

HOFFMANN · EITLE & PARTNER ? O 1 Q c / A

PATENTANWÄLTE *·® I Q D 4 H

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-197Ä) · DIPL-ING. W.EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN

D1PL.-ING. K. FDCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERNHAUS) · D-8000 MÖNCHEN 81 . TELEFON (089) 9Π087 . TELEX 05-296Ί9 (PATHE)

30 580 o/wa

MEIJI SEIKA KAISHA, LTD., TOKYO/JAPAN

Antibiotikum SF-1942, Verfahren zu dessen Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzung, die das Antibiotikum SF-1942 enthält

PATENTANSPRÜCHE

1/ Eine antibiotische SF-1942 Substanz mit den folgenden Eigenschaften:

Aussehen und Art: weisse, elektrisch neutrale

Substanz

Zersetzungspunkt: schmilzt allmählich in einem

Temperaturbereich von 122 bis 134°C unter Zersetzung (amorphes Pulver)

Elementaranalyse (Gew.%): C: 65,57; H:7,8O; 0:26,38;

Nj O

UV-Absorptionsspektrum: kein charakteristisches Maximum bei der UV-Absorption

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Optische Drehung:

Molekulargewicht:

Löslichkeit:

Farbreaktion:

IR-Absorptionsspektrum: Absorptionsbanden bei 3400,

2960, 1780, 1710, 1630, 1450, 1390, 1020, 780 cm"¹ und ein Absorptionsspektrum wie es bei der Verwendung der KBr-Tablettenmethode in Fig. 2 gezeigt wird

Z°k/n = ~21,8 , 1 %-ige methanolische Lösung

350 bis 400, bestimmt nach der Dampfdruckmethode

Löslich in Äthylacetat, niedrigem Alkohol (C.-C,), Aceton, Benzol, Chloroform; unlöslich in Wasser und Hexan

positiv: Lemieux, Schwefelsäure und 2,4-Dinitrophenylhydrazin; negativ: Ninhydrin und Greig-Rayback-Reagenz

0,52 (Benzol/Methanol; 5:1 VoI/ VoI)

0,46 (Chloroform/Methanol; 10:1 Vol/Vol)
0,41 (Benzol/Aceton; 2:1 Vol/Vol)

Mobilität bei Hoch- verhält sich wie eine elektrisch Spannungselektrophorese . . _ , . auf Filterpapier: neurrale Substanz.

Rf-Werte bei Dünnschichtchromatografie (Kieselgel) :
2. Verfahren zur Herstellung einer antibiotischen SF-1942 Substanz aus einem SF-1942-substanzbildenden Stamm, der genus Streptomyces, dadurch gekennzeichnet ,

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dass man den SF-1942-substanzbildenden Stamm auf einem Nährmedium kultiviert, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, und die Kultivierung bei einer Temperatur von etwa 22 bis etwa 32°C unter aeroben Bedingungen vornimmt, bis sich eine wesentliche Menge an SF-1942-Substanz in dem Nährmedium angesammelt hat, und dass man die SF-1942-Substanz aus dem Nährmedium gewinnt.

Pharmazeutische Zusammensetzung zur therapeutischen Behandlung bei Lebewesen, einschliessend Menschen, zur Bekämpfung eines Tumors oder von Cancer, dadurch g e k e η η zeichnet , dass es a\Ls aktiven Bestandteil die SF-1942-Substanz gemäss Anspruch 1 zusammen mit anderen pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln enthält.

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