DE2623227A1 - Lucknomycin und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Description

DR.A.VAN DERWERTH DR. FRANZ LEDERER REINER F.MEYER

DlPL-ING. (1934-1974) DIPL-CHEM. DlPL-ING.

8000 MÜNCHEN 80 LUCILE-GRAHN-STBASSE 22

TELEFON: (089)472947 TELEX: 524624 LEDER D TELEGR.: LEDERERPATENT

21. Hai 1976 16.04.06

UCB, S.A.

4-, Chaussee de Charleroi, Saint-Gilles-lez-Bruxelles,

Belgien

Lucknomycin und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein neues Mittel gegen. Pilze und Protozoen, das im folgenden mit "Lucknomycin" bezeichnet wird, so\*ie ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Es sind bereits verschiedene Antibiotika mit pilzhemmsnder oder pilztötender Wirkung bekannt, jedoch werden auf der ganzen Welt weiterhin Untersuchungen durchgeführt, um neue Antipilzniittel zu entdecken, welche -verschiedene Vorteile gegenüber den bereits bekannten Mitteln aufweisen.

Es wurde nun ein neues Mittel gegen Pilzerkrankungen und Protozoenerkrankungen gefunden, welches im folgenden al3 "Lucknomycin" bezeichnet wird und das sich als wirksam gegen das Wachstum insbesondere von Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis und Aspergillus niger erwiesen hat. Ebenfalls ist es gegen Trichomonas vaginalis wirksam.

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Lucknomycin weist die folgenden chemischen und physikalischen Merkmale auf:

1. Physikalische Merkmale

1.1 Aussehen: Pulver von gelb-oranger Farbe

1.2 Elementaranalyse:

berechnet für C₆₁Hq₆IT₂O₂^ (Hol.-Gew. = 1240):

C = 59,05; H = 7,7^; N = 2,26 (%)

gefunden:

C= 58,92; H = 7,58; N = 2,29 (%)

1.3 Schmelzpunkt: Das Produkt beginnt sich bei ungefähr

150 ⁰C zu zersetzen, jedoch schmilzt es selbst bei JOO ⁰G nicht.

1.4 Löslichkeiten:

- löslich in Pyridin, Dimethylformamid und Bimethylacetaaid

- weniger löslich in Methanol von 60 %, konzentriertem Äthanol, Isopropanol;

- unlöslich in Benzol, Aceton, Wasser, Chloroform, absolutem Äthanol, Cyclohexan, Ithylacetat und Äther.

In Schwefelsäure ergibt Lucknomycin eine intensive, blaue Färbung. 1*5 ΙΕ-Spektrum: Aufnahme des Spektrums als EBr-CabIette (ca"" ']

3400 (S) +
2860 (Ii) ++
1600 (S)
1465 (W)

1325 (W)

1185 (S)

1075 (S)
995 (W)
850 (M)

3100 (W) +++

1715 (κ)

.1575 (W)

1390 (W)

1295 (W) 1140 (W) 1045 (V)

940 (W)

835 (W)

2930 (S) 1650 (H) 1545 (W) 1350 (W) 1250 (W) 1110 (M) 1010 (S) 890 (V) 800 (W)

starke Absorption mittlere Absorption schwache Absorption

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1.6 UV-Spektrum:

Aufgenommen "bei einer Konzentration von 1 mg/100 ml Dimethylformamid

344 mu (t = 3,5 x 10⁴)

364 mia (E, = 5,52 χ 10⁴)

384 ιημ (C « 8,04 χ 10⁴)

408 χψ (£ = 6,6 χ 10⁴)

1.7 optische Drehung:

Ca3_D = 187° "bis 194 ° (C = 0,3 in Dimethylformamid "bei 25 °C"

2. Chemische Merkmale

- Lucknomycin ist unter die aromatischen Heptaene einzuordnen, da es durch Eückaldolisierung N-Methyl-p-araino-acetophenon liefert.

- Die Methanolyse schreibt Lucknomycin einen Substituenten vom Suckertyp zu, der mit einer authentischen Probe von Mycosamin identifiziert wurde.

- Lucknomycin enthält keine titrierbare Carboxylgruppe.

3.. Biologische Merkmale
3.1 Antipilzspektrum

In ein Medium aus Pepton-Dextrose, das mit dem zu untersuchenden Organismus beimpft ist, wird Lucknomycin in unterschiedlichen Verdünnungswerten eingeführt. Mach 2 bis 5 Tagen der Inkubation bei 28 ⁰C wird die Anzahl von/Ug des Antibiotikums pro ml Medium bestimmt, die angewandt werden müssen, um eine vollständige Inhibierung des Wachstums (MIC) des betreffenden Organismus zu erzielen» Um die Antipilzaktivität von Lucknomycin besser zu zeigen, wurde sie mit derjenigen von anderen bereits bekannten Antipilzantibiotika verglichen.

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Mikroorganismus	Produkt	HIC ψι	I/ ml)
Candida albicans 11651	Lucknomycin Nystatin Amphotericin Pimaricin	0,1 - 2,5 1,25 5	0,2
Aspergillus niger	Lucknomycin ITy statin Amphotericin Pimaricin	0,5 0,6 2,5
Trichophyton mentagrophy- tes	Lucknomycin Nystatin	25 25
Trichophyton acuminatum	Lucknomycin Nystatin	12,5 25
Trichomonas vaginalis	Lucknomycin Nystatin Amphotericin B Pimaricin Ketronidazol	<0,05 >10 >10· >10 0,5
Candida krusei	Lucknomycin	• 0,2 -	0,4
Candida tropicalis	Lucknomycin	0,1 -	0,2

3.2 Antibakterielles Spektrum

Die experimentellen Bedingungen waren die gleichen wie für das Antipilzspektrum, lediglich daß die Dauer der Inkubation einen Tag bei 37 ⁰C betrug. Lucknomycin zeigt keine Hemmaktivität bei einer Konzentration von 10 mcg/ml bei folgenden Bakterien: Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Lactobacillus acidophilus
Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Streptococcus faecalis.

3-3 Antipr-otozoenaktivität

Eine Konzentration von 0^5 mcg/ial des· Antibiotikums tötet 50 % der Individuen einer in vollem Wachstum befindlichen Kultur von Trichomonas vaginalis in einem Zeitraum von ungefähr 30 Minuten.

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3.4 Toxizität

Dosis letalis LD₁-Q, bei der Haus in mg/kg: Applikationsweg ^^Ώ50

intravenös 10-20

intraperitoneal 5-10

subkutan >800

per os >800

4. Pharmakologische Versuche in vivo

4.1 Aktivität gegen Trichomonas vaginalis

Dieser Versuch wurde bei der Maus an einem subkutanen Abszess von Trichomonas vaginalis durchgeführt. Die'ED^.--Werte wurden aufgrund von subkutanen Injektionen einer Suspension (oder Lösung) der im folgenden aufgeführten Produkte bei verschiedenen Konzentrationen im Bereich des Abszesses abgeschätzt:

Produkt ^ED50 S^eS^en Trichomonas vaginalis

** (in/ug/ml)

Lucknomycin 12

Candicidin 24

Trichomycin 43

I-letronidazol 250

Pimaricin 720

4.2 Aktivität gegen Candida albicans in der Gynäkologie

Die Versuche wurden bei der Ratte mit durch Candida albicans hervorgerufene Vaginitis durchgeführt. Der Vergleich wurde mit zwei Vergleichsprodukten durchgeführt, nämlich mit Mycostatine (Wirkstoff: Nystatin) und Canestene (Wirkstoff: Clotrimazol)

Wirkstoff (in mg/Kom- Anzahl der geheilten Ratten/

prette) Anzahl der infizierten Ratten

nach A-.A-ppl.^nach 8 Appl,nach Λ2 Appl,

a) Lucknomycin 5 mg 14/16 13/15 12/12

b) Clotrimazol 20 mg 17/18 16/17 . 17/17

c) Mycostatine 4 mg 5/11 8/11 9/11 +) Appl. = Applikation

a) galenische Rezeptur der Versuchskoinpretten: Lucknoinycin 5 mg

Natriumborat 50 mg

kolloidale Kieselerde 0,8 mg (Warenbezeichnung Aerosil E Glyzerinpalmito-stearat 1 mg (Warenbezeichnung Frecirol) Natriumlaurylsulfat 0,8 mg (Warenbezeichnung LSEa) mikrokristalline Cellulose 52 mg (Warenbezeichnung Avicel

pH 102) Lactose FK bis auf 200 mg

b) 1/5 der handelsüblichen Komprette zu 100 mg von Clotrimazol

c) 1/5 dex" handelsüblichen Komprette mit ungefähr 20 mg (100.000 Einheiten) an Hycostatine.

5. Therapeutische Anwendungen

Lucknomacin ist ein Antipilz- und Antiprotozoenantibiotikum, das unter anderem für folgende Anwendungen eingesetzt werden

- Behandlung von Candidosen im allgemeinen und auf der Hautoberfläche (Bermatologie) oder im Bereich der buccalen, vaginalen, intestinalen Schleimhäute,

- Behandlung von Infektionen von Hohlräumen durch Trichomonas vaginalis und insbesondere die therapeutische Anwendung in der Gynäkologie,

- Anwendung in der Tiermedizin als Antipilziaittel,

- Anwendung in der Landwirtschaft zur Bekämpfung von Pflanzenmykosen,

- Heilaktivität gegen prostatische Hypertrophie,

- usw..

5-1 Beispiele für Kompretten für gynäkologische Zwecke Lucknooycin
Natriumbicarbonat
Weinsäure

kolloidale Kieselerde
(Warenbezeichnung Aerosil R 972)

Glyzerinpalmito-stearat 1 mg (Warenbezeichnung Precirol)

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10	,65	mg
2	,65	mg
	,8	mg
0	mg

Natriumlaurylsulfat 0,8 mg (Warenbezeichnung LSNa)

mikrokristallines Cellulose 52 mg (Warenbezeichnung Avicel pH 102)

Lactose PK bis auf 200 mg oder

Lucknomycin	10	mg
Harnstoff	25	mg
Lactose SD I kolloidale Kieselerde Γ Magnesiumstearat J	70	mg

USV/.

5.2 Beispiele für Antipilz- und Antiprotozoenformulierungen zur dermatologischen Anwendung Zusätzlich zu den konventionellen Trägern kann man gegebenenfalls geeignete Mengen eines antiinflammatorischen Mittels, eines Antibiotikums (oder Antiseptikums) mit breitem Spektrum und/oder eines Antihistaminikums zusetzen.

Fette Salbe	500	mg
Lucnomycin	10	ml
Dimethylacetamid	auf	100 g
Vaseline 70 % Ί flüssiges Paraffin 50 % J bis
Creme	500	mg
Lucknomycin	10	g
Dimethylacetamid	12,	68 g
Gemisch aus GIyζerinmono- . und -di-stearat	o,	55 g
Crodawax A22	o,	114 g
Hydroxybenzoesäuremethylester (Warenbez. Nipagin M)	o,	045 g
Hydroxybenzoesäurepropylester (Wsrenbez. Uipasol;	51/	r1106
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Monopalmitat von Polyoxyäthylen- 1CO g sorbitan (Warenbez. Tween 40 von Atlas)

destilliertes Wasser bis auf 100 g

wasserfreie Grundlage

Lucknomycin 500 mg

Dimethylacetamid 10 g

Monopalmitat von Polyoxyäthylen- 0,5 g sorbitan (Warenbez. Tween 40 von Atlas)

Bienenwachs 5,5g

Stearylalkohol 20 g

Glyzerin bis auf 100 g

Gelee

Lucknomycin 1000 mg

Dimethylacetamid 98 g

Glyzerin 98 g

ÜFordihydroguajaretsäure 0,2 g

Zitronensäure 0,1 g

Acrylsäurepolymeres 2 g

(Warenbez. Carbopol 9^0 von

Goodrich)

Triäthanolamin . erforderl. Menge

Monopalmitat von Polyoxyäthylen- 1 g sorbitan (Warenbez. Tween 40 von Atlas)

6» Beschreibung des Mikroorganismus Der Lucknomycin-produzierende Stamm wurde einer Identifikationsuntersuchung durch das "Centraalbureau voor Schimmelcultures a Baarn (Niederlande)" unterzogen und unter der Stammnummer CBS 101.74.hinterlegt. Die Untersuchung hat gezeigt, daß dieser Mikroorganismus sich gut der Art Streptomyces diastatochrömogenes (Krains) Waksman und Henrici hinsichtlich seiner wesentlichsten

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Merkmale anschließt. Der einzige Unterschied, die Nichtverwertung von Saccharose, weist keine solche Bedeutung auf, daß er eine Garantie eines neuen Stammes "bildet. S. "bottropensis Waksinan

1956, S. phaeophaciens Maeda et al. 1952 wie auch S. luteogriseus Schmitz et al. 1964 sind ebenfalls sehr verwandt und können gegebenenfalls als Synonyme betrachtet werden, welche bereits

zuvor durch Hütter 1967 für S. bottropensis und S. phaeophaciens angegeben wurden.

Zur Untersuchung der Morphologie und der Eigenschaften der Kultur wurde der Organismus (Versuchsprobe der Spuren mittels Platinschlinge in destilliertem V/asser aus Kulturen in geneigten Eeagenzgläsern) in den im folgenden genannten Medien während 10 bis 14 Tagen bei 28 ± 1 ⁰C kultiviert. Im optischen Mikroskop wurden die Kulturen direkt als gut sporenbildend in Fetrischaien beobachtet. Die Proben für die Untersuchungen im Elektronenmikroskop wurden erhalten, indem auf das in Sporenbildung befindliche Mycelium vorsichtig mit Farmvar überzogene Kupfergitter gepreßt wurden. Es wurden weiterhin Beobachtungen für die Merkmale der Kultur durchgeführt, insbesondere für Färbung des Luftmycels und des Substratmycels (Maers und Paul 1950) und hinsichtlich eventueller Veränderungen der Färbung der Medien.

6.1 Farbe:

Medium

B e ob achtungen

Farbe des Farbe des lösliches Luftmycels Substrat- Pigment ____^ mycels

1. Hafermehlagar

2. Mineralsalz-Stärkeagar

3· Asparagin-Dextroseagar

4. Hefe-Malζ-Agar

5. Czapek-Agar

graubräunlich

grau
grau

grau

klar
grau

blaßbraun keines

blaßgelb keines

blaßgelb keines

blaßbraun keines

klar keines grau

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6.	Conn-Agar	sandweiß
7-	Nähragar	bronze braun
8.	Tomaten-Hafermehl- Agar	grau bräunlich
9-	Hickey-Tre sner-Agar	oliv-grün
0.	Kartoffelagar	weiß "bis schiefer grau

ΛΛ. Melassesgar

grau

blaßbraun keines fahl rot "braun

blaßbraun keines

bernstein- keines gelb

Ahornzucker klar braun dunkelbraun keines

6.2 Mikroskopische Merkmale Morphologie der Sporenketten:

Teilungsspiralen: Die Spiralen sind bei 4- bis 6 Drehungen offen. Die reifen Sporenketten besitzen 10 bis 50 Sporen · pro Kette. Die Sporophorenverzweigungen liegen in sympodialer Anordnung vor. Die Sporen sind elliptisch. Die Sporenoberfläche ist glatt.

!Farbe der Kolonie: Farbe der Luftmasse in der Reihe der Grautöne auf Eefe-Mals-Agar, Hafermehlagar, Glyzerin-Asparagin-Agar und Salz-Stärke-Agar.

Rückseite der Kolonie: keine unterscheidungskräftigen Pigmente (braun-bliven-f arbig auf Hafer-Malz-Agar, braungelblich bis braun mit gelbem Rand auf Haferniehlagar und gelb-gräulich mit einigen dunkelbraunen Flecken auf Glyzerin-Asparagin-Agar und Salz-Stärke-Agar).

Farbe im Medium: Ausbildung von schwarzen Pigmenten in Pepton-Hefe-Eisen-Agar und Tyrosin-Agar. Keine Pigmente in Hefe-Malz-Agar, Hafermehlagar, Saiz-Stärke-Agar und Glyzerin-Asparagin-Agar.

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— "11 —

6.3 Biochemische Eigenschaften

Bildung von Melamin: positiv

Zersetzung von Tyrosin: positiv

Bildung von Schwefelwasserstoff: positiv Proteolyse (Gelatine): positiv

Reduktion von Nitraten: negativ

Verwertung von Kohlenstoff:

iirabinose, Bhamnose, Glucose, Galactose, Fructose, Mannose, Lactose, Maltose, Dextrose, Glyzerin und Salicin werden vollständig verwertet: Xylose, Eaffinose, Stärke, Inosit, Mannit und Natriümacetat werden partiell verwertet; Saccharose, Inulin, Sorbit und Natriumeitrat werden nicht verwertet. ;

Lucknomycin wird erhalten, wenn man den Erzeugungsmikroorganistnus in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Tauchbedingungen kultiviert. Zur Herstellung von begrenzten Mengen dieser Substanz kann man Oberflächenkulturen und Kolben verwenden. Man kultiviert den Organismus in einem Nährmedium, das eine Quelle für Kohlenstoff, z. B. ein assimilierbares Kohlehydrat, und eine Quelle für Stickstoff, z. B. eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder proteinartiges Material enthält. Als bevorzugte Kohlenstoffquellen seien z. B. genannt: Arabinose, Rhamnose, Glucose, Galactose, Fructose, Mannose, Lactose, Maltose, Dextrose, Glyzerin, Salicin, Xylose, Eaffinose, Stärke, Inosit, Mannit, Natriumacetat. Als bevorzugte Stickstoffquellen seien z. B. genannt: Ammoniumsulfat, Maisquellwasser, Pepton, Malzextrakt, Protein . aus Baumwollsamenkörnern. Vorteilhafterweise kann man eine Kombination dieser Quellen für Kohlenstoff und für Stickstoff verwenden. Wahlweise kann man dem Fermentationsmedium Spurenmetalle zusetzen (Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen,

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usw.), falls man zur Herstellung dieses Mediums Leitungswasser und nicht-gereinigte, rohe Ausgangsmsterialien verwendet.

Die Herstellung "von Lucknomycin wird in dem Temperaturbereich durchgeführt, der ein zufriedenstellendes Wachstum des Mikroorganismus erlaubt, d. h. zwischen 20 und 32 ⁰C und vorzugsweise zwischen 27 und 29 C. Die optimale Bauer der Fermentation kann von 2 bis 10 Tagen variieren. Vorzugsweise sollte das Kulturmedium einen pH-Wert zu Beginn in der Nähe von 7?0 auf v/eisen. Der pH-Wert am Ende hängt von der Anwesenheit von Puffern ab und er sollte vorzugsweise ebenfalls in der Nähe von 7?0 zum Zeitpunkt der Durchführung der Sterilisation liegen.

Wenn die Fermentation in Behältern von großen Abmessungen durchgeführt wird, wird es bevorzugt, eher die vegetative Form als die Sporenform des Mikroorganismus im Hinblick auf das Impfen zu verwenden, um jede Verzögerung bei der Bildung von Lucknomycin zu vermeiden, und um die Fermentationsvorrichtung am besten auszunutzen. Daher ist es vorteilhaft, ein vegetatives Inoculat in einer Nährbouillonkultur durch Inoculieren dieser Bouillon mit einem Teil einer Kultur des Bodens oder einer Schrägkultur herzustellen. Wenn man auf diese Weise ein gelbes und aktives, vegetatives Inoculat erhalten hat, wird dieses aseptisch in die größeren Behälter "überführt. Das Medium, das zur Herstellung des vegetativen Inoculates gedient hat, kann mit dem zur Herstellung des Lueknomycin in großen verwendeten Mediums identisch oder hiervon λ jrschieden sein, sofern ein gutes Wachstum des Mikroorganismus sichergestellt wird.

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Die Analysenwerte, welche mit Lucknccycin erhalten wurden, teilen dieser Verbindung die Formel C^_/,H_Cf-H^.,Op_/t zu. Lucknomycii ist in Pyridin, Dimethylformamid, Dimetfcy!acetamid löslich, es ist weniger löslich in Methanol mit 60 %, Äthanol und Isopropanol, und es ist unlöslich in Benzol, Aceton, Wasser, Chloroform, absolutem Äthanol, Cyclche>:an, Äthylacetat und Äther.

Man kann verschiedene Arbeitsweisen zur Isolierung und zur Reinigung von Lucknomjein anwenden^ s» B. die Extraktion mit Lösungsmittel, die Gelchromatogrsiie, die Flüssig-Flüssig-Verteiiung in einer Craig-Apperattir. 3Ie Arbeitsweisen der Extraktion mit Lösungsmittel sind zv.v Gewinnung in technischem Maßstab bevorzugt₄ da sie reacher arbeiten und weniger arbeitsintensiv e"^?nd.

Die Arbeitsweisen zur Reinigung ;r:it.te!Ls Gelchromc-tografie (Herckogel 500 oder S ^ßiaäex LE 20" sfnd bevGÄ=3U^t.

Bei einer bevorzugten Arbeitsweise Kir ■ Gewinnung wird Lucknomycin aus seinem. EuItürmeeins durch Abtrennen des Mycels und der nicht aufgelösten ]?3s"'.".-vboffe in konventioneller Weise, z. B, durch Filtrieren r-ö/si⁸ Zentrifugieren gewonnen. Anschließend wird das Antibiociknoi av.ä der filtrierten oder sentriiugiertsn Bouillon d'^rc'.-:-. Γ ^rekuicn herausgeholt· Nach dem Abtropfen \v_::A dem Filtriereu (oder Zentrifugieren) wird das Mycel mit Alkohol extrahifirte Dieser Extrakt -wird konzentriert und man extrahiert iaa v-nlösliciie Material mit Chloroform:, ItJier und. Hexan sut Entfernung von Spuren eines polypeptidartigeii Antibiotil.:;:, _: welches k:;in Inisresse besitzt» AnEchließand wird das 'uzJI'Ssliehe Materiel sit Aceton gewaschen und unter Yaknu^i getvockneto Eine gesetzliche Reinigung oder er.ne Rein.'^u:r-v -·.- χι Eücketinden. welche

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Lucknoinycin enthalten, kann durch Gelchromatografie -unter Verwendung "von z. E. Dimethylformamid als Elutionsmittel durchgeführt werden. Unter Vakuum wird das Eluat aus der. Chromatografiesäule "bei einer Temperatur unterhalb von 40 C konzentriert, das Lucknomycin wird iiiit einem Gemisch aus Äther-Hexan (1:1) ausgefällt und durch Filtrieren oder Zentrifugieren gewonnen.

Die erfindungsgemäße, neue Verbindung kann gegen folgende Mikroorganismen eingesetzt werden:

.^spergilius niger₅ Candida aibicans, Candida krusei^ Candida 'cropicslis, Sacchromyces cerevisiae, Tr-ichomonas vaginalisc Sie ist mäßig aktiv gegen Trichop-hytons sientagrophytes. und aousinatus. Sie ist inaktiv gegen folgende Bakterien: E„ eoli,

Klebsiella pneumoniae. Lactobacillus acidophilus, Froteus ^trab-ilis, Pseudornonas aeruginosa. Staphilococcus aureus '.-.ιβ. Streptococci".s faecalis«

ie Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher 3rläutert.

'. BJspisl Ί Fermentation von Streptomyces diastatochromogeaes zrzv Herstellung von Lucknomycin

Stadium ^g^
3s wird eine lyopliilisierte Kultur von S₀ diastatochromogsnee in eine 500-ml-Sehütt elf lasche gegeben, welciie 100 ml des folgenden, sterilen Mediums enthält?

P.indfleisclie^rtrakt - 3 g

!,Bacto-Bsef-Extract von Difeo
Laboratories, Detroit, Hich.)

?epton 5 g

',Bactc—Peptone von Difco Laboratories, Detroit, Hich_o)

Dextrose 10 g

isfeestrakt 5 S

; Difeo Lsbors-tories, Detr-oit _s

Mich.)

6098B1/1106_1OOOml

wobei man hierin den pH-Wert auf 7,2 mit einer Natriunhydroxid-Iosung einstellt.

Die Schüttelflasche und ihr. Inhalt werden 2 Tage bei 28 - 1 ⁰C

auf einem Drehschütteltisch (250 Upm, Weglänge 50*8 ®®d einer Inkubation unterzogen.

Es wird eine Inoculatscharge von ungefähr 6 1 nach folgender Methode hergestellt:

10 υ1" Inoculat vom Stadium der Keimbildung werden in 3ede einer Reihe von Schüttelflasehen überführt, welche jeweils 200 ml des folgenden, sterilen Mediunis enthalten:

Glyzerin 10 ml

L-Asparagin 1 g

(von BDH Chemicals Ltd., Pool,
Großbritannien)

Dikaliumhydrogenphosphat 1 g

(von J.T. Baker Chemicals Co.,

Hefeextrakt 0,5 g

(von Difco Laboratories,
Detroit, Mich.)

Leitungswasser 1000 ml

Die Schüttelflaschen und ihr Inhalt werden einer Inkubation von 2 Tagen bei 28 ί 1 ⁰C auf einer Drehschüttelvorrichtung (250 Upm/Weglänge 50,8 mm) unterworfen. Die Brühen werden vereinigt und aseptisch in eine sterile Inoculatflasche überführt.

Die 6 1 Inoculat werden aseptisch in einen Fermentator von 100 1 überführt, der 60 1 des folgenden, sterilen Mediums enthält:

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Erdnußmehl 9CC g

Dextrose (Cerelose) 900 g

Natriumchlorid 30 g

Celciumcarbonat 6 g

Hefeextrakt 6 g

Erdnußöl 60 ml

Antischaurrmittel 3 ml

(Varenbezeichnung Shodorsil 410 von Ehone Poulenc, Paris, Frank reich)oder jedes andere geeignete Antischaummittel

Leitungswasser, aufgefüllt auf 60 1

Der pH-Wert wird auf 6,9 - 7,0 vor der Sterilisation ein-" geregelt, und es wird eine aerobe Fermentation während 48 Stunden durchgeführt, bis das Volumen der Zellen ungefähr 10 bis 15 % des Gesamtvolumens ausmacht, und zwar unter folgenden Bedingungen:

Temperatur 28 t 1 ⁰C

Zufuhr von steriler Luft 60 l/min Druck 0,49 kg/cm²

Rühren 300 Upm

Stadium der Fermentation Eine Charge von 30 1 des Inoculates werden aseptisch in einen

Fermentator von 400 1 überführt, der folgendes Medium enthält:

Mehl 6000 g

Glucosesirup (mit 60 % Cerelose) 9000 g

Natriumchlorid 1500 g

Calciumcarbonat 300 g

Hefeextrakt . 300 g

Erdnußöl 3 1

Antischaummittel 15

(Warenbez. Ehodorsil 410)

Leitungswasser . 300

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Die Fermentation wird "bei 28 - 1 ⁰C imiaer unter Rühren mit 200 Upm, unter Zufuhr von Druckluft von 0,49 kg/cm überdruck und in einer Henge von 300 l/min durchgeführt. Während der 5-tägigen Fermentation v/erden zu verschiedenen Zeitpunkten Proben der in Fermentation "befindlichen Brühe entnommen und auf Bildung des Antibiotikums mittels der spektrofotometrischen Methode untersucht. Man extrahiert das gewaschene Kycel mit Äthanol und mißt die optische Dichte des äthanolischen Extraktes "bei 383 Wl in einem Colorimeter (Bausch und Lomb). Es wird eine

Sichkurve von reinem Lucknomycin aufgestellt und der Gehalt der Proben durch Bezugnahme auf diese Kurve berechnet.

Beispiel 2 Herstellung von Lucknomycin in verschiedenen Medien

!lach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise wird die Keimbildung einer lyophilisierten Kultur der Art S. diastatochromogenes gemäß der Erfindung durchgeführt. Nach dem Schütteln während 2 Tagen bei 28-1 ⁰C wird das Zellentnaterial durch Zentrifugieren des Gemisches der Fermentation in einer

sterilen Flasche gesammelt. Das feste Material wird durch Zentrifugieren gewaschen, wobei zwei Vaschvorgänge mit 100 ml destilliertem, sterilem Waschwasser durchgeführt werden, anschließend wird es in 100 ml sterilen, destillierten Wasser in Suspension überführt. Die Suspension wird als Inoculat von 10 % in verschiedenen, synthetischen Medien zur Fermentation verwendet, und die Bildung von Lucknomycin bestimmt. Die Fermentationsversuche werden in Schuttelflaschen durchgeführt, und es wird die in Beispiel 1 beschriebene, colorimetrische Bestimmungsmethode für Lucknomycin angewandt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

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Medium (Gew.-%) Schüttel- gebildetes, dauer Lucknomycin (Tage) (yug/ml)

Erdnußmehl: 2 % Glyzerin: 1 % natriumchlorid: 0,5 % Calciumcarbonate 0,1 %

Erdnußmehl: 2 % Glyzerin: 1 % Natriumchlorid: 0,5 % Calciumcarbonat: 0,1 % Erdnußöl: 1 %

Sojamehl: 2 % Glyzerin: 1 % . Natriumchlorid: 0,5 % Calciumcarbonat: 0,1 % Erdnußöl: 1 %

Erdnußmehl: 2 % Cerelose (Dextrose): 1,5 Natriumchlorid: 0,5 % Calciumcarbonat: 0,1 °/o Erdnußöl: 1 %

Erdnußmehl: 2 % Glucosesirup: 3 % Natriumchlorid: 0,5 % Calciumcarbonat: 0,1 % Erdnußöl: 1 %

160

212

Beispiel 3 Einfluß von Ammoniumsulfat und organischem Stickstoff auf die Ausbeute an Lucknomycin

Es wurden Versuche in 500 ml konischen Kolben durchgeführt, Vielehe 100 ml des folgenden Mediums enthielten, ergänzt mit organischem Stickstoff unterschiedlichen Herkommens und mit Ammoniumsulfat bei optimalen Werten:

Erdnußmehl Cerelose (Dextrose) Na triumchlorid Calciumcarbonat

2 Gew./Vol.

1,5
0,5
0,1

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Man gibt ein Inoculat von 10 %, wie in Beispiel 2 "beschrieben, hinzu, und man schüttelt die Kolben auf einer Drehschütteleinrichtung (250 Upm, Weglänge 50,8 mm) "bei 28 - 1 ⁰G während 72 Stunden, wobei folgende Titerwerte für Lucknomycin erhalten wurden:

Gew.-%_Stickstoff ^Volumen /H

Ammoniumsulfat 0,1 % -24

Maisquellwasser 0,1 % 45

Pepton 0,1 % 70

Malzextrakt 0,1 % 100

Protein aus Baumwollsamen 0,5 % 100

Kontrollversuch 91

Beispiel 4 Extraktion und Reinigung von Lucknomycin

Nach der Fermentation wird das Mycel durch Abtropfen und Filtrieren (oder Zentrifugieren) gewonnen, es wird mit Wasser gewaschen, dann wird es dreimal durch Verreiben mit Alkohol (Äthanol oder Methanol) extrahiert. Es wird gefunden, daß 90 Gew.-% des Antibiotikums sich in dem Mycel und 10 % in der Kulturflüssigkeit befinden. Man kann das Antibiotikum aus der Kulturflüssigkeit durch Extraktion mit n-Butylalkohol gewinnen.

Der Extrakt des Antibiotikums wird bei einer Temperatur unterhalb von 50 ⁰C bei Abwesenheit von Licht von dem Lösungsmittel befreit. Der Rückstand d.er alkoholischen Extrakte wird zunächst mit Hexan (oder Petroläther) extrahiert, anschließend wird er mit Chloroform behandelt, um eine antibakterielle Substanz hieraus zu entfernen. Im Verlauf von vorangegangenen Untersuchungen wurde festgestellt, daß diesespölypeptidartige Antibiotikum kein "besonderes Interesse besitzt, so daß. es verworfen wird. ' ■

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Die Reinigung kann ebenfalls durch Gelchromatogrefie (Kolelrulsrfiltration) auf lierckogel 500 oder Sephadex LH-20 unter Verwendung von Dimethylformamid als Elutionsmittel durchgeführt werden. Die Eluate werden entweder mit einem Universaldetektor (Pye Unicam ä fil) oder mit einem UV-Absorptionsmeßgerät "bei 406 mu untersucht.

Die Fraktionen, welche die Substanz mit Antipilzwirkung enthalten, werden im Vakuum (10" mm Hg) bei 40 ⁰C eingeengt und mit Äther ausgefällt. Anschließend wird der Fiederschlag zentrifugiert und dreimal mit Äther zur Entfernung aller Spuren von Dimethylformamid gex^aschen.

Ebenfalls kann man Lucknomycin durch Gegenstromtrennung unter Verwendung des Lösungsmittelsystems Pyridin (35 Teile) Äthylacetat (65 Teile) - Wasser (83 Teile) in einer Gegenstronverteilungsapparatur mit 100 Craig-Röhren durchführen und es 261 Überführungen unterwerfen. Die optische Dichte der unteren und oberen Phasen werden gemessen. Eine einzige Spitze wird beobachtet. Die das Antibiotikum enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Trockene unter vermindertem Druck eingedampft. Der so erhaltene Rückstand (Pulver von goldgelber Farbe) wird abschließend mit einer geringen Menge von v/armem Methanol gewaschen.

Schmelzpunkt: bräunt sich ohne zu schmelzen von 150 ⁰C an (Zersetzung).

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   Neues Antibiotikum mit Antipilz- und Antiprotozoenwirkung mit der Bezeichnung "Lucknomycin", dadurch gekennzeichnet, daß es folgende physikalische und chemische Eigenschaften aufweist:

   (a) gelb-oranges Pulver,

   (b) beginnt sich "bei 15O ⁰C zu zersetzen, schmilzt jedoch selbst bei 300 ⁰C nicht,

   (c) besitzt ein Molekulargewicht von 1240,

   (d) weist folgende Elementaranalyse auf: C = 58,92; H = 7,58; IT = 2,29 (%)

   (e) ist löslich in: Pyridin, Dimethylformamid und Mm et hy I-acetamid;

   ist weniger löslich in Methanol von 60 %, konzentriertem Äthanol, Isopropanol;

   ist unlöslich in Benzol, Aceton, Wasser, Chloroform, absolutem Äthanol, Cyclohexan, Äthylacetat und Mäthyläther,

   (f) ergibt in Schwefelsäure eine intensiv blaue Färbung,

   (g) besitzt das folgende IR-Spektrum in einer KBr-Pastille (in cm" ):

   3400 (S) 1465 (W) 1075 (S) 3100 (W) 1390 (W) 1045 (W) 2930 (S) 1350 (W) 1010 (S)

   2860 (M) 1325 (W) 995 (W)

   1715 (M) 1295 (W) 940 (W)

   1650 (M) 125Ο (W) 890 (V/)

   1600 (S) 1185 (S) 850 (M)

   1575 (W) 1140 (W) 835 (W)

   1545 (W) 1110 (H) 800 (W)

   wobei S = stark Absorption, K = mittlere Absorption,

   W = schwache Absorption bedeuten,

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   (h) "besitzt das folgende UV-Spektrum bei einer Konzentration von i mg/100 ml Diinethylfomainid:

   344 ψ Xt = 3,5 χ 10⁴)

   364 mn (£= 5,52 χ 10⁴)

   384 mp (6 = 8,04 χ 10⁴)

   408 ΐψ (£, = 6,6 χ ΊΟ⁴)
   (i) "besitzt eine optische Drehung [α]_Ώ von 187 bis 1^CH °

   (C = 0,3 in Dimethylformamid "bei 25 ⁰C) (j) ist ein aromatisches Heptaen, das durch Rückaldolisierung B-Methyl-p-aminoacetophenon liefert, "besitzt einen Substituenten vom Iiycosamintyp und enthält keine titrierbare Carboxylgruppe.

   2- Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums mit Antipils-" wirkung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß esη Streptomyces diastatochromogenes, var. Krains, v/elcher die Hinterlegungsnummer CBS 101.74- trägt, in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Tauchbedingungen kultiviert, bis eine "wesentliche Aktivität als Antipilz- und Antiprotozoenantibiotikum in dem Hedium durch Bildung von Lucknomycin erhalten ist.

   3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces diastatochromogenes, var. Krains mit der Hinterlegungsnummer CBS 101.74- in einem wäßrigen Nährinedium, welches eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff ι;.ηα eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff enthält, unter aeroben Tauchbedingungen kultiviert, bis eine wesentliche Aktivität als Antipilz- und Antiprctozoenantibiotikuin in dem Medium durch Bildung von Lucknomycin erreicht ist, und daß man das so gebildete Lucknomycin isoliert.

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   4. Verfahren nach Anspruch 3s dadurch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung das Iiedium zur Gewinnung eines festen Hückstandes und eines Filtrates filtriert, daß man den festen
   Rückstand mit einem niederen Alkanol extrahiert, daß men
   diesen Extrakt einengt, daß man ihn mit Chloroform, !thyläther und Hexan zur Entfernung einer polypeptidartigen,
   antibakteriellen Substanz behandelt, und daß man das Lucknomycin aus diesem Extrakt gewinnt.

   5· Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Lucknomycin aus dem Filtrat durch Extraktion mit
   n-Butylalkohol gewinnt.

   6. Arzneimittel mit einem Gehalt des Antibiotikums mit Antipilz- und Antiprotozoenwirkung nach Anspruch 1.

   7· Antibiotikum mit Antipilz- und Antiprotoζοenwirkung,

   bezeichnet als "Lucknomycin" nach Anspruch 1 in im wesentlichen reiner .Form.

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