DE2816087A1

DE2816087A1 - Verwendung eines stickstoff enthaltenden polysaccharids zur foerderung der arzneimittelempfindlichkeit von gegen antibiotika resistenten bakterien

Info

Publication number: DE2816087A1
Application number: DE19782816087
Authority: DE
Inventors: Spaeter Genannt Werden Wird
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1977-04-13
Filing date: 1978-04-13
Publication date: 1978-11-02
Also published as: JPS53127813A; AU519028B2; FR2387037A1; SE7804110L; JPS5639288B2; IT1095587B; NL7803875A; DK155916C; DK155916B; DK162678A; FR2387037B1; SU793408A3; IT7822280A0; CH638983A5; GB1572387A; CA1100876A; NL170593C; SE446818B; DD138276A5; HU179217B

Description

Beschreibung;

Die Erfindung "betrifft die Verwendung eines Stickstoff enthaltenden Polysaccharide zur Förderung der Arzneimittelempfindlichkeit von Bakterien, die gegen Antibiotika resistent geworden sind.

Die Fortschritte auf dem chemotherapeutischen Gebiet und insbesondere die Verbreitung einer Vielzahl von Antibiotika haben zu einer drastischen Abnahme der bakteriellen Infektionserkrankungen, wie z. B. der Tuberkulose, der Dysenterie und dergleichen, geführt und ihr Beitrag zur Volksgesundheit steht außer jedem Zweifel· Diese modernen Errungenschaften haben jedoch andererseits zu einer schnellen Zunahme der sogenannten arzneimittelresistenten Bakterien geführt, die den vorhandenen Chemotherapeutika standhalten. Noch schlimmer ist aber, daß viele "multipel-arzneimittelresistenten Bakterien", d. h. Bakterien, die gegen zwei oder mehr Arten von Arzneimitteln resistent sind, sich aus den gefährlichen Keimen, wie z. B. Kycobakterien, Shigellen, Staphylokokken und dergleichen, entwickelt haben und daß diese umwälzenden Neuentwicklungen ernsthafte Probleme auf dem Gebiet der Chemotherapie gegen diese Infektionserkrankungen mit sich bringen. Aus diesem Grunde haben die Antibiotika-Präparate in der Regel einen kurzen Lebenszyklus und die Arzneimittelhersteller sind daher gezwungen, die neuen Arten von Antibiotika eine nach der anderen in schneller Folge unter enormen Eosten auf den Markt zu bringen. Dies kann zu riesigen Verlusten führen, die vom Standpunkt der Sozialökonomie aus betrachtet nicht ignoriert werden können.

Angesichts dieser Situation wurden nun umfangreiche

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Untersuchungen mit arzneimittelresistenten Bakterien durchgeführt und dabei wurde gefunden, daß durch Verwendung eines spezifischen^Stickstoff enthaltenden Polysaccharide in Kombination mit Antibiotika eine auffällige Verbesserung der Arzneimittelempfindlichkeit der Keime erzielt werden kann, die gegen Antibiotika resistent geworden waren. Es wurde auch gefunden, daß mit dem Stickstoff enthaltenden Polysaccharid nicht nur die Wirksamkeit der Antibiotika gegenüber den resistenten Keimen verbessert werden kann, sondern daß es aufgrund seiner Wirkung auch die Langzeit verwendung der Antibiotika mit unveränderter Wirksamkeit erlaubt.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine neue Verwendung für das Stickstoff enthaltende Polysaccharid nicht nur in bezug auf die Förderung der medizinischen Antibiotika-Empfindlichkeit von Bakterien, die gegen Antibiotika resistent geworden sind, sondern auch in bezug auf die Erhöhung der Wirksamkeit (Potenz) der Antibiotika gegenüber den Bakterien bei gleichzeitiger Verlängerung der Wirkung der Antibiotika anzugeben.

Weitere Ziele, Vorteile und Merkmale der Erfindung gehen aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen hervor. Es zeigen:

Pig. 1 ein Infrarot-Absorptionsspektrum des erfindungsgemäß verv/endeten,Stickstoff enthaltenden Polysaccharids (KP);

Pig. 2 ein Protonen-kernmagnetisches Resonanzabsorptionsspektrum (HHR) der Substanz; und

Pig. 3 his 6 Diagramme, welche die erfindungsgemäßen Effekte

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erläutern.
Die Erfindung wird nachfolgend näher beschrieben.

Wesentlicher Gedanke der Erfindung ist ein Stickstoff enthaltendes Polysaccharid, das herstellbar ist durch Extrahieren des Mycels von Basidiomyceten, die zu dem Genus Coriolus von Polyporaceae gehören, mit einem wässrigen Lösungsmittel, das auf wirksame Weise verwendet wird zur Förderung der Arzneimittelempfindlichkeit von gegen Antibiotika resistenten Bakterien.

Das Stickstoff enthaltende Polysaccharid, das als eine aktive Komponente des erfindungsgemäßen Agens verwendet wird, ist erhältlich durch Extrahieren des Mycels von Basidiomyceten, die zu dem Genus Coriolus von Polyporaceae gehören, mit einem wässrigen lösungsmittel· Der hier verwendete Ausdruck "Mycel der Basidiomyceten, die zu dem Genus Coriolus von Polyporaceae gehören" basiert auf der Klassifikation von Eokuya Imazeki und Tsugio Hongo (Hoikusha Pub. Co.) in "Coloured Illustration of Fungi of Japan". Das Verfahren zur Herstellung des Stickstoff enthaltenden Polysaccharids, das als aktive Komponente erfindungsgemäß verwendet wird, wird nachfolgend kurz beschrieben.

Die Mycele der Basidiomyceten, die zu dem Genus Coriolus gehören, die als Ausgangsmaterial für das Extraktionsverfahren verwendet werden, können entweder auf natürlichem Wege oder aus einer künstlichen Kultur gewonnen werden. Im Falle der künstlichen Kultivierung der Fungi unter Verwendung eines flüssigen Mediums ist es möglich, als Ausgangsmaterial das gesamte Kulturprodukt einschließlich nicht nur der gebildeten

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Mycele, sondern auch des Eluats in dem flüssigen Medium nach der Kultivierung zu verwenden. Das dabei erhaltene Ausgangsmaterial wird mit einem wässrigen Lösungsmittel extrahiert und der Extrakt wird geeigneten Behandlungen unterworfen, beispielsweise filtriert, neutralisiert, das Filtrat wird eingeengt, äialysiert, ausgesalzen und dergleichen, um das Material mit niedrigem Molekulargewicht (mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000) aus dem Extrakt zu entfernen, und es wird getrocknet, wobei man eine pulverförmige Substanz erhält. Die dabei erhaltene pulverförmige Substanz besteht aus einem Stickstoff enthaltenden Polysaccharid und sie kann als aktive Komponente erfindungsgemäß verwendet werden. Das auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltene Stickstoff enthaltende Polysaccharid hat die folgenden Eigenschaften:

Physikalisch-chemische Eigenschaften

(1) Allgemein

Die Substanz liegt in Form eines Pulvers vor, ist braun gefärbt, v/eist keinen definierten Schmelzpunkt auf und verkohlt, wenn sie stark erhitzt wird. Sie ist in organischen Lösungsmitteln, wie Pyridin, Chloroform, Benzol, Hexan und dergleichen, unlöslich, in Wasser jedoch löslich.

(2) Infrarot-AbsorOtionssgektrum

Das Infrarot-Absorptionsspektrum dieser Substanz zeigt eine Absorption bei und in der Eahe von 3600 - 3200 cm""'¹, 2920 - 2900 cm"¹, 1660 - 1610 cm"¹, 1460 cm"¹, 1410 cm"¹, 1360 cm"¹, 1230 cm~¹, II50 cm"¹, 1080 cm"¹, 1060 - 990 cm"¹, 925 cm"¹, 890 cm"¹, 840 cm"¹, 755 cm"¹ und 705 cm"¹. Es gibt eine Absorption durch ρ -Bindungen von Glucan in dem Saccharid-Anteil bei 890 cm und eine weitere Absorption durch

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CL-Bindungen von Glucan bei 840 cm .

(3) Elementaranal^se

Die Zusammensetzung der Substanz, bestimmt durch Elemen taranalyse, ist folgende: sie enthält 42 bis 46 % Kohlenstoff, 5,3 bis 7,0 % Wasserstoff und 0,5 bis 8,0 % Stickstoff. Der Rest ist Sauerstoff.

(4) O£tische_Drehung

Die optische Drehung der Substanz, bestimmt durch das spezifische Drehvermögen \jX~] -Q₉ beträgt 0 bis 50.

(5) §E^!5§^Ü£5

Die Substanz ist positiv in bezug auf die Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, die Anthron-Schwefelsäure-Eeaktion und die Ninhydrin-Reaktion. Die positive Disposition für diese Earbreaktionen zeigt an, daß die erfindungsgemäß verwendete aktive Substanz aus Saccharid und Protein besteht. Um die Saccharidzusammensetzung des Stickstoff enthaltenden PoIysacc-harids kennenzulernen, wurde eine Probe mit methanolischer Chlorwass erst off säure hydrolysiert und nach der Srimethylsilylierung unter Anwendung eines bekannten Verfahrens einer Gaschromatographie unterworfen. Das dabei erhaltene Ergebnis zeigte, daß die Substanz hauptsächlich aus Glucose besteht und auch Mannose, Galactose, Xylose und Fucose enthält. Eine Aminosäure-Analyse des Protein-Anteils des Stickstoff enthaltenden Polysaccharids zeigte, daß der Protein-Anteil der Substanz aus Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Prolin, Glycin, Alanin, Cystin, Valin, Methionin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin, lysin, Histidin und Alginin besteht. Unter diesen Resten überwiegen

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die Asparaginsäure, das threonin, die Glutaminsäure, das Glycin, das Alanin, das Valin und das Leucin und sie machen mehr als 70 % äer gesamten Aminosäuren aus.

( 6 ) Pr ot onen-ke rnmagnet is ehe s _Ee sonanz ε j>ekt rum_

Zur Bestimmung des Verhältnisses zwischen den Saccharid- und Protein-Anteilen in dem Stickstoff enthaltenden PoIysaccharid sowie der Saccharidbindungen darin wurde eine HMR-Absorptionsspektroskopie durchgeführt. Das HMR-Absorptionsspektrum der Probe wurde bei 100 MHz unter Verwendung von schwerem Wasser als Lösungsmittel und B"atrium-2,2-dimethyl-2-silanopentan-5-sulfonat (D.S.S.) als internem Standard gemessen. Wie in der Pig. 2 gezeigt, wurden Absorptionen festgestellt bei 0,9 +, 0,2 - 1,2 +. 0,2 ppm, 2,0 _+ 0,2 ppm, 4,5 +_ 0,2 ppm, 4,7 _+ 0,2 ppm, 5,0 +_ 0,2 ppm bzw. 5,4 ± 0,2 ppm, und eine breite Absorptionsbande war bei 3»0 bis 4,4 ppm zu erkennen. Der Protein-Anteil wurde untersucht, wobei man annahm, daß der Bereich von 0,5 bis 2,5 PP^ &it der Protonenintensität des Protein-Anteils zusammenhängt und daß der Bereich von 2,5 bis 6,0 ppm mit der Protonenintensität des Saccharids zusammenhängt· Der Protein-Anteil wurde zu weniger als 40 % bestimmt. Unter der Annahme, daß der Bereich von 4,4 bis 4,9 ppm mit den β-Bindungen des Saccharids und der Bereich von 4,9 bis 5^ PP^m mit den CL-Bindungen zusammenhängt, wurde ihr Verhältnis ( A /o- )bestimmt, wobei gefunden wurde, daß es innerhalb des Bereiches von 85/15 bis 40/60 liegt.

(7) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des erfindungsgemäß verwendeten _? Stickstoff enthaltenden Polysaccharide, bestimmt durch Ultrazentrifugieren, liegt innerhalb des Bereiches von 5000 bis

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300.000.

Akute Toxizität

Es wurde ein Ölest durchgeführt mit Mäusen vom Stamm ICE-JCL, die 4· bis 5 Wochen alt waren und ein Gewicht von 21 "bis 24- g hatten, und mit Ratten vom Stamm Donryu, die 4 bis 5 Wochen alt waren und ein Gewicht von 100 bis 150 g hatten. Die in einer physiologischen Kochsalzlösung gelöste Substanz wurde auf die nachfolgend angegebenen vier Arten verabreicht: intravenös, subkutan, intraperitoneal und oral. Die generellen Symptome, der Tod und die Änderung des Körpergewichts der Versuchstiere wurden innerhalb eines Zeitraums von 7 Tagen beobachtet und danach wurden sie getötet und einer Autopsie unterworfen. Dabei wurde gefunden, daß soxvohl bei den Hatten als auch bei den Hausen kein Todesfall auftrat, selbst bei der höchsten Dosis, wie sie in der nachfolgenden Tabelle I angegeben ist, nicht. Die Bestimmung der IjD,-q war praktisch unmöglich, weil keines der Tiere in dem Versuch starb.

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Tabelle I

Tier	Art der Verabrei chung	^LB50	(mg/kg)
	intravenös	weiblich.	männlich
Maus	subkutan intraperitoneal	>13OO	>1300
	oral	>5000 >5000	>5000 >5000
	intravenös	> 20000	>20000
Ratte	subkutan intraperitoneal	>600	>600
	oral	>5000 >5000	>5000 >5000
>20000	>20000

Nachfolgend wird der Effekt des Stickstoff enthaltenden Polysaccharide (nachfolgend einfach als erfindungsgemäß verwendete Substanz bezeichnet) auf die Förderung der Arzneimittelempfindlichkeit von arzneimittelresistenten Bakterien, die gegen Antibiotika resistent geworden sind, beschrieben.

Bei den Antibiotika, die gegenüber den arzneimittelresistenten Bakterien ihre Wirkung xiieder aufweisen, wenn sie mit der erfindungsgemäß verwendeten Substanz kombiniert werden, handelt es sich um solche, die von Schimmelpilzen, Bakterien, Actinomyceten und dergleichen abgeleitet sind .,und typische Beispiele für solche Antibiotika sind folgende:

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Penicillin G (nachfolgend abgekürzt mit PG) Streptomycin (nachfolgend abgekürzt mit SH) Kanamycin (nachfolgend abgekürzt mit EM) Chloramphenicol (nachfolgend abgekürzt mit CP) Tetracyclin (nachfolgend abgekürzt mit TC) Erythromycin (nachfolgend abgekürzt mit EM) Aminobenzy!penicillin (nachfolgend abgekürzt mit IBPC) Cephaloridin (nachfolgend abgekürzt mit CES) Colistin (nachfolgend abgekürzt mit CL)

Die erfindungsgemäß verwendete Substanz (nachfolgend gelegentlich auch als erfindungsgemäße Substanz bezeichnet) hat die Wirkung, daß sie die Arzneimittelempfindlichkeit der nachfolgend angegebenen arzneimittel-resistenten Bakterien gegenüber den Antibiotika fördert: Escherichia coli
Streptococcus faecalis
Staphylococcus aureus
Enterobacter aerogenes
Salmonella enteritidis
Shigella sonnei
Klebsieila pneumoniae
Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa.

Die Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz in bezug auf die

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Förderung der Arzneimittelempfindlichkeit von arzneimittelresistenten Bakterien vrarde auf die nachfolgend beschriebene Weise bestätigt.

Arzneimittel-resistente Bakterien wurden auf die nachfolgend beschriebene Weise hergestellt durch die Konzentrationsgradient en-Plattenkultivierung (vergleiche "Chemotherapeutics and Resistant Bacteria", 1970, von Chikara Watanabe, Asakura Shoten). Es wurden Agarplatten mit einem Arzneimittelkonzentrationsgradienten innerhalb des Bereiches von 10 bis 100 μ g/ml hergestellt und die Bakterien jedes zu testenden Stammes wurden aufgestrichen oder aufgeschmiert. Diese Platten wurden mehrere Tage lang bei 37° C gehalten und die Kolonie, die sich in dem Hochkonzentrationsbereich gebildet hatte, wurde isoliert und erneut auf ähnliche Weise in die Platten inokuliert. Dieser Vorgang wurde mehrere Haie wiederholt zur Gewinnung von Bakterienstämmen, die gegenüber den jeweiligen Arzneimitteln resistent waren.

Die Arzneimittelempfindlichkeit der arzneimittel-resistenten Stämme und diejenige der Originalstämme (der empfindlichen Stämme) wurden an Hand der minimalen Wachstumshemrakonzentration (nachfolgend abgekürzt mit MIC) nach dem Standardverfahren der Japanese Chemotherapeutical Association (vergleiche "Chemotherapy", Band 22, Kr. 6, 1126 (1974), äes MIC Determination Method Reform Committee) miteinander verglichen. Insbesondere wurden doppelt verdünnte Systeme jedes Arzneimittels hergestellt und sie wurden mit dem Herzinfusionsagar-Medium (Nippon Eiyo Kagaku Co., Ltd.) gemischt zur Herstellung der Agar-Platten. Dann wurde eine ösenfüllung jedes Stammes, der bei 37°C in einer Crypto-Soja-Bouillon (Nippon Eiyo Kagaku Co., Ltd.) 18 Stunden lang kultiviert worden war,

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auf jede der Platten auf ge stricken und nach. 18-stündiger Kultivierung bei 37°C wurde das Wachstum des Stammes auf jeder Platte untersucht.

Um die Änderung der EHC bei jedem resistenten Stamm durch die kombinierte Verwendung der erfindungsgemäßen Substanz und der Antibiotika (derjenigen, die ihre Wirkung auf die Bakterienstämme verloren haben) zu erkennen, wurde das gleiche Yerfahren wie oben durchgeführt, wobei diesmal jedoch zusätzlich noch 10 bis 1000 ,αg/ml der erfindungsgemäßen Substanz in die Systeme eingemischt wurden, und der MIC-Wert wurde nach dem vorstehend erwähnten Agarplattenverfahren bestimmt.

Die HEG wurde erkennbar herabgesetzt auf die Hälfte des Wertes vor der Zugabe oder auf weniger durch Zugabe der erfindungsgemäßen Substanz. Die Zugabemenge der erfindungsgemäßen Substanz beträgt mehr als 10 ug/ml, vorzugsweise mehr als 100 yUg/ml. Der pH-Wert des Mediums wurde bei 7,2 _+ 0,1 gehalten, so daß die MC durch den pH-Wert des Hediums nicht beeinflußt wird. Es wurde auch vorher an Hand des Agarverdünnungs-Kultivierungsverfahrens festgestellt, daß die erfindungsgemäße Substanz selbst keine antibakterielle Aktivität gegenüber den getesteten Bakterienstämmen aufwies.

Der therapeutische Test für Infektionserkrankungen wurde wie folgt durchgeführt:

Eine Maus vrurde intraperitoneal mit 1 χ 10⁸ Zellen der arzneimittel-resistenten Bakterien geimpft und 1 bis 3 Stunden später wurden 10 bis 1000 mg/kg (Körpergewicht der Maus) Arzneimittel und 1 bis 10 mg/kg der erfindungsgemäßen Substanz

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intraperitoneal oder oral verabreicht. Zur Bestimmimg der Überlebensrate zur Bewertung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Substanz wurden nach der Verabreichung 7 Tage lang tägliche Beobachtungen durchgeführt. In diesem Falle wurde gefunden, daß die wirksame Dosis der erfindungsgemäßen Substanz vorzugsweise mehr als 10 mg/kg bei der intraperitonealen Verabreichung und mehr als 100 mg/kg bei der oralen Verabreichung betrug. Sie war höher als 40 %. Dadurch wurde sichergestellt, daß die erfindungsgemäße Substanz in der Lage ist, die therapeutische Wirkung nicht nur bei Invitro-Versuchen, sondern auch in der Chemotherapie der getesteten Infektionserkrankungen zu verbessern.

Die erfindungsgemäße Substanz weist auch eine extrem niedrige akute Toxizität auf und sie kann auf verschiedene Arten verabreicht iirerden, beispielsweise durch intraperitoneale Injektion, durch dermale Verabreichung, durch orale Verabreichung und durch intrarektale Verabreichung,, Die erfindungsgemäße Substanz kann auch mit einem Arzneimittel gemischt werden im Verlaufe der Arzneimittelherstellung oder sie kann einzeln verabreicht werden.

Wenn die Substanz zu Tabletten, Körnchen, Pulver, Kapseln oder dergleichen für die orale Verabreichung verarbeitet wird, kann die Zusammensetzung eines solchen Präparats Zusätze des Typs, wie er allgemein in Arzneimittelpräparaten verwendet wird, wie z. B. Bindemittel, Einschlußmittel, Hilfsmittel, Gleitmittel, Desintegrationsmittel, Netzmittel und dergleichen, enthalten. Wenn die Substanz in Form einer Flüssigkeit für die orale Verabreichung verx^endet wird, kann sie zu einem Präparat in Form eines internen flüssigen Arzneimittels, wie z. B. zu einer Schüttelmischung, zu einer

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Suspension, zu einer Emulsion, zu einem Sirup oder dergleichen;, verarbeitet werden oder sie kann zu einem Trockenprodukt verarbeitet werden, das unmittelbar vor der Verwendung aufgelöst wird. Solche flüssigen Präparate können auch Zusätze und/oder Konservierungsstoffe des Typs enthalten, wie sie üblicherweise für Arzneimittelpräparate verwendet werden. Die Insektionslösungen können Zusätze, wie Stabilisatoren, Puffer, Konservierungsmittel, Isotoner und dergleichen, enthalten und sie können in Form von Einheitsdosisampullen oder in Form von Mehrfachdosisbehältern auf den Markt gebracht werden. Die vorstehend beschriebenen Zubereitungen können auch in Form einer wässrigen Lösung, Suspension, in Form einer Lösung oder Emulsion in einem Öl oder in einem wässrigen Träger vorliegen, während die aktive Komponente in Form eines Pulvers vorliegen kann, das unmittelbar vor der Vervrendung mit einem geeigneten Träger, z. B. sterilisiertem, keimfreiem Wasser, aufgelöst wird. Wenn die Substanz in Form einer Salbe oder Creme**verwendet wird, kann sie eine öl- oder Fettbasis, eine Emulsionsbasis, eine wasserlösliche Basis, ein Konservierungsmittel oder dergleichen enthalten.

Die Erfindung wird zur weiteren Erläuterung der außergewöhnlichen erfindungsgemäßen Effekte an Hand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1

Es wurde ein flüssiges Medium der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung hergestellt:

+) (inunction)

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Pepton	5 g
Hefeextrakt	3 g
KH₂PO₄	0,3 g
TT ΤΤΠ/'Λ J\.^n,f7t, 1 ■.	0,3 g
MgSO₄* 7H₂O	0,3 g
Glucose	50 g
Wasser	1 1
pH-Wert 6,0

Ein aliquoter Anteil von I50 ml dieses Mediums wurde in jede von 100 konischen Kolben mit einer Kapazität von 1 1 eingeführt und nach dem Verschließen jedes Kolbens mit einem Baumwollpfropfen wurde das flüssige Medium 30 Minuten lang bei 120^oC sterilisiert und dann auf übliche Weise mit den getrennt davon kultivierten Schrägagar-Mycelen von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. CM-105-Stamm. (!Perm. Ees. Inst. Deposit Nr. EEEM-P-24-16) inokuliert, woran sich eine 29-tägige stationäre Kultivierung bei 25 bis 27°C anschloß. Die auf diese Weise erhaltene Kultur auf schlämmung (Kulturbrühe), wurde in einem Trommeltrockner vom Doppeltrommeltyp getrocknet, wobei man 4-51 g eines trockenen Produkts erhielt. I50 g dieses trockenen Produktes wurden zerkleinert und mit einer 0,1 η Natriumhydroxidlösung bei einer Temperatur von 95 bis 98°C unter Normaldruck 3 Stunden lang extrahiert unter Verwendung eines Extraktors aus rostfreiem Stahl. Die dabei erhaltene alkalische Extraktlösung wurde neutralisiert und filtriert und dann wurde das IPiltrat auf 500 ml eingeengt. Diese konzentrierte Lösung wurde dann in einen Cellophanfilm eingekapselt und 90 Stunden lang in fließendem Wasser einer

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Dialyse unterworfen. Das dabei erhaltene Dialysat wurde unter vermindertem Druck weiter eingeengt und sprühgetrocknet, wobei man 19» 5 S pulverförmiges Produkt erhielt.

Zur Bestimmung der Eigenschaften dieses pulverförmigen Produkts wurde eine Probe davon einer Elementaranalyse unterworfen unter Verwendung eines CHIT-CORDER MT-2 Analysators (Yanagimoto Seisakujo Co., Ltd.), wobei erhalten wurde, daß sie 4-2,1 % Kohlenstoff, 6,9 % Wasserstoff und 5,8 % Stickstoff enthielt. Die Bestimmung des spezifischen Drehvermögens wurde mit einer 0,25%igen wässrigen Lösung der Probe unter Verwendung eines YAlTACO-OR-50-Hodells (Yanagimoto Seisakujo Go·, Ltd.) durchgeführt. Das Ergebnis zeigte, daß das spezifische Drehvermögen des Produkts +12° betrug.

Zur Bestimmung der Saccharidzusammensetzung des Produktes wurden 10 mg der Probe zu einer 3/öigen methanolischen Chlorwasserst offsäurelösung zugegeben zur Durchführung einer 16-stündigen Methanolyse bei 100⁰C. Der Reaktant wurde nach dem Neutralisieren der Chlorwasserstoffsäure mit Silbercarbonat bei Raumtemperatur abfiltriert und das dabei erhaltene FiI-trat wurde eingeengt und zur Trockne eingedampft. Das feste Produkt wurde dann in 0,5 ml Pyridin gelöst und es wurden 0,2 ml Hexamethyldisilazan und 0,3 ml Trimethylchlorsilan zugegeben, die Mischung wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen, um eine Trimethylsilylierung zu bewirken. Dann wurde das Produkt in Chloroform gelöst und nach dem Abwaschen von überschüssigem Reagens und nach dem Entwässern wurde das Filtrat zur Trockne eingedampft. Dieses Produkt wurde dann in Tetrachlorkohlenstoff gelöst und einer Gaschromatographie unterworfen. Das Ergebnis zeigte, daß es 70,5 % Glucose, 3,8 % Galactose, 10,3 % Mannose, 5,4 % Xylose

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und 10,0 % Fucose enthielt.

Zur Bestimmung der Proteinzusammensetzung des pulverförmigen Produktes wurde eine Probe davon einer Amino säure analyse unterworfen unter Anwendung eines normalen Verfahrens. Als Ergebnis erhielt man die folgende Zusammensetzung: 15 % Asparaginsäure, 8 % Threonin, 6 % Serin, 14 % Glutaminsäure, 4 % Prolin, 8 % Glycin, 10 % Alanin, 4 % Isoleucin, 6 % Leucin, 1 % Tyrosin, 4 % Phenylalanin, 2 % Tryptophan, 2 % Lysin, 3 % Al ginin, 4 % Ammoniak und 1 % H-Glucosamin sowie eine Spur Histidin.

Zur Bestimmung der NMR-Absorption wurde schweres Wasser als Lösungsmittel verwendet, wobei DSS als interner Standard verwendet wurde, und zur Eliminierung irgendeines möglichen Einflusses von restlichem leichtem Wasser in schwerem Wasser wurden die Werte verwendet, die einer Korrektur unterworfen worden waren, die auf der Basis der angenommenen Lorenz-Kurve durchgeführt wurde. Unter diesen Bedingungen wurde das Verhältnis des Saccharid-Anteils zu dem Protein-Anteil bestimmt, wobei man annahm, daß die Absorption bei 0,5 "bis 2,5 ppm auf das Proton in dem Protein-Anteil und die Absorption bei 2,5 bis 6,0 ppm auf das Proton in dem Saccharid-Anteil zurückzuführen war. Das dabei erhaltene Verhältnis von Saccharid zu Protein betrug 89/11. Es wurde auch das Verhältnis von /5/qL bestimmt, wobei man annahm, daß eine Absorptionsbande bei 4,4 bis 4,9 ppm mit den β -Bindungen des Saccharide und eine Absorptionsbande bei 4,9 bis 6,0 ppm mit den CL-Bindungen in Zusammenhang steht. Dieses Verhältnis betrug 65/35·

Das Molekulargewicht wurde bestimmt durch Ultrazentrifugieren und dieses wurde durchgeführt unter Anwendung des

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Sedimentationsgleichgewichtes und des synthetischen Grenzflächenmusters unter Verwendung eines optischen Interferenzsystems unter den nachfolgend angegebenen Bedingungen: Konzentration der Probe 0,3 %\ Lösungsmittel M/10 KGl; Temperatur 25⁰C; Flüssigkeitssäule 1,7 mm; und Drehzahl 22000 UpM bei einer Meßdauer von 5 Stunden. Das dabei erhaltene durchschnittliche Molekulargewicht betrug 100.000.

Test zur Bestimmung des Effektes in bezug auf die Förderung der Arzneimittelempfindlichkeit der arzneimittel-resistenten Bakterien, die gegen Antibiotika resistent geworden waren:

(1) SiEStellliSS-yoSr.SSSneimittel-resistenten__Bakterien

Unter Anwendung der vorstehend erwähnten Konzentrationsgradienten-Plattenkultivierung unter Verwendung von Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Klebsiella pneumoniae und Pseudomonas aeruginosa wurden Proben von arzneimittel-resistenten Bakterien hergestellt. Die MIG-Verte der ursprünglichen Bakterien und diejenigen der Bakterien, die gegenüber den Arzneimitteln resistent geworden waren, sind in der folgenden Tabelle II zus ammengefaßt.

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	Tabelle II	CL	Minimale Wachs turnsnemmkonz ent ra tion MIC ( /Xg/ml)	resistenter Stamm
			ursprünglicher Stamm	12,5 25 25 12,5 100 <
Bakterien	Anti biotika		0,025 3,1 0,8 0Λ 1,6	25
Staphylococcus aureus	PC CP TC SM		0,4-	OOOOIAIA OOOlACVlCVl I V VCVJ
Strept ο c ο c cus faecalis	TC	12,5 3,1 6,3 1,6 3,1 3,1 100 <	100
Escherichia coli	PC SM KM CP TC CER EM	3,1	100 < ' 12,5 100 < 12,5
Enterobacter aerogenes	KM	6,3 0,8 25 1,6 100 <	50
Salmonella enteritidis	PC CP SM TC EM	3,1	1OO< 100 25 25 1OO<
Shigella sonnei	KM	6,3 1,6 0,8 1,6 12,5	25
Klebsiella pneumoniae	PC SM CP TC EM	0,8	200
Proteus mirabilis ABPC	12,5
Pseudomonas aeroginosa

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Die tHC-Werte von PG wurden errechnet unter der Annahme, daß 1667 U (Einheiten) = 1 mg;

die MC-Werte von CL wurden errechnet unter der Annahme, daß 30.000 U (Einheiten) = 1 mg.

(2) Effekt der Förderung der Arzneimittelempfindlichkeit der arzneimittel-resistenten Bakterien

Zur Bestimmung der Änderung der HIC-Werte der jeweiligen arzneimittel-resistenten Stämme durch gemeinsame Verwendung der erfindungsgemäßen Substanz und verschiedenerAntibiotika (solcher, die für die Erzielung von resistenten Bakterien verwendet worden waren) wurde die erfindungsgemäße Substanz dem Kulturmedium in Hengen von 10 bis 1000 /UL g/ml zugesetzt und die MC-Werte wurden nach dem Agarplattenverfahren bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III zusammengefaßt.

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	Tabelle III	Konzentra	Minimale Waehstums-	zuge
		tion der er	hemmkonzentration	geben*
Resistenter	Arznei	findungsge	MIC ( /J.g/ml)
Bakterien-	mittel	mäßen Sub	nicht-zu-
stamm	(Anti	stanz (/ig/ml)	gegeben**	1,6
	biotika)			6,3
				3,2
Staphylococcus		1000	12,5	3,2
aureus		100	25
PC-resistent	PC	100	25
CP-resistent	CP	1000	12,5	6,3
TC-resistent	TC
EM-re si stent	EM			25
Streptococcus		100	25	50
faecalis				12,5
TC-resistent	TC	1000	100	6,3
Escherichia coli		1000	200	12,5
SM-resistent	SM	100	50
KH- "	KM	100	25
CP- "	CP	10	25	12,5
TG- "	TC
CER- "	CER
Ent erob act er		1000	100	3,2
aerogenes				6,3
KM-resistent	ZM
Salmonella		100	12,5
enteritidis		100	12,5	25
CP-resistent	CP			6,3
TC- "	TC			12,5
Klebsiella		1000	100
pneumoniae		100	25
SM-resistent	SM	100	25
CP- "	CP
TC- "	TC

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Tabelle III (Fortsetzung)

Resistenter Bakterienstamm

Arzneimittel (Antibiotika)

Konzentration der erfindungsge-
Sub-

Minimale Wachstumshemmkonz entration MIC (Mg/ml)
nicht-zu- zuge-

stanz £c/g/ml) gegeben** geben"

Shigella sonnei KM-resistent ZM

Proteus mirabilis

AEPC-resistent ABPG

Pseudomonas aeruginosa

CL-resistent GL

1000

200

12,5

100

Fußnoten: * Die erfindungsgemäße Substanz wurde zu dem Kulturmedium zugegeben

** Die erfindungsgemäße Substanz wurde dem Kulturmedium nicht zugesetzt

Beispiel 2

Ein therapeutischer Test für Infektionserkrankungen wurde mit 5 Gruppen von männlichen Mäusen vom ICR-JCL-Stamm (die jeweils ein Gewicht von 22 + 1 g hatten) durchgeführt, wobei jede Gruppe aus 10 Mäusen bestand, unter Verwendung des gegen Penicillin G resistenten Stammes von Staphylococcus aureus, wie er in Beispiel 1 erhalten worden war. Der gegen Penicillin G resistente Stamm von Staphylococcus aureus, der in

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einem Trypto-Soda-Agar-Medium (ITippon Eiyo Kagaku Co., Ltd.) 18 Stunden lang bei 37°C kultiviert worden war, wurde in einer Trypto-Soja-Bouillon (ITippon Eiyo Kagaku Co. Ltd.) suspendiert, die 5 °/° Mucin enthielt, und 0,25 ml dieser Suspension wurden intraperitoneal in jede Maus inokuliert. Das Inokulum wurde so kontrolliert, daß es sich dabei um 5 χ 10 Zellen pro Maus handelte. Zwei Stunden nach der Inokulierung wurde Penicillin G intraperitoneal verabreicht in einer Dosis von 2,5 x 10 U/kg (Körpergewicht der Maus) bzw. 5 χ 10 U/kg» während die nach dem Verfahren des Beispiels 1 hergestellte erfindungsgemäße Substanz ebenfalls intraperitoneal in einer Dosis von 100 mg/kg (Körpergewicht der Maus) verabreicht wurde. Die auf diese Weise behandelten Mäuse wurden nach der Verabreichung 7 Tage lang jeden Tag beobachtet und die Überlebensrate der inokulierten Mäuse wurde ermittelt. Die Ergebnisse sind in der ]?ig. 3 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, daß durch die kombinierte Verwendung der erfindungsgemäßen Substanz, d. h. des Stickstoff enthaltenden Polysaccharide (HP), die Heilwirkung von Penicillin G verbessert werden kann bei gleichzeitiger Erhöhung der Empfindlichkeit der resistenten Bakterien in vivo gegenüber Penicillin G.

Beispiel 3

Es wurde ein ähnlicher therapeutischer Test für Infektionserkrankungen mit 5 Gruppen von männlichen ICR-JCX-Mäusen (die jeweils ein Gewicht von 22 J₁ 1 g hatten und wobei jede Gruppe aus 10 Mäusen bestand) durchgeführt unter Verwendung von gegen Tetracyclin resistentem Escherichia coli und der nach dem Verfahren des Beispiels 1 hergestellten erfindungsgemäßen

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Substanz. 0,25 ^l einer Trypto-Soja-Bouillon-Suspension (vergleiche Beispiel 2), die 5 % Mucin enthielt, der gegen Tetracyclin resistenten Bakterien, hergestellt wie in Beispiel 1, wurden intraperitoneal in jede Maus inokuliert. Das Inokulum betrug 5 ^c 10 Zellen pro Maus. 2 Stunden nach der Inokulierung wurde Tetracyclin oral in Dosen von 80 mg/kg (Körpergewicht der Maus) bzw. 160 mg/kg verabreicht bei gleichzeitiger oraler Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz in einer Dosis von 100 mg/kg. Die Ergebnisse sind in der Fig. 4· der beiliegenden Zeichnungen an Hand der Überlebensrate während der 7-tägigen Periode nach der Verabreichung dargestellt. Daraus geht hervor, daß durch die kombinierte Verwendung der erfindungsgemäßen Substanz mit Tetracyclin eine weit höhere Heilwirkung erzielt werden kann als wenn Tetracyclin allein verwendet wird. Da weitgehend die gleiche Wirkung bei der oralen Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz wie bei ihrer intraperitonealen Verabreichung erzielt wird, kann die erfindungsgemäße Substanz neben ihrer hohen Wirksamkeit als eine solche bezeichnet werden, deren - Anwendungsbereich verbreitert ist.

Beispiel 4-

Gegen Penicillin G resistente Staphylococcus-aureus-Bakterien

wurden in einer Menge von 5 x 10 Zellen/Maus in 5 Gruppen (zu 10 Mäusen pro Gruppe) von männlichen ICE-JCL-Mäusen (mit einem Gewicht von 22 £ 1 g) nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren inokuliert, woran sich eine intraperitoneale Verabreichung von 2,5 χ 10 U/kg Penicillin G und von 1, 10, 100 und 1000 mg/kg der erfindungsgemäßen Substanz an 4 Gruppen (die gleichen wie in Beispiel 1) anschloß. Bei der

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täglichen Beobachtung dieser Mäuse innerhalb eines Zeitraums von 7 Tagen nach der Verabreichung erhielt man die in Pig. 5 dargestellten Ergebnisse.

Beispiel 5

Ein ähnlicher therapeutischer Test für Infektionserkrankungen wurde durchgeführt unter Verwendung von 6 Gruppen von männlichen ICR-JCL-Mäusen, wobei jede Gruppe aus ΊΟ Mäusen bestand, die mit 5 x 10 Zellen der gegen Tetracyclin resistenten Escherichia coli-Balrberien (Maus) inokuliert vrurden unter Anwendung der in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren. 2 Stunden nach dem Inokulieren wurde Tetracyclin in einer Dosis von 80 mg/kg (Körpergewicht der Maus) verabreicht bei gleichzeitiger oraler Verabreichung der in Beispiel 1 verwendeten erfindungsgemäßen Substanz in den jeweiligen Dosen von 0,10, 100, 1000 und 10.000 mg/kg, wobei die sechste Gruppe als Eontrollgruppe diente. Die Mäuse wurden bis zum siebten Tag nach der Verabreichung täglich beobachtet und die während der Beobachtung erzielten Ergebnisse sind in der Fig. 6 dargestellt.

Beispiel 6

Der Stamm CM-I5I von Coriolus hirsutus (Fr.) Quel (Perm. Res. Inst. Deposit. Ur. PEEM-P 27II) wurde wie in Beispiel 1 kultiviert und dann extrahiert und gereinigt, wobei man 17,5 S einer pulverförmigen Substanz erhielt. Die Eigenschaften dieser Substanz, bestimmt nach den in Beispiel 1 angegebenen Verfahren, waren folgende:

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(1) Elementaranalyse: 4-3,7 % Kohlenstoff, 6,4 % Wasserstoff,

und 5,5 % Stickstoff

(2) Spezifisches Drehvermögen: £^] jp = +30°

(3) Saccharidzusammensetzung: 79 % Glucose, 15 % Mannose, 2 %

Xylose, 4 % Galactose und Spuren Fucose

(4) Proteingehalt: 33 %

(5) Verhältnis der Saceharidbindungen (/3 /öl ): 71/29

(6) Durchschnittliches Molekulargewicht: 95 000

(7) Zusammensetzung des Protein-Anteils: 15 % Asparaginsäure,

9 % Threonin, 5 % Serin, 14 % Glutaminsäure, 6 % Prolin, 9 % Glycin, 9 % Alanin, 7 % Valin, 1 % Methionin, 5 % Isoleucin, 6 % leucin, 2 % Tryptophan, 4 % Phenylalanin, 2 % Lysin, 3 % Arginin, 2 % Ammoniak, 1 % N-Glucosamin und jeweils Spuren an Cystin, Tyrosin und Histidin.

Dann wurde das nachfolgend beschriebene Experiment mit der erfindungsgemäßen Substanz mit den oben angegebenen Eigenschaften durchgeführt. ·

Gegen Chloramphenicol resistente Salmonella enteritidis wurden wie in Beispiel 1 hergestellt. 0,25 ^ml einer Suspension der obengenannten, gegen Chloramphenicol resistenten Bakterien in einer Trypto-Soja-Bouillon (vergleiche Beispiel 2), die 5 % Mucin enthielt, wurden intraperitoneal in jede Maus von 5 Gruppen von Mäusen inokuliert, wobei jede Gruppe aus 10 Mäusen bestand. Das Inokulum betrug 1 χ 10 Zellen/Maus. 25 Stunden nach dem Inokulieren wurden 50 mg/kg Chloramphenicol intraperitoneal verabreicht. Einer weiteren Gruppe wurden 500 mg/kg der erfindungsgemäßen Substanz oral verabreicht. Die Überlebensrate 5 Tage nach der Verabreichung betrug 40 %

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in der Gruppe, der nur Chloramphenicol verabreicht worden war, während sie 80 % in der Gruppe betrug, welcher das Antibiotikum in Kombination mit der erfindungsgemäßen Substanz verabreicht worden war.

Beispiel 7

Nach dem Verfahren des Beispiels 1 wurden gegen Streptomycin resistente Klebsiella pneumoniae hergestellt und es wurden 0,25 ral einer Irypto-Soja-Bouillon (vergleiche Beispiel 2), die 5 % Hucin und diese Bakterien enthielt, intraperitoneal in 3ede Maus von 2 Gruppen von Musen inokuliert, wobei 3ede

Gruppe aus 10 Mäusen bestand, in einer Menge von 1 χ 10 Zellen pro Maus. 3 Stunden nach dem Inokulieren wurden 100 mg/kg Streptomycin intraperitoneal verabreicht. Einer weiteren Gruppe wurden 120 mg/kg der erfindungsgemäßen Substanz, hergestellt wie in Beispiel 6 angegeben, intraperitoneal verabreicht. Die Überlebensrate 6 Tage nach der Verabreichung betrug 50 % bei der Gruppe, der nur Streptomycin verabreicht worden war, sie betrug jedoch 80 % bei der Gruppe, welcher die erfindungsgemäße Substanz in Kombination mit Streptomycin verabreicht worden war.

Beispiel 8

0,25 ml einer Suspension von gegen Colistin resistenten Pseudomonas aeruginosa, die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 angegeben in Trypto-Soja-Bouillon (vergleiche Beispiel 2), die 5 % Mucin enthielt, kultiviert worden waren, wurden intraperitoneal in jede Maus von 2 Gruppen von

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männlichen ICR-JCL-Mäusen (Körpergewicht 22 + 1 g, 10 Mäuse in jeder Gruppe) in einer Menge von 1 χ 10 Zellen/Maus inokuliert· 2 Stunden nach dem Inokulieren wurden 190 mg/kg (1 jJLs - 30 U) Colistin intraperitoneal verabreicht. Die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 6 angegeben erhaltene erfindungsgemaße Substanz wurde in einer Dosis von I5OO mg/kg oral verabreicht. Die Überlebensrate 6 Tage nach der Verabreichung betrug 40 % in der Gruppe, der nur Colistin verabreicht worden war, und sie betrug 70 % in der Gruppe, in der die erfindungsgemäße Substanz in Kombination mit Colistin verabreicht worden war.

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Claims

MÜLLER-BORE · DEUFSL · SCHÖlV · HERTE L PATENTANWÄLTE DR. WOLFGANG MÜLLER-BORE (PATENTANWALT VON 1927 - 1975) DR. PAUL DEUFEL. D1PL.-CHEM. DR. ALFRED SCHÖN. DIPL.-CHEM. WERNER HERTEL, DIPL.-PHYS. \ S, April 1978 EDREHi KAGAEÜ EOGTO EiBUSHIEI EAISHA , Horidome-ch bashi, Cimo-k Tokyo / Japan Ho. 8, Horidome-cho 1~chome Hihonbashi, Cimo-ku Verwendung eines Stickstoff enthaltenden PoIysaccharids zur !förderung der Arzneimittelerapfindlichkeit von gegen Antibiotika resistenten Bakterien Patentansprüche

1. Verwendung eines Stickstoff enthaltenden Polysaccharide, das durch Extrahieren des Mycels von Basidpmyceten, die zu dem Genus Coriolus von Polyporaceae gehören, mit einem wässrigen Lösungsmittel erhältlich ist, zur Förderung der Arzneimittelempfindlichkeit von gegen Arzneimittel resistenten Bakterien, die gegen Antibiotika resistent geworden sind, das ein Molekulargewicht von 5000 bis 300.000, bestimmt durch Ultrazentrifugieren, aufweist, 4-2,0 bis 46,0 % Kohlenstoff, 5,3 bis 7,0 % Wasserstoff und 0,5 bis 8,0 % Stickstoff enthält, ein spezifisches Drehvermögen

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von O bis +50,0° aufweist, in Wasser gut löslich, in Aceton, Pyridin, Chloroform und Hexan jedoch, unlöslich.

ist, im Infrarotabsorptionsspektrum eine charakteristische

—1 — 1

Absorption bei 840 cm und 890 cm aufweist und bei dem das Verhältnis von Saccharid-Anteil zu Protein-Anteil in dem kernmagnetischen Eesonanzspektrum 62/38 bis 97/3 "beträgt.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Antibiotika um Streptomycin, Chloramphenicol, Penicillin G, Kanamycin, Aminobenzylpenicillin, Tetracyclin, Erythromycin, Cephaloridin und Colistin handelt.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den gegen Arzneimittel resistenten Bakterien um Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enteri-tidis, Klebsiella pneumoniae, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus faecalis, Proteus mirabilis und Enterobacter aerogenes handelt.

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