DE1642665C3 - Einheitliche Protease, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Zubereitung mit entzündungshemmender Wirkung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die in den Ansprachen definierten Gegenstände.

Von der Anmelderin wurde gefunden, daß ein von ihr isoliertes und als Serratia sp. E-15 bezeichnetes Bakterium, welches die Hinterlegungsbezeichnung ATCC 21074 erhalten hat, eine Protease mit starker proteolytischer Aktivität bildet Weitere Untersuchungen der Anmelderin haben ergeben, daß die Fähigkeit dieses Stammes zur Bildung der Protease unter ganz bestimmten Bedingungen erheblich gesteigert wird. Es erwies sich als möglich, die Protease in einer so hohen Reinheit zu gewinnen, daß sie für medizinische Zwecke sowie für Untersuchungen ihrer enzymatischen Eigenschaften verwendet werden kann. Aufgrund der Verfügbarkeit der durch Serratia ATCC 21074 gebildeten gereinigten Protease wurde ferner festgestellt, daß diese Protease ungewöhnlich hohe caseinolytische und fibrinolytische Aktivität hat und Tieren (einschließlich Menschen) ohire jeden nennenswerten Schaden und ohne Desaktivierung verabreicht werden kann, und daß diese Protease eine viel stärkere entzündungshemmende Wirkung hat als die bekannten entzündungshemmenden Mittel, wie z.B. Phenylbutazon.

Durch das Verfahren gemäß der Erfindung ist es möglich, die Protease leicht, in hoher Ausbeute und in einer so hohen Reinheit herzustellen, daß sie unbedenklich ihrer neuen Verwendung als entzündungshemmendes Mittel zugeführt werden kann.

Serratia sp. E-15 wurde von den Erfindern aus dem Intestinum einer Seidenraupe isoliert und zeigt die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften:

Mikrobiologische Eigenschaften von Serratia sp. E-15: Kurze Stäbchen von 0,8-1,Ox 1,2-1,8 μ. Keine Bildung von F.ndosporen. Beweglich mit Hilfe von Geißeln. Nicht säurefest. Gramnegativ.

Agarkolonien: Glatt, gewöhnlich kreisrund, gräulichweiß. Rosa Pigment kann in das Medium diffundieren, falls gebildet.

Brühe: Schnell trübe. Nach längerer Züchtung färbi sich die Flüssigkeit ros;i

Gelatine-Stichkultur: Schnelle schichtweise Verflüssigung.

Milch: Koagulierung. Peptonisierung.

Kasein: Hydrolysiert:

F.sculin: Hydrolysiert.

Harnstoff: Wenig hydrolysiert.

Stärke: Nicht hydrolysiert.

Arginin: Hydrolysiert.

Nitrite: Aus Nitraten gebildet.

Schwefelwasserstoff: Nicht gebildet

Indol: Nicht gebildet.

Ammoniak und Trimelhylamin: Gebildet.

Voges-Proskauer-Test: Positiv.

Methylrottest: Schwach,

Citrate: Als einzige Kohlenstoffquellc ausgenutzt.

Ammoniumsalze: Nicht als einzige Stickstoffquellc ausgenutzt.

Methylenblautest: Reduziert,

Cytochromoxydascrenktion: Negativ. Wuchst auf KCN-Medien.

Säurebildung aus Maltose, Saccharose, Cellobiose, Trehaloäe, Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Salicin, Glycerin, Mannit, Adonil und Inosit.

Keine Siiurebildung aus Stärke. Dextrin, Inulin, Raffinose, Lactose, Melibiose, Melezitose, Sorbose, Rhamnose, Arabinose, Xylose, Methylglucosid und Dulcit

Optimale Wachstumstemperatur: 30 C. Kein Wachstum bei 45 C. Salzverträglichkeit: Wachstum in 7,5%igem NaCI. Kein Wachstum in 8%igem NaCI. Katalase: Positiv.

Unterscheidungsmerkmale: Das Pigment aus diesem Organismus zeigt ein für Prodigiosin charakteristisches Spektrum mit einem Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 540 m;j. in einem sauren Medium. Das Pigment ist in Äthanol, Methanol und Wasser leicht löslich.

Gemäß Bergeys »Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage, 1957, zeigen diese mikrobiologischen Eigenschaften, dali die Bakterie E-15 folgende Zugehörigkeit hat:

Klasse	Schizomycetes
Ordnung	Eubacteriales
Familie	Enterobacteriaceae
Stamm	Serratieae
Gattung	Serratia

Von den Spezies, die gemäß Bergeys Manual zur Gattung Serratia gehören, ähnelt E-15 am meisten der Spezies Serratia piscatorum, jedoch kann E- f ^ nicht als S. piscatorium bezeichnet werden, da S. piscatorium Harnstoff nicht hydrolysiert und in einer 8-Stunden-Kultur Pigment bildet, während E-15 Harnstoff hydrolysiert und in einer 8-Stunden-Kultur kein Pigment bildet. Ferner ist das von E-15 gebildete Pigment verschieden von dem durch S. piscatorum gebildeten Pigment hinsichtlich der Wasserlöslichkeit. Der Stamm ist somit verschieden von den zur Gattung Serratia gehörenden bekannten Stämmen und wird in dieser Beschreibung als »Serratia sp. E-15« oder einfach als »E-15« bezeichnet.

Eine Probe von Serratia sp. E-15 ist bei der American Type Culture Collection, Maryland, USA, hinterlegt worden und erhielt die Hintcrlegungsnummer ATCC 21074.

Zur Züchtung von E-15 können übliche Kulturmedien für Serralia verwendet werden. Die Fähigkeit zur Bildung von Protease wird bei E-15 jedoch durch die Bestandteile der Kulturmedien, insbesondere durch die organische Slickstoffquclle., stark beeinflußt. Die Protease kann in einem Kulturmedium gebildet werden, das beliebige Quellen von assimilierbarem Stickstoff, z. B. Ammoniumsalze, Nitrate, Maisquellwasscr, Pcpton, Casein, Fleischextrakt, Sojubohnenmehl usw., enthält. Bei E-15 hat jedoch die gleichzeitige Verwendung von Milchcasein und Sojabohnenmehlexlrakt eine auffallende Steigerung der Protcasebildung zur Folge, wodurch es möglich ist. eine sehr aktive und gereinigte Protease in großen Mengen herzustellen. Der synergislische Effekt der gleichzeitigen Verwendung von Milchcasein und Sojabohnenmehlcxtrakt ist spezifisch, und der Effekt wird bei anderen Kombinationen nicht festgestellt.

SojabohnenmeMextrakl wird hergestellt, indem Sojabohnenmehl oder entfettetes Sojabohnenmehl mit Wasser bei Raumtemperatur (etwa 20 bis 25 c) etwa 30 Minuten unter Röhren extrahiert wird und die unlöslichen Bestandteile abfiltriert werden. In dieser Beschreibung bedeutet ».Y% (Gew./Vol.) Sojabohr.snj mehlextrakt« ein Produkt, das hergestellt wird, indem man XGewichtsteile Sojabohnenmehl oder entfettetes Sojabohnenmehl zu 100 Raumteilen Wasser gibt, das Gemisch bei Raumtemperatur etwa 30 Minuten rührt und das so behandelte Gemisch zur Entfernung der

in darin enthaltenen unlöslichen Bestandteile filtriert. Die nachstehend beschriebenen Versuche veranschaulichen die Vorteile der Verwendung von Milchcasein und Sojabohnenmehlextrakt hinsichtlich der Bildung der Protease. In dieser Beschreibung beziehen sich

π die Prozentangaben für die Bestandteile des Kulturmediums auf Gewicht/Volumen.

Versuch I

>(i Zehn Kulturmedien (A) bis (J) wurden hergestellt durch Zusatz von 2% Milchcasein und einer in Tabelle 1 genannten unterschiedenen Menge Sojabohnenmehlextrakt zu einem Grundrnedium (pH 7,0), das aus 1% Ammoniumphosphate 0,05% Kaliumchlo-

2-1 rid, 0,1% Natriumchlorid, 0,02% Calciumchloriddihydrat, 0,02% Magnesiumsulfatheptahydrat. 0,5% Sojabohn_fiöl und Wasser bestand. Serratia sp. E-15 ( ATCC 21074) wurde in jedem dieser 10 Kulturmedien 2 Tage bei 28 C unter Verwendung einer ro-

Hi tierenden Schüttelvorrichtung gezüchtet Die einzelnen Kulturbrühen wurden zur Entfernung der Zellen zentrifugiert, worauf die Proteaseaktivität jeder obenstehenden Lösung nach der Methode von Kunitz (J. Gen. Physiol. 30, 291, 1947) bei einem pH-

Ji Wert von 9 bei 37 C gemessen wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 genannt.

Eine Proteaseinheit(PE) wurde definiert als die Enzymmenge, die I ;xg-Äquivalent Tyrosin pro Minute bildet.

Tabelle 1	Menge Sojabohncn-	ProtcaseaktiviUit
Kultur	mehlextrakt
medium	(%)	(PU/ml)
	0	672
A	0,5	1460
B	1,0	3750
C	2.0	4170
D	5,0	4740
E	10,0	4370
F	15.0	3500
G	20.0	2880
Il	25,0	2180
I	30.0	2010
J

Versuch 2

Sieben Kulturmedien (K) bis (Q) wurden durch Zusatz von 2% Sojabohnenmehlextrakt und der in Taöelle 2 genannten unterschiedlichen Menge Milchcasein zürn Grundmedium hergestellt, das die im Test 1 genannte Zusammensetzung hcHe. Die Messung der Proteascaktiviliit wie im Versuch 1 hatte die nachstehend in Tabelle 2 genannten Ergebnisse.

Tabelle 2

^v ■' i

Kulturmedium

Menge Milchcaseiii

Proteascaktivitäl
ίΡΕ/ml)

928
1570
3750
4230
4250
4330
2120

Der synergislische Effekt zwischen Milchcascin und Sojabohncrirrtehlextrakt ergibt sich deutlich aus den Ergebnissen der Versuche 1 und 2 und ist am auffallendsten, wenn im Kulturmedium die Konzentration

K	0
L	0,5
M	1,0
N	2,0
O	5.0
P	10,0
0	15.0

an Sojabohnenmehlextrakt etwa 1 bis 15% beträgt. Dieser synergistische Effekt ist so spezifisch, daß er nicht festzustellen ist, wenn andere StickstofT-quellen außer Milchcasein zusammen mitSojabohnenmehlextrakt verwendet werden. Dies wird durch den Versuch 3 veranschaulicht.

Versuch 3

Zu einem wäßrigen Kulturmedium, das die gleiche Zusammensetzung wie das Grundmediuni in Test I hatte, wurde I % Sojabohnenmehlextrakt gegeben. Das Gemisch wurde in sechs gleiche Teile geteilt. Ein Teil diente als Vergleichsprobe, und die anderen 5 Teile wurden nach Zusatz von 1% einer weiteren Stickstoffquelle, nämlich Maisquellflüssigkeit, Gelatine, CaseinhydrolysatfCasaminosäure), Pepton bzw. Milchcasein, dem Test unterworfen. Die Züchtung und die Bestimmung der Proteaseaktivität wie in Versuch 1 führten zu den in Tabelle 3 genannten Ergebnissen. empfohlen, für die Bildung von Protease gemäß der Erfindung ein Medium zu verwenden, das Calciumchlorid und Phosphate, z. B. Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Atlnmoniumphosphat usw., enthält. Die bevorzugten Mengen liegen füf Calciumchlorid bei etwa 0,01 bis 0,05%, insbesondere bei etwa 0,02%, gerechnet als GaCI₂' 2H₂O, und für das Phosphat bei etwa 0,7 bis 1,5%, gerechnet als PO₄.

Die Kultivierung von E-15 wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt. In der Praxis wird E-15 vorzugsweise in einem wäßrigen Medium unter Schütteln oder in einem Tank unter Rühren und unter Belüftung kultiviert. Die Luft wird gewöhnlich vorzugsweise in einer Menge von etwa 0,5 bis 1 I/Min./1 wäßriges Medium zugeführt.

Die übrigen speziellen Kultivierungsbedingungen sind so aufeinander abzustimmen, daß die höchste Proteasebildung erzielt wird, jedoch wird im allgpfTieinsri wiihrsnd dsr Ku!>ivierunⁿ die Tpmnprainr bei etwa 25 bis 35 C und der pH-Wert des Mediums zwischen neunral (pH 6 bis pH 9), insbesondere bei 7 gehalten. Die maximale Bildung der Protease wird gewöhnlich nach einer Kultivierungsdauer von 15 bis 40 Stunden festgestellt.

Auf diese Weise wird die Protease durch E-15 während der Kultivierung gebildet und im Kulturmedium angereichert. Wenn die Proteaseaktivität im Medium höher ist als 3000 PU/ml, läßt sich die Protease sehr leicht isolieren, und die so erhaltene reine Protease hat hohe Aktivität. Die Abtrennung und Reinigung der Protease kann nach an sich bekannten, auf diesem Gebiet üblichen Methoden erfolgen, z. B. durch Ausfällung unter Verwendung eines Fällmittels, Ausfällung beim isoelektrischen Punkt, Aussalzen, Dialyse, Ionenaustauschchromalographie, Ge!-Filtration usw.

In dem folgenden Beispiel verhallen sich Gewichtsteile zu Raumteilen wie Gramm zu Milliliter.

Tabelle 3	Proteaseaktivität
Zusiil7liche SlickstofTquelle	(PE/ml)
	670
_	505
M aisquei !flüssigkeit	1090
Gelatine	1240
Caseinhydrolysat	1880
Pepton	3660
Milchcasein

WennMilchcaseinundSojabohnenmehlextraktbeidc in der optimalen Menge im Kulturmedium verwendet werden, ist die Verwendung anderer bestimmter Kohlenstoffquellen nicht notwendig. Es ist vielmehr zu empfehlen, keine andere Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Saccharose, Maltose oder Dextrin, zuzusetzen, weiä durch den Zusatz solcher Kohlenstoffquellen das Kulturmedium angesäuert wird und die Bedingungen für die Bildung einer hochaktiven Protease im angesäuerten Medium ungünstig sind.

Dem Medium werden gewöhnlich weitere Nährstoffe, z.B. Metallsalze, Phosphate, Vitamine und Wuchsfaktoren, zugesetzt Was diese zusätzlichen Nährstoffe anbelangt, so kann E-15 auf einem Kulturmedium wachsen, das die gewöhnlichen Nährstoffe für die Züchtung von Serratia enthält Es wird jedoch

_Af) Beispiel 1

Mit Serration sp. E-15 (ATCC 21074) werden 30 000 Raumteile eines Kulturmediums (pH 7) beimpft, das aus 1% Milchcasein, 1% Sojabohnenmehlextrakt, 1% (NH₄J₂HPO₄, 0,1% NaCI, 0,05% KCl, 0,02% CaCI₂-2H₂O, 0,02% MgSO₄ · 7H₂O, 0,3% Sojabohnenöl und Wasser besteht. Die Kultur wird 30 Stunden bei 28"C unter Rühren und Zuführung von Luft in einer Menge von 0,5 I/Min./1 Medium bebrütet. Die Pcoteaseaktivilät der obenstehenden Flüssigkeit der Kultur in verschiedenen Phasen während der Kultivierung ist nachstehend in Tabelle 4 angegeben.

Tabelle 4

Kullivierungs- pH-Wert des Proteaseaktivitäl

dauer Kulturmediums

Stcl.

(PE/m!)

0	7,09	_
dO 6	6,92	242
12	6,85	2640
18	6,90	3370
24	6,72	4060
30	6,50	3740

Nach einer Kuitivierungsdauer von 24 Stunden werden 5000 Raumteile der Kulturbruhe zentrifugiert, wobei 4800 Raumteile obenstehende Flüssigkeit er-

halten werden, der (NH₄J₂SQ₄ bis zu 66% Sättigung Zugesetzt wird, wobei sich ein Niederschlag bildet. Der erhaltene Niederschlag wird abgetrennt, in 100 Raumteilen Wasser gelöst und durch eine Cellophanmembran gegen destilliertes Wasser 2 Tage bei 5"C dyalisierl. 400Raumteile der so erhaltenen innen-Iösung werden der fraktionierten Fällung durch stufenweise^ Zusatz von Aceton unterworfen. Die Fraktion, die zwischen 40 und 60Vol.-% Aceton ausgefällt wird, wird durch Zentrifugieren abgetrennt und getrocknet, wobei ein rohes Enzympräparat erhalten ivird.

3 Gcw.-Teilc des rohen Enzympräparats werden in lOO Raumteilen destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird durch eine Cellophanmembran gegen eine 0,01-molarc Phosphatpufferlösung von pH 7,0 bei 5 C" 2 Tage dialysiert. 120 Raumteile der dialysierten Inneniösung werden durch eine Säule (Volumen etwa 1200 Teile) gegeben, die mit DÄAÄ-Cellulose gefüllt ist, die vorher mit einer 0.01 molaren Phosphatnufferlösung von pH 7,0 gepuffert worden ist, wobei das Enzym 2i> an der Säule adsorbiert wird. Das Enzym wird mit einer 0,1 molaren wäßrigen Natriumchloridlösung eluiert. Das Eluat wird fraktioniert, wobei jeweils Portionen von je lORaumleilen abgenommen werden. Zu 120 Raumteilen der enzymreichen Fraktion wird (NH₄J₂SO₄ bis zu 66% Sättigung gegeben, wobei sich eine Fällung bildet. Die Fällung wird abgetrennt und in 30 Raumteilen einer O.Olmolaren Phospatpufferlösung von pH 7,0 gelöst. Die Enzymlösung wird der Gelfiltration durch eine Säule von kleinkörnigem hydrophilem unlöslichem, durch Vernetzung von Polysaccharid-Dextrat erhaltenem Produkt (Volumen etwa 400 Teile) unterworfen, worauf wiederum mit (NH₄J₂SO₄ bis zu 66% Sättigung gefällt wird. Die erhaltene Fällung wird auch in diesem Fall 3 Tage durch eine Ceilophanmembran gegen destilliertes Wasser bei 5 C dialysiert. 55 Raumteile der Innenlösung werden lyophilisiert, wobei etwa 1 Gewichtsteil gereinigte Protease erhallen wird, die eine Proteaseaktivität von 4400 P/mg hat.

Die erfindungsgemäß auf die im Beispiel beschriebene Weise hergestellte Protease hat die folgenden Eigenschaften:

1) Das Enzym hat die Natur eines einheitlichen und einzelnen Proteins bei der Untersuchung durch zentrifugale Analyse. Die Sedimentationskonstante (S₂Ow), gemessen mit der Ultrazentrifuge, beträgt 3,8 S, woraus das Molekulargewicht mit etwa 6 ■ 10⁴ nach der Archibald-Methode bestimmt wird (W. J. Archibald, J. Phys. & Colloid Chem., 51, 1204, 1947).

2) Elementaranalyse: C: 47,39%, H: 7,18%, N: 15,18%.

3} Das UV-Äbsorptiofisspektnirn ist iri Fig. 1 dargestellt. Es zeigt die Kurve eines typischen Proteins mit einer maximalen Absorption bei einer Wellenlänge von 275 bis 278 πιμ und einer Schulter bei 290 πιμ.

4) Das Infrarot-Absorptionsspektrum ist in Fig.2 dargestellt Es zeigt starke Absorptionsbanden bei den folgenden Wellenlängen in μ: 3,0 (stark), 3,38 (mittel), 6,05 (breit, stark), 6,55 (breit, stark), 6,88 (schwach), 7,15 (breit, mittel), 8,12 (mittel) und 9,3 (breit, schwach).

5) Der isoelektrische Punkt, gemessen durch Papierelektrophorese, Hegt zwischen pH 5 und 6.

6) Die optimale Enzymaktivität zeigt das Produkt bei pH 8,5 bis 9,5, wie Fig. 3 zeigt, und bei einer Temperatur von 35 bis 45"C, wie Fig.4 zeigt

7) Die pl-l-Stäbilitäl ist in Fig. 5 dargestellt Hier zeigt die ausgezogene Linie die Stabilität bei 37 C und die gestrichelte Linie die Stabilität bei 4'C. Es ist ersichtlich, daß das Enzym bei einem pH-Wert zwischen 5 und 7 bei 37"C und noch bei pH 10 bei 4 C stabil ist

8) Die Wärmebeständigkeit, die ermittelt wurde, indem die Enzymlösung 10 Minuten erhitzt wurde₍ ist in Figiö dargestellt. Diese Abbildung zeigt, daß das Enzym bei 40"C stabil ist, aber die Aktivität verloren geht, wenn 10Minuten ohne Substrat auf 6O⁰C erhitzt wird.

9) Die Enzymaktivitäl wird in Gegenwart von Nickel**, Cadmium*^f, Kupfer** oder Quecksilber** inhibiert, während sie in Gegenwart von Co** um 20 bis 30% gesteigert wird.

10) Die Enzymaktivität wird in Gegenwart von Äthylendiamintelraacetat bei einem pH-Wert von 4 bis 6 inhibiert und durch einen Zusatz von Zn**, Mn** oder Co⁺* wiederhergestellt, wie Fig. 7 zeigt

11) Die Enzymaktivität wird in Gegenwart von p-Chlormercuribenzoat oder Diisopropylflüofphosphat nicht gehemmt.

12) Die Proteaseaktivität gegenüber Kasein liegt über 2000 PE/mg.

Die auf die beschriebene Weise hergestellte Protease hat hohe proteolytische Aktivität, besonders eine höhe caseinolylische und fibrinolytische Aktivität Im Vergleich zu bekannten alkalischen oder neutralen Proteasen hat die erfindungsgemäß hergestellte Protease eine höhere proteolytische Aktivität, wie die Werte in den Tabellen 5 und 6 zeigen.

Tabelle 5	Caseinolytischc Aktivitäl (PE/mg)	pH 9,0
Enzym	pH 7,1	3612 688 104 710
	2100 611 106 418
E-15-Pro tease Chymotrypsin Bromelin Pronase
Tabelle 6

Enzymmenge, die zur Auflösung' von Fibringerinnsel Γη ΙΟ Minuten erforderlich ist

4μg/ml
50μg/mI

E-15-Protease
Chymotrypsin
Bromelin
Pronase

Aufgrund der Stabilität und der optimalen Aktivität der Protease bei etwa 37°C in der Nähe des neutralen pH-Bereichs wird die erfindungsgemäße Protease als entzündungshemmendes Mittel verwendet Die entzün-

yungshemmendc Wirkung der erfindungsgemäß hergestellten Protease und vöit Phenylbutazon wurde durch den nachstehend beschriebenen Versuch verglichen.

Versuch 4

Die nachstehend angegebene Menge der Testprobe wurde weiblichen Ratten, die ein Gewicht von 120 bis 150 g hatten, intraperitoneal injiziert. Nach 30 Ml· nuten würde ein Reizmittel in eine Hinterpfote der

10

behandelten Ratten sowie in die Hinterpfote von Vergleichstieren injiziert, die nicht die Testverbindungen erhalten hatten^ Dann wurde der Umfang der auf das Reizmittel zurückzuführenden Schwellung jede Stünde gemessen. Die hemmende Wirkung auf das Enlzündungsödcm, das durch die Reizmittel, nämlich I) 0,05 ml einer l%igen wäßrigen Carragecninlösung,

2) 0,05 ml einer 6%igcn wäßrigen Dcxtranlösung und

3) 0,05 ml einer 10%igen wäßrigen Ovalbuminlüsung verursacht worden war, ist nachstehend in Tabelle 7 als prozentuale Schwellung angegeben.

Tabelle 7

Reizmittel Testprobe

Dosis Zeit nach Injektion des Reizmittels, Stunden

mg/kg 0 12 3 4

E-15-Prolease	5	0	20	26	23	26	24
(4000 PE/mg)	10	0	io	13	17	16	13
E-15-Pfotease	20	0	15	19	20	21	20
(3159 PE/mg)	50	0	7	6	13	14	13
Phenylbutazon	50	0	13	19	22	24	23
Kontrolle	0	0	53	71	76	81	80
E-15-Protease	20	0	37	41	36	34	32
(3159 PE/mg)	50	0	16	18	17	16	15
Phenylbutazon	50	0	58	60	54	52	50
Kontrolle	0	0	54	76	79	80	78
E-15-Protease	20	0	41	42	38	35	35
(3159 PE/mg)	50	0 35	14	15	15	12	11
Phenylbutazon	50	0	53	63	63	58	56
Kontrolle	0	0	64	88	86	84	81

Die Werte in Tabelle 7 lassen deutlich erkennen, daß die erfindungsgemäß hergestellte Protease eine weit höhere entzündungshemmende und abschwellende Wirkung hat als Phenylbutazon.

Die akute Toxizität der Protease (3157 PE/mg) bei Mäusen oder Ratten 72 Stunden nach der Verabreichung ist in Tabelle 8 angegeben. Der Bereich in Klammern gibt die 95%-Sicherheitsgrenze an.

Tabelle 8

Verabfolgung Mäuse

Ratten

Gruppe Geschlecht Dosis Bemerkungen

(mg/kg/Tag)

männlich
weiblich

Subkutan

Intraperitoneal

Intravenös

Kein Tier ging bei 2500 mg/kg ein

44 (36,1-53,78)
18,34 (14,32-23,49) 14,23 (12,45-16,26)

Kein Tier ging bei 2000 mg/kg ein

3 4

5
6

-K0Ö

mähnlich 3
weiblich 3

is I is J

männlich
weiblich

männlich 60
weiblich 60

Kontrolle

Dosis entspricht der lOfachen üblichen
Dosis für Menschen

desgl. 50
desgl. 120

Zur Ermittlung der subakuten Toxizität wurde die erfindungsgemäße Protease (3157 PE/mg) Ratten (Wistar-Stamm) von je etwa 120 g täglich während eines Monats oral veTabfoIgt. Gruppen von je 15 Ratten wurden wie folgt behandelt:

Im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Gruppe 1 und 2) zeigte keine der Testgruppen (Gruppen 3 bis 8) wesentliche Unterschiede im allgemeinen Aussehen, Körpergewicht, Blut-Leber-Funktion, Blutzucker, Serumelektrolyte, Urinabscheidung und Eingeweidegewicht.

Wie die vorstehenden Werte zeigten, ist die erfindungsgemäße Protease im wesentlichen ungiftig und hat bei oraler Verabfolgung eine starke entzündungshemmende Wirkung.

Im Gegensatz zu den bisher bekannten steroiden

entzündungshemmenden Mitteln, die häufig Stoffwechselstörungen als Folge von Hypophysen- und Adrenal-AhomaÜtäl verursachen, wirkt die erfindungsgemäß hergestellte Protease direkt auf die Entzündung ein, ohne das Hypophysen- und Adrenalsystem zu beeinflussen, so daß die erfindungsgertiäß hergestellte Verbindung unbedenklicher als Mittel gegen Entzündungen¹ als die bekannten Mittel verwendet werden kann.

Die erfindungsgemäße Protease wird ferner wirksam durch die Darmwand aufgenommen, so daß sie sich leicht oral anwenden läßt. Um jedoch eine Beeinträchtigung des Magensaftes zu vermeiden, wird empfohlen, die Protease oral in form eines Präparats mit einem erst im Darm zerfallenden Überzug zu verabreichen.

Zum besseren Verständnis der Erfindung werden nachstehend die Zusammensetzungen von Zubereitungen mit entzündungshemmender Wirkung als Bei-

οιλΪαΙα iit*nantyt

Beispiel 2

Kapsel mit darmlöslichem Granulat gefüllt, Zusammensetzung des Kapselinhalts (pro Kapsel):

κι

Protease gemäß der Erfindung

Lactose

Maisstärke

Kristalline Cellulose

Celluloscglykolsäure

Sorbit

5 mg (10000 P)
46 mg
16 mg
12 mg

5 mg
10 mg

100 mg

Beispiel 3
Darmlösliche Tablette, Bestandteile pro Tablette:

Protease gemäß der Erfindung	5 mg (10000 P)
Lactose	79 mg
Maisstärke	45 mg
Gelatine	0,5 mg
Magnesiumslearat	0,5 mg

130 mg
Von den Proteasen der folgenden Literaturstellen ₄<5

1. FR-PS 1401474,

2. FR-PS 1453 205 = US-PS 32 81 331,

3. GB-PS 9 67 848,

4. GB-PS 10 29 978,

5. US-PS 29 27060, ^v)

6. US-PS 29 36 265,

7. US-PS 31 09 780,

8. US-PS 31 27 327,
, 9 US-PS 32 07 6Ή,

10 US-PS 33 31 751

unterscheidet sich die erfindungsgemäße Protease in folgenden Eigenschaften:

Von der Protease nach (1) unterscheidet sich die erfindungsgemäße Protease durch die Stabilität bei anderen pH-Werten.

Von den Proteasen nach (3), (5), (6), (8) und (10) sowie den Proteasen Γ und III von (2) unterscheidet sich die erfindungsgemäße Protease durch das Molekulargewicht.

Abweichend von der Protease nach (4) wird 'Me erflndungsgemüße Protease durch DiisopropylOuorphosphat nicht gehemmt, wie die Anmelderin festgestellt hat.

Von der Protease nach (7) unterscheidet sich die erfindungsgemäße Protease durch die Elcmenlaranalyse.

Gegenüber der Protease nach {9) hat die erfiniiungsgemäße Protease ein anderes Aktivitätsmaximum gegenüber Casein.

Die erfindungsgemäße Protease wurde mit bekannten Proteasen mit entzündungshemmender Wirkung verglichen:

Als bekannte Proteasen mit entzündungshemmender Wirkung wurden verwendet:

Bromelain (aus Ananas).

Es handelt sich hier um die zuerst aufgefundene Protease mit entzündungshemmender Wirkung.

«-Chymotrypsin (erhalten aus Rinderpankreas).

Pronase (erhalten durch Züchtung von Slreptomyces griseus nach [8]).

Bis zum Prioritätszeitpunkt der vorliegenden Anmeldung hielt man Pronase für die am stärksten entzündungshemmende Protease. Es war ajch die einzige Protease, die vor dem Prioritätszeilpunkt der vorliegenden Anmeldung als entzündungshemmendes Mittel verwendet wurde.

Protease gemäß der vorliegenden Erfindung mit einer Aktivität gegenüber Casein von 2100 P/mg bei einem pH-Wert von 7,1.

Die entzündungshemmende Wirkung der Proteasen wurde nach der Punch-Methode bestimmt, die im wesentlichen der von Ungar et al (Archives Internationals de Pharmacodynamie et de Therapie, 123, 71 [1959]) angegebenen Methode entspricht. Bestimmt wird die prozentuale Reduktion einer Schwellung in der Rückenhaut von Ratten.

Die Protease wurde oral männlichen Wistar-Ratten verabreicht, die jede ein Gewicht von 150 ± 10 g hatte. Gemessen wird die Inhibierung einer durch subkutane Injektion von Antirattenserum in den Rücken der Versuchstiere hervorgerufenen Schwellung 2 Stunden nach der Eingabe der Protease. Die Ergebrisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

Protease

Dosis
(mg/kg)

Reduktion

Bromeiain
»-Chymotrypsin

Pronase

Erfindungsgemäße
Protease

Die Versuchsergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäße Protease eine außergewöhnlich starke entzündungshemmende Wirkung bei oraler Vergabe hat.

400	8
40	12
70	18
100	24,5
30	23
60	28
100	35
15	18
30	30
60	39

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims (12)

Patentansprüche: I. Einheitliche Protease, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

1. Molekulargewicht: etwa 6 · 10⁴;

2. Elementaranalyse: C: 47,39%, H: 7,18%, N: 15,18%;

3. maximale Absorption im UV bei einer Wellenlänge von 275 bis 278 πιμ und einer Schulter in bei 290 πιμ gemäß Fig. I;

4. deutliche Absorptionsbanden in IR genäß Fig. 2 bei folgenden Werten: 3,0 (stark), 3,48 (mittel), 6,05 (breit, stark), 6,55 (breit, stark), 6,88 (schwach), 7,15 (breit, mittel), 8,12 (mitte!) und 9,3 (breit, schwach);

5. der isoelektrische Punkt, gemessen durch Papierelektrophorese, liegt zwischen pH 5 und 6;

6. die optimale Enzymaktivität liegt, wie Fig. 3 zeigt, bei einem pH-Wert von 8,5 bis 9,5 und, wie Fig.4 zeigt, bei einer Temperatur von 35 bis 45 C;

7. die Stabilität bewegt sich, wie Fig. 5 zeigt, im pH-Bereich von 5 bis 7 bei 37 C;

8. die Wärmebeständigkeit, die ermittelt wurde, indem die Enzymlösung IO Minuten erhitzt wurde, ist in Fig. 6 dargestellt Diese Abbildung zeigt, daß das Enzym bei 40 C stabil ist, aber die Aktivität verloren geht, wenn jo 10 Minuten ohne Substrat auf 60 C erhitzt wird;

9. die E zymaktivität wird in Gegenwart von Nickel¹ ',Cadmium". Kupfer** oder Quecksilber*' inhibiert während sie in Gegenwart von Co" um 20 bis 30°/:- gesteigert wird;

10. die Enzymaktivität wird in Gegenwart von Äthylendiamintetraacetat bei einem pH-Wert von 4 bis 6 inhibiert und durch einen Zusatz von Zn*', Mn** oder Co** wieder hergestellt, wie Fig. 7 zeigt;

11. die Enzymaktivität wird in Gegenwart von p-Chlormercuribenzoaten oder Diisopropylfluorphosphat nicht gehemmt;

12. die Proteaseaktivität gegenüber Kasein liegt über 2000 PE/mg.

2. Verfahren zur biotechnischen Herstellung der Protease nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Serratia sp. E-15 mit der Hinterlegungsbezeichnung ATCC 21074 in einem wäßtigen Kulturmedium, das etwa 1 bis I0Gew./VoI.-% Milchcasein, etwa 1 bis 15 Gew./Vol.-% Sojabohnenmehlexfrakt und andere für das Wachstum der Mikroorganismen erforderliche Nährstoffe enthält, bei einer Temperatur von 25 bis 35 C unter «eroben Bedingungen so lange züchtet, bis die Protease in einer wesentlichen Menge in dem Kulturmedium angereichert ist, und daß man die Protease aus der Fermentationsflüssigkeit nach an sich bekannten üblichen Methoden abtrennt und bo reinigt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium zusätzlich noch etwa 0,01 bis etwa 0,05 Gcw./Vol.-% CaCIj · 2H₂O enthält.

4. Pharmazeutische Zubereitung mit entzündungshemmender Wirkung, gekennzeichnet durch eine überwiegende Menge der Protease nach Arl· spruch I als aktiven Bestandteil und einen geringeren Anteil eines pharmazeutisch verträglichen Trägers dafür, oder durch einen geringeren Anteil der Protease nach Anspruch 1 als aktiven Bestandteil und einen größeren Anteil eines pharmazeutisch verträglichen Trägers dafür.