DD215580A5

DD215580A5 - Hypocholesterolaemisch aktives protein

Info

Publication number: DD215580A5
Application number: DD83258777A
Authority: DD
Inventors: Yasuo Kawai; Kazunaga Yazawa
Original assignee: Advance Kaihatsu Kenkyusho
Priority date: 1982-12-28
Filing date: 1983-12-28
Publication date: 1984-11-14
Also published as: JPH0142280B2; ES528497A0; ES8506806A1; DE3377654D1; MX7656E; US4812441A; CA1225957A; PL140807B1; SU1423002A3; EP0115157A2; JPS59122428A; AU568521B2; EP0115157B1; AU2224283A; HU191746B; PL245380A1; EP0115157A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines hypocholesterolaemisch aktiven Proteins. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuartigen wirksameren und sicheren Proteins, das zur Verringerung des Blutcholesterolgehaltes bei Saeugern geeignet ist. Erfindungsgemaess wird ein hypocholesterolaemisch aktives Protein mit den folgenden Charakteristika hergestellt: (a) durch Gelfiltration bestimmte relative Molekuelmasse: 30000 +- 7000; (b) Isoelektrischer Punkt: 7,9 +- 0,2; (c) Aminosaeurenzusammensetzung (Molprozent): Glycin 25,23; Alanin 10,98; Glutamat 10,34; Asparaginat 8,20; Lysin 6,39; Leucin 5,58; Valin 5,41; Isoleucin 5,18; Threonin 4,23; Tyrosin 4,19; Serin 3,46; Prolin 2,62; Arginin 2,60; Phenylalanin 2,51; Methionin 1,56; Histidin 1,30; Cystein 0,16; (d) Elektrophoresemuster: bei Polyacrylamidgel-Elektrophorese ein scharfes Band auf der Anodenseite. Dieses hypocholesterolaemisch aktive Protein wird von einem zur Gattung Streptococcus gehoerenden Mikroorganismus abgeleitet.

Description

AP C 12 P/258 777/3 63 332/12/20

Verfahren zur Herstellung eines hypocholesterolämisch aktiven Proteins

Anwendungsgebiet der iärfindung,

Die vorliegende Erfindung bezieht aich auf ein neuartiges hypocholesterolämisch aktives Protein (nämlich cholesterolreduzierendes Protein, im folgenden

mit "CRP" abgekürzt), ein Verfahren zur Herstellung desselben, eine das Protein enthaltende hypocholesterolämisch antiarteriosklerotische pharmazeutische Zusammensetzung sowie auf ein Verfahren zur Reduzierung des Blutcholesterols in Säugern·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Wie im Fachgebiet weithin bekannt ist, sind mehrere pharmazeutische Zusammensetzungen wie etwa Clofibrat sowie die mit ihm verwandten Präparationen nunmehr als therapeutische Arzneien gegen Arteriosklerose oder Hyperlipidämie, eine der sogenannten typischen geristrischen Järkraakungen oder Krankheiten des mittleren Lebensalters vorgeschlagen worden· Unter dem Gesichtspunkt beispielsweise der pharmakologischen Wirkungen und Nebenwirkungen können diese bekannten Arzneien hinsichtlich der erhofften Ziele jedoch noch nicht vollständig befriedigen, so daß der Bedarf nach .Entwicklung wirksamerer, und sicherer Medikamente bemerkenswert angestiegen ist· '

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuartigen

li!V; AdO I

- ' · · ': - · · ,;.; : -2- . ' · .. .. : i

' ν . - .- . - " " . .

hypocholesterolämischen aktiven Proteins, das zur Verringerung des Blutoholesterolgehaltes bei' Säugern geeignet ist·

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Protein mit den gewünschten Eigenschaften und ein Verfahren zu seiner Herstellung aufzufinden«

j Erfindungsgemäß wird ein neuartiges hypochlolesterolämisch aktives Protein - CRP - zur Verfügung gestellt, welches sicher an Säuger verabreicht werden kann· \

Insbesondere wird ein Verfahren zur Herstellung eines neuartigen Proteins, ORP zur Verfügung gestellt, welches in der Lage ist, den Blutcholesterolgehalt bei Säugern wirkungsvoll zu reduzieren·

Erfindungsgemäß wird weiterhin eine hypocholesterolämische oder antiarterioaklerotische pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die mit einen wirksamen Bestandteil ein neuartiges Protein, CRP, enthält· Durch - Anwendung der ->' erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist es möglich, den Blutchole st er olgehalt bei Säugern zu verringern·

Brfindungsgemäß wird ein hypocholesterolämisch aktives Protein hergestellt, das in der Lage ist, das Blutcholesterol bei Säugern zu reduzieren und das die nachstehenden Merkmale ^::7 ;';^: aufweist: ·" '· ' ' ' '. .. ' ' ',.

(a) Relative Molekülmasse nach Gelfiltration:

30 000 + 7 000

(b) Isoelektrischer Punkt: 7,9+0,2

(c) Aminosäurenzusammensetzung (Mol-%):

Glycin 15,23 Alanin 10,98

Glutamat	10,34	Asparaginat	5,20
Lysin	6,39	Leucin	5,58
Valin	5,41	Isoleucin	5,18
Threonin	4,23	Tyrosin	4,19
Serin	3,46	Prolin	2,62
Arginin	2,60	Phenylalanin	2,51
Methionin	1,56	Histidin	1,30
Cystein	0,16

(d) iÄlektrophoresebild: ein scharfes Band auf der Anodenseite bei Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese«,

Die vorliegende Erfindung wird in ihrer im folgenden gegebenen Beschreibung besser verständlich, wenn auf die beiliegenden Zeichnungen Bezug genommen wird«

j?ig, 1 veranschaulicht ein Polyacrylamidgel-Slektrophoreseprofil des erfindungsgemäßen CEP-Proteins; und die figuren 2 bis 4 veranschaulichen die üilutierungsdiagranune der Gelfiltration in weiter unten dargelegten Ausführungsbeispiel 1.

Die Anmelder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, daß ein neuartiges Protein, welches von zur Gattung Streptococcus gehörenden Mikroorganismen und/oder der überstehenden flüssigkeit der Kulturbouillen gewonnen wurde, in der Lage ist, das Blutcholesterol wirksam zu reduzieren und daß dieser von diesen sogenannten gastrointestinalen Bakterien und der überstehenden Flüssigkeit der Kultur-

bouillon extrahierte Bestandteil bei oraler Verabreichung im wesentlichein nichttoxisch ist.

Die bei der Herstellung des Produktes verwendeten Mikroorganismen, die Herstellungsmethoden, die physikochemischen üigensohaften wie auch die pharmakologischen Wirkungen des .erfindongsgemäßen GRP-Proteins seien im folgenden detailliert dargestellt·

Mikroorganismen 1. Arten

Zur Gattung Streptococcus gehörende und im Nahmen der vorliegenden Erfindung verwendbare Mikroorganismen sind: Streptococcus faecium, Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus avium, Streptococcus durans, Streptococcus saüvarius, Streptococcus mitis, Steptococcus equinus sowie andere, an entsprechender Stelle genannte„ Daneben werden die als einheimische intestinale Streptococci bezeichneten Arten vorzugsweise eingezogen.

Typische Beispiele für derartige, aus dem Kot gesunder Menschen isolierte Mikroorganismen sind am 15· Juli 1982 im Institut für Gärungsforschang (FRI) in Japan eingereicht worder, (sämtliche unter "KäRIa-P" laufenden Zahlen in Tabelle beziehen sich auf.die Hinterlegungsnummern des genannten Institutes), worauf sie dem Institut für Gärungsforschung (FRI) (d· h, der dem Budapester Vertrag angeschlossenen Internationalen Hinterlegungsbehörde in Japan) unter den folgenden FERlvI-BP-Hinterlegungsnummern in Tabelle 1 gemäß dem Budapester Vertrag zur Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke von Patenterteilungsverfahren überstellt wurden:

Tabelle 1 ^:' ,. ^: : " , . .. . ',

Name dea Stammea Hinterlegungsnummer

Streptococcus faecium ADV1009 P3RM-P-6624 PERM BP-296

faecalia	ADV9001	It	-6625	It	-297
a vi um	AD2OO3	It	-6626	tt	-298
aalivariua	ADV10001	rt	-6627	ti	-299
durana	ADV3001	tt	-6628	π	-300
mitia	ADV7001	rt	-6629	tt	-301
equinua	ACV8001	η	-6630	It	-302

Die genannten Stämme wurden auch beim ZIIvIBT in Jena, DDR, unter den Nummern ZIMBT 10976 bia 10982 hinterlegt,

2_e Mikrobiologiache Oharakteriatika der Mikroorganiamen Allgemeine mikrobiologiaohe Charakteriatika

Die mikrobiologiachen Merkmale der Mikroorganiamen in der vorliegenden Erfindung sind die gleichen wie jene der bekannten Mikroorganiamen, die zur identiachen Klaaae gehören. D. h,, die allgemeinen mikrobiologischen Charakteriatika, die Kultivierungaverfahren aowie andere Bigenachaften entaprechen jenen, die in den nachatehendeh Literaturquellen beachrieben werden: '

1) Bergey·β Manual of Determinative Bacteriology, 8, Auagabe, 490-509 (1974)

2) Int, J. Syat. Bact, Ί6, 114 (1966)

3) Microbiol, Immunol, 2^ (3),.,257-269 (1981) A) J, Clin_e Pathol. 22,"53-57 (1980)

5) J, General Microbiol, JJ28, 713-720 (1982)

6) Applied Microbiol* 2^ (6) 1131-1139 (1972).

Glycerol Arabinose Helezitose Sorbitol Antigene Gruppe

NV

Q(O) K

xlt aiSjS-Trfcphenyltetrazoliumchlorid· x2:s Nicht vorgenommen

3, Kultivierungaverfahren

Die Kultivierung dieser Mikroorganismen erfolgt auf die herkömmliche Weise, Beispielsweise können die bakteriellen Zellen durch stationäre Kultivierung in Rogosa-Bouillonmedium folgender Zusammensetzung unter einem aeroben Zustand gesammelt und durch Zentrifugieren der Kultur geerntet werden.

Zusammensetzung von Rocjosa-Bouillonmedium

Tryptikaee Hefeextrakt Tryptose K₂HPO₄

KH₂PO₄

Triarmoniumzit rat Tween 80 Glucose Cysteinhydrochlorid

Salzlösung*¹ Destilliertes Wasser

auf

g

5 g

3 g

2 g

1 9 g

0|2 g 5 ml 1 Liter

(pH 7, Hitzesterilisation bei 121 C über 15 min)

MgSO₄ FeSO/

H₂O

MnSO

H₂O

Destilliertes Wasser

11*5 g O₈ 68 g 2*Λ g ml

Herstellung des CRP-Proteins

Im folgenden wird ein Beispiel für die typischen Herstellungsweisen des genannten erfindungsgemäßen CRP-Proteins ausgeführt:

1. Sammlung von Mikroorganismen

3ede der weiter oben genannten Mikrobienlinien wird in Rogosa-Bouillonmedium eingeimpft"ⁿohne Verrühren 5 bis IO h lang bei 37 ⁰C unter aeroben Bedingungen bebrütet, um daraufhin eine Kulturflüssigkeit mit einer bestimmten Konzentration lebensfähiger Bakterienzellen zu erbringen. Die Kulturflüssigkeit« wird kontinuierlich bei 12 000 U/min zentrifugiert. Anschließend werden die geernteten Bakterienzellen in physiologischer Kochsalzlösung (0,85 % NaCl) zwei- bis dreimal gewaschen·

2· Zerstörung der Bakterienzellen

a) Die gewaschenen Zellen werden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und zwecks Zerstörung 10 min lang auf 115 °C rückerhitzt.

b) Die gewaschenen und in physiologischer Kochsalzlösung suspendierten bakteriellen Zellen werden vermittels Ultraschall, Französischer Presse sowie anderer konventioneller Methoden zerstört.

3, Beseitigung des Fettes von der Zelle

Die Suspension zerstörter Zellen wird mit Chloroform-Methanol (2:1, V/V) vermischt. Die durch das organische Lösungsmittel ' extrahierbaren Bestandteile werden sodann durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 3 000 U/min vollständig abgeschieden, worauf die Chloroformschicht verworfen wird.

4. Behandlung mit proteolytischen Enzymen

Die oben erwähnte entfettete ^probe wird mit proteolytischen Enzymen wie etwa Pronase, Trypsin und Pepsin unter Anwendung üblicher Verfahrensweisen behandelt. Von den eben genannten proteolytischen Enzymen dient Pronase dem speziellen Zweck am besten. Auf die Bedingungen, die bei Behandlung mit diesem En-

zym anzuwenden sind, wird in der nachstehenden Literaturquelle Bezug genommen:

Methods in Enzymology^ Bd, VIII, S. 26 (1966)·

5. Reinigung

Der zentrifugale Überstand des proteolytischen Reaktionsgemisches wird zwecks Ausfällung der Proteinfraktion mit Ausfällmitteln wie etwa Trichloressigsäure oder Ammoniumsulfat versetzt« Die ^proteinfraktion wird sodann mit geeigneten Nukleasen behandelt; um Nukleinsäurebestandteile wie etwa DNS und RNS in der Fraktion zu entfernen. Nach derartigen enzymatischen Behänd-.· lungen werden wiederholt Dialysen vorgenommen.

Die teilsweise gereinigte ^proteinfraktion wird nunmehr einer Wiederholung weiterer Reinigungsverfahren wie etwa Gelfiltration und Ammoniumsulfatfraktionierung unterzogenj abschließend wird so eine reine Präparation des als CRP-Protein bezeichneten Proteins gewonnen.

Entsprechend seiner weiter unten ermähnten physikochemischen Merkmale kann das CRP-Protein generell durch eine Vielzahl der "

im Fachgebiet weit verbreiteten Isolations- und Reinigungsverfahren hergestellt werden. Hierzu gehören beispielsweise die Verfahren der Ausfällung-Auflösung und Extraktion, der Lösungsmittelextraktion; Dialyse, Säulenchromatografie^ Elektrophoresei Gelfiltration oder deren Kombinationen, Die vorliegende Erfindung ist daher keinesfalls auf die spezifizierten Vorgehensweisen begrenzt.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich folglich auf die Herstellungsverfahren hypocholesteroloiiiischejc aktiver Produkte, die sich aus Protein zusammensetzen, welches von Mikroorganismen gewonnen wird, die der Gattung Streptococcus angehören, da ix&H die pharraakologisch© Aktivität in der Proteinfraktion findet. Dies wird in Jedem der folgenden Ausführungsbeispiele im Detail beschrieben.

Nebenbei bemerkt, die hypocholesterolemische Aktivität im Überstand der Kulturbouillon beträgt etwa ein Fünftel der in der Bakterienzelle vorhandenen Aktivität.

Physikochemische Eigenschaften des CRP-Proteins

Die physikochemischen und physiologischen Charakteristika des erfindungsgemäßen CRP-Proteins werden im folgenden aufgezeigt,

1. Chemische Natur und lösungsvermittelnde Eigenschaften

Bei der nach dem Entsalzen und Gefriertrocknen verwendeten pulverisierten Probe handelte es sich um ein nicht zerfließliches weißes Pulver von sehr guter Löslichkeit in Wasser und Löslichkeit in Aceton, Beim Vermischen der CRP-Lösung mit Ammonium-'sulfat oder Trichloressigsäure in kalter Umgebung (4 ⁰C) wurden Trübung bzw« Ausfällung beobachtet·

2. Relative Molekülmasse *

Nach Gelfiltration unter Verwendung einer Toyopearl HW 55 Säule (Toyospda Co, Ltd·)., äquilibriert mit 25 mM Tris-HCl-Puffer mit Gehalt an 0,3 M NaCl (pH 7,5) wurde die relative Molekülmasse des CRP-Proteins auf 30 000 + 7 000 geschätzt»

3. Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt des CRP-Proteins wurde unter Anwendung der isoelektrischen Fokussierungsmethode unter Einsatz von Ampholin (pH 3,5 bis 10, LKB Co._# Ltd) enthaltendem 5 %igem PoIyacrylamidgel bei einer finalen Konaentration von 2 % bei 4 ⁰C unter einer stabilen Spannung von 200 V über 3 h hinweg gemessen. Für die ÖLektrodenlösungen der Anode und der Katode wurden &^2xMMteäsui<9«iixxai(xMxft8xx)BXN¥ Lösungen von 0,02 M H₃PO₄ bzw. Ii M NaCl verwendet. Die Probe (100 Mikrogramm) wurde angelegt j die Färbung erfolgte vermittels Coomassie Brilliant Blue R-250, Der isoelektrische Punkt lag bei \7& + 0,2. Er lag damit zwischen jenen der Bezugsproteine von Rattenhämoglobin und Walratmyoglobin,

4, Aminosäurenzusammensetzung

Die Probe (31 rag) wurde in 1 ml 6 N HCl suspendiert und in eine Ampulle eingeführt» in Trockeneis-Mefalh/nol eingefroren, und daraufhin wurde die Luft in der Ampulle unter Vakuum durch N_~ Gas ersetzt. Der Gasaustausch wurde dreimal wiederholt^ worauf die Ampulle unter Vakuum verschlossen wunfle. Nach 24-stündiger Hydrolyse bei 110 ⁰C in einem Heizblock wurde das Hydrochlorid vermittels Rotationsverdampfung In vacuo entfernt, worauf die ^probe in 2DOyUl 1/50 N HCl aufgelöst wurde. Sodann wurden 50^ dieser **robe unter Einsatz eines Aminosäureanalysators (Modell 835 Hochgeschwindigkeits-Aminosäureanalysator, Hitachi, Ltd·) analysiert. Die Aminosäurezusammensetzung der Probe (des RCP- **roteins) ist in Tabelle 3 dargestellt·

Tabelle 3

	(Mol-%)
Aminosäure	25^23
Glycin	10,98
Alanin	10^34
Glutarnat	8,20
Asparaginat	6>39
Lysin	S\|58
Leucin	5,41
Valin	5,18
losleucin	4*23
Threonin	4,19
Tyrosin	3,46
Serin	2,62
Prolin	2,60
Arginin	2,51
Phenylalanin	1/56
Methionin	1*30
Histidin	O₁16
Cystein

5· Muster der Scheibenelektrophorese

Scheibenelektrophoretische Analysen des CRP-Proteins (25^g) wurden auf Polyacrylamidgelen (7 % Polyacrylamid) in Tris-Gylcin-Puffer (pH 8,3) bei 4 mA/Gel über 2^5 h hinweg vorgenommen. In einem Abstand von 4,2 + 0|2 cm von der Anode entfernt

wurde ein scharfes Proteinband der ^probe gewonnen. Die Darstellung des gele&trophoretischen sowie des densitometTischen Musters findet sich in Bild 1.

6· Physiologische Oharakteristika

Das CRP-Protein wirkt bei oraler Verabreichung an Säuger blutcholesteroireduzierend·

Diese Wirksamkeit erweist sich als stabile wönn das CRP-Prptein im Bereich von mindestens -80 ⁰C bis 115 ⁰C bei einem pH-Wert von 4,1 bis 10,9 gelagert wird.

. ' . ' ·,

Pharmakologische Wirkungen des CRP-Proteins

Ji, Pharmakologische Effekte

Wie sich in jedem der im folgenden dargestellten Ausführungsbeispiele zeigt, vermag die vorliegende, aus dem erfindungsgemäBen CRP-Protein bestehende antiarteriosklerotiache Droge eine außerordentlich wirksame Reduzierung des Blutchilesterols bei Säugern hervorzurufen. Demzufolge eignet sich dieses Präparat als therapeutisches oder präventives Medikament für Erkrankungen, die mit Arteriosklerose, Hyperlipidämie, Hyperlipoproteinämie, Xanthpmatose^ Cholecystolithiase, Bluthochdruck, Diabetes und anderen eng verwandt sind.

Das erfindungsgemäße Präparat kann Säugern oral, int raperitoneal, intravenös sowie über andere Applikationswege verabreicht werden. Die Menge pro Verabreichung beträgt etwa S /t,g bis 1 g/kg Körpermasse· Bevorzugt wird die orale Verabreichung von etwa 0,1 mg bis 100 mg/kg Körpermasse· Oedwede Drogenform der vorliegenden Erfindung kann herangezogen und als eine Lösung in physiologischer Kochsalzlösung und anderen Trägerilüssigkeiten, als Injektionspräparat; als Pulver nach Lyophilisierung usw., als Suppositorium, in Form von enterisch ummantelten Tabletten, sublingualen Tabletten; Granalien, Tabletten^ Kapseln usw_# mit geeigneten Trägerstoffen (ζ·Β· Stärke, Dextrin)* Verdünnungs- Is*«£JUkk (ζ.B· Calciumkarbonat, Laktose)» Verdünnungsmitteln

(z«B, physiologischer Kochsalzlösung, destilliertes Wasser) usw, eingesetzt werden«

2» ^Akute Toxizität ' ' .

Wie in d®n nachfolgenden Ausführungsbeispielen dargelegt, ergab sich eine LD₅₀ des SiÄi«ßK@iteät«a erfindungsgeraäßen CRP-Proteins von mehr als 802 mg/k| Körpermasse bei intraperitonealer Verabreichung an Mäuse* Bei oraler Verabreichung ist die Substanz im wesentlichen nichttoxisch«,

Ausführungsbeispiele

Pie vorliegende Erfindung sei im folgenden anhand der allerdings nicht als limitierend anzusehenden Ausführungsbeispiele detaillierter dargestellt.

Ausführungsbeispiel %

Herstellung und Reinigung des CRP-Proteins

Streptococcus faecium ADV1009 (FERM BP-296) wurde in 2 1 Rogosa-

Bouillonmediura mit einer finalen Konzentration von 1 χ 10 Bakterienzellen/ml inokuliert. Das beimpfte Medium wurde 10 h lang bei 37 ⁰C ohne Verrühren unter aeroben Bedingungen bebrütet j um

10 Bakterienzellen/ml Kulturmedium zu ergeben» Die Bakterienzellen wurden durch kontinuierliche Zentrifugation bei 12 000 U/min geerntet, mit physiologischer Kochsalzlösung (0,85 % NaCl) gewaschen und in der gleichen Lösung suspendiert« um 100 ml der ZeJLlsuspension bei einer Konzentration von

IiO

2 χ 10 /ml zu gewinnen*

Zwecks Entfettung wurde die obige Bakterienzellensuspension 10 min lang bei 115 ⁰C hitzebehandelt sowie dreimal mit ChIo- _y ro form-Methanol (ZtILi V/V) behandelte

Die entfettete Bakteriensuspension wurde 10 min lang bei 3 000 U/min zentrifugiert^ daraufhin wurde die untere Schicht, d.h. die Chloroformschicht verworfen. Dia wäßriges Schicht wurde als Ausgangsmaterial für die folgenden Reinigungsschritte verwendet.

-1.3-

Das Auagangamaterial wurde sodann 24 h lang bei 47 0 mit 20 mg Pronase (Sigma Protease Typ XIV) in 100 ml 0,0015 M GaGl₂ enthaltendes Phosphatpuffer (pH 7,8) behandelt; unter den gleichen Bedingungen erfolgte eine weitere Behandlung mit 10 mg Pronase· Die experimentellen Bedingungen der Behandlung mit Pronase entsprechen den in "Methods in Enzymology", Bd. VIII, S. 26 (1966), beschriebenen.

Das mit Pronase behandelte Material wurde durch lOminütige Zentrifugation bei 3 000 U/min in Ausfällungs- und Überstandsfraktion geteilt· Die Überstandsfraktion wurde mit 1/9 Volumen 100#iger (M/V)"Trichloressigsäure versetzt, 3 h lang unter Verrühren bei 4 ⁰G stehengelassen und daran anschließend 10 min lang bei 3 000 U/min zentrifugiert, um die Präzipitations- und Überstandfraktion zu gewinnen· Der Überstandfraktion wurde das gleiche Volumen 10%iger 'l'richloressigsäure zugesetzt, worauf der ganze Prozeß wiederholt wurde. Der so gewonnene niederschlag wurde zwecks Entfernung der Trichloressigsäure dreimal mit Ethylether gewaschen, in 50 ml destillierten Wasser aufgelöst, mit 1 H NaOH neutralisiert, zwecks vollständiger Entfernung der Trichloressigsäure dialysiert und abschließend zentrifugiert, um 345 mg (Trockenmasse)" der Niederschlagsfraktion zu erhalten·

Die so gewonnene Niederschlagsfraktion (345 mg) wurde mit 5 ml 0,1 M Tris-Acetatpuffer (pH 8,0), 1 ml 0,1 M Magnesiumacetat sowie 0,06 ml Desoxyribonuklease (2 mg/ml Desoxyribonuklease I (Sigma)) versetzt und 1 h lang bei "37 ⁰G bebrütet· Sodann wurde das Reaktionsgemisch 3 Tage lang gegenüber destilliertem Wasser dialysiert, wobei eine Zelluloseröhre mit analysierenden Substanzen von weniger als 3 500 an relativer Molekülmasse verwendet wurde· Die dialysierte Fraktion wurde bis zur Trockne eingedampft· Das so gewonnene ,Material wurde sodann in 5 ml 0,05 M Acetatpuffer (pH 4,6)

suspendiert (der Puffer enthielt 440 Einheiten Ribonuklease T₂ (Sigma)), 3 h lang bei 37 ⁰C bebrütet und gegenüber destilliertem Wasser dialysiert* Die dialysierte Fraktion (relative Molekülmasse > 20 000) wurde als Gereinigte Fraktion I (Trockenmasse 285 mg) bezeichnet.

Die obige Gereinigte Fraktion I wurde erneut mit Ribonukleaae T₂ behandelt und dialysiert, um so die Gereinigte Fraktion II (Trockenmasae 274 mg) zu erhalten. Diese Fraktion (II) wurde einem Toyopearl HW 55 Säulenchromatograph appliziert, welcher mit 0,3 M WaOl enthaltendes 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) äquilibriert worden war« Daa Säulenchromatogramm der Fraktion (II) bei 1 ml/min Elutionsgeschwindigkeit ist in Fig. 2 dargestellt; Linie A zeigt den Proteingehalt bei Jäxtinktion bei 280 nmj Linie B zeigt den Nukleinsäuregehalt beiJäxtinktion bei 260 nm; und Linie C zeigt den vermittels der Phenol-HpSO.-Methode festgestellten Zuckergehalts

Die später als die gepunktete Linie D in Fig_e 2 eluierte Teilmenge (Elutionsvolumen 67 ml) wurde mit Ammoniumsulfat (55%ifc3 Sättigung) behandelt, und aus dem Überstand der Äirunoniamsulfat-i'raktionierungsflüssigkeit wurde die Gereinigte fraktion III (Trockenmasse 205»5 *ng) gewonnen.

Fig. 3 zeigt das Säuienchromatograrnm der gereinigten Fraktion III unter den gleichen experimentellen Bedingungen, wie sie in Fig. 2 gezeigt sind.

Da diesr Fraktion (III) eine Spurenmenge an Zuckern enthält, wurde die Fraktion"dreimal mit 10%iger Trichloressigsäure behandelt und unter den gleichen experimentellen Bedingungen dialysiert, wodurch das abschließend gereinigte CRP-Protein gewonnen wurde (Trockenmasse 197,3 mg). In Fig. 4 ist das Säulenchromatogramm des GRP-Proteins dargestellt, welches unter den gleichen experimentellen Bedingungen aufgenommen wurde, wie sie in den Figuren 2 und 3 dargestellt sind· Die

physikochemiachen Eigenschaften des CRiyProteins sind weiter oben aufgeführt·

Tabelle 4 zeigt die Ausbeute und die Mengen an Protein laut Methode nach Lowry, an RKS laut Orcinol-Methode, an DNS laut

Piphenylamin-Methode sowie an Zuckern laut Phenol-HgSO .-Methode in jedem der Herstellungsprozesse. Die Tabellenwerte geben die Trockenmasse an (rag),

- ; . . , ' '. ,...;,. Tabelle 4 . ' .

Fraktionen Aus» Pro«· _{RNS D}m_S Zuk-

beute tein ker sehe Akti-

^_uLiiMiiMimui ^„„„, ,,;„,;'.;,„„„, '„„;, ,„ , ' , ; „ , „ ,„„ ,,„v^.tat. _i.

Präzlpltation 345 265,9 43,6 6,3 14,3 9,1

t-tön^±:5r⁹*^{e Frak}"" ^{28S 260}^ ^ia·*^{3 1}^^{2 1}^¹ «i^

tion¹!!⁹*^{0 Frak}~ 274 258_e3 3,6 0,8 11,2 11*8

tion¹!!!*^{6 Fral<}" 205,5 202^6 Spur Spur 2*9 16,9

CRP-Protein 197,3 197,3 Spur Spur Spur 17»6

Die in Tabelle 4 dargestellte spezifische Aktivität gibt die relative Aktivität der Cholesterolreduzierung durch jede der Fraktionen bei herkömmlichen Ratten pro Masseeinheit an, wobei die Aktivität der weiter oben erwähnten hitzebehandelten Bakterienzellen gleich Ji. gesetzt wird, Assay-Methoden bezüglich der hypocholesterolemischen Aktivität in Tierversuchen sÄnd weiter unten in Ausführungsbeispiel 2 dargestellt»

Nebenbei % es bestätigte sich, daß das CRP-Protein genau wie in diesem usführungsbeispiel auch unter Einsatz anderer in Tabelle 1 aufgeführter Bakterienlinien separiert und gereinigt werden kann, dies allerdings mit einer geringfügigen Variation der Ausbeute·

AusführungsbeispieI 2

Pharmakolo^isc^he^J/tfijrkung ,des_ίCRP»Proteins Ι» Hypocholesterolemische Aktivität (1)

Hergestellt wurden Proben von physiologischer Kochsalzlösung, die das Äquivalent zu 50 mg/kg Körpermasse an lyophilisiertem CRP-Protein enthielten« Oiese Proben wurden in einer täglichen

Dosie von 1 ml oral an konventionelle Ratten (18 Wochen alt, männlich, mittlere Körpermasse 246 g» 10 Ratten pro Gruppe) sowie an konventionelle und keimfreie Mause (18 Wochen alt, männlich, mittlere Körpermasse 30 g, 10 Mäuse pro Gruppe) verabreicht. Die Ratten und Mäuse wurden 8 bis12 Wochen lang gehalten. Sodann wurde von diesen das artetielle Slut aus der abdominalen Aorta gesammelt, worauf die Serumproben vermittels Zentrifugätion aus dem gesamten Blut separiert wurden· Das Cholesterol wurde vermittels der Methode nach Zurkowski (Choleskit, Kanto Kagaku K.K. ^: _t Oapan) bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Bei den in der Tabelle aufgeführten Werten /!handelt es sich um die Reduktionsrate {%) von den Werten der Kontrollgruppen, denen keine Probendosis verabreicht wurde» Die Zusammensetzung (Masseprozent) der ad libitum angebotenen Diät ist in Tabelle 6 aufgeführt.

Tabelle 5

Tiere	Zusammensetzung	Reduktionsrate {%)	6	Masseprozent
Herkömmliche Ratten (12 ^wochen) Herkömmliche Mäuse (8 Wochen) Keimfreie Mäuse (8 Wochen)	25,2 + 0,7 33,5 + 1,1 ^w mm ' 21,7 ♦ 0,9
Tabelle

Kasein 20

Sojabohnenöl 10

Weizenstärke ' 61

Mineralien 4

Vitamingemisch 2

Pulverisiertes Filterpapier 3

2. Hypocholesterolemisehe Aktivität (2)

Die oben erwähnten Proben wurden in einer täglichen Dosis von 1 ml oral an herkömmliche Ratten (18 Wochen alt, männlich* mittlere Kftrpe'rmasse 238 gv -15-Ratten Je Gruppe) sowie an herkömm- , liehe und keimfreie Mäuse (18 Wochen alft, männlich, mittlere ". Körpermaeee'31g, 10 Mäuse pro Gruppe) 12 Wochen lang verabreicht. Der Blutcholesterolgehalt wurde in der oben dargelegten Waise , bestimmte Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 aufgeführt.

Die Begriffe_e "cholesterolangsreichert¹* und "fruktoseangereichert" in der Tabelle kennzeichnen den Zusatz von 1 % Cholesterol zur Ό obenerwähnten Diät sSiSi die Substitution von Fruktose fur die

Gesamtmenge an Weizenstärke in der obigen Diät_a Die in der Tabelle angegebenen Werte entsprechen der Reduktionsrata gegenüber den Werten der dosisfreien Kontrollgruppe«

Tabelle 7

Tiere leduktionsrate (4)

Keimfreie Mäuse¹^ 35,4 + 1,3

Konventionelle Mäuse ' 38»3 + 0,7

Konventionelle Ratten ^; 49,2 .+ 1,1

Konventionelle Ratten²' 41,5 + 1,3

t ^; cholesterolangereicherte Diät

' fruktoseangereicherte Diät ·

3_e Hypocholesterolliiiische Aktivität (3)

10 tng/ral des CRP-Proteins enthaltende Proben physiologischer Kochsalzlösung wurden in einer täglichen Dosis von 1 ml pro Ratte 2 Wochen lang oral an hypercholesterolämische Ratten (18 Wochen alt, männlich* mittlere Körpermasse 250 g^ 5 Ratten pro Gruppe), die mit "cholesterolangareicherter" Diät gefüttert wurden, verabreicht. Das Blutcholesterol wurde in der oben erwähnten Weise bestimmt« Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt» Bei,dem für die Verabreichungsgruppe angegebenen Wert handelt es sich um die Cholesterol-Reduktionsrate (%)

gegenüber der dosisfreise Gruppe.

Tabelle 8

Tiere Reduktionsrate {%)

Verabreicht 49,9

Kontrolle 0

4. Dosisreaktion

0,1 mg bis 20 mg/ml CRP-Protein enthaltende Proben physiologischer Kochsalzlösung wurden in einer Tagesdosis von 1 ml pro Ratte oral an konventionelle Ratten (6 ^wochen alt, minnlich, mittlere Körpermasse 216 g; 5 Ratten pro Gruppe) 4 Wochen lang verabreicht. Das Bluteholesterol wurde in der obenerwähnten Weise bestimmt (die Kontrollgruppe blieb dosisfrei)· Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt.

	Tabelle 9

Dosierung (mg/Ratte)	Reduktionsrate (Durchschnitt %)
Kontrolle 0,1 1 10 20	0 9,8 + 0;7 14,3 + 1,2 47,9 + 1,1 ' 51,1 + 0,9

5. Akute Toxizität

1, 10 und ¹IOO mg des CRP-Proteins enthaltende Proben physiolo« gischer Kochsalzlösung (0,5 ml/Maus) wurden int raperitoneal an ICR-Mäuse (6 Wochen alt, männlich, mittlere Körpermasse 31,4 +0,6 g, 10 Mäuse pro Gruppe) verabreicht« Die thanatobiologische Beobachtung der Mäuse wurde über 14 Tage hinweg vorgenommen. Als .Kontrollsubstanz diente physiologische Kochsalzlösung. . ,

Der nach der Behrens-Kärber-Methode berechnete LD-₀-Wert lag bei mehr als 802 rag/kg Körpermasse, Die Substanz war bei oraler Verabreichung im wesentlichen nichttoxisch»

6« Pharmazeutische Präparationen

(1) Eine Menge von 50 mg dies gereinigten CRP-Proteins wurde gleichmäßig mit 250 mg gereinigten Stärkepulvers vermischt; worauf Tabletten für die orala Verabreichung geformt wurden. Diese Tablette entspricht einer Dosierung von 10 hitzebehandelten Zellen/kg Körpermasse für einen Erwachsenen mit einer Körpermasse von 50 kg«

(2) Das CRP-Protein könnte desgleichen gleichmäßig mit Verdunnungsgrundstoffen wie etwa Calciumcarbonat, Laktose usw., mit Schmälzmitteln wie etwa Stearinsäure, Talkum usw. wie auch mit anderen Zusatzstoffen versetzt werden, worauf Tabletten für die orale Verabreichung geformt werden können. Diese Tablette entspricht einer Tagesösis von 0,1 rag/kg bis 100 mg/kg Körpermasse*

(3) Das CRP-Protein (900 rag) wurde in destilliertem Wasser (30 ml) suspendiert und aufgelöst, wobei das Wasser mit Sirup gesüßt worden war. ^bodann wurden aus dieser Formulierung Sirupe gebildet« .

Claims

i&cf indungsanapruoh

1. Verfahren zur Herstellung eines hypocholesterolämiach aktiven Proteins mit Fähigkeit zur Reduzierung des Blutoholesterols fiei Säugern, welches die folgenden Charakteristika aufweist:

(a) Durch Gelfiltration bestimmte relative Molekülmasse:

30 000 + 7 000

(b) Isoelektrischer Punkt: 7,9 + 0,2

(c) Aminosäurenzusammensetzung (Molprozent): Glycin 25,23 Alanin 10,98

(d) Mektrophoresemuster:

bei Polyacrylamidgel-ßlektrophorese ein scharfes Band auf der Anodenseite, sowie gegebenenfalls einer pharmazeutischen Zusammensetzung hiervon,

gekennzeichnet durch Kultivieren eines zur Gattung

Streptococcus gehörenden Mikroorganismus in einem dafür geeigneten Kulturmediums sowie Sammeln des hypooholesterolämisch aktiven Proteins der Kultur und gegebenenfalls Hinzufügen eines geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoffes zu dem auf diese Weise gewonnenen Produkts und Bereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung«
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem genannten Mikroorganismus um mindestens ein Mitglied jener Gruppe handelt, die sich aus 8, faecium, S„ faecalis, S„ avium, S. bovis, S, selivarius, S. durans, S₈ mitis und S, equinus zusammensetzt,
3. Verfahren nach Punkt 1 _? gekennzeichnet dadurch, daß

es sich bei dem genannten Mikroorganismus um mindestens einen Stamm aus ^eher Gruppe handelt, die sich aus S₀ faecium PERM BP-296,' S₆ faecalis FBRM BP-297, S.. avium Fx-JRM BP 298, S, salivarius BP-299, S₉ durans PiSRM BP-300, S« mitis ΪΕΚΜ ΒΡ-30Ί und S₀ equinus FSRM BP-302 zusairnneneetate
4. Verfahren nach Punkt 1₉ gekennzeichnet dadurch, daß das hypocholesterolämisch aktive Protein von der Kultur abgesammelt wird, indem die geernteten Bakterienzellen in der Kultur zerstört werden und daraus eine Proteinfraktion abgeschieden wird©

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