DE3015030C2

DE3015030C2 -

Info

Publication number: DE3015030C2
Application number: DE3015030A
Authority: DE
Inventors: Jean Boulogne-Billancourt Fr Florent; Jean Paris Fr Lunel; Geb. Courtillet Denise Charenton Fr Mancy; Bernard Yerres Fr Vuillemin
Original assignee: RHONE-POULENC INDUSTRIES PARIS FR
Current assignee: RHONE-POULENC INDUSTRIES PARIS FR
Priority date: 1979-04-18
Filing date: 1980-04-18
Publication date: 1988-09-08
Also published as: SE8002898L; FI67571B; FI67571C; JPS6251275B2; AT370129B; IT8021495A0; IL59842A0; AU538492B2; GB2046759B; JPS5611795A; IT1209323B; NO155103B; PT71107A; FI801251A; ES8200920A1; GB2046759A; DK163980A; CA1122526A; SU1042602A3; CH646873A5

Description

Die Erfindung betrifft die neue Substanz, gemäß Anspruch 1, dessen Herstellungsverfahren gemäß den Ansprüchen 2-5, Arzneimittel gemäß Anspruch 6 und den neuen Mikroorganismus gemäß Anspruch 7.

Die Substanz 41 200 RP gemäß der Erfindung, welche nach der Behandlung der aus Micrococcus sedogenes M78=NRRL B-3505 isolierten Zellen mit Lysozym, Ausfällung der Verunreinigungen mit Calciumchlorid, Entfernung der Proteine durch Behandlung mit Phenol und anschließend Fraktionierung auf dem Molekularsieb erhalten wird, besteht im wesentlichen aus 11 bis 18% Aminosäuren (wovon 5,5 bis 7,5% Alanin sind), 10 bis 17% Glucose, 10 bis 17% Aminozucker und weniger als 5% Nucleinsäuren.

Die Substanz 41 200 RP, welche im allgemeinen mit einem Wassergehalt zwischen 2 und 6% isoliert wird, ist ein weißes, wasserlösliches, amorphes Pulver, enthaltend Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Phosphor, Schwefel, Chlor, Natrium und Calcium. Seine Elementarzusammensetzung (berechnet auf Trockensubstanz) ist in etwa:

% C = 45-47; % H = 7,1-7,6; % O = 35-38 (durch Differenz); % N = 4,0-5,7; % P = 0,9-1,2; % Cl = 0,1-0,4; % S unter 0,5; % Na = 2,0-3,0; % Ca = 0,9-1,9.

Das Verfahren zur Herstellung der Substanz 41 200 RP besteht im wesentlichen darin, daß eine wäßrige Suspension von Zellen (welche vorzugsweise getrocknet und gegebenenfalls bei einem pH von etwa 3 und bei einer Temperatur von etwa 120°C während 30 bis 60 Minuten behandelt worden waren), welche aus Kulturen von Micrococcus sedogenes M78=NRRL B-3505 isoliert sind, unter bestimmten und weiter unten präzisierten Bedingungen hinsichtlich Temperatur, pH-Wert und Dauer mit Lysozym behandelt werden, daß das Rohprodukt aus der flüssigen Phase der erhaltenen Suspension in Salzform isoliert und daß es gereinigt wird durch fortschreitende Ausfällung der Verunreinigungen mittels Calciumchlorid, anschließend durch Behandlung mit Phenol zur Entfernung von im wesentlichen des größten Teils der Proteine und schließlich durch Fraktionierung auf einem Molekularsieb, wobei die Fraktion mit hohem Molekulargewicht, d. h. zwischen 5×10⁵ und 5×10⁶ gesammelt wird (vgl. Anspruch 2).

Im allgemeinen wird das Lysozym in einer Menge von 2 bis 20 mg pro g eingesetzter Trockenzellen verwendet. Die Behandlung erfolgt bei einem konstanten pH-Wert zwischen 6,5 und 8, vorzugsweise bei etwa 7, während 1 bis 3 Stunden, vorzugsweise während 2 Stunden und bei einer Temperatur von etwa 37°C, wobei energisch gerührt wird.

Die flüssige Phase der erhaltenen Suspension wird im allgemeinen durch Zentrifugieren abgetrennt und die in ihr befindlichen Produkte mit geringem Molekulargewicht werden entweder durch Dialyse durch eine Membran geeigneter Porosität oder durch Ultrafiltration entfernt. Die so erhaltene Rohsubstanz kann in Salzform durch Lyophilisieren aus ihrer Lösung isoliert werden. In diesem Stadium der Herstellung besteht die erhaltene Substanz im wesentlichen aus Proteinen, Nucleinsäuren, Aminozuckern und weniger als 5% Polysacchariden und ihre Elementarzusammensetzung ist etwa die folgende:

% C = 41,5-44,9; % H = 5,6-5,9; % O = 29,4-32,2; % N = 11,2-12,6; % P = 3,2-4,4; % S = 0,1-0,5; % Cl = 0,2-0,4; % schwefelhaltiger Rückstand = 11,4-15,4.

Die rohe Substanz wird gereinigt in wäßriger Lösung bei einer Konzentration von zwischen 10 und 40 g/l, vorzugsweise 20 g/l, durch Zugabe einer konzentrierten Calciumchloridlösung, bis zur Erzielung einer Endkonzentration an Calciumchlorid zwischen 5 und 50 g/l, vorzugsweise 10 g/l. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt, die erhaltene Lösung wird dialysiert (oder ultrafiltriert) und dann mit einem Ionenaustauschharz mit Sulfonsäurefunktion in Alkaliform behandelt. Die erhaltene Substanz, welche mit Nr. 32 919 RP bezeichnet wird, kann aus ihrer wäßrigen Lösung durch Lyophilisieren abgetrennnt werden.

Die Substanz 32 919 RP besteht im wesentlichen aus 24 bis 33% Aminosäuren, 26 bis 33% Nucleinsäuren, 11 bis 17,5% Aminozuckern (Bestimmung nach der Methode Elson-Morgan und die Ergebnisse sind ausgedrückt in Glucosamin) und 2,8 bis 4,3% Polysacchariden und ihre Zusammensetzung ist in etwa:

% C = 44-48; % H = 5,2-6,7; % O = 29-33; % N = 10,0-11,6; % P = 2,3-3,7; % S unter 0,5; % Na = 3,0-3,8; % Ca = 0,15-0,50.

Die Substanz 32 919 RP wird von neuem gereinigt, indem in folgender Weise vorgegangen wird:
Eine wäßrige Lösung der Substanz 32 919 RP, deren Konzentration an Substanz 32 919 RP zwischen 10 und 50 g/l, vorzugsweise 25 g/l beträgt, wird mit einem gleichen Volumen eines Gemisches aus Phenol und Wasser (enthaltend vorzugsweise 10% Wasser) während 15 bis 60 Minuten, vorzugsweise 30 Minuten, bei einer Temperatur von etwa 65°C gewaschen. Nach dem Abkühlen wird die wäßrige Phase abgetrennt und mit einem chlorierten Lösungsmittel, vorzugsweise Chloroform bis zur Entfernung des gelösten Phenols gewaschen, dann wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die wäßrige, die aktive Substanz enthaltende Phase wird lyophilisiert.

Das so erhaltene Produkt wird in Wasser, das mittels eines Alkaliacetats, wie Natriumacetat, auf pH 7 gepuffert ist, gelöst. Die so erhaltene Lösung wird einer Fraktionierung auf dem Molekularsieb mit hoher Porosität, wie beispielsweise "Ultragel Ac A 22" "Sepharose 4 B", oder "Sepharose CL 4 B" unterworfen, wobei die Fraktion mit hohem Molekulargewicht gesammelt wird. Die Substanz 41 200 RP wird dann aus ihrer Lösung durch Lyophilisieren nach verlängerter Dialyse gegen demineralisiertes Wasser isoliert.

Der Mikroorganismus Micrococcus sedogenes M78=NRRL B-3505, dessen Züchtung unter geeigneten Bedingungen die Zellen liefert, welche zur Herstellung von 41 200 RP verwendet werden, ist als eine neue Spezies anzusehen, die zu dem Genus Micrococcus gehört.

Sie wurde aus einer Erdprobe isoliert, die in Brasilien nach den für die Isolierung von Mikroorganismen üblichen Methoden entnommen wurde. Eine Probe dieses Stammes wurde im Northern Regional Research Laboratory des US-Departments of Agriculture in Peoria, Illinois (USA) hinterlegt, wo sie am 14. August 1968 unter der Nummer NRRL B-3505 registriert wurde.

Diese erste Stelle ist authorisiert, den Stamm an Jeden, der von dem vorstehenden Dokument statthaft Kenntnis hat, zu verteilen.

Die Eigenschaften dieses Mikroorganismus wurden in Übereinstimmung mit den verschiedenen Identifikationsmethoden bestimmt, welche in dem "Manual of Microbiological Methods", Society of American Bacteriologists, Mc. Graw-Hill Book Company, New York (1957) zusammengefaßt sind sowie in den folgenden Werken J. Dumas, "Bact´riologie M´dicale", Editions M´dicales Flammarion, Paris (1951); S. Lambin und A. German, "Pr´cis de Microbiologie", Collection des Pr´cis de Pharmacie, Masson, Paris (1961); H. Cassagne, "Milieux de culture", Editions de la Tourelle, Paris (1961); Skerman, "Guide to the Identification of the Genera of Bacteria", The Williams and Wilkins Company, Baltimore (1967).

Die Bestimmung des Genus wurde nach dem Identifikationsschlüssel aus "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7th edition, The Williams and Wilkins Company, Baltimore (1957) vorgenommen.

Das Studium der morphologischen Eigenschaften des Stamms M78 wurde auf statischen Kulturen von 24 Stunden bei 26°C bewirkt. Diese Kulturen bestehen aus cocciformen, Gram-positiven, nicht säureresistenten, unbeweglichen Zellen von 1 µm bis 1,3 µm Durchmesser, welche isoliert oder zu zwei oder vier Zellen gruppiert sind oder in Ketten von 4 bis 16 Zellen vorhanden sind oder auch in unregelmäßigen Haufen von 20 bis 50 Zellen vorliegen. Die Anwesenheit von Sporen wurde nicht beobachtet.

Die Kulturen auf geneigter Nährgelose haben das Aussehen eines reichlichen, fetten Überzugs, glatt oder sehr wenig runzlig, geruchlos, nicht homogen, von weicher Konsistenz. Die Kulturen auf Nährgelose in Petrischalen liegen in Form von runden Kolonien mit regelmäßigen Rändern und glatter Oberfläche vor; diese Kolonien sind abgeplattet oder leicht konvex und mehr oder weniger opak.

Die Kulturen in Glucosenährbouillon sind mäßig trüb, ohne Pigment, geruchlos und mit einem flockigen Sediment.

Kultiviert auf Kartoffeln, bildet der Stamm M78 einen fetten, glatten, sehr hellgelb-weißlichen Überzug ohne Schwärzung der Kartoffel oder des löslichen Pigments.

Das Studium der biochemischen Eigenschaften wurde auf bei 26°C inkubierten Kulturen durchgeführt. Die Gesamtheit der beobachteten Resultate ergibt folgendes:

Respirationstyp:Strikt aerob Reduktion von Nitraten zu Nitriten:Positiv Chromogenese:Negativ Indolproduktion:Negativ H₂S-Produktion:Negativ Verflüssigung der Gelatine:Negativ in 21 Tagen Hydrolyse des Caseins:Positiv Test mit Methylrot:Negativ Untersuchung des Acetyl-Carbinols
(Reaktion nach Voges-Proskauer):Negativ Züchtung auf Magermilch:Keine Koagulation, keine Peptonisation, Alkalischmachen des Milieus von pH 6,1 bis pH 7,5 zwischen dem 1. und 21. Tag Optimale Entwicklungstemperatur: 4°C - keine Entwicklung
22°C - gute Entwicklung
26°C - sehr gute Entwicklung
30°C - gute Entwicklung
37°C - mittelmäßige Entwicklung
45°C - keine Entwicklung Katalyse:Positiv Oxidase:Negativ

Bildung von Säuren aus den Gluciden und den Polyalkoholen (aerob und anaerob) entwickelt durch Umschlagen von Phenolrot:

Glucose:Negativ Galaktose:Negativ Arabinose:Negativ Saccharose:Negativ Lactose:Negativ Mannit:Negativ Glycerin:Negativ Hydrolyse der Stärke:Positiv Aesculin-Milieu:Keine Schwärzung

Kultur auf einem Millieu, das mit großen Konzentrationen von NaCl versetzt ist:

4% NaClMittlere Entwicklung 10% NaClKeine Entwicklung Verwendung von Harnstoff
als einzige Stickstoffquelle:Negativ Urease:Negativ Hydrolyse des Chitins:Negativ Kultur auf autotrophem Milieu mit
(NH₄)₂SO₄ als einziger Stickstoff-
quelle:Keine Entwicklung, keine Bildung von Nitriten aus NH₄-Ion

Wenn man im Prinzip der Methode von Pridham [Journal of Bacteriology, 56, 107-114 (1948)] folgt, so verwertet der Stamm M78 mittelmäßig oder gut als Kohlenstoffquellen die folgenden Substanzen: Stärke, Äthanol, Natriumacetat, Natriumpropionat, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, Natriumcitrat, Natriumpyruvat. Folgende Substanzen werden nicht verwertet oder ermöglichen nur eine geringe Entwicklung: Ribose, Arabinose, Glucose, Lactose, Maltose, Saccharose, Trehalose, Glycerin, Mannit, Inosit, Glutarsäure, Natriumtartrat, Galacturonsäure.

Die Untersuchung der Stickstoffquellen, welche von dem Stamm M78 für seine Entwicklung verwertbar sind, wurde nach derselben Methode durchgeführt, wobei das Natriumcitrat als Kohlenstoffquelle verwendet wurde und das NH₄H₂PO₄ des Basismilieus durch verschiedene Stickstoffverbindungen ersetzt wurde. Unter diesen Bedingungen werden die folgenden Verbindungen gut oder mittelmäßig verwertet: NaNO₃, NaNO₂, NH₄H₂PO₄, DL-Asparagin, Succinimid, Glycin, DL-Alanin, DL-Asparaginsäure, DL(+)-Glutaminsäure, L(-)-Tyrosin, DL-Prolin. Nicht verwertet werden: Adenin, Uracil, Kreatinin, D(+)-Glucosamin, Sarcosin, L(+)-Arginin, DL-Methionin, Betain.

Indem man sich auf den Identifikationsschlüssel von "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7^th edition, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1957 bezieht, ermöglicht die Tatsache, daß die untersuchten Bakterienzellen keine photosynthetischen Pigmente enthalten, daß sie unfähig sind, sich auf einem Milieu für Autotrophe zu entwickeln, daß sie sich durch Teilung fortpflanzen, daß sie sphärisch isoliert in kurzen Ketten oder in unregelmäßigen Anhäufungen vorliegen und daß sie keine Trichome besitzen, den Stamm M78 in die Ordnung der Eubacterialen (Buchanan, 1917) zu klassifizieren bzw. einzuordnen.

Andererseits ist das Bakterium M78 sphärisch, Gram-positiv, strikt aerob, reduziert die Nitrate in Nitrite, ist unfähig, die Glucide in Anaerobiose zu fermentieren und bildet keine Sporen: Diese Charakteristika ermöglichen es, es in die Familie der Micrococcaceae (Pribram, 1929) einzuordnen.

Diese Familie ist in 6 Genera unterteilt, welche in zwei Gruppen je nach dem Respirationstyp aufgeteilt sind: Diese Unterscheidung ermöglicht es, das Bakterium M78 in die erste Gruppe einzuordnen, welche die Genera Micrococcus, Staphylococcus, Gaffkya und Sarcina umfaßt. Diese Gruppe ist in zwei Untergruppen gespalten, welche durch die Art, wie deren Zellen gruppiert sind, charakterisiert sind. Die untersuchten Bakterienzellen sind nicht systematisch in Tetraden und Bündeln von 8 Zellen vorhanden: Diese Eigenschaft führt dazu, den Stamm M78 entweder in den Genus Micrococcus oder in den Genus Staphylococcus einzuordnen.

Eine große Anzahl von Eigenschaften und insbesondere die Tatsache, daß der Stamm M78 unfähig ist, die Glucose in Anaerobiose zu fermentieren und daß strikte aerobe Bedingungen vorhanden sind, ermöglicht es, ihn mit dem Genus Micrococcus in Zusammenhang zu bringen.

Um eine größere Genauigkeit zur Bestimmung des Genus zu ergeben, hat man für zahlreiche Tests Vergleiche mit Staphylococcus areus 209 P, Neisseria catarrhalis A 152 (IP), Streptococcus faecalis ATCC 8043, Streptococcus faecalis ATCC 9790 durchgeführt, was erlaubte diese verschiedenen Genera mit cocciformen Zellen zu entfernen und von denen gewisse, zu anderen Familien als die Micrococcaceae gehören.

Unter den 16 beschriebenen Spezies, welche zum Genus Micrococcus gehören, denen sich der Stamm M78 am meisten nähert, sind die folgenden: Micrococcus varians, Micrococcus caseolyticus und Micrococcus colpogenes.

Der Stamm M78 differiert insbesondere von Micrococcus varians durch die Nichtbildung von Säuren ausgehend von Glukose, Lactose, Saccharose, Glycerin, Mannit und durch die Nichtsäuerung der Milch.

Er differiert von Micrococcus caseolyticus durch die Abwesenheit von Verflüssigung der Gelatine, Peptonisation der Milch und Erzeugung von Säuren ausgehend von Glucose, Lactose, Mannit, Glycerin.

Der Stamm M78 ist auch verschieden von Micrococcus colpogens durch die wesentliche Tatsache, daß er das Chitin nicht hydrolysieren kann und daß er mehr Urease-negativ ist.

Der untersuchte Stamm weist definitiv mit den beschriebenen Gattungen des Genus Micrococcus Differenzen auf, die es erlauben, ihn als eine neue Spezies anzusehen.

Das Verfahren zur Herstellung der Zellen, welche zur Herstellung von 41 200 RP verwendet werden, besteht darin, den Micrococcus sedogenes, Stamm M78 auf einem geeigneten Milieu und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und dann die Zellen, welche sich im Verlaufe der Züchtung vermehrt haben, abzutrennen.

Die Züchtung des Micrococcus sedogenes, Stamm M78 kann nach jeder aeroben Züchtungsmethode auf der Oberfläche oder submers bewirkt werden, jedoch ist die letztere aus Gründen der Bequemlichkeit vorzuziehen. Man verwendet zu diesem Zweck die üblichen Beimpfungs- und Fermentationstechniken und die verschiedenen Apparatetypen, welche in der Industrie der Fermentationen üblicherweise im Gebrauch sind.

Das Fermentationsmilieu soll im wesentlichen assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoff-, Phosphor- und Schwefelquellen, mineralische Bestandteile und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Bestandteile in Form von wohldefinierten Produkten oder komplexen Mischungen, wie man sie in den biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs finden kann, eingebracht werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kann man Kohlehydrate wie die Dextrine, Stärke oder andere kohlenstoffhaltige Substanzen wie Alkohol (Äthanol) oder wie gewisse organische Säuren: Milchsäure, Zitronensäure, verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche Öle, wie Specköl oder Sojaöl können vorteilhaft diese verschiedenen Kohlenstoffquellen ersetzen oder ihnen zugefügt werden.

Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschieden. Es können sehr einfache chemische Substanzen sein wie mineralische oder organische Ammoniumsalze oder gewisse Aminosäuren. Sie können auch durch komplexe Substanzen, welche den Stickstoff hauptsächlich in Eiweißform enthalten, eingebracht werden: Casein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysate, Sojamehl, Arachismehl, Fischmehl, Fleischextrakte, Hefeextrakte, lösliche Rückstände von der Destillation von Alkohol aus Korn, Maisquellwasser.

Der Schwefel und der Phosphor werden im allgemeinen in ausreichender Menge durch die oben erwähnten komplexen Substanzen eingebracht. Sie können auch in Form von Sulfaten und Phosphaten eingebracht werden.

Unter den zugefügten mineralischen Bestandteilen können gewisse einen Puffer- oder neutralisierenden Effekt haben wie die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder die Calcium- oder Magnesiumcarbonate. Andere tragen zum ionischen Gleichgewicht, das während der Entwicklung des Micrococcus sedogenes, Stamm M78 notwendig ist, bei, wie die Alkalimetall- oder Erdalkalimetallchloride und -sulfate oder die Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer- oder Mangansalze.

Der pH-Wert des Fermentationsmilieus zu Beginn der Züchtung soll zwischen 6,0 und 7,8, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5 liegen. Die optimale Temperatur zur Fermentation ist zwischen 25 und 30°C, jedoch kann eine befriedigende Erzeugung auch für Temperaturen zwischen 20 und 35°C erreicht werden.

Die Belüftung der Fermentation kann in ziemlich weiten Grenzen variieren. Man hat jedoch gefunden, daß Belüftungen von 0,3 bis 31 Luft/l Brühe und pro Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute wird nach 8 bis 20 Stunden Züchtung, vorzugsweise nach 15 Stunden, erreicht, wobei diese Zeit im wesentlichen vom verwendeten Milieu abhängt.

Der pH-Wert des Fermentationsmilieus bei Beendigung der Züchtung liegt im allgemeinen zwischen 7,3 und 8,8 und es ist vorzuziehen, daß er zwischen 8,0 und 8,4 liegt.

Der Microorganismus Micrococcus sedogenes, Stamm M78 wird dann aus dem Fermentationsmedium durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt, vorteilhaft nachdem das Letztere bis zu einem pH-Wert von etwa 3 durch Zugabe einer Mineralsäure wie Salzsäure angesäuert wurde. Für die späteren Behandlungen kann man entweder die so erhaltenen rohen Zellen verwenden oder eine Dehydratisierung durch Lyophilisierung oder durch Waschen mit Alkohol oder einem Keton und dann Trocknen unter vermindertem Druck bewirken, um die gereinigten trockenen Zellen zu erhalten. Es kann besonders vorteilhaft sein, die erhaltenen Zellen einem Erhitzen bei einer Temperatur zwischen 120 und 130°C während 30 bis 60 Minuten vor der späteren Verwendung zu unterwerfen.

Die neue Substanz 41 200 RP gemäß der Erfindung zeigt bedeutende und nützliche biologische Eigenschaften.

Intravenös, subcutan, intraperitoneal oder intranasal an Mäuse verabreicht, erhöht die erfindungsgemäße Substanz in bedeutender Weise die Beständigkeit der Mäuse gegen Infektion durch normalerweise tödliche Dosen von virulenten Bakterienstämmen wie Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli und Viren wie Virus der Encephalomyocarditis, der Maushepatitis der Grippe (menschliche Viren adaptiert an die Maus, Typ A₀ und A₂), des Herpes und des Arbovirus Semliki-Forest. Der erhöhte Widerstandszustand dauert mindestens 96 Stunden nach der Behandlung an.

Verabreicht auf parenteralem Wege an Mäuse, stimuliert dieses Produkt stark die phagocytäre Kraft des reticulo-endothelialen Systems und erhöht in der Milz die Anzahl der Lymphocyten, welche die Antikörper erzeugen. Es übt eine stimulierende Wirkung auf die Hypersensibilitätsreaktionen vom verzögerten Typ und die Produktion von Antikörpern gegenüber gewissen Antigenen aus.

Bei der Maus, welcher Tumorzellen eingepflanzt wurden (wie die Zellen des Sarcoms 180) begünstigt dieses Produkt die Abstoßung der Tumoren, indem es eine nekrotische Reaktion in ihrem Bereich hervorruft.

Unter gewissen Bedingungen erhöht das erfindungsgemäße Produkt die Zahl und/oder die cytolytische Aktivität der Lymphocyten T der Milz gegenüber den allogenischen Tumorzellen.

Beim Tier (Maus) sind je nach dem angewandten experimentellen System und den Verabreichungswegen die aktiven Dosen im allgemeinen zwischen 0,03 und 3 mg/kg und vorzugsweise zwischen 0,3 und 1 mg/kg. Im allgemeinen genügt eine einzige Behandlung, um den gewünschten Effekt während einer Zeitdauer von wenigstens 48 Stunden zu erreichen.

Bei der Maus beträgt die 50%ige letale Dosis (DL₅₀) des 41 200 RP bei intravenöser Verabreichung etwa 23 mg/kg.

Im folgenden sind:

- die Proteine nach der Analyse der Aminosäuren ausgedrückt,
- die Glucose durch die Methode mit Anthron bestimmt,
- der Phosphor durch die Molybdat-Methode nach Mineralisierung dosiert,
- der Gehalt an Nucleinsäuren durch die Absorption bei 258 nm bestimmt,
- die Aminozucker nach der Methode von Elson-Morgan bestimmt und in Glucosamin ausgedrückt entweder durch Bestimmung mit Ninhydrin durch Analyse und Abtrennung mittels eines Autoanalysators Biotronik LC 6000 E.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1 (A) - Herstellung der Zellen

Man gibt in ein Fermentationsgefäß von 170 l:

Pepton1200 g Fleischextrakt600 g Sojaöl1200 ccm Leitungswasser, Auffüllen auf110 l

Der pH-Wert wird auf 6,90 durch Zugabe von 10 N Natronlauge eingestellt, dann sterilisiert man das Milieu durch Durchleiten von Dampf bei 122°C während 40 Minuten. Nach dem Abkühlen ist das Volumen der Brühe aufgrund der Kondensation des Dampfs im Verlaufe der Sterilisation 120 l; der pH-Wert des Milieus beträgt 6,70. Man beimpft mit 200 ccm einer bewegten Erlenmeyer-Kultur von Micrococcus sedogenes, Stamm M78.

Die Kultur wird bei 27°C während 14 Stunden unter Rühren und bei Belüften mit steriler Luft entwickelt; sie ist dann geeignet für die Beimpfung der Erzeugerkultur.

Die Erzeugerkultur wird in einem Fermentationsgefäß von 800 l bewirkt, das mit folgenden Substanzen beschickt ist:

L-Milchsäure4 kg Sojaöl2 l Ammoniumsulfat2,4 kg Natriumchlorid2 kg Monokaliumphosphat0,4 kg Magnesiumsulfat, 7H₂O0,8 kg Kupfersulfat, 5H₂O0,02 kg Zinksulfat, 7H₂O0,12 kg Kobaltchlorid, 6H₂O0,008 kg Leitungswasser, Auffüllen auf370 l

Der pH-Wert des Milieus wird durch Zugabe von 2950 ccm 10 N Natronlauge auf 7,10 eingestellt, dann sterilisiert man die Brühe durch Durchleiten von Dampf von 122°C während 40 Minuten. Nach dem Abkühlen ist das Volumen der Brühe aufgrund der Kondensation des Dampfs im Verlaufe der Sterilisation 400 l; sein pH-Wert beträgt 4,20 und wird durch Zugabe von 2100 ccm einer wäßrigen 5 N Natronlaugelösung auf 6,60 eingestellt.

Man beimpft dann mit 40 l der Impfkultur aus dem oben beschriebenen 170 l-Fermentationsgefäß. Die Kultur wird bei 27°C während 16 Stunden unter Rühren mit einer Turbine mit 205 U/Minute und unter Belüftung mit einem Volumen steriler Luft von 15 m³/ Stunde entwickelt.

Am Ende des Arbeitsganges beträgt der pH-Wert der Züchtung 8,20 und das Volumen der Brühe 440 l.

Die so erhaltene Brühe wird auf +4°C abgekühlt und der pH-Wert durch Zugabe von 4 Liter 5 N Salzsäure auf 3 eingestellt; die Zellen werden durch Zentrifugieren mit 4000 U/Minute (2900 g) isoliert.

Die Zellen werden mit 80 l Äthanol bei -10°C aufgenommen, wobei während 15 Minuten gerührt wird, dann werden sie durch Zentrifugieren isoliert und bei 35°C unter vermindertem Druck (5 mm Hg) während 15 Stunden getrocknet. Man erhält so 1500 g trockene Zellen.

(B) Herstellung von 32 919 RP

1 kg der wie unter (A) beschrieben hergestellten Zellen werden in 40 l sterilem destilliertem Wasser suspendiert, in einem Reaktionsgefäß aus rostfreiem Stahl, das mit einem Doppelmantel versehen ist, der durch Zirkulation von Wasser und energisches zentrales Rühren auf konstanter Temperatur gehalten wird. Der pH- Wert wird durch Zugabe von 10 N Natronlauge auf 7,0 eingestellt.

Man gibt dann 2 g Lysozym zu und rührt während 2 Stunden bei 37°C, wobei der pH-Wert durch Zugabe von 5 N Natronlauge periodisch wieder auf 7,0 eingestellt wird.

Das Gemisch wird dann auf einer Sharples M 16 Maschine (2 aufeinanderfolgende Durchgänge von 17 000 U/Minute mit einem Verbrauch von 30 l/Stunde) zentrifugiert. Das Überstehende (37 l) wird ultrafiltriert (Apparat UFP 20, ausgestattet mit einer Acrylmembran Iris 3042), indem das Retentat recycliert und 3×40 l demineralisiertes, auf +4°C abgekühltes Wasser zugegeben wird.

Man gewinnt so 7 l konzentriertes Retentat, das von seinen kleinen Molekülen (Molekulargewicht unter etwa 25 000 Dalton) befreit ist. Sein pH-Wert wird durch eine Lösung von 5 N Natronlauge wieder auf 7 eingestellt, dann wird die erhaltene Lösung lyophilisiert.

Man erhält so 147 g Rohprodukt.

31 g dieses Produkts werden in 1550 ccm entmineralisiertem Wasser bei einer Temperatur von etwa 20°C unter Rühren während 30 Minuten gelöst; man gibt dann innerhalb von 5 Minuten und unter weiterem Rühren 31 ccm einer wäßrigen Lösung von 668 g/l Calciumchloriddihydrat zu; man hält das Rühren noch 30 Minuten aufrecht. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren auf der Laboratoriums- Sharples-Maschine mit 40 000 U/Minute mit einem Verbrauch von 5 l Wasser/Stunde entfernt. Das Überstehende wird auf einer Zellulosemembran während 3 Tagen bei +4°C gegen 3×40 l entmineralisiertes Wasser dialysiert.

Das Retentat wird dann in einen Kolben mit 310 ccm Polystyrolsulfonsäureharz Dowex 50 X2, Natriumzyklus unter Rühren während 1 Stunde behandelt; das Harz wird abfiltriert und auf dem Filter mit 310 ccm Wasser gewaschen.

Die Waschwässer werden zu dem Filtrat gegeben und das Ganze wird lyophilisiert.

Man erhält so 17 g 32 919 RP in Salzform, dessen Charakteristika die folgenden sind:

- Aussehen:Weißes Pulver, - Zusammensetzung:Wasser (Fischer) = 15,7%
Trockensubstanz:
  - Proteine (Summe der Aminosäuren) = 24,6%
  - Polysaccharide = 3,9%
  - Nucleinsäuren = 28,9% nach dem UV-Spektrum - Elementaranalyse:C = 46,30, H = 5,84, O (durch Differenz) = 30,71, N = 10,04, P = 3,11, S unter 0,5, Na = 3,70, Ca = 0,30%.

(C) Reinigung des 31 219 RP

25 g Substanz 32 919 RP, welche unter den Bedingungen des Beispiels (B) erhalten wurden, werden in 1 l entmineralisiertes Wasser, das in einem Reaktionsgefäß von 2 l enthalten ist, das mit einem Rührer und einer Temperaturregelungsvorrichtung versehen ist, gegeben; man gibt 1 l eines Gemisches aus Phenol/Wasser (109 ccm Wasser/1 kg Phenol) zu. Das Gemisch wird auf 65°C unter energischem Rühren erwärmt. Das Rühren wird während 30 Minuten bei dieser gleichen Temperatur vorgenommen. Nach raschem Abkühlen des Reaktionsgefäßes mittels eines Eisbades auf eine Temperatur von 25°C trennt man die Phasen durch Zentrifugieren bei 3300 g während 30 Minuten auf einer gekühlten Laboratoriumsmaschine (Jouan Typ K 63 F, Kapazität 4 l).

Man erhält so 450 ccm wäßrige Phase.

Die Phenolphase und die Interphase werden von neuem mit 1 l entmineralisiertem Wasser während 30 Minuten bei 65°C extrahiert; nach dem Abkühlen und Zentrifugieren, wie oben angegeben, erhält man von neuem 1470 ccm wäßrige Phase.

Die wäßrigen Phasen werden vereinigt. Das Phenol wird durch zweimalige aufeinanderfolgende Waschungen mittels jeweils 2 l Chloroform entfernt. Die wäßrigen Phasen werden dann durch Zentrifugieren während 30 Minuten bei 3300 g geklärt. Man erhält so 1800 ccm wäßrige Phase.

Diese geklärte wäßrige Phase wird dann während 3 Tagen bei +4°C gegen 3×40 l entmineralisiertes Wasser dialysiert. Das Retentat wird lyophilisiert und man erhält so 14,5 g eines weißen amorphen Pulvers.

Man löst 8 g dieses Pulvers in 400 ccm sterilem, 0,1 M Natriumacetatpuffer vom pH 7 (man löst 136,09 g Natriumacetat analysenrein in 0,9 l demineralisiertem Wasser, dann stellt man den pH- Wert auf 7,0 durch Zugabe von Essigsäure (d = 1,049) ein und füllt auf 1 l auf; die Sterilisation wird durch Erhitzen während 45 Minuten bei 120°C bewirkt; diese Lösung wird auf ein Zehntel mit sterilem entmineralisiertem Wasser gerade im Augenblick des Gebrauchs verdünnt).

Die erhaltene Lösung wird auf eine Säule von Sepharose CL 4 B^(R) (Durchmesser 13,5 cm, Höhe 65 cm), die in einem Kühlraum (+4°C) installiert ist und mit sterilem 0,1 M Natriumacetatpuffer vom pH 7,0 gefüllt ist, gegossen. Das Eluieren wird mit demselben Puffer mit einem Verbrauch von 1,33 l/Stunde, wobei kontinuierlich das Absorptionsvermögen des Eluats bei 230 nm unter 0,1 cm registriert wird, bewirkt.

Man sammelt zuerst eine Fraktion von 3,13 l, welche entfernt wird. Die folgende Fraktion (1,22 l), welche einem Absorptionspeak bei 230 nm entspricht, wird in eine Röhre von regenerierter Cellulose Nojax^(R) eingeführt und wird bei +4°C während 3 Tagen gegen 3×40 l entmineralisiertes Wasser dialysiert und dann wird das Retentat (1300 ccm) lyophilisiert. Der erhaltene feste Stoff wird in 93 ccm entmineralisiertem Wasser aufgenommen und die Lösung wird mit derselben Membran, wie oben, während 48 Stunden bei +4°C gegen 2×20 l entmineralisiertes Wasser dialysiert. Das Retentat wird lyophilisiert. Man erhält so 1,3 g Substanz 41 200 RP, deren Charakteristika die folgenden sind:

- Aussehen:Weißes amorphes Pulver - UV-Spektrum:Dieses Spektrum ist in Fig. 1 dargestellt - Infrarotspektrum: (Bestimmt aus Preßlingen, vermischt mit KBr).

Dieses Spektrum ist in Fig. 2 dargestellt, wobei man in der Abszisse einerseits die Wellenlängen ausgedrückt in Micron (oberer Rand) und andererseits die Wellenzahlen in cm^-1 (unterer Rand) aufgetragen hat und auf der Ordinate ist der Prozentsatz Transmission angegeben.

In der folgenden Tabelle sind die hauptsächlichen Banden der Infrarot- Absorption der Substanz 41 200 RP ausgedrückt in Wellenzahlen ausgedrückt in cm^-1 zusammengestellt:

- Zusammensetzung:Wasser (Fischer) = 3,8%
Trockensubstanz:
  - Aminosäuren = 12,3% (davon 7% Alanin)
  - Glucose = 11,95%
  - Nucleinsäure = unter 1,3% (aufgrund des UV-Spektrums)
  - Aminozucker = 16,3% - Elementaranalyse:C = 45,58, H = 7,47, N = 4,85, O = 37, P = 1,17, Cl = 0,25, Na = 2,36,
Ca = 1,33, S = unter 0,5%.

- Elektrophorese:

In einem Gel mit 1% Agarose mit Barbitalpuffer von pH 8,6 und unter einer Spannung von 6 V/cm wandert das 41 200 RP gegen die Anode mit einer Geschwindigkeit von etwa 11 mm/Stunde (das Produkt wird mit Schiff'schem Reagens nach periodischer Oxidation oder mit Soudan-B-Schwarz sichtbar gemacht.

Beispiel 2

Man arbeitet wie in Beispiel 1 (A). Nach 16 Stunden Züchtung wird die Brühe auf 4°C abgekühlt und der pH-Wert durch Zugabe von Salzsäure auf 3 eingestellt. Die Zellen werden durch Zentrifugieren mit 4000 U/Minute isoliert. Der saure Zellkuchen wird dann im Autoklaven während 45 Minuten bei 122°C erhitzt. Nach dem Abkühlen werden die Zellen mit Äthanol gewaschen und dann getrocknet.

Wenn man dann wie in Beispiel 1 (B) und 1 (C) arbeitet und die gleichen Mengen verwendet, so erhält man 0,55 g Substanz 41 200 RP in Form eines weißen amorphen Pulvers, dessen Charakteristika die folgenden sind:

- Zusammensetzung:Wasser (Fischer) = 6%
Trockensubstanz:
  - Aminosäuren = 17,7% (davon 7,2% Alanin)
  - Glucose = 10,5%
  - Nucleinsäure = unter 3%
  - Aminozucker = 15,2% - Elementaranalyse:C = 46,90, H = 7,32, N = 5,38, O = 35, P = 1,08, Cl = 0,18, Na = 2,26,
Ca = 1,83, S = unter 0,5%.

Das Infrarotspektrum dieses Produkts ist identisch mit demjenigen der Substanz 41 200 RP, welche gemäß Beispiel 1 erhalten wurde.

Die Erfindung betrifft auch die Arzneimittel, welche aus dem erfindungsgemäßen Produkt bestehen und die pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche es zusammen mit einem oder mehreren verträglichen und pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungs- oder Hilfsmitteln und gegebenenfalls mit einem anderen therapeutisch aktiven Produkt, wie einem Antibiotikum enthalten.

Vorzugsweise werden diese Zusammensetzungen parenteral oder intranasal verwendet.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung können sterile wäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen sein. Als Träger kann man in letzterem Fall Propylenglycol, ein Polyäthylenglycol, pflanzliche Öle, insbesondere Olivenöl, und organische, injizierbare Ester, beispielsweise Äthyloleat verwenden. Diese Zusammensetzungen können auch Hilfsmittel enthalten, insbesondere Netzmittel, Emulgiermittel und Dispergiermittel. Die Sterilisation kann auf mehrere Arten erfolgen, beispielsweise indem der Zusammensetzung sterilisierende Mittel einverleibt werden. Sie können auch in Form von festen Zusammensetzungen, welche durch Bestrahlung (β-Strahlen) steril gemacht wurden, hergestellt werden, welche dann in sterilem Wasser gelöst oder in jedem anderen injizierbaren sterilen Milieu dispergiert werden können, gegebenenfalls im Augenblick der Verwendung.

Die Zusammensetzungen zur intra-nasalen Verabreichung können sterile wäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen sein, die gegebenenfalls zusammen mit einem verträglichen Mittel assoziiert sein können.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind besonders nützlich in der Human- und der Veterinärtherapie zur immunologischen Behandlung (Immunotherapie) von Carcinom, gegebenenfalls zusammen mit einem geeigneten chemotherapeutischen Anticarcinommittel oder im Verlaufe von Remissionen, welche durch letzteres eingeleitet wurden.

Die Zusammensetzungen können auch zur Erhöhung der Widerstandsfähigkeit gegen virale, bakterielle, fungische oder parasitäre Infektionen verwendet werden, um die natürliche Widerstandskraft des Organismus, der spezifisch auf diese Infektion wirkt, zu stimulieren, durch intra-nasale Verabreichung die natürlichen Sperren gegen Infektionen des Atmungssystems zu stärken oder um auf die spezifische Immunisierung während der gleichzeitigen Verabreichung einer bakteriell wirkenden viralen oder parasitären Vaccine eine unterstützende Wirkung auszuüben.

Diese Zusammensetzungen erlauben auch die adäquaten immunologischen Reaktionen bei Personen, welche angeborene oder als Folge des Alters oder von immuno-suppressorische Behandlungen immunodefiziente Zustände aufweisen, wiederherzustellen.

In der Humantherapie hängen die Dosen von dem gewünschten Effekt und von der Dauer der Behandlung ab: Sie sind im allgemeinen zwischen 0,1 und 10 mg/Tag für den Erwachsenen bei parenteraler Verabreichung.

Das folgende Beispiel soll eine erfindungsgemäße Zusammensetzung erläutern.

Beispiel

Man stellt eine Lösung her, die 5 g der Substanz 41 200 RP in Salzform, welche vorher durch Bestrahlung mittels β-Strahlen sterilisiert wurde, in 100 ccm steriler injizierbarer Kochsalzlösung enthält. Diese Lösung wird aseptisch in Ampullen von 5 ccm in einer Menge von 2 ccm/Ampulle verteilt. Diese Ampullen werden verschlossen. Sie enthalten jeweils 100 mg aktiven Wirkstoff.

Claims

1. Die neue Substanz, bezeichnet mit der Nummer 41 200 RP, dadurch gekennzeichnet, daß sie, isoliert aus Zellen des Stammes Micrococcus sedogenes NRRL B-3505 ein amorphes weißes Pulver ist, das in wasserfreiem Zustand im wesentlichen aus 11 bis 18% Aminosäuren, 10 bis 17% Glucose, 10 bis 17% Aminozucker und weniger als 5% Nucleinsäuren besteht, deren Elementarzusammensetzung folgendermaßen ist: % C = 45-47; % H = 7,1-7,6; % O = 35-38; % N = 4,0-5,7; % P = 0,9-1,2; % Cl = 0,1-0,4; % S unter 0,5; % Na = 2,0-3,0; % Ca = 0,9-1,9und das sie immunostimulierende Eigenschaften besitzt.

2. Verfahren zur Herstellung der Substanz 41 200 RP des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine wäßrige Suspension von Zellen des Micrococcus sedogenes NRRL B-3505 mit Lysozym bei einem konstanten pH-Wert zwischen 6,5 und 8 während 1 bis 3 Stunden bei einer Temperatur von 37°C behandelt,
b) ein Rohprodukt in Salzform aus der flüssigen Phase der erhaltenen Suspension isoliert und es durch Behandlung mit Calciumchlorid reinigt, um die Substanz 32 919 RP zu erhalten,
c) die Substanz 32 919 RP durch Behandlung ihrer wäßrigen Lösung mit Phenol und anschließende Fraktionierung auf dem Molekularsieb die Fraktionen mit Molekulargewicht zwischen 5×10⁵ und 5×10⁶ gesammelt werden, aus denen man die Substanz 41 200 RP isoliert.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zwischen 2 und 20 mg Lysozym/g eingesetzter Zellen verwendet.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man 5 bis 50 g Calciumchlorid/l Lösung des zu reinigenden Produktes verwendet.

5. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Reinigung der Substanz 32 919 RP in wäßriger Lösung eine wäßrige Phenollösung, enthaltend 90% Phenol, verwendet.

6. Arzneimittel, enthaltend das Produkt gemäß Anspruch 1, gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren verträglichen und pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungs- oder Hilfsmitteln und gegebenenfalls mit einem oder mehreren anderen therapeutisch wirksamen Produkten.

7. Die neue Substanz gemäß Anspruch 1 produzierender Stamm Micrococcus sedogenes NRRL B-3505.