LU82370A1 - Nouvelle substance biologiquement active,sa preparation et les medicaments qui la contiennent - Google Patents

Description

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La présente invention concerne une nouvelle substance biologiquement active, désignée par le numéro 41 200 EP, obtenue à partir de cellules isolées de la culture d'un nouveau microorganisme, désigné par l’appellation Micrococcus sedogenes M 78, 5 son procédé de préparation et les médicaments qui la contiennent.

La substance 41 200 BP selon la présente invention, qui est obtenue après traitement par le lysozyme des cellules isolées de Micrococcus sedogenes souche M 78, précipitation des impuretés par le chlorure de calcium, élimination des protéines par traitement au phénol suivie d’un fractionnement sur 10 tamis moléculaire, est constituée essentiellement par 11 à 18 % d’acides aminés (dont 5,5 à 7,5 % d’alanine), 10 à 17 % de glucose, 10 à 17 % de sucres aminés et moins de 5 % d’acides nucléiques.

Généralement isolée avec une teneur en eau comprise entre 2 et 6 %, la substance 41 200 EP est une poudre blanche hydrosoluble amorphe contenant 15 du carbone, de l’hydrogène, de l’oxygène, de l’azote, du phosphore, du soufre, du chlore, du sodium et du calcium. Sa composition élémentaire (calculée sur sec) est voisine de : G % = 45 - 47 H % = 7,1 - 7,6 0 % = 35 - 38 (par différence) N % = 4,0 - 5,7 P % “-.0,9 - 1,2 Gl % = 0,1 - 0,4 20 S % inférieur à 0,5 Na % = 2,0 - 3,0 Ga % = 0,9 - 1,9

Le procédé de préparation de la substance 41 200 EP consiste essentiellement à traiter par le lysozyme, dans des conditions de température, de pH et de durée déterminées et précisées ci-après, une suspension aqueuse de cellules (de préférence préalablement séchées et éventuellement traitées à 25 pH voisin de 3 et à une température voisine de 120°G pendant 30 à 60 minutes) isolées de cultures de Micrococcus sedogenes souche M 78, à isoler sous forme salifiée le produit brut à partir de la phase liquide de la suspension obtenue, à le purifier par précipitation progressive d’impuretés au moyen de chlorure de calcium puis par traitement au phénol pour éliminer essentiellement la - 30 plus grande partie des protéines et enfin par fractionnement sur un tamis moléculaire en recueillant la fraction de haut poids moléculaire c’est-à-dire 5 g compris entre 5.10 et 5.10 .

Généralement, le lysozyme est utilisé à raison de 2 à 20 mg par gramme de cellules séchées mises en jeu. Le traitement s'effectue à un pH 35 constant compris entre 6,5 et 8, de préférence voisin de 7, pendant 1 à 3 heures, de préférence pendant 2 heures, et à une température voisine de 37 tout en agitant énergiquement. (fi/ i ; f ‘ 2 -* *

La phase liquide de la suspension obtenue est généralement séparée par centrifugation et les produits de faibles poids moléculaires en solution sont éliminés soit par dialyse à travers une membrane de porosité convenable, soit par ultra-filtration. La substance brute ainsi obtenue peut être isolée . 5 sous forme salifiée par lyophilisation de sa solution. A ce stade de la préparation, la substance obtenue est constituée essentiellement par des protéines, des acides nucléiques, des sucres aminés et moins de 5 % de polysaccharides et sa composition élémentaire est voisine de : G % = 41,5 - 44,9 H % = 5,6 - 5,9 0 % = 29,4 - 32,2 N % = 11,2 - 12,6 10 P % = 3,2- 4,4 S % = 0,1 -0,5 Cl % = 0,2- 0,4 • Gendres sulfuriques % = 11,4 - 15,4.

La substance brute est purifiée, en solution dans l’eau à une concentration comprise entre 10 et 40 grammes par litre, de préférence 20 grammes par litre, par addition d’une solution concentrée de chlorure de 15 calcium jusqu’à l’obtention d’une concentration finale en chlorure de calcium comprise entre 5 et 50 grammes par litre, de préférence 10 grammes par litre.

Le précipité formé est éliminé par centrifugation et la solution résultante est dialysée (ou ultrafiltrée) puis traitée par une résine âchangeuse d’ions portant une fonction acide sulfonique sous forme alcaline. La substance obtenue, 20 désignée par le numéro 32919 KP,peut être séparée de sa solution aqueuse par lyophilisation.

La substance 32919 RP est constituée essentiellement par 24 à 33 % d’acides aminés, 26 à 33 % d’acides nucléiques, 11 à 17,5 % de sucres aminés (détermination selon la méthode Elson-Morgan et expression des résultats en 25 glucosamine) et 2,8 à 4,3 % de polysaccharides, et sa composition est voisine de : G % = 44 - 48 H % = 5,2 - 6,7 0 7. = 29 - 33 N 7. = 10,0 - 11,6 P % = 2,3 - 3,7 S % inférieur à 0,5 Na 7. = 3,0 - 3,8 Ga % = 0,15 - 0,50.

La substance 32919 RP est à nouveau purifiée en opérant de la manière suivante : 30 Une solution aqueuse de la substance 32919 RP, dont la concentration en substance 32919 RP est comprise entre 10 et 50 grammes par litre, de préférence 25 grammes par litre, est lavée par un volume égal d'un mélange phénol-eau (contenant de préférence 10 % d’eau) pendant 15 à 60 minutes, de préférence 30 minutes, à une température voisine de 65°C. Après refroidissement, la phase 35 aqueuse séparée est lavée par un solvant chloré, de préférence le chloroforme, / jusqu’à élimination du phénol dissous puis est dialysée contre de l’eau distille. La phase aqueuse contenant la substance active est lyophilisée. /jj % * 4 \ 3

Le produit ainsi obtenu est mis en solution dans l'eau tamponnée à pH 7 au moyen d'un acétate alcalin tel que l'acétate de sodium. La solution ainsi obtenue est soumise à un fractionnement sur tamis moléculaire à haute porosité tel que "Ultragel Ac A 22" de l'Industrie Biologique Française, 5 "Sepharose 4 B" otf'Sépharose CL 4B" de la Société Pharmacia, en recueillant la fraction de haut poids moléculaire. La substance 41200 KP est alors isolée de sa solution par lyophilisation après dialyse prolongée contre de l'eau déminéralisée.

Le microorganisme Micrococcus sedogenes, souche M 78, dont la 10 culture dans des conditions appropriées fournit les cellules qui sont utilisées pour la préparation du 41200 RP, doit être considéré comme une espèce nouvelle qui appartient au genre Micrococcus.

Il a été isolé à partir d'un échantillon de terre prélevé au Brésil selon les méthodes habituelles d'isolement des microorganismes. Un échantillon 15 de cette souche a été déposé au Northern Regional Research Laboratory de l'U.S. Department of Agriculture à Peoria, 111. (Etats-Unis) où il a été enregistré le 14 août 1968 sous le numéro NRRL B-3505.

Ce laboratoire est autorisé à distribuer la souche à toute personne ayant licitement connaissance du présent document.

20 Les caractères de ce microorganisme ont été déterminés conformément aux différentes méthodes d'identification résumées dans "Manual of Microbiological Methods", Society of American Bactériologiste, Mc Graw-Hill Book Company,

New-York ( 1957 ) ainsi que dans les ouvrages suivants : J. Dumas, "Bactériologie Médicale", Editions Médicales Flammarion, Paris (1951); S. Lambin et A. German, 25 "précis de Microbiologie", Collection des Précis de Pharmacie, Masson, Paris, (1961); H. Cassagne, "Milieux de culture", Editions de la Tourelle, Paris (1961); Skerman, "Guide to the Identification of the Genera of Bacteria", The Williams and Wilkins Company, Baltimore (1967).

La détermination du Genre a été faite selon la clé d'identification 30 du "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7ème édition, The Williams and Wilkins Company, Baltimore (1957).

L'étude des caractères morphologiques de la souche M 78 a été effectuée sur des cultures statiques de 24 heures à 26°C. Ces cultures sont constituées par des cellules cocciformes Gram-positives, non acido-résistantes, 35 immobiles, de 1 μ à 1,3 μ de diamètre, isolées ou groupées par deux ou quatre, / cellules, ou en chaînettes de 4 à 16 cellules, ou bien encore en amas irréduj/J' liers de 20 à 50 cellules. La présence de spores n'a pas été observée.

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Les cultures sur gélose nutritive inclinée ont l’aspect d'un enduit gras abondant, lisse ou très peu rugueux, inodore, non chromogène, ayant une consistance molle. Les cultures sur gélose nutritive en boites de Petri se présentent sous la forme de colonies circulaires, à bords réguliers, à surface 5 lisse ; ces colonies sont aplaties ou légèrement convexes, plus ou moins opaques* Les cultures en bouillon nutritif glucose sont modérément troubles, sans pigment, inodores, avec un sédiment floconneux.

Cultivée sur pomme de terre, la souche M 78 forme un enduit gras, lisse, blanc jaunâtre très pâle, sans noircissement de la pomme de terre ni 10 pigment soluble.

L’étude des caractères biochimiques a été effectuée sur des cultures incubées à 26°C. L’ensemble des résultats observés se résume de la manière suivante : - Type respiratoire : aérobie strict 15 - Réduction des nitrates en nitrites : positif - Chromogénèse : négatif - Production d'indole : négatif - Production de HgS : négatif - Liquéfaction de la gélatine : négatif en 21 jours 20 - Hydrolyse de la caséine : positif - Test au rouge de méthyle : négatif - Recherche de 1’acétyl-méthyl-carbinol (réaction de Voges-Proskauer) : négatif - Culture sur lait écrémé : pas de coagulation, pas de peptonisation, alcalinisation du milieu de pH 6,1 à pH 7,5 entre le 1er et le 21e jour 25 - Température optimale de développement : 4°C - pas de développement 22°C - bon développement 26°C - très bon développement 30°C - bon développement 37°C - développement médiocre 30 45°C - pas de développement - Gatalase : positif - Oxydase : négatif - Formation d’acides à partir des glucides et polyalcools suivants ( en aéro- biose et anaérobiose) décelée par virage du rouge de phénol : / 35 - glucose : négatif * / - galactose : négatif / //

- arabinose : négatif KM

; 5 1 1 - saccharose : négatif - lactose : négatif - mannitol : négatif - glycérol : négatif 5 - Hydrolyse de l’amidon : positif - Milieu à l’esculine : pas de noircissement - Culture sur milieu additionné de fortes concentrations de NaCl : 4 % NaCl : développement moyen 10 % NaCl : pas de développement 10 - Utilisation de l’urée comme seule source d’azote : négatif - Uréase : négatif - Hydrolyse de la chitine î négatif - Culture sur milieu pour autotrophe [avec (NH^^SO^ comme seule source d’azote] : pas de développement J pas de formation de nitrites à partir de NH^" 15 - En suivant le principe de la méthode de Pridham [journal of Bacteriology, 56>, 107-114, (1948)], la souche M 78 utilise moyennement ou bien, comme sources de carbone, les substances suivantes : amidon, éthanol, acétate de sodium, propio-nate de sodium, acide succinique, acide malique, citrate de sodium, pyruvate de sodium. Ne sont pas utilisés ou ne permettent qu’un développement pauvre : 20 ribose, arabinose, glucose, lactose, maltose, saccharose, tréhalose, glycérol, mannitol, inositol, acide glutarique, tartrate de sodium, acide galacturonique.

- La recherche des sources d'azote utilisables par la souche M 78 pour son développement a été faite selon cette même méthode de Pridham, en utilisant le citrate de sodium comme source de carbone et en remplaçant NH^H^PO^ du milieu 25 de base par divers composés azotés. Dans ces conditions, les composés suivants sont bien ou moyennement utilisés : NaNOg , NaNi^, NH^H^PO^, DL asparagine, succinimide, glycine, DL alanine, acide DL aspartique, acide DL (+) glutamique, L (-) tyrosine, DL proline. Ne sont pas utilisés : adénine, uracile, créatinine, D (+) glucosamine, sarcosine, L (+) arginine, DL méthionine, bétaîne.

30 En se rapportant à la clé d’identification du "Bergey’s Manual of

Determinative Bacteriology", 7e édition, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1957, le fait que les cellules bactériennes étudiées ne contiennent pas de pigments photosynthétiques, qu’elles soient incapables de se développer sur un milieu pour autotrophes, qu’elles se reproduisent par scissiparité, 35 qu’elles soient sphériques, isolées, en courtes chaînettes ou en amas irrégu- / liers, et qu'elles ne possèdent pas de trichomes, permet de classer la souche/ M 78 dans l'ordre des Eubacteria1es (Buchanan, 1917)· / Λ , t 6 A * D’autre part, la bactérie M 78 est sphérique, Gram-positive, aérobie stricte, réduit les nitrates en nitrites, est incapable de fermenter les glucides en anaérobiose et ne forme pas de spores : ces caractères permettent de la ranger dans la famille des Micrococcaceae (Pribram, 1929)· 5 Cette famille est divisée en six genres répartis en deux groupes selon le type respiratoire : cette distinction permet de classer la bactérie M 78 dans le premier groupe qui comprend les genres Micrococcus, Staphylococcus, Gaffkya et Sarcina. Ce groupe est scindé en deux sous-groupes caractérisés par la façon dont les cellules sont groupées. Les cellules bactériennes étudiées ne 10 se présentent pas systématiquement en tétrades ou en paquets de huit cellules : cette propriété conduit à classer la souche M 78 soit dans le genre Micrococcus soit dans le genre Staphylococcus*

Un grand nombre de caractères, et en particulier le fait que la souche M 78 soit incapable de fermenter le glucose en anaérobiose et qu'elle soit 15 aérobie stricte, permet de la rattacher au genre Micrococcus»

Afin de donner plus de précision à la détermination du genre, on a effectué, pour de nombreux tests, des comparaisons avec Staphylococcus aureus 209 P, Neisseria catarrhalis A 152 (IP), Streptococcus faecalis ATCC 8043, Streptococcus faecalis ATCC 9790, ce qui a permis d’éliminer ces différents 20 genres à cellules cocciformes, et dont certains appartiennent à d’autres familles que les Micrococcaceae.

Parmi les 16 espèces décrites appartenant au genre Micrococcus, celles dont pourrait se rapprocher le plus la souche M 78 sont les suivantes : Micrococcus varians, Micrococcus caseolyticus et Micrococcus colpogenes.

25 La souche M 78 diffère notamment de Micrococcus varians par la non- formation d'acides à partir du glucose, du lactose, du saccharose, du glycérol, du mannitol et par la non-acidification du lait*

Elle diffère de Micrococcus caseolyticus par l’absence de liquéfaction de la gélatine, de peptonisation du lait, et de production d’acides à partir 30 du glucose, du lactose, du mannitol, du glycérol* „ La souche M 78 est également différente de Micrococcus colpogenes par le fait essentiel qu'elle ne peut hydrolyser la chitine, et qu'elle est de plus * uréase-négative*

La souche étudiée présente en définitive avec les espèces décrites 35 du genre Micrococcus des différences qui permettent de la considérer comme une espèce nouvelle* /

Le procédé de préparation des cellules utilisées pour la prépa , 1 7 t 4 du 41200 RP consiste à cultiver Micrococcus sedogenes, souche M 78, sur un milieu et dans des conditions appropriés, puis à séparer les cellules qui se sont multipliées au cours de la culture.

La culture de Micrococcus sedogenes, souche M 78 peut être effectuée 5 par toute méthode de culture aérobie en surface ou en profondeur, mais cette , dernière est à préférer pour des raisons de commodité. On utilise à cette fin les techniques d'ensemencement et de fermentation et les différents types d’appareils qui sont d’un usage courant dans l’industrie des fermentations.

Le milieu de fermentation doit contenir essentiellement des sources 10 de carbone,d*azote, de phosphore et de soufre assimilables,des éléments minéraux et éventuellement des facteurs de croissance, tous ces éléments pouvant être apportés sous forme de produits bien définis ou par des mélanges complexes tels qu’on en rencontre dans les produits biologiques d’origines diverses.

Comme sources de carbone assimilable on peut utiliser des hydrates de 15 carbone tels que les dextrines, l’amidon ou d’autres substances carbonées comme des alcools (éthanol) ou comme certains acides organiques : acides lactique, citrique. Certaines huiles animales ou végétales comme l’huile de lard ou l’huile de soja peuvent remplacer avantageusement ces différentes sources carbonées ou leur être adjointes.

20 Les sources convenables d’azote assimilable sont extrêmement variées.

Elles peuvent être des substances chimiques très simples comme les sels minéraux ou organiques d’ammonium, certains acides aminés. Elles peuvent être aussi apportées par des substances complexes contenant principalement l’azote sous forme protidique : caséine, lactalbumine, gluten et leurs hydrolysats, farines 25 de soja, d’arachide, de poisson, extraits de viande, de levure, résidus solubles de distillation d’alcool de grain (distillers’ solubles), liqueur de trempage de mais (com-steep).

Le soufre et le phosphore sont généralement apportés en quantité suffisante par les substances complexes mentionnées ci-avant* Ils peuvent être égale-30 ment apportés sous forme de sulfates et phosphates* v Parmi les éléments minéraux ajoutés certains peuvent avoir un effet tampon ou neutralisant, comme les phosphates alcalins ou alcalino-terreux ou les carbonates de calcium ou de magnésium. D’autres apportent l’équilibre ionique nécessaire au développement de Micrococcus sedogenes, souche M 78, comme les 35 chlorures et sulfates des métaux alcalins et alcalino-terreux ou les sels de / zinc, de cobalt, de fer, de cuivre, de manganèse.

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Le pH du milieu de fermentation au départ de la culture doit être compris entre 6,0 et 7,8 et de préférence entre 6,5 et 7,5. La température optimale pour la fermentation est comprise entre 25 et 30°C, mais une production satisfaisante est obtenue pour des températures comprises entre 20 et 35°C.

5 L’aération de la fermentation peut varier entre des valeurs assez larges. On a cependant trouvé que des aérations de 0,3 à 3 litres d’air par litre de bouillon et par minute conviennent particulièrement bien. Le rendement maximal est obtenu après 8 à 20 heures de culture, de préférence après 15 heures, ce temps dépendant essentiellement du milieu utilisé.

10 Le pH du milieu de fermentation à la fin de la culture est généralement compris entre 7,3 et 8,8 et il est préférable qu’il soit compris entre 8,0 et 8,4.

Le microorganisme Micrococcus sedogenes, souche M 78, est ensuite séparé du milieu de fermentation par filtration ou centrifugation, avantageu-15 sement après avoir acidifié ce dernier jusqu’à un pH voisin de 3 par addition d’un acide minéral tel que l’acide chlorhydrique. Pour les traitements ultérieurs, on peut soit utiliser les cellules brutes ainsi obtenues soit effectuer une déshydratation par lyophilisation ou par lavage à l’alcool ou à l’acétone, puis un séchage sous pression réduite pour obtenir des cellules sèches purifiées.

20 II peut être particulièrement avantageux de soumettre les cellules obtenues à un chauffage à une température comprise entre 120 et 130°G pendant 30 à 60 minutes avant leur utilisation ultérieure.

La nouvelle substance 41200 RP selon la présente invention présente des propriétés biologiques remarquables et utiles.

25 Administrée par voie intra-veineuse, sous-cutanée, intra-péritonéale ou intra-nasale à des souris, la substance selon l’invention augmente de manière significative la résistance des souris à l’infection par des doses normalement mortelles de souches virulentes de bactéries telles que Listeria 1 monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli et de virus tels que le 30 virus de l’encêphalomyocardite, de l’hépatite murine, de la grippe (virus humains adaptés à la souris, type Ao et Αρ,άβ l’herpès et de l’arbovirus Semliki-Forest. L’état de résistance accrue persiste au moins 96 heures / — * J 9 » * +

Administré par voie parentérale à des souris, ce produit stimule fortement le pouvoir phagocytaire du système réticulo-endothélial et augmente > au niveau de la rate, le nombre de lymphocytes producteurs d’anticorps. Il exerce tin effet stimulant sur les réactions d’hypersensibilité de type retardé 5 et de production d’anticorps vis-à-vis d’antigènes particulaires.

Chez la souris greffée avec des cellules tumorales (telles que des cellules du sarcome 180), ce produit favorise le rejet des tumeurs en provoquant une réaction nécrotique à leur niveau.

Dans certaines conditions, le produit selon l’invention augmente le 10 nombre et/ou l’activité cytolytique des lymphocytes T de la rate vis-à-vis de cellules tumorales allogéniques.

Chez l’animal (souris), selon les systèmes expérimentaux utilisés et les voies d’administration, les doses actives sont généralement comprises entre 0,03 et 3 mg/kg et de préférence entre 0,3 et 1 mg/kg. Généralement un 15 seul traitement suffit pour obtenir l’effet recherché pendant une période d’au moins 48 heures.

Chez la souris, par voie intra-veineuse, la dose létale 50 % (DL^q) du 41200 RP est voisine de 23 mg/kg.

Dans ce qui suit : 20 - les protéines sont exprimées d’après l’analyse des acides aminés - le glucose est déterminé par la méthode à 1’anthrone - le phosphore est dosé par la méthode au molybdate après minéralisation - la teneur en acides nucléiques est déterminée par l’absorbance à 258 nm.

- les sucres aminés sont dosés par la méthode de Elson-Morgan et exprimés en 25 glucosamine, soit par dosage à la ninhydrine après hydrolyse et séparation à l’aide d’un autoanalyseur Biotrbnik LC 6000 E.

Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, montrent comment l’invention peut être mise· en pratique.

» Exemple 1 - (A) - Préparation des cellules 30 On charge dans un fermenteur de 170 litres : - peptone ... 1200 g - extrait de viande ... 600 g - huile de soja ... 1200 cm3 - eau de ville, complément pour 110 litres / 35 Le pH est ajusté à 6,90 par addition de soude 10 N, puis on , / stérilise le milieu par barbotage de vapeur à 122°C pendant 40 minutes. refroidissement, du fait de la condensation de la vapeur au cours de la/& * ‘ 10 A ·* stérilisation, le volume du bouillon est de 120 litres $ le pH du milieu est de 6,70. On ensemence avec 200 cm3 d’une culture en erlenmeyer agité de Micrococcus sedogenes, souche M 78.

La culture est développée à 27°G pendant 14 heures en agitant 5 et en aérant avec de l’air stérile ; elle est alors convenable pour l’ensemencement de la culture productrice.

La culture productrice est effectuée dans un fermenteur de 800 litres chargé avec les substances suivantes : - acide L-lactique .... 4 kg 10 - huile de soja .... 2 litres - sulfate d’ammonium .... 2,4 kg - chlorure de sodium .... 2 kg - phesphate monopotassique .... 0,4 kg - sulfate de magnésium, 71^0 .... 0,8 kg 15 - sulfate de cuivre, 51^0 .... 0,02 kg - sulfate de zinc, 71^0 .... 0,012 kg - chlorure de cobalt, 6H20 .... 0,008 kg - eau de ville complément pour .... 370 litres

Le pH du milieu est ajusté à 7,10 par addition de 2950 cm3 de soude 20 10 N, puis on stérilise le bouillon par barbotage de vapeur à 122°C pendant AO minutes. Après refroidissement, du fait de la condensation de la vapeur au cours de la stérilisation, le volume du bouillon est de 400 litres îson pH, égal à 4,20, est ajusté à 6,60 par addition de 2100 cm3 d’une solution aqueuse de soude 5 N.

25 On ensemence alors avec 40 litres de la culture inoculum en fermenteur de 170 litres décrite ci-dessus. La culture est développée à 27°G durant 16 heures en agitant avec une turbine tournant à 205 tours/minute et en aérant avec un volume d’air stérile de 15 m3/heure.

En fin d’opération le pH-de la culture est de 8,20 et le volume du 30 bouillon de 440 litres.

V

Le moût ainsi obtenu est refroidi à + 4°C et son pH est ajusté à 3 par addition de 4 litres d’acide chlorhydrique 5N. Les cellules sont isolées par centrifugation à 4000 tours/minute (2900 ^)· , Les cellules sont reprises avec 80 litres d’éthanol à -10°G en agitant 35 pendant 15 minutes, puis isolées par centrifugation et séchées à 35°C sous pression réduite (5 mm de mercure) pendant 15 heures. / /

On obtient ainsi 1500 g de cellules sèches.

-, 11 A * (B) - Préparation du 32919 KP - 1 kg de cellules préparées comme décrit en (A) sont mises en suspension dans 40 litres d’eau distillée stérile, dans un réacteur en acier inoxydable muni d’une double enveloppe thermostatêe par circulation d’eau et 5 d’une agitation centrale énergique. Le pH est ajusté à 7,0 par addition de soude 10 N.

On ajoute alors 2 g de lysozyme et on agite pendant 2 heures à 37°G en réajustant périodiquement le pH à 7,0 par addition de soude..5N,

Le mélange est alors centrifugé sur machine Sharples M16 (2 passages 10 successifs à 17000 tours/minute avec un débit de 30 litres par heure). Le surnageant (37 litres) est ultrafiltré (appareil UFP 20 équipé d’une membrane acrylique ISIS 3042) en recyclant le rétentat et en ajoutant 3 fois 40 litres d’eau déminéralisée, refroidie à + 4°C.

On recueille ainsi 7 litres de rétentat concentré et débarrassé de 15 ses petites molécules (PM inférieur à 25000 daltons environ). Son pH est réajusté à 7 par une solution de soude 5N, puis la solution obtenue est . -lyophilisée.

On obtient ainsi 147 g de produit brut.

31 g de ce produit sont dissous dans 1550 cm3 d’eau déminéralisée 20 à une teirpérature voisine de 20°C en agitant pendant 30 minutes ; on ajoute alors, en 5 minutes et en agitant constamment, 31 cm3 d’une solution aqueuse à 668 g/1 de chlorure de calcium dihydraté ; on maintient l’agitation pendant 30 minutes. Le précipité formé est éliminé par centrifugation sur machine Sharples de laboratoire à 40000 tours/minute avec un débit de 5 litres par 25 heure. Le surnageant est dialysé sur membrane cellulosique pendant 3 jours à + 4°G contre 3 fois 40 litres d’eau déminéralisée.

Le rétentat est alors traité dans un ballon par 310 cm3 de résine polystyrène sulfonique DOWEX 50 X2 en cycle sodium, en agitant pendant 1 heure j la résine est filtrée et lavée sur filtre par 310 cm3 d’eau.

£0 Les eaux de lavage sont jointes au filtrat et l’ensemble est lyophi lisé.

• On obtient ainsi 17 g de 32919 KP sous forme salifiée dont les carac téristiques sont les suivantes : “ - aspect »: poudre blanche 35 - composition : eau (Fischer) % = 15,7 sur sec : - protéines % (somme des acides aminés) = 24,6 - polysaccharides % = 3,9 ///

- acides nucléiques % = 28,9 d’après le spectre UV / M

• 12

1 K

- analyse élémentaire : C % = 46,30 H % = 5,84 0 % (par différence = 30,71 N % = 10,04 P % = 3,11 S % inférieur à 0,5

Na% = 3,70 Ga % = 0,30 (G) - Purification du 31219 SP - 5 25 g de substance 32919 RP obtenue dans les conditions de l’exemple (B) sont dissous dans 1 litre d’eau déminéralisée contenue dans un réacteur de 2 litres muni d’une agitation et d’un dispositif de régulation de température ; on ajoute 1 litre de mélange phénol-eau (109 cm3 d’eau pour 1 kg de phénol). Le mélange est chauffé à 65°C, sous agitation énergique.

10 L’agitation est poursuivie pendant 30 minutes à cette même température. Après refroidissement rapide du réacteur au moyen d’un bain de glace, à une température voisine de 25°G, on sépare les phases par centrifugation à 3300 g pendant 30 minutes sur machine de laboratoire réfrigérée (JOUAN type K 63 F de capacité 4 litres).

15 On obtient ainsi 450 cm3 de phase aqueuse.

La phase phénolique et l’interphase sont à nouveau extraites par 1 litre d’eau déminéralisée pendant 30 minutes à 65°C ; après refroidissement et centrifugation comme indiqué ci-dessus, on obtient à nouveau 1470 cm3 de phase aqueuse.

20 Les phases aqueuses sont réunies. Le phénol est éliminé par deux lavages successifs au moyen de 2 litres de chloroforme à chaque fois. Les phases aqueuses sont ensuite clarifiées par centrifugation pendant 30 minutes à 3300 g. On obtient ainsi 1800 cm3 de phase aqueuse.

Cette phase aqueuse clarifiée est alors dialysée pendant trois 25 jours à + 4°G contre 3 fois 40 litres d’eau déminéralisée. Le rétentat est lyophilisé, on obtient ainsi 14,5 g d’une poudre amorphe blanche.

On dissout 8 g de cette poudre dans 400 cm3 d’un tampon acétate de sodium 0,1 M à pH 7 stérile (on dissout 136,09 g d’acétate de sodium pour ^ analyse dans 0,9 litre d’eau déminéralisée, puis ajuste le pH à 7,0 par 30 addition d’acide acétique (d = 1,04£) et complète à 1 litre ; la stérilisation est effectuée par chauffage pendant 45 minutes à 122°G ; cette solution est diluée au 1/10 avec de l’eau déminéralisée stérile juste au moment de l’emploi)· (R) * La solution obtenue est versée sur une colonne de SEPHAROSE GL 4B^ 1 (diamètre : 13,5 cm, hauteur : 65 cm) installée en chambre froide (+ 4°G) et 35 montée en tampon acétate de sodium 0,1 M à pH 7,0 stérile. L’élution est effec-/ tuée avec le même tampon au débit de 1,33 litre/heure en enregistrant en conjzmu l’absorbance à 230 nm sous 0,1 cm de l’éluat. / // * 13 J r

On recueille d’abord une fraction de 3,13 litres qui est éliminée.

La fraction suivante (1,22 litre), qui correspond à un pic d’absorbance à 230 tun, est introduite dans un tube de cellulose régénérée NOJAX^^ et est dialysée à + 4°G pendant trois jours contre 3 fois 40 litres d’eau déminéralisée 5 puis le rétentat (1300 cm3) est lyophilisé. Le solide obtenu est repris dans 93 cm3 d’eau déminéralisée et la solution est dialysée, avec la même membrane que ci-dessus, pendant 48 heures à + 4°G contre 2 fois 20 litres d’eau déminéralisée. Le rétentat est lyophilisé.

On' obtient ainsi 1,3 g de substance 41200 RP dont les caracté-10*> ristiques sont les suivantes : - aspect : poudre amorphe blanche - spectre Ü.V. : Ce spectre est représenté par la figure 1 - spectre infra-rouge : (déterminé à partir de coup rimés en mélange avec KBr).

Ce spectre est représenté par la figure 2 sur laquelle on a porté, en abscisses, 15 d’une part les longueurs d’ondes exprimées en microns (échelle supérieure) et d’autre part les nombres d’ondes en cm“! (échelle inférieure) et en ordonnées le pourcentage de transmission.

Dans le tableau suivant sont indiquées les principales bandes d’absorption infra-rouge de la substance 41200 SP exprimées en nombre d’ondes 20 (cm ^ î 3420 cm"1 tF (dont H20) 1440 cm ép. 900 cm f 3280 cm"1 êp. 1405 cm"1 ép. 875 cm"1 f -1 -1 -1 3090 cm ép. 1375 cm F 800 cm m 2970 cm 1 ép. 1335 cm 1 ép* 775 cm 1 f 25 2950 cm 1 ép. 1310 cm 1 m 720 cm 1 ép.

2920 cm" F 1230 cm m 630 cm ép, 1 11 2845 cm m 1210 cm ép. 560 cm F (dont H_0) -1 -1 -1 ^ 2680 cm ép. 1160 cm F 520 cm ép.

2100 cm 1 tf 1115 cm 1 F 480 cm 1 ép.

30 1730 cm" ép. 1060 cm . tF 450 cm ép.

1645 cm"1 tF 1025 cm"1 ép. 400 cm"1 ép.

1545 cm 1 F 945 cm 1 m 3651cm.1 ép.

-1 1460 cm ép .

tF = très forte f = faible 35 F = forte tf = très faible / m = moyenne ép .= êpaulement / \f

T

4 14 ί * - composition : eau (Fischer) % : 3,8 sur sec : acides aminés 7. : 12,3 (dont 7 % d*alanine) glucose % : 11,95 acides nucléiques % s inférieur à l,3(d*après le spectre UV) 5 sucres aminés ’ 16,3 - analyse élémentaire C%= 45,58 H 7. = 7,47 N 7. = 4,85 0 7. = 37 P 7. = 1,17 Cl 7« = 0,25 Na % = 2,36 Ga 7. = 1,33 S % inférieur à 0,5 10 - électrophorèse *

Dans un gel à 1 % d*agarose avec tampon barbital à pH 8,6 et sous une tension de 6 V/cm, le 41200 EP migre vers l*anode à la vitesse de 11 mm par heure environ. (Le produit est mis en évidence par le réactif de Schiff après oxydation périodique ou par le noir Soudan B).

15 Exemple 2 -

On opère comme dans l*exemple 1(A) .Après 16 heures de culture, le moût est refroidi à 4°G et son pH est ajusté à 3 par addition d*acide chlorhydrique. Les cellules sont isolées par centrifugation à 4000 tours/minute.

Le gâteau cellulaire acide est alors chauffé en autoclave pendant 45 minutes 20 à 122°G. Après refroidissement, les cellules sont lavées par lfêthanol puis séchées.

En opérant ensuite comme dans lTexençle 1 (B) et 1 (G), et en utilisant les mêmes quantités, on obtient 0,55 g de substance 41200 EP sous forme d*une poudre amorphe blanche dont les caractéristiques sont les suivantes: 25 - composition : eau (Fischer) 7. '· 6 sur sec : acides aminés % : 17,7 (dont alanine 7. 7,2) glucose % : 10,5 acides nudèiques % : inférieur à 3 sucres aminés % : 15,2 30 - analyse élémentaire : G % = 46,90 H % = 7, 32 N % = 5,38 0 % = 35 P % = 1,08 Cl % = 0,18 Na % = 2,26 Ca 7. = 1,83 S % inférieur à 0,5.

Le spectre infra-rouge de ce produit est identique à celui ds/la 35 substance 41200 EP obtenue à l*exemple 1. [ ^ / r

Claims (1)

15 ». -- -- - 1 ·· «· «ί * » *- REVENDI CATION Procédé de préparation d’une nouvelle substance désignée par le numéro 41200 RP qui, isolée à partir de cellules de la souche Micrococcus sedogenes M 78, est une poudre blanche amorphe constituée, à l'état anhydre, 5 essentiellement par 11 à 18 % d'acides aminés, 10 à 17 % de glucose, 10 à 17 % de sucres aminés et moins de 5 % d'acides nucléiques et dont la composition élémentaire est voisine de ; C % « 45-47 HZ- 7,1-7,6 0 % = 35-38 N Z 4,0-5,7 P % - 0,9-1,2 Cl Z “ 0,1-0,4 S % inférieur à 0,5 Na % = 2,0-3,0 10 Ca % = 0,9-1,9 * et qui possède des propriétés immunostimulantes, caractérisé en ce que : a) on traite par le lysozyme, à un pH constant compris entre 6,5 et 8, pendant 1 à 3 heures et à une température voisine de 37°C, une suspension aqueuse de cellules de Micrococcus sedogenes, souche M 78 15 (NRRL B-3505). b) isole un produit brut, sous forme salifiée, de la phase liquide de la suspension obtenue et le purifie par traitement au chlorure de calcium pour obtenir une substance désignée par le numéro 32919 RP. c) et purifie la substance 32919 RP par traitement de sa 20 solution aqueuse par le phénol suivi du fractionnement sur tamis moléculaire en recueillant la fraction de haut poids moléculaire dont on isole la substance 41200 RP. :35ms : JJ..............planches ......JUL· pages dont .....À.........page de aarde J.h....... . pages de description —A— pages de revendication? _______abrégé descriptif Luxembourg, le Ai. oh. ^sso Lj mapé^taire : /Jf v--"Charies München «