FR2548686A1 - Nouvelle proteine kud-pc, son procede de preparation et son application comme medicament - Google Patents

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Abstract

NOUVELLE PROTEINE KUD-PC. ON PRODUIT LA NOUVELLE SUBSTANCE DE L'INVENTION EN CULTIVANT DES MICROORGANISMES, PRODUISANT LA SUBSTANCE PROTEIQUE KUD-PC, APPARTENANT AU GENRE STREPTOSPORANGIUM, EN ACCUMULANT LA PROTEINE KUD-PC EN UNE MASSE CULTIVEE, ET EN ISOLANT DE CELLE-CI LA PROTEINE KUD-PC AINSI TRANSFEREE. APPLICATION DE L'ACTIVITE ANTI-TUMEUR DE LA PROTEINE.

Description

L'invention concerne une nouvelle protéine EUD-PC et son procédé de préparation. Elle concerne plus particulièrement la nouvelle protéine KtJJ)-PC obtenue en cultivant des microorganismes, produisant la substance protéique KUD-PC, appartenant au genre
Streptosporangium et présentant le pouvoir d'augmenter l'activité antitumeur.
On sait déjà que la souche de microorganismes
PO-357, appartenant au genre Streptosporangium, isolée dans un échantillon de sol prélevé à Setagaya-Ku, Tokyo,
Japon, produit l'antibiotique PO-357 (qui a ensuite été désigné sous le nom de Sporamycine), présentant une activité bactéricide contre Staphylococcus aureus et Bacillus subtilis, ainsi qu'une activité antitumeur. Les propriétés physicochimiques de cette substance et les propriétés taxonomiques de la souche de microorganismes producteurs, sont décrites dans la demande de brevet japonais publiée avant examen nO 53-7601.
La présente-invention est basée sur la découverte d'une substance physiologiquement active, ne présentant pas d'activité bactéricide, qui est différenciée par électrophorèse de la sporamycine et qui augmente l'activité antitumeur de substances antitumeur, ladite substance physiologiquement active étant désignée sous le nom de protéine KUD-PC.
La nouvelle protéine KUD-PC de l'invention (désignée ci-après par la dénomination KUD-PC) présente les propriétés physico-chimiques suivantes : 1) Analyse élémentaire : comprenant carbone, hydrogène,
azote, oxygène et soufre; C 49,98 %, H 7,27 %,
N 15,23 0, S 1,08 %, (trouvé après dessication à
1000C pendant 3 heures sous vide), 2) Poids moléculaire : 11500 calculé par comparaison
avec des substances standard (polypeptide standard
ou protéine standard de poids moléculaire 2512
16949) par électrophorèse sur gel de SDS-polyacryl-
amide, 3) point de fusion : 258-260 C (décomp.), 4) Rotation spécifique : [a!20 = -55,80 (c = 1,0 H O) 5) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet : le spectre
W de KUD-PC en solution aqueuse et dans NaOH 0,1N
est représenté à la figure 1.

ÀH2O : 253, 259, 265, 268 (épaulement), 275, 280
max
(épaulement) nm,
0,1N NaOH - 294 nm
max 6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge : fig. 2 (KBr), 7) Solubilité : soluble dans l'eau, insoluble dans les
solvants organiques ordinaires, tels que l'alcool,
l'acétone et le benzène, 8) Réactions colorées : positives : réactions de Folin
Lowry, du biuret et
de Rydon-Smith,
négatives : phénol-H2S04, et
anthrone-H2SO4,
Hydrolysant dans HC1 : positive
pour la réaction de
la ninhydrine, 9) Nature : pH 4-8 (solution aqueuse à 0,1 % de KUD-PC), 10) Couleur et forme cristalline : cristaux incolores,
les cristaux obtenus par ultrafiltration en solu
tion aqueuse sont du système hexagonal et ceux
obtenus par relarguage au sulfate d'ammonium
sont prismatiques, 11) Composition des aminoacides; les rapports molaires
des aminoacides d'après l'analyse d'un hydrolysat
par HCl sont les suivants (5 mg de KUD-PC sont hy
drolysés par HCl dans un tube scellé et analysés
par chromatographie en phase liquide (Modèle
Hitachi 034-2U)
amino-acide (riz)
acide aspartique 0,144
thréonine 0,258
sérine 0,226
acide glutamique 0,141
proline 0,111
glycine 0,250
alanine 0,363
valine 0,265
isoleucine 0,016
leucine 0,117 méthionine
tyrosine 0,020
phénylalanine 0,079
lysine 0,089
arginine 0,040
histidine trace) 12) Electrophorèse : le profil d'électrophorèse sur gel
de SDS-polyacrylamide est représenté à la fig. 3
où la substance ne présente qu'un seul pic (subs
tance unique) (chromato-balayage Shimazu CS-910).
Un diagramme d'électrophorèse de KUD-PC avec une membrane d'acétate de cellulose (Cellulo-gel RS, pH 2, tampon acétate-formiate 1M, 200 V, 1 heure, colo -ration par amido-noir 10B) représenté à la fig. 4, présente une seule bande.
La présente invention a pour objet une nouvelle substance protéique KUD-PC présentant les propriétés physicochimiques décrites ci-dessus.
L'invention a également pour objet un procédé de production de la nouvelle substance protéique KUD-PC, selon lequel on cultive des microorganismes, produisant la substance protéique KUD-PC, appartenant au genre
Streptosporangium, on accumule le KUD-PC dans une masse cultivée et on isole de celle-ci le KUD-PC ainsi obtenu.
La souche productrice de KUD-PC appartient au genre Streptosporangium comme précédemment décrit, et la souche P0-357, appartenant au genre Streptosporangium ne constitue qu'un exemple pour l'emploi dans la présente invention.
Les propriétés taxonomiques de la souche sont les suivantes 1. Propriétés morphologiques.
L'examen au microscope révèle que le mycelium aérien est droit, avec la plupart des sporanges au sommet du mycelium. La dimension du sporange est de 5-10/1, en moyenne 755 , de diamètre. La longueur des hyphes aériennes, porteuses de sporanges, est courte et généralement d'environ 3/1. Les spores sont rondes ou ovoides, avec une surface lisse et un diamètre de 0,9 1,4jti. On n'observe pas de flagelles.
2. Caractéristiques de cultures sur divers milieux.
Observations après 10-14 jours de culture à 270C.
Figure img00050001
Mycelium <SEP> pigment
<tb> Milieu <SEP> Croissance <SEP> Reverse
<tb> aérien <SEP> soluble
<tb> Agar/sucrose/nitrate <SEP> médiocre <SEP> orange <SEP> pâle <SEP> blanc <SEP> comme <SEP> lait <SEP> néant
<tb> Agar/glucose/asparagine <SEP> médiocre <SEP> jaune <SEP> pâle <SEP> blanc <SEP> comme <SEP> lait <SEP> néant
<tb> Agar/glycérol/asparagine <SEP> médiocre <SEP> jaune <SEP> pâle <SEP> blanc <SEP> comme <SEP> lait <SEP> néant
<tb> Agar/sel <SEP> minéral/amidon <SEP> médiocre <SEP> blanc <SEP> bru- <SEP> blanc <SEP> comme <SEP> lait <SEP> néant
<tb> nâtre-blanc
<tb> Agar/tyrosine <SEP> modérée <SEP> orange <SEP> pâle <SEP> orange <SEP> pâle <SEP> néant
<tb> Agar <SEP> nutritif <SEP> modérée-bonne <SEP> orange <SEP> orange <SEP> néant
<tb> Agar/extrait <SEP> de <SEP> levure/
<tb> extrait <SEP> de <SEP> malt <SEP> bonne <SEP> orange <SEP> orange <SEP> néant
<tb> Agar <SEP> / <SEP> farine <SEP> d'avoine <SEP> bonne <SEP> orange <SEP> foncé <SEP> orange <SEP> foncé <SEP> néant
<tb>
3. Propriétés physiologiques.
(1) Température de croissance : possible à 43 C,
croissance optimale à environ 27-30 C.
(2) Production de mélanine : négative sur agar de
tyrosine.
(3) Liquéfaction de gélatine : positive.
(4) Hydrolyse d'amidon : positive.
(5) Peptonisation du lait : positive.
(6) Formation de H2S : négative.
(7) Réduction de nitrates : positive.
4. Utilisation de sources de carbone.
Observé sur milieu d'agar de Pridham Gottlieb contenant 0,05 % d'extrait de levure.
Utilisation Glucose, B-arabinose, D-xylose, D-mannose.
Utilisation probable : D-galactose, D-raffinose, L-rhamnose, D-fructose,
Aucune utilisation : inositol, saccharose.
5. Composition des parois des cellules.
On effectue l'analyse des parois de cellules selon la méthode de Becker et al. [Appl. Microbiol., 13, 236 - 243 (1965)].
Figure img00060001
<tb>
<SEP> DAP* <SEP> glycine <SEP> arabinose <SEP> galactose
<tb> meso <SEP> type <SEP> t <SEP> -** <SEP> <SEP> I <SEP> - <SEP> I <SEP> - <SEP>
<tb>
* acide diaminopimelique
*- : non détecté.
Diverses propriétés taxonomiques citées cidessus montrent clairement une souche PO-357 comme un microorganismes appartenant au genre
Streptosporangium.
Parmi les espèces connues, Streptosporangium pseudovulgalae Nonomura [J. Ferm. Tech. Japan, 47, 701 - 709 (1969)] est étroitement apparenté à la souche Po-357, mais il existe des différences, particulièrement dans la couleur du mycelium aérien et dans leurs activités biologiques. Ainsi la souche PO-357 est désignée sous l'appellation Stretosorangium oseudovulgalae
PO-357. La souche est déposée à 11 institut dénommé
Fermentation Research Institut, Agency of Industrial
Science and Technology sous le n FERM-P 3571.
Selon la présente invention, on peut utiliser pour la production de KUD-PC, non seulement Streptosporangium espèce Po-357, mais encore ses mutants naturels ou artificiels, obtenus par le rayonnement UV, les rayons
X, par mutagenèse par radiations cru chimique, ainsi que par les microorganismes appartenant au genre Streptosporangium, présentant une activité de production de la nouvelle substance protéique KUD-PC.
Selon la présente invention, on cultive les microorganismes, appartenant au genre Streptosporangium, producteurs de KUD-PC, dans un milieu conventionnel. On peut effectuer la culture, en général, dans les milieux conventionnels pour Streptomyces. En ce qui concerne le milieu, on peut utiliser un milieu nutritif comprenant des sources assimilables de carbone et d'azote et des sels minéraux. En ce qui concerne les sources assimilables de carbone, on utilise, individuellement ou en combinaison, le glucose, le sucrose, les mélasses, l'amidon, la dextrine, la glycérine, ou un acide organique.
En ce qui concerne les sources d'azote, on utilise, individuellement ou en combinaison, la peptone, l'extrait de viande, l'extrait de levure, la levure anhydre,la poudre de soja, la liqueur d'infusion de mais, les galettes de graines de coton, la caséine, l'hydrolysat de protéines de soja, les aminoacides et l'urée. On ajoute, si nécessaire, des sels minéraux tels que des sels de sodium, potassium, calcium, magnésium ou des phosphates. On peut en outre ajouter, éventuellement, des traces d'éléments nutritifs ou de stimulants de croissance, qui accélèrent la croissance des micro- organismes ou la production de KUD-PC.
On effectue de préférence la culture en conditions aérobies, comme celles de culture agitée ou de culture de submersion aérée, ê pH neutre, à 27-300C, pendant 40-72 heures. On produit le KUD-PC dans un bouillon cultivé. On doit, de préférence, arrêter la culture lorsque l'on obtient la quantité max@@um de KUD-PC dans un bouillon cultivé. On détermine les conditions de la culture, telles que la composition de culture, le pH, la température, l'agitation et l'aération en fonction de la souche utilise et des autres conditions. On peut ajouter, si nécessaire, des agents antimoussants, comme l'huile de silicone, une huile végétale ou des agents tensioactifs.
Etant donné que le KUD-PC produit dans le bouillon cultivé ainsi obtenu, se trouve principalement dans le bouillon cultivé, on isole de préférence le
KUD-PC du filtrat de culture, séparé par centrifugation ou filtration,qprès l'addition éventuelle d'un adjuvant de filtration. On peut effectuer la séparation du KUD-PC du filtrat de culture par un traitement approprié à la nature du KUD-PC, soluble dans l'eau et insoluble dans les solvants organiques, comme l'alcool, l'acétone ou le benzène. On applique, en général, les méthodes conventionnelles de séparation et de purification des protéines ou polypeptides.C'est ainsi qu'on peut appliquer, séparément ou en combinaison ou de façon répétitive, les méthodes de relargage par le sulfate ou le chlorure d'ammonium, de précipitation fractionnée par le méthanol, l'éthanol ou l'acétone, de chromatographie par échange d'ions en utilisant des substances Fchan- geuses d'ions, comme la cellulose échangeuse d'ions oule "Sephadex" échangeur d'ions, de chromatographie par adsorption, utilisant le charbon actif, le gel de ai lice, l'alumine, l'hydroxyapatite, la cellulose ou une résine d'adsorption comme la résine dite HP-10, de chromatographie par filtration sur gel en utilisant le "Se- phadex" OU le "Biogel", d'électrophorèse, de distribution à contre-courant, de dialyse, d'ultrafiltration ou des processus de concentration. L'élut ion en chromatographie peut s'effectuer par l'eau, par des solutions aqueuses d'alcool, d'acétone, de sels minéraux ou organiques ou par des tampons.
Un mode de mise en oeuvre des processus de s6- paration et de purification du KUD-PC est décrit ci après.
On filtre un bouillon cultivé, additionné d'un adjuvant de filtration, pour séparer les myceliums. On ajoute du sulfate d'ammonium au filtrat de culture,
Jusqu'à 90 % de saturation, sous refroidissement, à neutre. On recueille le précipité de relargage par filtration ou centrifugation et on le dissout dans l'eau ou dans une solution neutre de tampon. On dialyse la solution sous refroidissement, ou on la soumet à l'ultra filtration en utilisant une membrane semiperméable pour dessaler. Un exemple de membrane semiperméable convenant à 1' invention est donné par une membrane synthétique semiperméable, qui clive les poids moléculaires inférieurs à 100 et supérieurs à 10000, comme les membranes de dénomination commerciale UH-L ou UK-10, vendues par la Société dite Toyo Roshi CO.
On fait passer la solution de dessalement à travers une colonne de cellulose échangeuse d'ions ou de "Sephadex" échangeur d'ions, suivi de lavage à l'eau, et élut ion par un solvant éluant.
Des exemples de cellulose échangeuse d'ions convenant à l'invention sont donnés par les celluloses dites "DEAE-, ECTEOLA-, SE-, et CM-cellulose".
De préférence, on talonne préalablement ladite cellulose chanteuse d'ions ou le "Sephadex" échan- geur d'ions, avec une solution de tampon de concentration préajustée. Le liquide éluant est un tampon com- posé de sel minéral ou organique. Un exemple de sel minéral est donné par le chlorure de sodium, de potassium, ou d'ammonium, le sulfate ou le phosphate d'ammo- nium, et un exemple de sel organique est donné par l'acétate de sodium ou le formiate de sodium, 0,01-1 M/1.
Des exemples de solution tampons sont les tampons phosphate, acétate, citrate ou trishydroxyméthylamino-méthane. Le pH de la solution tampon est de pH 5-8, de préférence neutre, à une concentration de 0,001-0,5 M/i. Dans le processus d'élution précédemment décrit, on peut faire varier par gradients ou en continu, les concentrations des sels organiques ou minéraux et des solutions tampons, ainsi que le pH.
On effectue la concentration ou le dessalement par relargage au sulfate d'ammonium, par ultrafiltration ou par dialyse. La purification de la solution concentrée ou dessalée de KUD-PC est de préférence effectuée par chromatographie par filtration sur gel. Un exemple d'agent de filtration sur gel est donné par les substances de dénomination commerciale "Biogel P 10, Biogel
P 30 ou "Sephadex G 75n, On élue par l'eau ou une solution tampon.
On peut faire cristalliser le KUD-PC dans la solution ainsi hautement purifiée de KUD-PC. Par exemple, la solution d'éluat hautement purifiée de KUD-PC, par chromatographie par échange d'ions et/ou chromatographie par filtration sur gel, est concentrée par ultrafiltration et/ou précipitation par sulfate d'ammo- nium, pour obtenir le KUD-PC cristallin. Si non cristal- lisé, le KUD-PC peut être isolé par une autre chromatographie ou lyophilisation.
Les propriétés biologiques du KUD-PC sont les suivantes 1) Action antimicrobienne
Le KUD-PC ne présente pas d'action bactéricide sur des organismes d'essai tels que Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis et Bacillus cereus.
2) Action cytoclasique.
Le Tableau I montre l'action cytoclasique (cytotoxique) du KUD-PC; on voit que le KUD-PC présente une forte activité cytoclasique vis à vis des cellules
BHK.
Tableau 1
KUD-PC sporamycine 3H-TdR 3H-UR Protéine
0/ug/ml 2,5 U/ml 4 21 22
O 5 5 24 23
0 10 55 30 42
0,1 2,5 27 -13 22
1 2,5 26 -27 28 10 2,5 42 O 17
0,1 5 49 14 42
I 5 34 -3 30 10 5 33 -12 23
0,1 10 84 43 52
1 10 68 44 41 10 10 42 5 30 3) Activité anti-tumeur.
(1) Méthode expérimentale (i) On fait une inoculation subcutanée de sarcome 180, 1 x 105 cellules, à des souris ddY. Après 3 jours, on leur fait une administration intraveineuse d'un mélange de sporamycine et de KUD-PC. Ensuite on fait une admi- nistration intraveineuse, aux jours 4, 5 et 6, de KUD-PC pour observer les effets de prolongation de vie.
(il) Effet contre le carcinome ascitique de Ehrlich
On fait une inoculation intrapéritonéale de carcinome ascitique de Ehrlich, 2,5 x 106 cellules, à des souris ddy (5 souris dans un groupe, âgées de 5 se-.
maines). Le lendemain on fait une administration intrapéritonéale d'un mélange de sporamycine et de KUD-PC, pour observer les jours de prolongation de vie.
(2) Evaluation :
traitées x 100 - 100 n taux de prolongation
non traitées de vie (%) (3) L'effet combiné de KUD-PC et de sporamycine contre le carcinome transplantable chez l'animal (carcinome ascitique de Ehrlich) est représenté aux Tableaux II-1 et II-2, où on voit que le KUD-PC augmente l'activité antitumeur de la sporamycine.
(4) Toxicité : La toxicité aiguë (LD50) de KUD-PC est la suivante
souris i.p. LD50 > 2000 mg/kg
souris i.v. LD, > 2000 mg/kg
Tableau II-1
Figure img00120001
<tb> <SEP> Echantillon <SEP> Taux <SEP> de <SEP> pro- <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris
<tb> longation <SEP> de <SEP> > 60 <SEP> jours <SEP> de <SEP> pro
<tb> KUD-PC <SEP> sporamycine <SEP> vie <SEP> (%) <SEP> longation <SEP> de <SEP> vie
<tb> <SEP> 0 <SEP> mg/kg <SEP> 0 <SEP> U/kg <SEP> 0% <SEP> 0/7
<tb> <SEP> 2,5 <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 0/7
<tb> 10 <SEP> 0 <SEP> 13 <SEP> 0/7
<tb> <SEP> 0 <SEP> 3,000 <SEP> 35 <SEP> 0/7
<tb> <SEP> 2,5 <SEP> 3,000 <SEP> 65 <SEP> 2/7
<tb> 10 <SEP> 3,000 <SEP> 70 <SEP> 3/7
<tb> <SEP> 0 <SEP> 6,000 <SEP> 43 <SEP> 1/7
<tb> <SEP> 2,5 <SEP> 6,000 <SEP> > 161 <SEP> 5/7
<tb> 10 <SEP> 6,000 <SEP> > 161 <SEP> 4/7
<tb>
Tableau II-2
Figure img00130001
sporamycine <SEP> KUD-PC <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> jours <SEP> Taux <SEP> de <SEP> prointenmédi@ipes <SEP> lon@etion <SEP> de
<tb> <SEP> (U/kg) <SEP> (mg/kg) <SEP> intermédiaires <SEP> longation <SEP> de
<tb> <SEP> de <SEP> prolongation <SEP> vie
<tb> <SEP> de <SEP> vie
<tb> <SEP> 21 <SEP> 0
<tb> <SEP> 1500 <SEP> 10 <SEP> 33 <SEP> 57
<tb> <SEP> 2,5 <SEP> 29 <SEP> 38
<tb> <SEP> 0,63 <SEP> 38 <SEP> 81
<tb> <SEP> 0,15 <SEP> 32 <SEP> 52
<tb> <SEP> - <SEP> 29 <SEP> 38
<tb> <SEP> 750 <SEP> 10 <SEP> 27 <SEP> 29
<tb> <SEP> 2,5 <SEP> 33 <SEP> 57
<tb> <SEP> 0,63 <SEP> 45 <SEP> 114
<tb> <SEP> 0,15 <SEP> 32 <SEP> 52
<tb> <SEP> 26 <SEP> 24
<tb> <SEP> 188 <SEP> 10 <SEP> 23 <SEP> 10
<tb> <SEP> 2,5 <SEP> 25 <SEP> 19
<tb> <SEP> 0,63 <SEP> 43 <SEP> 105
<tb> <SEP> 0,15 <SEP> 37 <SEP> 76
<tb> <SEP> 25 <SEP> 19
<tb>
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui suit de plusieurs exemples non limitatifs et à l'examen des dessins annexés, qui représentent divers modes de réalisation selon l'invention.
Exemple 1 - On inocule le contenu d'une boucle de microorganismes provenant d'une culture inclinée de Streptosporangium pseudovulgalae P0-357, FERIi-P n 3571, à un milieu liquide A comprenant : glucose 2,0 %, levure sèche 0,3 %, peptone 0,5 %, extrait de viande 0,5 %, carbonate de calcium 0,3 %, et chlorure de sodium 0,5 % (pH 7,0, 100 ml), dans un ballon de Sakaguchi de 500 ml, et on agite la culture à 70 tours/minute, à 270C, pendant 72 heures.On inocule cette culture d'ensemencement (10 ml) à un milieu B comprenant : glucose 0,2 %, amidon 1,5 %, levure sèche 0,15 %, peptone 0,23 %, extrait de viande 0,3 %, et carbonate de calcium 0,25 % (100 ml, pH 7,0), dans 10 ballons de 500 ml de Sakaguchi, et on agite la culture à 170 tours/minute, à 270C, pendant 48 heures. On inocule la seconde culture d'ensemencement (1 1) au milieu A (130 l), dans une cuve en acier inoxydable de 200 1, et on effectue une culture de submersion aérée, sous aération de 100 1/minute, agitation de 250 tours/minute, pression interne de 0,5 kg/cm , å 28 C, pendant 72 heures.On détecte le KUD-PC par électrophorèse avec membrane d'acétate de cellulose dans le bouillon cultivé. On refroidit le bouillon cultivé (115 1) au-dessous de 50C, on ajoute le produit de dénomination commerciale "Hyflosupercel" (2,3 kg) et on filtre dans un filtre-presse. On lave à l'eau les myceliums filtrés, on réunit au bouillon filtré, on refroidit au-dessous de 50C, on ajoute du Hyflosupercel (400 g), puis du sulfate d'ammonium (82,5 kg) jusqu' 90 % de saturation en sulfate d'ammonium. On agite le mélange au-dessous de SOC pendant 1 heure et on recueille le précipité ainsi obtenu, pour obtenir une substance humide solide (900 g).
On effectue les opérations suivantes dans une chambre noire, au-dessous de 50C.
On dissout ladite substance solide dans l'eau (1 1), on filtre pour retirer les insolubles et on lave à l'eau. On réunit le filtrat et la solution de lavage (4 1 au total). On ajoute du sulfate d'ammonium (2,5 kg) jusqu'à saturation à 90 % en sulfate d'ammonium, on agite pendant 1 heure et on filtre le sédiment pour obtenir le produit précipité (102 g) qu'on dissout dans l'eau (450 ml). On dialyse la solution avec un tube de cellophane contre de l'eau ionisée (30 1) pendant 3 jours. On remplace l'eau déionisée tous les deux jours.La solution dessalée ainsi obtenue (1170 ml) est passée sur une colonne (9 x 50 cm) de DEAE-cellulose (vendue par la Société dite Brown C ), du type granuleux, préalablement tamponnée par un tampon de phosphate 0,002 M (pH 7,5-8). On élue avec le tampon de phosphate 0,002 M (pH 7,4, 6,4 1) et un tampon de phosphate 0,01 M (pH 7,4, 5 1), dans l'ordre indiqué, pour fractionner en fractions de 30 mi chacunee On contrôle chaque fraction selon la méthode de détection de protéines de Folin-Lawry et par un bio-essai, en utilisant
Staphylococcus aureus 209P, et on trouve KUD-PC dans les fractions n 181-300 et la sporamycine dans les fractions n 321-400. On recueille les fractions contenant le KUD-PC (3,8 1), on leur ajoute du sulfate d'ammonium jusqu'à 40 % de saturation en sulfate d'ammonium, et on filtre le précipité formé pendant 1 heure. On ajoute du sulfate d'ammonium au filtrat, jusqu'à 90 % de saturation en sulfate d'ammonium, on agite pendant 1 heure et on recueille le précipité qu'on dissout dans l'eau. On fait passer la solution (78 ml) sur une colonne (6,0 x 62 cm) de gel de dénomination commerciale "Biogel P-30" (vendu par la Société dite Biorad Laboratories C ), on élue à l'eau pour filtration sur gel, et on fractionne l'éluat en fractions de 20 g.On contre chaque fraction selon la méthode de détection des protéines et par bio-essai, comme précédemment décrit, pour obtenir les fractions n0 41-54 (280 ml). Les fractions réunies sont concentrées jusqu'à 10 ml par ultrafiltration avec membrane UH-1, et on laisse reposer pendant la nuit en refroidissant. On filtre les cristaux précipités, on lave avec une petite quantité d'eau et on sèche pour obtenir des cristaux incolores hexagonaux de KUD-PC (120 mg), de point de fusion 258-260 C (décomp.).
On réunit la première liqueur mère et la solution de lavage, on ajoute du sulfate d'ammonium jusqu'à 25 % de saturation et on laisse reposer pendant 3 jours, sous refroidissement, dans une chambre noire. On filtre les cristaux précipités, on lave avec une petite quantité d'eau froide et on sèche pour obtenir des cristaux incolores prismatiques de KUD-PC (770 mg). On réunit la deuxième liqueur mère et la solution de lavage et on ajoute du sulfate d'ammonium jusqu'à 30 % de saturation, pour obtenir des cristaux (569 mg).On traite ensuite la troisième liqueur mère par du sulfate d'ammonium jusqu'à 60 yo de saturation pour obtenir des cristaux (450 mg). Les cristaux hexagonaux incolores et les cristaux prismatiques ainsi obtenus sont soumis à l'électrophorèse avec une membrane d'acétate de cellulose (vendue sous la dénomination commerciale de "Cellulogel RS" par la Société dite Chemetron CO, 5 x 12 cm) (tampon d'acé- tate(formiate 1 M, pH 2, 200 V, n heure, colorant amide
Black 10 3). Comme le montre la fig. 4, on trouve des bandes uniques identiques dans la même position. La fig.
3 représente le profil d'électrophorèse sur gel de SD6- polyacrylamide des cristaux incolores hexagonaux (balayage par nscanner Shimazu CS-910"), où on trouve une bande unique.
Exemple 2 - Un bouillon cultivé principal (116 1), obtenu par le même processus que dans l'exemple 1, est traité comme dans l'exemple I pour obtenir une solution dessalée (1080 ini). On fait passer la solution sur une colonne (9 x 50 cm) de DEAE-cellulose, préalablement tamponnée par un tampon au phosphate 0,002 M (pH 7,0-7,4), et purifiée comme dans l'exemple 1, pour obtenir les fractions n 121-260, contenant le KUD-PC et la sporamycine. On réunit les fractions et on les traite comme dans ltexemple 1, jusqu'à 90 % de saturation par sulfate d'aiamonium, et par chromatographie sur colonne de
Biogel P-30, pour obtenir le KUD-PC dans les fractions nO 41-50 et la sporamycine dans les fractions nO 53-64.
La fig. 5 représente un diagramme de chromatographie sur colonne de Biogel P-30. On traite les fractions contenant le KtJD-PC par ultrafiltration et cristallisation comme dans l'exemple 1, pour obtenir des cristaux incolores hexagonaux (730 mg) (point de fusion 258-2600C, décomp.) des cristaux prismatiques (1,48 g) et des cristaux (0,9 g)q On trouve ces cristaux avec une seule bande, dans la même position électrophorétique, par électrophorèse avec membrane d'acétate de cellulose.
Exemple 3 - Un bouillon principal cultivé, obtenu comme dans l'exemple 1, est purifié comme dans l'exemple 1, pour produire, par 40-90 % de saturation en sulfate d'ammonium, un précipité des fractions contenant KUD-PC, obtenues par chromatographie sur une colonne de DEAEcellulose. On dissout le précipité dans l'eau (70 mil), et on fait passer sur une colonne (16 x 78 cm) de
Sephadex G-50, préalablement gonflé à l'eau, pour la chromatographie par filtration sur gel. On élue à l'eau et on fractionne l'éluat par fractions de 20 g. On contrôle chaque fraction pour la détection des protéines, et on obtient les fractions nO 56-80 contenant le KUD-PC.
La solution est dessalée et concentrée par ultrafiltration, et le concentrat (100 ml) est lyophilisé pour donner une poudre blanche de XUD-PC (1,45 g).
Le produit présente une bande unique à l'électrophorèse avec membrane d'acétate de cellulose, ce qui confirme son identité avec les cristaux incolores hexagonaux et les cristaux prismatiques, obtenus dans l'exemple 1.
Exemple 4 - Conformément à l'exemple 1, par fermentation dans une cuve de 200 1, pendant 96 heures, on obtient un bouillon principal de culture (114 1). Le KUD-PC est détecté dans le bouillon par électrophorèse avec une membrane d'acétate de cellulose et on ne trouve pas de sporamycine par le bio-essai.
On purifie le bouillon principal comme dans l'exemple 1, pour obtenir des cristaux incolores hexagonaux (50 mg, point de fusion 258-2600C avec décomp.) et des cristaux prismatiques (1,89 g). Ces cristaux présentent une bande unique dans l'électrophorèse avec acétate de cellulose.
Sur les dessins annexés,
La fig. 9 représente le spectre UV de KITD-PC.
La fig. 2 représente le spectre IR du KUD-PC.
La fig. 3 représente le profil d'électrophorèse du XUD-PC dans l'électrophorèse sur gel de SDS-polyacryl- amide.
La fig. 4 représente un diagramme d'électrophorèse de KUD-PC avec membrane d'acétate de cellulose.
La fig. 5 représente un diagramme de chromatographie sur colonne de Biogel P-30 de KUD-PC et de sporamycine.
Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux exemples décrits. Elle est susceptible de nombreuses variantes, selon les applications envisagée, sans qu'on s'écarte pour cela de l'esprit de l'invention.

Claims (1)

    - REVENDICATIONS 1 - Nouvelle protéine KUD-PC, caractérisée par les propriétés physicochimiques suivantes 1) Analyse élémentaire : comprenant carbone, hydrogène, azote, oxygène et soufre; C 49,98 %, H 7,27 %, N 15,23 %, S 1,08 %, 2) Poids moléculaire : 11500 (par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide), 3) point de fusion : 258-2600C (décomp.), 4) Rotation spécifique : 2D0 = 55,80 (c = 1,0, H O), 5) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet : tel que re- présenté à la figure 1.
  1. 6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge : tel que re
    présenté à la fig. 2, 7) Solubilité : soluble dans l'eau, insoluble dans les
    solvants organiques ordinaires, tels que l'alcool,
    l'acétone et le benzène, 8) Réactions colorées : positives: réactions de Folin
    Lowry, du biuret et
    de Rydon-Smith,
    négatives: phénol-H2S04, et
    anthrone-H2S04,
    Hydrolysat dans HCl : positive
    pour la réaction de
    la ninhydrine, 9) Nature : pH 4-8 (solution aqueuse à 0,1 % de KUD-PC), 10) Couleur et forme cristalline : cristaux incolores, 11) Composition desiminoacides : les rapports molaires
    des aminoacides d'après l'analyse d'un hydrolysat
    par HCl sont les suivants
    acide aspartique 0,144
    thréonine 0,258
    sérine 0,226
    acide glutamique 0,141
    proline 0,111
    glycine 0,250
    alanine 0,363
    valine 0,265
    isoleucine 0,016
    leucine 0,117
    méthionine
    tyrosine 0,020
    phénylalanine 0,079
    lysine 0,089
    arginine 0,040
    histidine trace) 12) Electrophorèse : le profil d'électrophorèse sur gel
    de SDS-polyacrylamide est représenté à la fig. 3 où
    la substance ne présente qu'un seul pic.
    2 - Procédé de production d'une nouvelle substance protéique EUD-PC, caractérisé en ce qu'on cultive des microorganismes, produisant la substance protéique
    KUD-PC,appartenant au genre Streptosporangium dans un milieu nutritif, on accumule la protéine KUD-PC en une masse cultivée et on isole de celle-ci la substance protéique KUD-PC ainsi obtenue.
    3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que 12 icroorganisme produisant la substance protéique KUD-PC, appartenant au genre Streptosporangium, est Streptosporangium pseudovulgalae P0-357 PERM PnO 3571.
    4 - Médicament contenant la substance KUD-PC selon la revendication 1.
    5 - Médicament selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un composé à activité antitumorale.
    6 - Médicament selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comporte de la Sporamycine.
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