LU82327A1

LU82327A1 - Substance antibiotique a/16686 et son procede de preparation

Info

Publication number: LU82327A1
Application number: LU82327A
Authority: LU
Inventors: H Pagani; B Cavalleri; G Volpe
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1979-04-07
Filing date: 1980-04-03
Publication date: 1981-12-02
Also published as: AR222217A1; PH17230A; NL192989C; FR2452931B1; NO155496B; HU181534B; MX5958E; HK23584A; DE3013246A1; CA1142866A; IL59704A; SE441188B; SG22687G; JPS5697237A; ATA187480A; FI800881A; YU41917B; ES8103170A1; IL59704A0; FR2452931A1

Description

» ****** .

a attribué le numéro matricule ATCC 33076.

Les caractéristiques de la souche Actinoplanes sp. ·\-Η>

.. '· ’ V

| ATCC 33076 sont indiquées ci-après.

i ? ' § Morphologie ,| La souche se développe bien sur différents milieux I avec une coloration orange du mycélium du substrat. Elle ne i forme pas de pigment. Le mycélium aérien est toujours absent.

g A l’examen microscopique, le mycélium végétatif révèle des % hyphes ramifiées d'un diamètre d’environ 1 yjm. Les sporanges I se forment de manière peu abondante et uniquement sur de · l’agar-agar de pomme de terre ; ils sont globeux avec une ? surface très irrégulière et un diamètre allant de 5 à 9 ^im.

ï On observe une libération sporangiale après rupture de la î

H

paroi du sporange. Les spores sous-sphériques sont motiles ; (diamètre : 1-1,5 ^un). L’analyse des composants des parois des cellules révèle un modèle d’acide méso-diaminopimélique et de sucre de type D (Lechevalier et al., - "Chemical .;· composition as a critérium in the classification of Actino- mycetes" , "Adv. Applied Microbiology" , JL^, 1971 , "Academie I Press", N.Y.).

|! ' Caractéristiques de culture i

Le tableau 1 ci-après reprend les caractéristiques v i r de culture de la souche Actinoplanes ATCC 33076 cultivée sur H différents milieux classiques suggérés par "Shirling et î Gottlieb’1 ("Intern. J. System. Bact.", 16, 313-340, 1966) et d’autres milieux recommandés par Waksman ("The Actino-mycetes", volume XI - "The Williams and Wilkins Co.", 1961 ).

On détermine les caractéristiques de culture après incubation |j pendant 6 à 14 jours à 30°C.

5 · J· '

TABLEAU I

Caractéristiques de culture /x’;.·.

Les numéros de certains milieux de culture désignent ceux donnés par Shirling et Gottlieb dans "Methods for characte-rization of Streptomyces species" - "Intern. J. System. Bact." 16, 313-340, 1966.

Milieux de culture Caractéristiques de culture

Milieu n° 2 (extrait de levure/ Croissance abondante, surface agar-agar de malt) plissée, brun clair 12 H 12

Milieu n° 3 (farine d’avoine/ Croissance peu abondante, ·.

agar-agar) mince, orange clair 9 B 6

Milieu n° 4 (sels inorganiques/ Croissance modérée, surface agar-agar d'amidon) recouverte d'une croûte, orange 11 L 12

Milieu n° 5 (glycérol/agar-agar Croissance peu abondante, d'asparagine) hyaline

Milieu n° 6 (peptone/extrait de Croissance peu abondante, levure/agar-agar de fer) hyaline à brun clair

Milieu n° 7 (agar-agar de Croissance peu abondante, tyrosine) surface lisse, brun 5 D 11

Agar-agar de farine d'avoine Croissance abondante, surface (suivant Waksman) plissée, orange à brun 12 C 10

Agar-agar de Hickey et Tresner Croissance abondante, surface recouverte d'une croûte, orange 11 G 8 ;·'

Agar-agar de glucose de Czapek Croissance modérée, surface v:: recouverte d'une croûte, orange 11 G 8

Agar-agar de glucose/asparagine Croissance peu abondante, surface recouverte d'une croûte, orange clair 11 F 6

Agar-agar nutritif Croissance modérée, surface lisse, orange 11 G 8

Agar-agar de pomme de terre Croissance abondante, surface plissée, ambre-brun 12 E 10

Agar-agar de Bennett Croissance abondante, surface ..//.. //.

plissée, orange 11 C 8 .

* j.

- 5 - ' V·-'- TABLEAU I (suite)

Milieux de culture Caractéristiques de culture

Agar-agar de malate de calcium Croissance modérée, surface lisse, orange clair 10 C 6

Agar-agar de lait écrémé Croissance abondante, surface plissée, orange 9 C 2

Agar-agar de Czapek Croissance modérée, surface recouverte d'une croûte, orange 10 D 7 . ' ;.

Agar-agar d’oeuf Croissance modérée, surface lisse, hyaline à orange clair

Agar-agar de peptone/glucose Croissance abondante, surface plissée, orange 11 G 11

Agar-agar Croissance très peu abondante.

surface lisse, hyaline Sérum de Loeffler Croissance très peu abondante.

surface lisse, orange

Pomme de terre Croissance peu abondante, surface recouverte d'une croûte, brun clair Gélatine Croissance peu abondante, orange clair

Cellulose Croissance très peu abondante. - ‘ ’ mince, hyaline - 6 - · ·'/··.

. r - .

Utilisation de carbone

Le tableau II donne l'utilisation de sources de carbone c examinées conformément au procédé de Pridham et Gottlieb ("J. Bact." 56, 107, 1948).

TABLEAU II

Sources de carbone Utilisation .

Inositol -

Fructose +

Rhamnose +

Mannitol -

Xylose +

Raffinose

Arabinose +

Cellulose

Sucrose +

Glucose + •Mannose + :-¾

Lactose - : ::··.·.····:·ν

Salicine + + = utilisation positive - = pas de croissance :;··· 'y

Caractéristi gués physiologiques . Λ·-···

Le tableau IIX donne les caractéristiques physiologiques de la souche.

TABLEAU III

ί Essai Résultats

Hydrolyse d’amidon Positive

Formation de Positive Réaction à la tyrosinase Négative χ·· : ,

Hydrolyse de caséine Positive

Solubilisation de malate de calcium Négative

Liquéfaction de gélatine Positive coagulation Positive

Lait de tournesol ^ peptonisation Négative Décomposition de cellulose Négative

Pour la production de l'antibiotique A/16686, on cultive la souche Actinoplanes sp. ATCC 33076 dans des conditions aérobies dans un milieu nutritif aqueux contenant une ./..-7.:. source assimilable de carbone, une source assimilable d * azote et des sels inorganiques. Ce milieu de culture peut être l'un ou l'autre des différents milieux nutritifs habituellemei utilisés dans la technique de la fermentation ; toutefois, certains milieux sont préférés. C'est ainsi que, par exemple les sources préférées de carbone sont le glucose, le fructose; le mannose, le sucrose et analogues. Les sources préférées d'azote sont la farine de soya, la peptone, l'extrait de ---.: viande, l'extrait de levure, la tryptone, les acides aminés . . -:.

- «i - et analogues. Parmi les sels inorganiques pouvant être incorporés dans les milieux de culture, il y a les sels solubles habituels capables de fournir des ions sodium, potassium, fer, zinc, cobalt, magnésium, calcium, ammonium, chlorure, carbonate, sulfate, nitrate et analogues. Habituellement, on soumet la souche productrice d'antibiotique à une culture préalable dans un ballon à agitation, puis on utilise la culture pour inoculer des cuves de fermentation en vue de produire d'importantes quantités d'antibiotique A/16686. Le milieu utilisé pour la culture préalable peut être le même que celui employé pour des fermentations plus importantes ; toutefois, on peut également utiliser d'autres milieux.

La souche productrice d'antibiotique A/16686 peut se développer à des températures comprises entre environ 20°C et environ 37°C, de préférence, à des températures d'environ 28-30°C.

Au cours de la fermentation, on peut suivre la production de l'antibiotique en déterminant, par des essais, l'activité antibiotique d'échantillons du bouillon ou d'extraits des solides mycéliens.

Les organismes dont on connaît la sensibilité à . l'antibiotique A/16686, sont utiles à cet effet. Un organisme .-'· de titrage particulièrement utile est Sarcina lutea. On effectue avantageusement le titrage biologique par le procédé de diffusion d'agar-agar sur des plaques d'agar-agar. La production maximale de l'activité antibiotique se manifeste généralement à peu près entre le troisième et le cinquième jour. L'antibiotique produit au cours de la fermentation de la souche Actinoplanes sp. ATCC 33076 se trouve à la fois dans le bouillon et dans la masse mycélienne. En conséquence^ y la récupération de l’antibiotique A/16686 peut être effectuée ··; « par extraction séparée du bouillon et du mycélium. _ ί On effectue le plus avantageusement l’extraction ! ' de la masse mycélienne avec du méthanol, cependant que d’autres "1 * * £ alcools inférieurs et le chloroforme sont egalement appropries.

î On récupère l’antibiotique A/16686 sous forme d’un produit i brut à partir du solvant d’extraction par un procédé habituel.

D'une manière analogue, on soumet également le bouillon à une % extraction, de préférence, avec du n-butanol et l'on obtient î , , ÿ une quantité supplémentaire de l'antibiotique brut A/16686 ! par précipitation à partir de cette solution. Ensuite, on effectue la purification de l'antibiotique A/16686 en traitant le produit récupéré des solvants d'extraction avec un mélange 4:7:2 de chloroforme, d'éthanol et d'eau, en séparant le produit huileux formé et en le versant dans l'eau. Ce traitement provoque la solidification du productique l'on récupère par filtration et que l'on soumet à une purification complé- v mentaire par chromatographie dans une colonne de gel de silice I , 7 en procédant a une elution avec un mélange 1:1 d'acétonitrile et de HCl 0,01N. L'antibiotique A/16686 qui, suivant ce « ' ;=v·: 4 procédé, est récupéré sous forme d'un chlorhydrate, est i ensuite dessalé par chromatographie dans une colonne de gel de dextrane réticulé. On contrôle chaque étape du procédé ^ de purification ci-dessus par chromatographie sur couche f. mince en utilisant un système solvant approprié tel qu'un système solvant basique, par exemple, un mélange 2:3:4 de n-propanol, de n-butanol et d'hydroxyde d'ammonium K (phase supérieure) ou un mélange 10:9:1 de méthanol, d'acétate d'ammonium aqueux.à 10^ et d'hydroxyde d'ammonium à 10%} système dans lequel n'importe quel sel d'addition d'acide .r - * · β-. . - - io - ;·: d’antibiotique Α/16686 se transforme en une base libre.

En conséquence, toutes les étapes décrites ci-dessus ont pour but d’isoler l’antibiotique pur A/16686 caractérisé par une valeur particulière dans le système solvant particulier utilisé.

On peut avantageusement adopter d’autres procédés de purification, notamment des procédés classiques d'extraction et d'adsorption. Ces autres procédés peuvent être aisément suivis pas à pas en contrôlant le déroulement de la purification par chromatographie sur couche mince, ainsi qu'on l'a décrit ci-dessus. En suivant, à la chromatographie sur couche mince, la tache de l'antibiotique A/16686 d'une valeur particulière, l’homme de métier sera ainsi à même de déterminer les opérations qui pourraient avantageusement être effectuées pour isoler l'antibiotique pur A/16686.

Le chlorhydrate de l'antibiotique pur A/16686, que l'on obtient conformément au procédé décrit ci-dessus, peut ensuite être éventuellement transformé en une base libre correspondante ou en un autre sel d'addition d'acide physio-logiquement acceptable par des procédés classiques.

L'antibiotique A/16686 est un agent antimicrobien et il est particulièrement actif contre les micro-organismes gram-positifs. En particulier, le tableau IV ci-après résume le spectre d'activité in vitro de l'antibiotique A/16686 : ~ - ' - 11 - ‘ ---------------------------- ···*.....

I TABLEAU IV

\ Organismes Concentration inhibi- trice minimale (ug/ml) ö de l’antibiotique | · * A/16686 ;· S. aureus ATCC 6538 0,16 S. aureus ATCC 9144 0,16 ~~ S. aureus Tour 0,31 ΐ. Staphylococcus 10B Ciba 0,08 v S. epidermidis ATCC 1222 8 0,08 . j;.: .. : ; S. saprophyticus NCTC J2<)2 0,16 : M. flavus ATCC 10240 0,016 S. lutea ATCC 9341 0,02 S. pyogenes C 203 SKF 13400 0,01 S. pneumoniae Felton UC 41 0,05 S. faecalis ATCC 7080 0,31 S. foecium ATCC 10541 0,08 • S. agalactiae ATCC 7070 0,02 ί S. mutans ATCC 27607 0,08 ΐ C. diphtheriae var. mitis ATCC II05I 0,31 ' C. xerosis NCTC 9755 0,02 B. subtilis ATCC 6633 0,062 B. cereus var. mycoides ATCC 11778 0,08 C. perfringens ISS 30543 0,16 P. acnes ATCC 6919 0,4 P. acnes ATCC 6922 0,8 P. acnes ATCC 25746 0,4 j.

. ·' ·*·' .- " :'*** ·* ·-····· .*.·-. . ·νν ' ·· ... :·

Le tableau V reprend les résultats obtenus en soumettant l’antibiotique A/16686 à des essais vis-à-vis d’une variété de souches de Staphyloccus aureus, Streptococcus ;. ·.·. pyogenes. Streptococcus pneumoniae et Streptococcus faecalis isolées cliniquement.

TABLEAü V

Organismes Concentration inhibitrice minimale {jxg/ml) de l’antibiotique A/16686 S. aureus 54310 L 1096 0,62 S. aureus 54560/I L 1097 0,31 S. aureus 54635 1* 1098 0,31 S. pyogenes L 33 0,04 S. pyogenes L 794 0,08 S. pyogenes L 800 0,04 S. pyogenes L 801 0,16 S, pyogenes L 802 0,08 S. pyogenes L 803 0,08 S. pyogenes L 804 0,62 S. pyogenes L 805 0,08 S. pneumoniae L 1055 0,04 <. ..

S. pneumoniae L 1102 0,04 S. pneumoniae L H74 0,05 S. faecalis L 768 0,31 S. faecalis L876 0,31 S. faecalis L 922 0,31 S. faecalis L 949 0,31 S. faecalis L 965 0,31 S. faecalis LÜ39 0,62 ...... v S . f o ec ium L 7 6 3 0,16 ·.

I · I On a également constaté que l’antibiotique A/l 6686."./:; I , ' -> exerçait une activité de haut ordre in vivo contre différents ' ·.

l organismes pathogènes. L’efficacité de l’antibiotique A/l668 î ressort clairement du tableau VX qui indique les valeurs ^50 (^oses efficaces à 50%) contre trois micro-organismes ^ - différents chez la souris.

!-J

I TABLEAU VI

J

: DE^o (mg/kg par voie sous-cutanée) ' t S. aureus Tour S. pyogenes S. pneumoniae C203 ISM Felton UC 41 7/ 7 " ' ; A/16686 24,6 0,09 0,2

On a constaté que l'antibiotique A/16686 avait une toxicité relativement faible lorsqu'on l'a utilisé sur des animaux d'essai. Par exemple, lorsque cet antibiotique est administré par voie intrapéritonéale à des souris, la valeur DLj-q (= dose létale à 50$) se situe entre environ 500 et 750 mg/kg.

En conséquence, la présente invention a également pour objet l'utilisation de l'antibiotique A/16686 comme 7 77 agent antibactérien, étant entendu que l'expression "utilisation" englobe tous les aspects et actes industriellement applicables de cette utilisation, y compris la mise en oeuvre de l'antibiotique A/16686 dans des compositions pharmaceutiques qui, par conséquent, constituent un autre aspect de la présente invention.

Ces compositions pharmaceutiques, qui sont appro-priées pour une administration par voie orale, topique ou parentérale, sont préparées suivant les méthodes habituelles -. — · ‘ " ' - .. — ------ αν- - 1 ; - connuι·β de l’homme de métier spécialisé dans les sciences - v:·.

pharmaceutiques. Des exemples de ces formulations sont ££:·κ·*:% décrits, notamment, dans "Remington's Pharmaceutical Sciences", ISième édition, 1975> "Mack Publishing Co.",

Easton, Pennsylvanie, E.TJ.A. Parmi ces formulations, , il y a les comprimés, les capsules, les poudres, les onguents, les solutions liquides, les solutions pour injection et analogues. L'unité de dosage peut contenir 0,5 à 99$J do préférence, 5 à 80$ de l'ingrédient actif. La dose quotidienne peut être déterminée en tenant compte de plu-sieurs facteurs tels que le poids du corps, l'organisme fi provoquant l'infection, la gravité de l'infection, la période et le mode d'administration.

Afin d'illustrer plus complètement la mise en oeuvre de la présente invention, on donnera les exemples ci-après.

Exempü c 1

Fermentation de la souche Actinoplanes sp. ATCC 33076

On soumet une culture d'Actinoplanes sp. ATCC

33076 à une culture préalable en faisant croître cette souche dans une culture en ballons secoué ayant la composition sui- _.

·.

vante :

Extrait de viande 3 g/l

Extrait de levure 5 g/l I

Tryptone 5 g/l

Amidon soluble 24 g/l 2

Glucose 1 g/l

CaCO^ 4 g/l

Eau du robinet 1 litre.

/ . ·**' .

On secoue les ballons pendant environ 96 heures ? à 28-30°C, puis on utilise les cultures préalables (1 litre) ä pour procéder à l'inoculation dans les cuves de fermentation vi':; Z contenant chacune 10 litres du milieu nutritif suivant : p Extrait de viande 40 g g Peptone 40 g 3 Extrait de levure 10 g I Chlorure de sodium 25 g §

Farine de soya 100 g § Glucose 250 g I CaCO- 50 g · g ^ . . '· I Eau du robinet 10 litres.

£. On soumet les charges de fermentation à une I incubation dans des conditions aérobies avec agitation à une température de 2S-30°C. A intervalles, on procède au 5 titrage microbiologique de l'activité antibiotique par le % procédé de diffusion d'agar-agar en utilisant Sarcina lutea g I comme organisme d'essai. L'activité maximale est atteinte ÿ après 72 à 120 heures de fermentation.

ï Exemple 2 • Récupération de l'antibiotique A/16686

On refroidit, à 10°C, 170 litres d'un bouillon * de fermentation complet préparé comme décrit.à l’exemple 1 ÿ et on le porte à un pH de 3j5 au moyen de HCl à 18^. On filtre le bouillon acide obtenu en utilisant un adjuvant ! .* de filtration ("Clarcel Flow-Ma" ) et on lave le gâteau mycéli· I avec de l'eau. Ensuite, on soumet séparément le bouillon §! filtré et le mycélium à un traitement complémentaire.

k I . -.'V:· ifr.

.Μ*·'·. · a) On utilise 30 litres de méthanol pour extraire la masse mycélienne qui, après filtration, est à nouveau ....

extraite avec un mélange de méthanol et d’eau (30 litres de .··"·*-·" méthanol plus 5 litres d’eaq). On rejette le mycélium épuisé et on concentre les deux extraits méthanoliques sous vide à une température inférieure à 40°C pour obtenir 6 litres d’un concentrât aqueux. On extrait ce concentrât aqueux avec trois portions (10 litres chacune) de n-butanol que l’on combine et concentre à un faible volume sous vide.

On ajoute ce concentrât à de l’éther de pétrole et on sépare le précipité obtenu par décantation, puis on ---//.

l’ajoute à une quantité supplémentaire d’éther de pétrole.

On sépare le précipité par filtration et on le sèche sous vide à ld température ambiante pour obtenir 80 g de l’antibiotique A/16686 sous forme d'une matière brute ayant, vis-à-vis de S. pneumoniae UC 41, une concentration inhibitrice minimale de 0,1 ^ig/ml.

b) On refroidit, à 10°C, 165 litres du bouillon filtré plus le produit de lavage et on règle le pH à 3j5 par s · addition de 2,5 litres de HCl concentré. On extrait la solution ainsi obtenue avec 80 litres de n-butanol, puis on .

concentre l’extrait organique sous vide à une température ........:’·.· inférieure à 35°C pour obtenir 6 litres d'un concentrât butanolique. On ajoute ce concentrât à de l’éther de pétrole et l'on ajoute le précipité obtenu et séparé par décantation à une quantité supplémentaire d'éther de pétrole. On sépare le solide par filtration et on le sèche sous vide à la température ambiante pour obtenir 26,3 g d’antibiotique brut A/16686 ayant, vis-à-vis de S. pneumoniae UC 41, une concen- //..· tration inhibitrice minimale de 0,8 ug/ml.

J* . - > -** -

- J

I Exemple 3 ; - j • ; ί Purification de l'antibiotique A/16686 • ^

-·; U

.¾¾ On traite 47,7 gdel’antibiotique brut A/16686 obtenu a l'exemple 2a) avec 1,4 litre d'un mélange 4î7î2 ·.

J (en volume/volume/volume) de chloroforme, d’éthanol et d’eau, J puis on sépare le produit huileux formé de la solution par décantation. Ensuite, on ajoute encore 70 ml du mélange I ci-dessus au produit huileux et l’on répète la séparation.

I En traitant le produit huileux avec 440 ml d'eau, ce produit I se solidifie, puis on le sépare par centrifugation et filtra- I tion.

rU

x \ a) On met le solide séparé en suspension dans 4* I70 ml d'eau, on le dissout par addition de 400 ml de méthano et on le filtre. Ensuite, on extrait les solvants sous vide I par addition de n-butanol à une température ne dépassant 5 jamais 35°C et l’on obtient ainsi un concentrât butanolique : d'environ 50 ml. Par addition de 500 ml d'éther diéthylique, f il se forme un précipité que l'on sépare par filtration et I que l’on sèche sous vide à la température ambiante pour I; obtenir 1,012 g d'antibiotique assez pur A/16686 ayant, I vis-à-vis de S, pyogenes, une concentration inhibitrice § / '% minimale de 0,025 ^ig/ml. On soumet l'antibiotique assez ’’ pur A/16686 ainsi obtenu aux procédés de purification décrits ci-après :

On dissout 1,58 g de l'antibiotique A/16686 carac térisé par une concentration inhibitrice minimale de 0,025 jig/τύ. vis-à-vis de S. pyogenes dans un mélange 1:1 (volume/ volume) d'acétonitrile et d'eau et on applique la solution ainsi obtenue à une colonne contenant 430 g de gel de silice 60 ("Merck’’, 0,06-0,2 mm) que l'on prépare dans le même j.

mélange. On développe la colonne en utilisant tout d'abord le même mélange d'aeétonitrile et d'eau et en recueillant 70 fractions de 20 ml chacune, puis en utilisant un mélange 1:1 (volume/volume) d'aeétonitrile et de HCl 100N et en recueillant encore 290 fractions de 20 ml chacune. On contrôle l’élution de la colonne par chromatographie sur couche mince et sur des plaques de gel de silice 60 ^254 en titrant des fractions vis-à-vis de Sarcina lutea. On combine les fractions 130 à 265, puis on extrait les solvants sous vide avec du n-butanol pour obtenir un concentrât de 20 ml de n-butanol. On verse ce volume résiduel dans une importante quantité d'éther éthylique et, par filtration, on sépare le précipité formé, puis on le sèche sous vide à la température ambiante sur du î*2®5 l'on obtient 1,015 g de l'antibiotique A/16686.

On dissout 0,67 g de la substance ci-dessus dans 24 ml d'eau et Jt ml de méthanol. On applique la solution obtenue à une colonne de 3 x 62 cm contenant 220 g de "Sephadex LH-20" que l'on prépare dans un mélange 7:3 (volume/ volume) de méthanol et d'eau. On développe la colonne avec : · le même mélange en recueillant des fractions de 10 ml. On combine les fractions 24 à 32 et on extrait les solvants sous vide à une température inférieure à 35°C avec du n-butanol jusqu’à ce qu'on obtienne un volume résiduel de butanol d'environ 10 ml. On ajoute cette solution à de l'éther éthylique afin de précipiter l'antibiotique A/16686 pur désiré. On sépare le précipité par filtration, on le lave avec de l'éther éthylique et on le sèche sous vide > ;.

sur du î*2®5 ®· ^-a température ambiante pour obtenir 0,26 g d’antibiotique pur A 16686.

_ . „ b) On soumet le filtrat à une extraction sous vide à une température inférieure à 35°C en ajoutant du n-butanol x . · : ' . pour obtenir un concentrât de n-butanol de 50 ml. Par addition d’éther de pétrole, il se forme un précipité que l'on sépare par filtration et que l'on sèche sous vide à la température ambiante pour obtenir 42,9 g d'antibiotique A/I6686 partiellement purifié et caractérisé par une concentration inhibitrice minimale de 0,2 yag/ml vis-à-vis de S. pyogenes.

On met cette substance antibiotique en suspension dans 2,5 1 xjg d'eau et on la dissout par addition de NaOH IN jusqu'à un pH de 7· Ensuite, on extrait la solution aqueuse obtenue avec trois portions (5 litres chacune) de n-butanol et, après lavage à l'eau, on concentre cette phase organique à 200 ml sous vide et à une température inférieure à 35°C.

En ajoutant de l'éther diéthylique au concentrât, il se forme un précipité que l'on filtre et sèche sous vide à la température ambiante. On dissout le produit séché dans 160 ml de la couche supérieure d'un mélange 2:3:4 (volume/volume/volume) de n-propanol, de n-butanol et d'hydroxyde d'ammonium IN. On applique la solution obtenue à une colonne d'une hauteur de 100 cm, d'un diamètre de 7*5 cm : -V·· et contenant 1,7 kg de gel de silice 60 ("Merck", 0,06-0,2 mm) que l’on prépare dans le mélange de solvants çi-dessus. On développe la colonne en utilisant le même mélange et en recueillant des fractions de 300 ml. On contrôle 11élution de la colonne par chromatographie sur couche mince. On combine les fractions 21 à 26 et on les soumet à une extraction sous vide à une température inférieure à 35°C avec du n-butanol pour obtenir un concentrât de n-butanol de 50 ml, . j. ‘ : - 20 - *

Par addition d'éther diéthylique, il se forme un précipité - que l'on sépare par filtration, qu'on lave avec de l'éther diéthylique et que l'on sèche sous vide sur du P20j. 3 -l-3 température ambiante. On récolte 1,875 g d'antibiotique A/I6686 assez pur; que l'on purifie ensuite davantage en suivant les mêmes procédés que ceux décrits sub (a) ci-dessus.

Sous forme de son chlorhydrate, l'antibiotique A/I6686 est une matière blanche, cristalline et légèrement hygroscopique d'un point de fusion de 224-226°C. Cette substance est très soluble dans l'eau et le diméthylformamide, ·:·.· Vv soluble dans le inéthanol, l'éthanol, le propanol et le butanol, mais insoluble dans l'éther éthylique, l'éther de pétrole et le benzène. L'analyse élémentaire du chlorhydrate de l'antibiotique A/16686, préalablement séché à 140°C sous une atmosphère inerte indique la composition suivante dans les pourcentages approximatifs ci-après (moyenne de plusieurs analyses) : carbone · 51,73$ ; hydrogène : 6,34$ ; azote : 9,96$ j chlore (teneur totale) : 5,8ΐί : ions chlore : 4,74$ et résidus : 1%. La figure 1 des dessins annexés donne le spectre d'absorption des rayons inframages dans du nujol.

On observe les maxima d'shsrrption suivants ; V.

(en cm ) : 3290-3070, 2930 et 286ü mjol) , 1765, I63O, ’’ 1510, 1455, 1375 (nujol), 1230, 11;:, ::50, 1065, 1030, 1015, 98Ο, 84Ο et 820.

La figure 2 des dessins innées donne le spectre d'absorption des rayons ultraviolets s~ec les maxima d'absorption suivants : • I a) dans du méthanol 1 232 nm (e}^ = 178) I 1 cm 265 nm (E*^ = 107) v 1 cm

b) dans du méthanol contenant du HCl 0,1N

231 nm (e}^ =167) 1 cm ' 27Ο nm (EÎ^ = 96) 1 cm

c) dans du méthanol contenant du NaOH 0,1N

250 nm (E^cnT 232) 295 nm (saillie) d) dans du méthanol contenant un tampon d’un pH de 7>38 23I nm (e}* = 167) |! 1 cm ' 27Ο nm (E^ = 96) i 1 cm ' ! ’ j On enregistre les spectres d’absorption des I rayons ultraviolets avec un spectrophotomètre de ”Beckmann DK-2”.

Le chlorhydrate de l’antibiotique A/16686 a une Λ i rotation spécifique [a]D4 de + 49>7° (c = 0,43$ dans le diméthylformamide).

% i! L’antibiotique A/16686 donne les réactions carac- ' téristiques suivantes : ! » ninhydrine (solution éthanolique à 3$) négative

I A

\ ninhydrine (solution éthanolique à 3$ + acétate de sodium) positive 1% FeCl- - 1% K0Fe(CN)Â (solution aqueuse) positive j 336 (Vert)

Molisch positive I Fehling négative $ · -â-

Biuret positive ’ ' Anthrone positive - 22 - -

HoS0. concentré négative 2 4 KMnO^ aqueux positive ^ Le tableau ci-après donne les valeurs R^ de l’an tibiotique A/I6686 à la chromatographie sur papier en utilisant des systèmes d’élution différents et la souche S. aureus ATCC 6538 comme organisme de détection : 4 TABLEAU VII : Comportement chromatographique (papier de ΐ Whatman n° l) de l’antibiotique A/16686.

Systèmes d’élution Valeurs 1) n-butanol saturé d’un tampon de Sô’rensen d'un pH de 6 0,00 2) n-butanol saturé d'eau contenant 2% d'acide p-toluène-sulfonique 0,00 3) n-butanol saturé d'eau contenant 2% d'hydroxyde d'ammonium 0,00 4) Tampon de Sörensen (pH : 6) saturé de n-butanol 0,05 5) Mélange ^il\2 de n-butanol, de méthanol et d'eau 0,43 6) Acétate d'éthyle saturé d'eau 0,00 7) Mélange 2:1:1 de n-butanol, d'acide acétique et d'eau 0,52 8) Mélange 4^3:7 de n-butanol, de pyridine et d'eau 0,87 ; * Chromatographie descendante

Rm : 40 cm

Quantités : 20 yug du composé dissous dans du méthanol aqueux (2 mg/ml).

Le tableau ci-après donne les valeurs R^ de l'antibiotique A/16686 dans différents systèmesde chromatographie sur couche mince (les conditions sont indiquées en dessous du tableau) : t· " 1 ..... ..........-·»»*****,.;„„,

TABLEAU VIII

Systèmes d'élution (volume/ Valeurs R.£

Ivolume/volume) 1) Mélange 2:3:4 de n-propanol, de * n-butanol et d’hydroxyde d’ammonium N 0,15 (phase supérieure) 2) Mélange 4*2:5 de n-butanol, d'acide acétique et d’eau 0,61 3) n-butanol, éthanol, acide chlorhydrique 0, IN 0,61 4) Mélange 4*7*2 de chloroforme, d'éthanol et d'acide acétique à 10$ 0,00 5) Mélange 4:1:5 de n-butanol, d'acide acétique et d'eau 0,17 6) Mélange 10:9*1 de méthanol, d'acétate d'ammonium aqueux à 10$ et d'hydroxyde d'ammonium à 10$ 0,52 7) Mélange 6:4*3*1 de n-butanol, de pyridine, d’eau et d’acide acétique 0,45 8) Mélange 10:9*1 de méthanol, d'acétate d'ammonium aqueux à 10$ et d'hydroxyde d'ammonium à 10$ 0,11 9) Mélange 1:1 de NaH^PO. aqueux 0,25M et d'acétonitrile 4 0,68 10) Mélange 1:1 de méthanol et d'acétate d'ammonium aqueux à 10$ 0,65 11) Mélange 4*2:5 de n-butanol, d'acide acétique et d'eau 0,77

Rm : environ 140 mm

Quantités : 2-5 d'une solution (l mg/ml) du composé dans un mélange 1:1 d'acétonitrile et d'eau. Visualisation : a) bio-autographie sur plaques d'agar-agar ensemencées de B. subtilis ATCC 6633 J b) carbonisation par chauffage avec de l'acide a-naphtol sulfurique ; c) vapeur d'iode ; d) réactif de chlore/toluidine ; e) lumière ultraviolette à 254 um.

- 24 - 1 à 7 - plaques de gel de silice 60 (•'Merck11 ) j visualisation a, e, b, c, d, e 8,9 - gel de silice 60 Foc. traité au silane ("Merck") $ visualisation e 10, 11 - plaques de cellulose F ("Merck"visualisation a.

Ainsi qu'on le détermine par des techniques chro-i matographiques à haut rendement, l'antibiotique A/16686, isolé et purifié comme décrit à l'exemple 3î est constitué d'un composant principal en une quantité allant jusqu'à 70-80$, tandis que les 30-20$ restants sont attribuables au moins à deux composants mineurs.

Le chlorhydrate de l'antibiotique A/16686 isolé comme décrit dans les exemples précédents est le chlorhydrate d'un glycopeptide basique chloré qui se différencie des antibiotiques appartenant au groupe classique des glyco-peptides par sa teneur en chlore et par ses différents composants d'acides aminés. En effet, après hydrolyse acide dans de l'acide chlorhydrique 6N à 110°C pendant 6 heures, au moyen d'un auto-analyseur d'acides aminés, l'analyse * des acides aminés de l'antibiotique A/16686 indique la présence des acides aminés suivants : ornithine (118 ^ig/mg = • 0,58yjM/mg), acide aspartique (29,2 yig/mg = 0,22^iM/mg), thréonine (68 ^ig/mg = 0,57^iM/mg), glycine (.25 yag/mg = 0,33yuM/mg), alanine (29 yig/mg = 0,32^iM/mg), leucine (41 yug/mg = 0,31 jM/mg) et phénylalanine (42 ^ig/mg = 0,25 ^M/*ng) · ^

En outre, on détecte quatre pics en utilisant la colonne pour les acides aminés neutres et acides. Deux de ces quatre acides aminés sont identifiés par des techniques de chromatographie gazeuse et de spectrométrie de - 25 - i I masse après transformation en leurs dérivés correspondants trifluoracétyliques d'ester méthylique j on leur attribue les structures suivantes : i' j OH OH Cl φ φ j CH-NH2 ch-nh2

COOH COOH

I II

Exemple 4 j ! Isolation de la base libre i

En traitant une solution de 0,05 g du chlorhydrat jl de l'antibiotique A/16686 dans un mélange de 3 ml d'eau et il

Ji de 8 ml d'éthanol avec 2 ml de 1,2-époxybutane, il se forme j; un précipité qui, après l'avoir laissé reposer à basse température pendant un jour, est séparé par centrifugation, puis soumis à un lavage avec de l'éthanol et séché sur du I Ρ205 sous vide à la température ambiante pour obtenir 0,016 de la base libre correspondante.

En traitant cette forme basique libre de l'antibiotique A/16686 avec un acide organique ou inorganique

Ipharmaceutiquement acceptable, il se forme un sel d'additioi d'acide correspondant. Les acides pharmaceutiquement acceptables sont des acides non toxiques appropriés pour la form« ' s tion de sels thérapeutiquement utiles de façon connue dans la technique, par exemple, l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide nitrique, l'acide tartrique, l'acide acétique, l'acide succinique, l'acide lactique, l'acide glutamique ou

Claims

1 F) elle a une rotation spécifique [a]^ de ! + 49,7° (c = 0,43$ dans du diméthylformamide) ; G) elle donne les réactions caractéristiques « . suivantes : ninhydrine (solution éthanolique à 2%) négative ninhydrine (solution éthanolique à 2% + acétate de sodium) positive 1% FeCl^ - 1$ K^Fe(CN)^ positive (ver ; Molish positive 1. ehling négative I Biuret positive m Millon négative **2®®4 concen^r® négative KMnO. pos itive £ ** H) elle donne les valeurs ci-après à la j ‘ chromatographie sur papier de Whatman n° 1 en utilisant la souche S. aureus ATCC 6538 comme organisme de détection : Système d'élution Valeurs RP * t 1. n-butanol saturé d'un tampon de Sörensen d'un pH de 6 0,00 j 2) n-butanol saturé d'eau contenant 2% d'acide p-toluène-sulfonique 0,00 3. n-butanol saturé d'eau contenant 2% 0,00 d'hydroxyde d'ammonium ί a 4) tampon de Sörensen d'un pH de 6 saturé de n-butanol 0,05 5. mélange 4:1:2 de n-butanol, de méthanol | et d'eau 0,43 6. acétate d'éthyle saturé d'eau 0,00 7. mélange 2:1:1 de n-butanol, d'acide acétique et d'eau 0,52 8. mélange 4:3:7 de n-butanol, de pyridine et d'eau 0,87 I) elle donne les valeurs R^ ci-après dans des ’ systèmes de chromatographie sur couche mince de gel de silice indiqués ci-après : : K

7 Systèmes d'élution (volume/ Valeurs R^ volume/volume) 1. mélange 2:3:4 de n-propanol, de n-butanol et d'hydroxyde d'ammonium N (phase supérieure) 0,15 2. mélange 4:2:5 de n-butanol, d'acide ; acétique et d'eau 0,61 3. mélange de n-butanol, d'éthanol et d'acide chlorhydrique 0,1N 0,61 * Λ / ^ - 36 - 4. mélange 4:7:2 de chloroforme, d'éthanol et d’acide acétique à 10% 0,00 5. mélange 4:1:5 de n-butanol, d’acide # acétique et d’eau 0,17 6. mélange 10:9:1 de méthanol, d’acétate r d’ammonium aqueux à 10% et d’hydroxyde d’ammonium à 10% 0,52 7. mélange 6:4:3:1 de n-butanol, de pyridine, d’eau et d’acide acétique 0,45 8. mélange 10:9:1 de méthanol, d’acétate d’ammonium aqueux à 10% et d’hydroxyde d’ammonium à 10% 0,11 9. mélange 1:1 de NaHLPO. aqueux 0,25M et d’acétonitrile ^ 0,68 10. mélange 1:1 de méthanol et d’acétate d’ammonium aqueux à 10% 0,65 11. mélange 4:2:5 de n-butanol, d’acide acétique et d’eau 0,77 1 à 7 - sur plaques de gel de silice 60 ^254 * 8,9 sur gel de silice 60 F„_. traité au silane et 10,11, sur plaques de cellulose Fj j) après hydrolyse acide ..dans de l’acide chlorhydrique 6N à 110°C pendant 6 heures, l’analyse des i acides aminés indique au moins la présence des acides aminés reconnus suivants : l’ornithine, l’acide aspartique, la thréonine, la glycine, l’alanine, la leucine, la phényl- * j a alanine, la p-hydroxy-phénylglycine et 1’hydroxy-phényl- I 7. glycine chloro-substituée, ! I caractérisé en ce qu’il consiste à cultiver la souche ! Actinoplanes sp. ATCC 33076 dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de carbone, des sources i assimilables d’azote et des sels inorganiques, dans des conditions aérobies submergées jusqu’à la formation d’une ? v| I importante quantité d’activité antibiotique, récupérer cette 3 -f i 3 y - 37 - k l s ! activité antibiotique par extraction séparée du bouillon et H du mycélium avec un solvant organique choisi parmi les ^ alcanols inférieurs et le chloroforme, traiter la substance antibiotique récupérée des solvants d’extraction avec un mélange 4:7:2 de chloroforme, d'éthanol et d’eau, verser le produit huileux séparé dans l'eau, séparer le produit * solidifié et le purifier davantage par chromatographie dans une colonne de gel de silice en éluant avec un mélange 1:1 ! d'acétonitrile et de HCl 0,01N de façon à récupérer le i I | chlorhydrate de l'antibiotique A/16686 que l'on dessale par \\ chromatographie dans une colonne de gel de dextrane réticulé jj ce procédé étant, en outre, caractérisé en ce que le chlorig hydrate de l'antibiotique A/16686 peut éventuellement être : '1 1 transformé en une base libre correspondante ou en un autre sel d'addition d'acide physiologiquement acceptable par des procédés classiques.

1. Substance antibiotique choisie parmi le groupe comprenant la base libre de l'antibiotique A/16686 H ! et ses sels d'addition d'acide non toxiques et pharmaceu- tiquement acceptables, caractérisée en ce que, sous forme de son chlorhydrate, elle présente les particularités ; » suivantes : i : A) elle est une matière cristalline blanche d'un point de fusion de 224-226°C ; IB) elle est très soluble dans l'eau et le diméthylformamide, soluble dans le méthanol, l'éthanol, le propanol et le butanol, mais insoluble dans l'éther éthylique, l'éther de pétrole et le benzène ; C) sa composition*élémentaire en pourcentages approximatifs est la suivante : 51,73% de carbone, 6,34# d'hydrogène, 9,96% d'azote, 5,84# de chlore (teneur totale) 4,74# d'ions chlore et 1% de résidus; D) elle a un spectre d'absorption des rayons infrarouges dans du nujol avec les maxima d'absorption suivants : (voir figure 1 des dessins annexés) : 3290-3070, 2930 et 2860 (nujol), 1765, I63O, I5IO, 1455, 1375 (nujol), - 1230, 1175, 1130, 1065, 1030, 1015, 980, 84Ο et 820 cm-1 ; E) elle a un spectre d'absorptioq des rayons ultraviolets avec les maxima d'absorption suivants (voir figure 2 des dessins annexés) î ‘ a) dans du méthanol : 232 nm (E^ = 178) 1 cm 265 nm (eJ* = 107) x cm - 27 - ' ' .............. b) dans du méthanol contenant du HCl 0,1N ; 231 nm (E^m = 167) 270 nm (E^m = 96) c) dans du méthanol contenant du NaOH 0,1N : 250 nm (E^m = 232) » 295 nm (saillie) d) dans du méthanol contenant un tampon d’un pH de 7,38 : 23I nm (E^m = 167) 270 nm (E^m = 96) r\ j F) sa rotation spécifique [a]^ est de + 49*7° (c = 0,43$ dans du diméthylformamide); G) elle donne les réactions caractéristiques suivantes : ninhydrine (solution éthanolique à 3%) négative ninhydrine (solution éthanolique à 3% + acétate de sodium) positive 1% FeCl^ - 1$ K^Fe^N)^ positive (vert Molish positive F ehling négative Biuret * positive s Anthrone __ positive Millon négative H2S0^ concentré négative positive H) elle donne les valeurs ci-après à la chromatographie sur papier de IVhatman n° 1 en utilisant la souctu S. aureus ATCC 6538 comme organisme de détection : Systèmes d'élution Valeurs 1. n-butanol saturé d’un tampon de Sorensen d'un pH de 6 0,00 2. n-butanol saturé d'eau contenant 2$ d'acide p-toluène-sulfonique 0,00 3. n-butanol saturé d'eau contenant 2$ d'hydroxyde d'ammonium 0,00 1 4) tampon de Sorensen d'un pH de 6 saturé de n-butanol 0,05 ; * 5) mélange 4:1:2 de n-butanol, de inéthanol et d'eau 0,43 " 6) acétate d'éthyle saturé d'eau 0,00 7. mélange 2:1:1 de n-butanol, d'acide acétique et d'eau 0,52 8. mélange 4:3:7 de n-butanol, de pyridine et d'eau 0,87 I) elle donne les valeurs R^ ci-après dans dif férents systèmes de chromatographie sur couche mince indiqua ci-après : ' Systèmes d'élution (volume/ Valeurs volume/volume) l) mélange 2:3:4 de n-propanol, de n-butanol et d'hydroxyde d'ammonium N (phase supérieure) 0,15 ; 2) mélange 4:2:5 de n-butanol, d'acide j acétique et d'eau 0,61 i 3. mélange de n-butanol, d'éthanol et j d'acide chlorhydrique 0,1N 0,61 . 4) mélange 4:7:2 de chloroforme, d'éthanol . et d'acide acétique à 10$ 0,00 i 5) mélange 4:1:5 de n-butanol, d'acide acétique et d'eau 0,17 6. mélange 10:9:1 de méthanol, d'acétate d'ammonium aqueux à 10$ et d'hydroxyde d’ammonium à 10$ 0,52 i 7. mélange 6:4:3:1 de n-butanol, de pyridine, d'eau et d'acide acétique 0,45 / / / ^ i i .3. 8. mélange 10:9:1 de méthanol, d'acétate d'ammonium aqueux à 10$ et d'hydroxyde d'ammonium à 10$ 0,11 9. mélange 1:1 de NaH„P0. aqueux 0,25M et d'acétonitrile 0,68 10. mélange 1:1 de inéthanol et d'acétate v d'ammonium aqueux à 10$ 0,65 11. mélange 4:2:5 de n-butanol, d'acide , acétique et d'eau 0,77 1 à 7 - sur plaques de gel de silice 60 ^254 * '< 8,9 sur gel de silice 60 F0 r . traité au - 254 silane et 10,11 sur plaques de cellulose F ; t J) après hydrolyse acide dans de l'acide chlorhydrique 6N à 110°C pendant 6 heures, l'analyse des acides aminés indique au moins la présence des acides aminés reconnus suivants : l'ornithine, l'acide aspartique, la thréonine, la glycine, l'alanine, la leucine, la phényl-alanine, la p-hydroxyphénylglycine et 1 'hydroxyphényl-glycine chloro-substituée.

2 A

2. Procédé de préparation d'une substance antibiotique choisie parmi le groupe comprenant la base libre de l'antibiotique A/16686 et ses sels d'addition d'acide physiologiquement acceptables, cette substance présentant, sous forme de son chlorhydrate, les particularités suivantes A) elle est une matière cristalline blanche d'un point de fusion de 224-226°C ; B) elle est très soluble dans l'eau et le diméthy] formamide, soluble dans le méthanol, l'éthanol, le propanol et le butanol, mais insoluble dans l'éther éthylique, l'éthei de pétrole et le benzène ; C) elle a une composition élémentaire dans les pourcentages approximatifs suivants : 51*73% de carbone, 6,34$ d'hydrogène, 9/96$ d'azote, 5*84$ de chlore (teneur . j. / totale), 4*74$ d'ions chlore et 1$ de résidus; ' Uli»,,.. J "30 " D) elle a un spectre d’absorption des rayons infrarouges dans du nujol avec les maxima d’absorption suivants (voir figure 1 des dessins annexés) : 3290-3070, 2930 et 2860 (nujol), 1765, 1630, 1510, 1455, 1375 (nujol), 1230, 1175, 1130, 1065, 1030, 1015, 98Ο, 840 et 820 cm"1 ; E) elle a un spectre d’absorption des rayons ultraviolets avec les maxima d’absorption suivants (voir figure 2 des dessins annexés) : a) dans du mêthanol : 232 nm (E^m = 178) 265 nm = I07) * b) dans du mêthanol contenant du HCl 0,1N : 1 23I nm (EÎ^ = 167) ^ ^ lcm ' ! 27Ο nm (eJ^ = 96) / lcm ' c) dans du mêthanol contenant du NaOH 0,1N : 250 nm (E1^ = 232) J lcm 295 nm (saillie) d) dans du mêthanol contenant un tampon d’un pH de 7,38 : 231 nm (= 167) 270 nm (E**, = 96) * 2 J 4t F) elle a une rotation spécifique [a]^ de + 4°*| (c = 0,43$ dans du diméthylformamide) ; J dg G) elle donne les réactions caractéristiques m 1 3 suivantes : >JÊ / 1 - 31 - ninhydrine (solution éthanolique à 3%) négative ninhydrine (solution éthanolique à 3% + acétate de sodium) positive 1% FeCl^ - K^Fe(CN)^ positive (vert Molish positive Fehling négative » Biuret positive ; Anthrone positive ! i, i “ Millon négative H2S04 concentré négative KMnO^ positive H) elle donne les valeurs Rp ci-après à la chro-I matographie sur papier de Tihatman n° 1 en utilisant la ! souche S. aureus ATCC 6538 comme organisme de détection : Systèmes d'élution Valeurs Rp 1. n-butanol saturé d'un tampon de Sorensen d'un pH de 6 0,00 2. n-butanol saturé d1 eau contenant 2% d'acide p-toluène-sulfonique 0,00 3. n-butanol saturé d'eau contenant 2% d'hydroxyde d'ammonium 0,00 4. tampon de Sorensen d'un pH de 6 saturé de n-butanol 0,05 5. mélange 4:1:2 de n-butanol, de méthanol et d'eau 0,43 6. acétate d'éthyle saturé d'eau 0,00 17. mélange 2:1:1 de n-butanol, d'acide acétique et d'eau 0,52 8. mélange 4:3ï7 de n-butanol, de pyridine j et d'eau 0,87 i i j / 5 / ! v f * i ! l) elle donne les valeurs ci-après dans différents systèmes de chromatographie sur couche mince indiqués ci-après : Systèmes d'élution (volume/ Valeurs R^. ; volume/volume) w 1. mélange 2:3:4 de n-propanol, de n— butanol et d’hydroxyde d’ammonium R (phase supérieure) 0,15 2. mélange 4:2:5 ée n-butanol, d’acide acétique et d’eau 0,61 » 3. mélange de n-butanol, d’éthanol et j d'acide chlorhydrique 0,1N 0,61 i 4) mélange 4:7:2 de chloroforme, d'éthanol | et d'acide acétique à 10$ 0,00 i 5. mélange 4:1:5 de n-butanol, d'acide acétique et d'eau 0,17 6. mélange 10:9:1 de méthanol, d'acétate d'ammonium aqueux à 10$ et d'hydroxyde d'ammonium à 10$ 0,52 7. mélange 6:4:3:1 de n-butanol, de pyridine, d'eau et d'acide acétique 0,45 8. mélange 10:9:1 de méthanol, d'acétate d'ammonium aqueux à 10$ et d'hydroxyde d'ammonium à 10$ 0,11 ; 9) mélange 1:1 de NaHLPO. aqueux 0,25M et d'acétonitrile ^ 0,68 ( 10. mélange 1:1 de méthanol et d'acétate d'ammonium aqueux à 10$ 0,65 11. mélange 4:2:5 de n-butanol, d'acide acétique et d'eau 0,77 » 1 à 7 - sur plaques de gel de silice 60 ^254 > 8,9 sur gel de silice 60 For. traité au silane 254 et 10, 11 sur plaques de cellulose F ; j j) après hydrolyse acide dans de l'acide chlor hydrique 6N à 110°C pendant 6 heures, l'analyse des acides aminés indique au moins la présence des acides aminés } j reconnus suivants : l'ornithine, l'acide aspartique, la ! thréonine, la glycine, l'alanine, la leucine, la phényl- \ A . i. ----------- alanine, la p-hydroxy-phénylglyçine et 1 ' hydroxy-phényl-glycine chloro-sübstituée, caractérisé en ce qu’il consiste à cultiver la touche Actinoplanes sp. ATCC 33076 dans un milieu de culture „ contenant des sources assimilables de carbone, des sources assimilables d'azote et des sels inorganiques dans des conditions aérobies submergées jusqu'à la formation d'une importante quantité de l'antibiotique A/16686, puis récu-* pérer cette activité antibiotique par des procédés classi- ; ques.

3. Procédé de préparation d'une substance antibiotique choisie parmi le groupe comprenant la base libre de l'antibiotique A/16686 et ses sels d'addition d'acide non toxiques et pharmaceutiquement acceptables, cette substance présentant, sous forme de son chlorhydrate, les particularités suivantes : A) elle est une matière cristalline blanche d'un point de fusion de 224-226°C 5 B) elle est très soluble dans 1'eau et le diméthj formamide, soluble dans le méthanol, l'éthanol, le.propanol et le butanol, mais insoluble dans l’éther éthylique, l'éth< de pétrole et le benzène ; C) elle a une composition élémentaire dans les pourcentages approximatifs suivants : 51,73% de carbone, « 6,34% d'hydrogène, 9*96$ d'azote, 5*84$ de chlore (teneur totale), 4*74$ d' ions chlore et 1$ de résidus ; D) elle a un spectre d'absorption des rayons infrarouges dans du nujol avec les maxima d'absorption suivants (voir figure 1 des dessins annexés) : 3^90-3070, 2930.et 2860 (nujol), 1765* I63O, 1510, 1455, 1375 (nujol), /_ . - 34 - ' * 1230, 1175, 1130, 1065, IO3O, 1015, 98Ο, 840 et 820 cm“1 5 E) elle a un spectre d'absorption des rayons ultraviolets avec les maxima d'absorption suivants (voir Î-» figure 2 des dessins annexés) : a) dans du méthanol : 232 nm (E^ = 178) lcm 265 nm (eJ^ = 107) lcm * b) dans du méthanol contenant du HCl 0,1N : 23! ™ (Eîcm = 167) 270 nm (EÎ^ = 96) ' v 1 cm c) dans du méthanol contenant du NaOH 0,1N : 250 nm (E?* = 232) 1 cm 295 nm (saillie) d) dans du méthanol contenant un tampon d'un pH de 7,38 : 231 nm (e}^ = 167) lcm 270 nm (E= 96) lcm

4· Substance antibiotique suivant la revendicati 1, caractérisée en ce qu'elle est le chlorhydrate de l'antibiotique A/16686.

5. Utilisation d'une substance antibiotique choisie parmi le groupe comprenant la base libre de l'anti-fl <*' biotique A/16686 et ses sels d'addition d'acide physiologi quement acceptables, comme agent antibactérien.

6. Composition pharmaceutique contenant une substance antibiotique choisie parmi le groupe comprenant la base libre de l'antibiotique A/16686 et ses sels d'addition d'acide physiologiquement acceptables,, comme ingrédient actif. \ l V V · r . K \ Λ A K ' 1 ’