OA10066A - Lipopeptides d'actinoplanes sp a activite pharmacologique procede pour leur production et leur utilisation - Google Patents

Description

1 0066 - î - L'invention concerne des lipopeptides comportant desséquences d'aminoacides très homologues mais des restesesters d’acides gras différents (fractions lipidiques), qui sontsynthétisés par Actinoplanes sp. pendant la fermentation etsont excrétés dans le milieu de culture, un procédé pourl'isolement des lipopeptides à partir du milieu de cultureet leur purification, l'utilisation des lipopeptides en tantque substances actives pharmacologiques, en particuliercontre des bactéries Gram positives, ainsi qu'Actinoplanessp. DMS 7358 pour la production des lipopeptides précités.

Des métabolites secondaires provenant de micro-organismes sont utilisés avec succès dans le traitement demaladies infectieuses. En ce qui concerne les métabolitessecondaires, il s'agit de composés à faible masse molécu-laire, dont la formation s'effectue dans des voies bio-synthétiques qui dérivent du métabolisme primaire, et dontla fonction pour les organismes producteurs respectifs estinexpliqué. Jusqu'à présent, on connaît environ 8 000 méta-bolites secondaires isolés à partir de cultures de diversmicro-organismes (en particulier des champignons et des bac-téries appartenant au genre Streptomyces).

Le domaine d'utilisation principal de ces métabolites secondaires est le traitement de maladies infectieuses. Leur large utilisation entraîne toutefois fréquemment l'appari- tion d'une résistance, de sorte qu'il y a un besoin constant de nouveaux antibiotiques et de substances actives à nouveau 1 0066 - 2 - mécanisme d'action (H.C. Neu, Science 257, 1992, p. 1064-1073).

En outre, le champ d'applications de substancesactives microbiennes s'étend également à des maladies qui necomptent pas parmi les maladies infectieuses (par exemple letraitement de tumeurs, 1'immunomodulation ou pour la régula-tion du métabolisme) et au domaine phytosanitaire (herbi-cides et insecticides). Cependant, les substances activescomportent souvent également des inconvénients, caractériséspar des activités peu satisfaisantes, une toxicité trop éle-vée et/ou des effets secondaires indésirables.

La littérature décrit des lipopeptides dont la frac-tion d'aminoacides, en ce qui concerne la séquence, estidentique ou, en ce qui concerne la composition en amino-acides, est identique ou très similaire aux lipopeptidesselon l'invention. Par contre, en ce qui concerne la frac-tion lipidique, ces lipopeptides se distinguent essentielle-ment des lipopeptides selon l'invention.

Comme exemples de lipopeptides tels qu'indiqués ci-dessus, on peut citer: - les antibiotiques de type amphomycine [J. Antibiotics, 38,p. 517 (1965)]; - la glumamycine [J. Antibiotics, 38, p. 517 (1965)]; - la zaomycine [J. Antibiot. Ann., p. 194 (I960)]; - l'aspartocine [Antibiot. Ann., 194 (I960)]; - la tsuhimycine [J. Antibiotics, 21, p. 439 (1968)]; - la laspartomycine [J. Antibiotics 21, p. 55 (1968)].

Ces lipopeptides, qui sont désignés par "lipopeptidesde type amphomycine" sont synthétisés par des micro-organismes appartenant au genre Streptomyces. Ils mani-festent leur activité antibiotique contre des bactéries Grampositives, comme par exemple des streptocoques, staphylo-coques et entérocoques. Ces derniers temps, notamment dessouches appartenant aux genres Staphylococcus et Enterococcus , se révèlent de façon croissante comme des germes à pro- 1 0066 blêmes. Par "germes à problèmes", le spécialiste entend desmicro-organismes contre lesquels une lutte efficace à l'aided'antibiotiques courants [par exemple des antibiotiques detype β-lactame ou des antibiotiques glycopeptidiques, comme 5 par exemple la vancomycine ou la teicoplanine) deviententre-temps impossible en raison de résistances.

Un groupe de souches de micro-organismes qui ont éla-boré des résistances sont par exemple les souches deStaphylococcus aureus résistantes à la méthicilline, dési- 10 gnées par l'abréviation MRSA. On sait depuis lors que cessouches MRSA ont fréquemment élaboré des résistances nonseulement contre la méthicilline, mais également contred'autres antibiotiques (par exemple la vancomycine).

Abstraction faite des composés déjà cités, obtenus à 15 partir de Streptomyces, en connaît un composé provenant d'Actinoplanes nipponensis ATCC 31145 qui, en raison de sonspectre d'action et des propriétés physico-chimiquesdécrites, présente des similitudes structurales avec leslipopeptides selon l'invention, et est dénommé 20 "Compound 41 012" (US-A-4 000 397) . La culture par fermenta-tion d'Actinoplanes nipponensis ATCC 31145, dans diversesconditions de culture, donne toujours des rendements relati-vement faibles en Compound 41 012.

Le but de l'invention est de chercher des substances 25 naturelles microbiennes à propriétés améliorées.

Ce but est atteint selon l'invention par la culture par fermentation d.' Actinoplanes sp. dans une solution nutri-tive, contenant des sources de carbone et d'azote ainsi quedes sels minéraux, jusqu'à l'accumulation dans le milieu de 30 culture des lipopeptides, de préférence des lipo-peptides A 1437, l'isolement subséquent des lipopeptides àpartir du milieu de culture et éventuellement la dissocia-tion du mélange en ces composants individuels. Les lipo-peptides ont une activité pharmacologique et par conséquent 35 , une activité thérapeutique, et peuvent être utilisés en tant 1 0066 qu'antibiotiques à action contre des bactéries Gram posi-tives, de préférence contre des souches résistantes auxglycopeptides.

En conséquence, l'invention concerne:

1. Des lipopeptides caractérisés en ce que l'on cultive parfermentation Actînoplanes sp. dans un milieu de culture jus-qu'à l'accumulation dans le milieu de culture d'un ou plu-sieurs lipopeptides de formule I

dans laquelle R1 représente un acide gras ou acide gras hydroxylé à une ouplusieurs insaturations, saturé ou, indépendamment decela, ramifié ou non ramifié, ayant une longueur dechaîne de 6 à y compris 22 atomes de carbone, et 2 R représente Asp ou Asn, et éventuellement on purifie un ou plusieurs lipopeptides deformule I à partir du milieu de culture, à l'exclusion dulipopeptide de formule I dans lequel R1 représente et 2 R représente Asp.

00H 2. Des lipopeptides, caractérisés en ce que l'on cultive parfermentation Actînoplanes sp. dans un milieu de culture,jusqu'à l'accumulation dans le milieu de culture d'un ouplusieurs lipopeptides choisis parmi: a) i-acide gras en C.[ ^-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro, -- t b) i-acide gras en Cq ^-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro, c) i-acide gras en C.[ ^-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro, d) i-acide gras en C14-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro,

_____ I .e) ai-acide gras en <3Ί ^-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-

Dab-Val-Pro, 1 0066 - 5 - f) ai-acide gras en ç.-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro, g) ai-acide gras en C15-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro,

--—J h) n-acide gras en C._-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly- X l —

Dab-Val-Pro, —-_/ i) n-acide gras en C13-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro, j) n-acide gras en C.[ 4~Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Ppo, éventuellement on purifie un ou plusieurs de ces lipo-peptides à partir du milieu de culture.

3. Des lipopeptides de formule II

R1-R2-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro II dans laquelle

R2 = Aspou

COOH 10066 - 6 - R2 = Asn ou

R2 = Aspou

COOH et 2 R représente Asp dans les trois cas cités en dernier. 4. Un procédé pour la production d'un ou plusieurs lipo-peptides de formule I tels que caractérisés en 1., d'un ouplusieurs lipopeptides tels que caractérisés en 2., ou d'unou plusieurs lipopeptides de formule II, tels que caractéri-sés en 3., caractérisé en ce que l'on cultive par fermenta-tion Actinoplanes sp. dans un milieu de culture, jusqu'àl'accumulation dans le milieu de culture d'un ou plusieurslipopeptides, et éventuellement on purifie un ou plusieurslipopeptides à partir du milieu de culture. 5. Une utilisation d'un lipopeptide de formule I en tant quesubstance pharmacologiquement active, en particulier en tantqu'antibiotique contre des bactéries Gram positives, defaçon particulièrement préférée contre des bactéries résis- 10066 - 7 - tances aux glycopeptides.

6. L'utilisation du lipopeptide de formule III

R1-R2-D^b-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro III dans laquelle R1 représente

et 2 R représente Asp, en tant que substance pharmacologiquement active, en parti-culier en tant qu'antibiotique contre des bactéries Grampositives, de façon particulièrement préférée contre desbactéries résistantes aux glycopeptides. 7. Actinoplanes sp. DSM 7358.

Dans ce qui suit, l'invention est décrite en détail,en particulier dans ses modes de réalisation préférés.Définition des abréviations - Dab signifie acide 2,3-diaminobutyrique, - Pip signifie acide pipécolique (synonyme = homoproline), - MeAsp signifie 0-méthylaspartate, - Gly signifie glycine, - Asn signifie asparagine, - Asp signifie acide aspartique, - Val signifie valine, - Pro signifie proline, - n signifie normal/non ramifié et - CID signifie "collisional induced decay” (désintégrationinduite par collision). L'abréviation ”i” signifie "iso”, tandis que "ai” ala signification de "ante-iso". Ces désignations sont con-nues du spécialiste, en relation avec les acides gras(Biochemistry, Zubay, Editions Addison Wesley, Londres,Amsterdam, 1983).

Tous les pourcentages se rapportent au poids, à ..moins d'indication contraire. Dans le cas de liquides, les 10066 - 8 - proportions de mélange se rapportent au volume, à moinsd'indication contraire.

Le procédé selon l'invention peut être utilisé pourla fermentation à l'échelle du laboratoire (dans la plage dumillilitre au litre) et pour l'échelle industrielle (àl'échelle du mètre cube).

Actinoplanes sp. est isolé à partir d'un échantillonde sol. Pour la purification à partir du sol, on met en sus-pension ce micro-organisme avec une solution physiologiquede NaCl (à 0,9 %), en préparant une série de dilutions. Onétale ensuite les diverses dilutions (10°-106) sur du milieunutritif pour actinomycètes. Après une incubation des cul-tures à 30°C, pendant 2 à 14 jours, on obtient des coloniesd'actinomycètes qui peuvent être isolées par plusieursétapes successives de purification.

La détermination des genres est effectuée à l'aide decritères morphologiques et taxonomiques, selon des méthodesconnues du spécialiste. En particulier les spores mobilessont caractéristiques du genre Actinoplanes. A l'aide d'étapes successives d'isolement et de puri-fication, on peut isoler une colonie d'Actinoplanes sp. quiexcrète très efficacement dans le milieu de culture un ouplusieurs composés appartenant au groupe des lipopeptidesselon l'invention, de préférence les lipopeptides A 1437 A, B, C, D, E, F, G, H, K, L et/ou M et qui est désignée commeune souche productrice majeure.

Par "souche productrice majeure", on désigne un iso-lat qui produit ou excrète dans les milieux de culture un ouplusieurs composés du groupe des lipopeptides selon l'inven-tion, en une quantité 10 à 100 fois plus élevée par compa-raison avec des isolats de la même espèce d'Actinoplanes.

Une colonie fortement productrice d'Actinoplanes sp.est multipliée. Un isolat a été déposé le 18 juin 1990, sousles clauses du Traité de Budapest, à la Deutschen Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 10066 - 9 - IB, 3300 Braunschweig, RFA, sous le numéro suivant;

Actinoplanes sp. DSM 7358.

Actinoplanes sp. DSM 7358 possède un mycélium de cou-leur orangée et est caractérisé par des sporanges globuleux.

Dans une solution nutritive (également désignée par"milieu de culture"), qui contient une source de carbone etune source d'azote ainsi que les sels minéraux usuels,Actinoplanes sp. , de préférence DSM 7358, produit un ou plu-sieurs composés du groupe des lipopeptides selon l'inven-tion.

Au lieu de la souche DSM 7358, on peut également uti-liser des mutants et variants de celle-ci, qui synthétisentun ou plusieurs composés du groupe des lipopeptides selonl'invention. De tels mutants peuvent être produits, d'unefaçon connue en soi, par des moyens physiques, tels qu'uneirradiation, par exemple à l'aide de rayons UV ou derayons X, ou par des agents mutagènes chimiques, comme parexemple le méthanesulfonate d'éthyle (EMS), la 2-hydroxy-4-méthoxy-benzophénone (MOB) ou la N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG).

Le criblage, pour l'obtention de mutants et devariants qui synthétisent un ou plusieurs composés du groupedes lipopeptides selon l'invention, s'effectue selon leschéma suivante: - séparation du mycélium après la fermentation, - précipitation des lipopeptides à pH 1-2 (à 4°C) , - reprise du précipité dans H2O/MeOH (1:1), - analyse par HPLC, CCM ou test d'Hemmhof.

Les conditions de fermentation décrites ci-après sontvalables pour Actinoplanes sp. , l'isolat DSM 7358 déposéainsi que des mutants et variants de ceux-ci.

Dans une solution nutritive qui contient une source de carbone et une source d'azote ainsi que les sels minéraux usuels, Actinoplanes sp., de préférence DSM 7358, produisent un ou plusieurs composés du groupe des lipopeptides selon 10066 - 10 - l'invention, mais de préférence les lipopeptides A 1437 A-Hainsi que K, L, M.

Des sources de carbone préférés pour la fermentationaérobie sont des glucides assimilables et des alcools glyci-diques, tels que le glucose, le lactose ou le D-mannitol,ainsi que des produits naturels contenant des glucides,comme par exemple l'extrait de malt. En tant que substancesnutritives azotées, on prend en considération: des amino-acides, des peptides et des protéines, ainsi que leurs pro-duits de dégradation, tels que des peptones ou des tryp-tones, et également des extraits de viande, des graines mou-lues, par exemple de maïs, blé, haricot, soja ou coton, desrésidus de distillation de la production de l'alcool, desfarines de poisson ou des extraits de levure, mais égale-ment des sels d'ammonium et des nitrates. En tant que selsminéraux, la solution nutritive peut contenir par exempledes chlorures, carbonates, sulfates ou phosphates des métauxalcalins ou alcalino-terreux, de fer, zinc, cobalt et manga-nèse.

La formation des lipopeptides selon l'invention sedéroule particulièrement bien dans une solution nutritivequi contient environ 0,1 à 5 %, de préférence 0,3 à 2 %d'extrait de viande et 0,2 à 5 I, de préférence 0,5 à 2 % desaccharose, et 0,05 à 5 g/1, de préférence 0,1 à 0,5 g/1d'extrait de levure, et 0,05 à 2 g/1, de préférence 0,1 à1 g/1 de sulfate de magnésium, et 0,05 à 10 g/1, de préfé-rence 0,1 à 1 g/1 de dihydrogénophosphate de potassium ou desodium, et 0 à 100 μΜ, de préférence 5 à 20 μΜ de chlorureferrique. Les données en poucentage se rapportent danschaque cas au poids de la solution nutritive totale.

Dans cette solution nutritive, Actinoplanes sp. , depréférence Actinoplanes DSM 7358, élabore un mélange deslipopeptides selon l'invention. Le mélange consiste de pré-férence en 11 lipopeptides distincts, détectables. Ces lipo-peptides ont été dénommés A, B, C, D, E, F, G, H, K, L et M. 1 0066 - Il - 10 15 20 25 30 35 .

Ils sont caractérisés comme suit: Dénomi-

nation R

R2 = Asp A 1437 C R-|

R2 = Asn

A 1437 G R!

R2 = Asp

Masse moléculaire 1290 1304 1289 1303 1290 1289 1318 1 0066 - 12 - A 1437 H R, = 1317

COOH R2 = Asn A 1437 K Rt = R2 = Asp A 1437 L R, = R2 = Asp A 1437 M R-, = 1318

COOH

COOH

COOH 1318 1318 R, = Asp

Le lipopeptide A 1437 A possède, de même queA 1437 C, un acide gras iso en C13 jusqu'à présent inconnudans des lipopeptides du type amphomycine. La séquenced'aminoacides de A 1437 A correspond à celle de l'amphomy-cine, mais celle-ci possède un acide gras ante-iso en C13·

La composition en aminoacides et la séquence d'aminoacidesde A 1437 C n'est pas connue pour d'autres lipopeptides. A 1437 B possède, de même que A 1437 D, un acide grasiso-C14 et par conséquent l'acide gras connu pour la tsushi-mycine. A 1437 D se distingue toutefois des lipopeptidesconnus jusqu'à présent d'après l'état de la technique, parsa composition en aminoacides et sa séquence d'aminoacides,tandis que A 1437 B possède la séquence d'aminoacides de1'amphomycine. Selon la littérature,la composition en amino-acides de 1'amphomycine, de la zaomycine et de la tsushimy-cine est la même. 1 0066 - 13 - A 1437 E provenant d'Actinoplanes sp. , en particulierd'Actinoplanes DSM 7358, est identique à l'amphomycine con-nue, provenant de Streptomyces. A 1437 F comporte un acide gras ante-iso en C13» etpossède donc le même type d'acide gras que celui connud'après l'amphomycine. Sa séquence d'aminoacides et sa com-position en aminoacides est inconnue d'après l'état de latechnique.

De même que l'aspartocine, les lipopeptides A 1437 Get A 1437 H comportent chacun un acide gras ante-iso en C^g.La séquence d'aminoacides de A 1437 G correspond à celle del'amphomycine, tandis que la séquence et la composition deA 1437 H est inconnue d'après l'état de la technique. A 1437 K, L et M comportent des aminoacides non rami-fiés ayant une longueur de chaîne en C12-Cl4’ La s^cïuenced'aminoacides des trois lipopeptides cités correspond àcelle de l'amphomycine.

Les lipopeptides A 1437 A à H comportent tous uneliaison de la fonction carboxy de la proline C-terminaleavec la fonction β-amino du reste Dab amino-terminal. Cetteliaison est représentée par *,_|".

Selon la composition de la solution nutritive, onpeut faire varier la fraction quantitative d'un ou plusieursdes lipopeptides selon l'invention. En outre, au moyen de lacomposition du milieu, il et possible d'orienter la synthèsevers l'élaboration de certains lipopeptides, de sorte qu'unlipopeptide n'est pas du tout produit par le micro-organismeou l'est en une quantité inférieure à la limite de détec-tion.

Le milieu de culture d'Actinoplanes sp. , de préfé-rence DSM 7358, contient des lipopeptides comportant unacide gras ou un acide gras hydroxylé, à une ou plusieursinsaturations, saturé ou, indépendamment de cela, ramifié ounon ramifié, ayant une longueur de chaîne de 6 à y compris s 22 atomes de carbone, de préférence de 10 à y compris 1 0066 - 14 - 20 atomes de carbone, en particulier de 13, 14 ou 15 atomesde carbone.

De tels acides gras sont connus du spécialiste,ainsi, par exemple, d'après Rompp Chemie Lexicon, Prof. Falbeet Prof. Regitz, 9 édition, Editions George Thieme,Stuttgart, New York, ou d'après 1'Encyclopedia of Chemistry, C.A. Hampel et G.G. Hawley, 3*“* édition, Van NostrandReinhold Company, New York. L'énumération suivante d'acides gras est donnée àtitre d'exemple, ne prétend pas être exhaustive et ne repré-sente aucune limitation.

Des acides gras saturés non ramifiés des lipopeptidesselon l'invention sont par exemple les acides caproïque,oenanthique, caprylique, pelargonique, caprique, undéca-noïque, laurique, tridécanoïque, myristique, pentadéca-noïque, palmitique, margarique, stéarique, nonadécanoïque,arach id ique, béhén ique.

Des acides gras saturés ramifiés des lipopeptidesselon l'invention sont par exemple l'acide isobutyrique oul'acide isovalérianique, ou les acides correspondants ayantla configuration "ante-iso".

Des acides gras insaturés non ramifiés des lipo-peptides selon l'invention sont par exemple l'acide acry-lique ou l'acide crotonique.

Un acide gras à double insaturation, non ramifié, deslipopeptides selon l'invention est par exemple l'acide sor-bique.

Des acides gras à triple insaturation, non ramifiés,des lipopeptides selon l'invention sont par exemple l'acidelinolénique ou l'acide élaéostéarique.

Un acide gras à triple insaturation, non ramifié, deslipopeptides selon l'invention est par exemple l'acide ara-chidonique.

Un acide gras à quintuple insaturation, non ramifié,des lipopeptides selon l'invention est par exemple l'acide 1 0066 - 15 - clupanodonique.

Un acide gras à sextuple insaturation, non ramifié,des lipopeptides selon l'invention est par exemple l'acidedocosahexaénoïque.

Des lipopeptides comportant des acides gras plusieursfois ramifiés, comme par exemple l'acide 2',4',6',8'-tétra-méthyldécanoïque, peuvent en outre être présents dans lemilieu de culture.

Des acides gras hydroxylés des lipopeptides selonl'invention sont par exemple les acides gras à configuration"iso" ou "ante-iso", hydroxylés en position 2' et 3' et/ou àl'extrémité de la chaîne carbonée.

Dans le cas de l'addition de 0,01 à 5 %, de préfé-rence de 0,02 à 0,1 % de L-valine à la solution nutritivedécrite plus haut, la souche Actinoplanes sp. produit depréférence les lipopeptides A 1437 B et D. Dans le cas del'addition de 0,01 à 5 %, de préférence de 0,1 à 0,5 % deL-leucine à la solution nutritive décrite plus haut, lasouche Actinoplanes sp. produit de préférence les lipo-peptides A 1437 A et C. Dans le cas de l'addition de 0,01 à5 %, de préférence de 0,05 à 0,5 % de L-isoleucine à lasolution nutritive décrite plus haut, la souche Actinoplanessp. produit surtout les lipopeptides A 1437 E, F, G et H.Dans le cas de l'addition de 0,01 à 5 %, de préférence de0,05 à 0,5 % d'acide L-a-aminobutyrique à la solution nutri-tive décrite plus haut, la souche Actinoplanes sp. produitde préférence le lipopeptide K. Dans le cas de l'addition de0,01 à 5 %, de préférence de 0,05 à 0,5 % de L-norvaline àla solution nutritive décrite plus haut, la soucheActinoplanes sp. produit de préférence les lipopeptides Let/ou M. La même chose s'applique à la souche DSM 7358 pré-férée .

En plus de ces aminoacides, on peut également utili-ser les acides α-cétoniques correspondants des aminoacides : cités (a-céto-isovalérate, α-céto-isocaproate, a-céto-(3- 1 0066 - 16 - méthylvalérate, α-cétovalérate) ou leurs acides correspon-dants (isobutyrate, isovalérate, a-méthylbutyrate,n-butyrate, propionate, valérate) aux concentrations corres-pondantes, ou d'autres substances qui peuvent intervenirdans la biosynthèse des acides gras.

La culture du micro-organisme s'effectue en modeaérobie, c'est-à-dire par exemple en culture submergée avecsecouement ou agitation dans des flacons secoués ou des fer-menteurs, éventuellement avec introduction d'air ou d'oxy-gène. Elle peut également être effectuée dans une plage detempératures d'environ 18 à 35°C, de préférence aux environsde 25 à 35°C, en particulier à 28-32°C. L'intervalle de pHdevrait se situer entre 6 et 8, de préférence entre 6,5 et 7,5. Dans ces conditions, on cultive le micro-organisme engénéral pendant une durée de 24 à 300 heures, de préférencede 36 à 140 heures.

On effectue avantageusement la culture en plusieursétapes, c'est-à-dire qu'on prépare d'abord dans un milieunutritif liquide une ou plusieurs précultures qu'on utiliseensuite pour ensemencer le milieu de production proprementdit, la culture principale, de préférence en un rapport de1:10 en volume. On obtient la préculture, par exemple, enensemençant avec un mycélium une solution nutritive et en lalaissant se développer pendant environ 36 à 120 heures, depréférence 48 à 72 heures. On peut obtenir le mycélium, parexemple en laissant la souche se développer pendant environ3 à 40 jours, de préférence 4 à 10 jours, sur un milieunutritif solide ou liquide, par exemple de la gélose auxextraits de malt et de levure, ou de la gélose au bouillonnutritif (un milieu classique pour micro-organismes conte-nant les composants principaux peptone, chlorure de sodiumet gélose, par exemple de la société Difco).

On peut suivre le déroulement de la fermentation àl'aide du pH des cultures ou du volume du mycélium, ainsique par des méthodes chromatographiques, comme par exemple 1 0066 - 17 - la chromatographie sur couche mince ou la chromatographieliquide à haute pression, ou par contrôle de l'activité bio-logique. Un composé selon l'invention est contenu aussi biendans le mycélium que dans le filtrat de culture, mais lamajeure partie (t 90 %) se trouve dans le filtrat de cul-ture.

Le procédé d'isolement décrit dans ce qui suit sert àla purification des lipopeptides selon l'invention, mais depréférence des lipopeptides A 1437 A-H ainsi que K, L, M. L'isolement et la purification des lipopeptides selonl'invention, à partir du milieu de culture, s'effectue selondes méthodes connues, en tenant compte des propriétés chi-miques, physiques et biologiques des substances naturelles.Pour la détermination de la concentration d'antibiotiquesdans le milieu de culture ou dans les étapes individuellesd'isolement, on peut utiliser la chromatographie sur couchemince, par exemple sur gel de silice, avec un mélange de NH^à 25 %/isopropanol en tant qu'éluant, ou la HPLC. La détec-tion lors de la séparation par chromatographie sur couchemince peut s'effectuer par exemple au moyen de réactifscolorés, tels que l'anisaldéhyde, en comparant convenable-ment la quantité de la substance formée avec une solution deréférence.

Pour l'isolement d'un lipopeptide selon l'invention,on sépare d'abord le mycélium du bouillon de culture, selonles procédés usuels, et on ajuste ensuite le filtrat de cul-ture à un pH de 0,5 à y compris 4, de préférence de 1,5 à ycompris 2,5, de préférence à 4°C. L'ajustment du pH et parconséquent la précipitation des lipopeptides A 1437, peuts'effectuer à l'aide de n'importe quel acide du commerce. Onmet la solution à incuber pendant jusqu'à 16 heures, de pré-férence jusqu'à 4 heures, et on sépare ensuite par centrifu-gation le précipité obtenu.

Le précipité, qui contient les lipopeptides totaux, • est remis en suspension dans un volume d'eau bidistillée 1 0066 - 18 - représentant du volume initial, et ajusté à pH 6 à 7 àl'aide de NaOH. Le précipité passe alors totalement en solu-tion; la solution est refroidie jusqu'à -20°C et lyophili-sée. Le lyophilisât, dénommé dans ce qui suit “produitbrut", contient de 5 à 30 % de lipopeptides et est utilisépour l'isolement ultérieur.

Une nouvelle purification d'un ou plusieurs lipo-peptides selon l'invention s'effectue par chromatographiesur des matériaux appropriés, de préférence, par exemple,sur du gel de silice, de l'oxyde d'aluminium, des échangeursd'ions ou des résines adsorbantes, et, de façon tout parti-culièrement appropriée, sur des échangeurs d'anions faible-ment ou fortement basiques. A l'aide de cette chromatogra-phie, on sépare les lipopeptides qui comportent Asp ou Asnen tant qu'aminoacide amino-terminal. La chromatographie deslipopeptides s'effectue avec des solutions aqueuses tampon-nées ou des mélanges de solutions aqueuses et de solutionsalcooliques.

Par "solutions aqueuses tamponnées", on entend parexemple l'eau, un tampon phosphate, l'acétate d'ammonium, untampon citrate, un tampon borate à une concentration de 0 à1 M, de préférence de 1 à 100 mM; on utilise en particulierdes solutions tamponnées au phosphate à une concentration de1 à 100 mM.

Par "mélanges de solutions aqueuses ou alcooliques",on entend tous les solvants organiques miscibles à l'eau, depréférence le méthanol, 1'acétonitrile, à une concentrationde 10 à 80 % de solvant, de préférence de 40 à 60 % de sol-vant, ou bien toutes les solutions aqueuses tamponnées quisont miscibles aux solvants organiques. Les tampons à utili-ser sont les mêmes que ceux indiqués plus haut.

La préparation des lipopeptides, sur la base de leursdivers acides gras, s'effectue à l'aide de la chromatogra-phie en phases inversées, par exemple sur MCI® (résineadsorbante de Mitsubishi, Japon). On préfère en particulier 10066 - 19 - la chromatographie en phases inversées sur des matériauxhydrophobes, de préférence la chromatographie sur phasesRP-8 ou RP-18. On peut en outre effectuer la séparation àl'aide de la chromatographie sur gel de silice.

La chromatographie des lipopeptides s'effectue avecdes solutions aqueuses tamponnées ou acidifiées, ou desmélanges de solutions aqueuses avec des alcools ou d'autressolvants organiques miscibles à l'eau. Comme solvant orga-nique, on utilise de préférence l'acétonitrile.

Par "solutions aqueuses tamponnées ou acidifiées", onentend par exemple l'eau, un tampon phosphate, l'acétated'ammonium, un tampon citrate, un tampon borate, à une con-centration de 0 à 0,5 M, ainsi que l'acide formique, l'acideacétique, l'acide trifluoroacétique ou tous les acides ducommerce, connus du spécialiste, de préférence à une concen-tration de 0 à 1 %; On préfère en particulier une concentra-tion de 0,1 %.

On effectue la chromatographie avec un gradient quicommence avec 100 % d'eau et se termine avec 100 % de sol-vant; on utilise de préférence un gradient linéaire de 40 à60 % d'acétonitrile. L'ordre de succession des deux chromatographies pré-citées (chromatographie pour la séparation des lipopeptidesselon la présence des aminoacides Asp ou Asn et selon letype d'acide gras) est réversible. De préférence, la sépara-tion des lipopeptides selon les divers aminoacides esteffectuée dans la première étape, et seulement après cela oneffectue la séparation selon le type d'acide gras.

Si le produit brut précité contient des lipopeptidesà acide gras bien défini, on utilise la chromatographieindiquée précédemment (séparation des lipopeptides sur labase d'acides gras différents) pour l'élimination des selset la purification plus poussée des lipopeptides.

On peut également effectuer une chromatographie sur .gel ou la chromatographie sur phases hydrophobes. 10066 - 20 -

La chromatographie sur gel est effectuée sur des gelsde polyacrylamide ou de copolymère, tels que Biogel-P2®(Biorad) ou Fractogel TSK HW 40® (Merck, RFA, ou Toso Haas,USA) .

Les lipopeptides selon l'invention sont stables àl'état solide et en solutions dans l'intervalle de pH com-pris entre 4 et 8, en particulier 5 et 7, et peuvent parconséquent être incorporés dans des compositions galéniquesusuelles.

En raison de leurs propriétés pharmacologiques inté-ressantes, un ou plusieurs composés des lipopeptides selonl'invention conviennent à l'utilisation en tant que médica-ments .

Les substances selon l'invention ont une activitépharmacologique en particulier en tant qu'antibiotiquescontre des bactéries Gram positives, de préférence contredes souches résistantes aux glycopeptides.

Dans le cas de souches résistantes à la pénicillineou la méthicilline (souches MRSA), qui ont développé desrésistances contre des antibiotiques, fréquemment seuls desglycopeptides tels que la vancomycine ou la teicoplanine ontune activité thérapeutique suffisante. Cependant, dessouches qui sont même résistantes à ces antibiotiques appa-raissent de plus en plus [FEMS Microbiol. Lett. 98 (1992) 109 à 116]. Un ou plusieurs composés des lipopeptides selonl'invention ont une remarquable activité également contreces germes à problèmes. L'invention concerne également des compositions phar-maceutiques contenant un ou plusieurs composés du groupe deslipopeptides selon l'invention.

Un ou plusieurs composés du groupe des lipopeptides selon l'invention, de préférence un ou plusieurs composés du groupe des lipopeptides A 1437 A-H, peuvent être en principe administrés tels quels. On préfère les utiliser en mélange avec des adjuvants ou véhicules appropriés. Comme véhicules, 1 0066 - 21 - on peut utiliser en médecine vétérinaire les compositionsusuelles d'aliments pour animaux ou, chez l'homme, tous lesvéhicules et/ou adjuvants pharmacologiquement acceptables.

Les médicaments selon l'invention sont en généraladministrés par voie orale ou parentérale, mais une adminis-tration rectale est en principe également possible. Desformes de préparation galéniques solides ou liquides appro-priées sont par exemple des granulés, poudres, comprimés,dragées, (micro)gélules, suppositoires, sirops, émulsions,suspensions, compositions pour aérosols, gouttes ou solu-tions injectables sous forme d'ampoules, ainsi que des com-positions à libération retardée de la substance active, dansla fabrication desquelles on utilise habituellement desvéhicules et additifs et/ou adjuvants tels que désinté-grants, liants, agents d'enrobage, agents de gonflement,lubrifiants ou agents de glissement, correcteurs de goût,édulcorants ou tiers-solvants. Comme exemples d'adjuvants ouvéhicules fréquemment utilisés, on peut citer le carbonatede magnésium, le dioxyde de titane, le lactose, le mannitolet d'autres sucres, le talc, la lactalbumine, la gélatine,l'amidon, des vitamines, la cellulose et ses dérivés, deshuiles animales ou végétales, des polyéthylèneglycols et dessolvants, comme par exemple l'eau stérile, des alcools, leglycérol et des polyols.

On peut éventuellement microencapsuler les doses uni-taires pour l'administration orale, afin de ralentir lalibération ou de la prolonger pendant une plus longue durée,par exemple par enrobage ou inclusion de la substanceactive, sous forme particulaire, dans des polymères ou ciresappropriées, ou similaires.

De préférence, les compositions pharmaceutiques sontpréparées et administrées en doses unitaires, chaque unitécontenant en tant que composant actif une dose déterminéed'un ou plusieurs composés du groupe des lipopeptides selon . l'invention. Dans le cas de doses unitaires solides, telles 10066 - 22 - que comprimés, gélules et suppositoires, cette dose peut aller jusqu'à environ 200 mg, mais de préférence d'environ 0,1 à 100 mg, et dans le cas de solutions injectables sous forme d'ampoules, elle peut aller jusqu'à environ 200 mg, mais de préférence d'environ 0,5 à 100 mg par jour.

La dose journalière administrée est fonction du poidscorporel, de l'âge, du sexe et de l'état du mammifère, danscertains cas, on peut toutefois également administrer desdoses journalières plus élevées ou plus faibles. L'adminis-tration de la dose journalière peut s'effectuer aussi bienpar prise unique, sous forme d'une seule dose unitaire oubien en plusieurs doses unitaires plus faibles, que parprise multiple de doses fragmentées, à intervalles détermi-nés.

On fabrique les médicaments selon l'invention en met-tant sous la ou sous une forme d'administration appropriéeun ou plusieurs médicaments du groupe des lipopeptides selonl'invention, avec des véhicules usuels ainsi qu'éventuelle-ment des additifs et/ou adjuvants usuels. L'invention est illustrée à l'aide des exemples des-criptifs et non limitatifs ci-après. Les pourcentages serapportent aux poids. Dans le cas de liquides, les propor-tions de mélanges se rapportent au volume, à moins d'indica-tion contraire.

Exemples

Exemple la: Production d’une culture sur glycérol<T Actinoplanes sp. DSM 7358

Dans un erlenmeyer stérile de 300 ml, on ensemenceavec la souche Actinoplanes sp. DSM 7358 100 ml de solutionnutritive (4 g/1 d'extrait de levure, 15 g/1 d'amidonsoluble, 1 g/1 de K2HPO4, 0,5 g/1 de MgSO4x7H2O, portés à1 000 ml avec de l'eau, pH avant la stérilisation: 7,0) eton met à incuber pendant 7 jours à 30°C et 150 tours/minute,sur un agitateur rotatif à secousses. On dilue ensuite 1,5 ml de cette culture avec 2,5 ml de glycérol à 80 %, et 1 0066 - 23 - on la conserve à -20’C.

Exemple lb: Production d'une culture ou d'une précultured*Actinoplanes sp. DSM 7358 en erlenmeyer

On ensemence un erlenmeyer de 300 ml, contenant100 ml de la solution nutritive suivante: 30 g/1 de saccha-rose, 2 g/1 de KNO3, 1 g/1 de K2HPO4, 0,5 g/1 de MgSO4x7H2O,0,5 g/1 de KC1, 0,01 g/1 de FeSO4x7H2O, 2 g/1 d'extrait delevure, 5 g/1 de peptone, avec une culture développée sur unpan incliné (même solution nutritive, mais avec 2 % degélose), ou avec 1 ml d'une culture sur glycérol (voirexemple la), et on le met à incuber sur un agitateur àsecousses, à 180 tours/minute et à 30°C. La production maxi-male d'un ou plusieurs composés du groupe des lipopeptidesselon l'invention est atteinte au bout d'environ 120 heures.Une culture submergée de 48 à 96 heures (quantité de l'ino-culum: environ 10 %) composée de la même solution nutritivesuffit pour l'ensemencement de fermenteurs de 10 et100 litres.

Exemple 2: Caractérisation comparative d’Actinoplanes sp. DSM 7358

Pour la caractérisation de la souche Actinoplanes sp.DSM 7358, on effectue une comparaison avec des souches trèsapparentées, selon la méthode ISP (International

Streptomyces Project) de Shirling et Gottlieb [Int. J. ofSys. Bacteriol. 16, 3 (1966) 313-340]. Les résultats (voirtableau 1) montrent que la souche Actinoplanes sp. DSM 7358diffère morphologiquement et physiologiquement des autressouches. 1 0066 - 24 -

Tableau 1

Actinoplanes sp.DSM 7358 A. utahensisNRRL 12052 A. brasiliensisATCC 25844 A. nipponensïslATCC 311455 Mycélium aérien - + (ISP 3) — Sporanges + + + + Milieu ISP 2 orangé orangé orangé-jaune orangé ISP 3 orangé orangé orangé-jaune orangé ISP 4 orangé orangé orangé-jaune orangé ISP 5 orangé orangé orangé-jaune orangé ISP 6 orangé orangé orangé-jaune orangé exopigment rouge exopigment rouge-marron exopigment rouge exopigment rouge Mélanine - - ( + ) ( + ) Glucose + + + + Arabinose + + + + Saccharose + + + + Xylose + (+) - Inositol + + (+) (+) Mannitol + + + - Fructose + + + - Rhamnose + + + + Raffinose + + (+) - Cellulose + + (+) - Mélibiose - - - - Amygdaline - + + + Gélatine (hydrolyse) + 4- + + 1 0066 - 25 -

Tableau 1 (suite)

Act inoplanes sp.DSM 7358 A. utahensisNRRL 12052 A. brasiliensisATCC 25844 A. nipponensisATCC 311455 Cltrate(hydrolyse) - - + - Urée (hydrolyse) + - - - Arginine hydrolase + - - - β-galacto- sidase - - - - Tryptopha- nase - - - - Lysine décarboxy- lase + Acétoïne (produc- tion) + + + 4- Indole (produc- tion) H2S (pro-duction) - - - - Toléranceà NaCl 0-2,5 7. 0-2,5 % 0-2,5 7. 0-2,5 */. - 26 - 10066

Exemple 3a: Production des lipopeptides A 1437 B et D

On utilise un fermenteur de 500 litres dans les con-ditions suivantes:

Milieu nutritif: 11 g/1 de saccharose 6 g/1 d'extrait de viande 0,3 g/1 d'extrait de levure0,6 g/1 de MgSO4

0,1 g/1 de KH2PO410 μΜ de FeCl3x6H2O 0,6 g/1 de L-valinepH 7,3 (avant la stérilisation)

Temps d'incubation : 120 heures

Température d'incubation: 30°C

Vitesse de l'agitateur : 50 tours/minute Aération : 150 1/min

Par addition répétée d'une solution éthanolique de polyol, on peut réprimer la formation de mousse. Le maximumde production est atteint au bout de 87 à 120 heures.

Une fois terminée la fermentation d'Actinoplanes sp. DSM 7358, on filtre le bouillon de culture avec additiond'environ 2 % d'adjuvant de filtration (Celite® par exemple)et on refroidit le filtrat de culture jusqu'à 4°C, et onl'ajuste à un pH de 1,5. Au bout de 4 heures, on centrifugeà 10 000 g et on remet le dépôt en suspension dans de l'eaudistillée. Par neutralisation de la suspension, la substancecitée passe en solution. On la congèle et on la lyophilise.Le rendement est d'environ 1,5 g/1 de produit brut (= 750 g).

Exemple 3b) Dissociation du produit brut (contient B + D)par chromatographie d’échange d’ions

On garnit avec du DEAE-Sepharose Fast Flow une colonne de chromatographie de 3,2 1 (10 cm de diamètre interne x 40 cm de hauteur) et on l'équilibre avec du tampon phosphate de potassium 10 mM, pH 7,0, dans du méthanol à 40 % (tampon A) . On injecte ensuite dans la colonne 25 g de 1 0066 - 27 - produit brut A 1437 B (obtenu selon l'exemple 3a), dissousdans 3,51 d'eau, et on lave avec 1 1 d'eau, puis avec 6 1de tampon A. Les impuretés du produit brut se trouvent dansl'effluent et dans l'eau de lavage. On applique ensuite ungradient de phosphate de potassium 10-100 mM, pH 7,0, dansdu méthanol à 40 %. Le peptide A 14 37 D est élué avec duphosphate de potassium 25 à 35 mM, et l'antibiotiqueA 1437 B est recueilli avec du phosphate de potassium 40 à55 mM. Les fractions correspondantes sont séparées du métha-nol sous vide. Pour l'élimination des sels, on utilise unecolonne de Dianion HP-20® (Mitsubishi, Japon) d'une capacitéde 1 1. On injecte alors dans la colonne les 9 1 de frac-tions contenant le peptide B pur et on lave ensuite avec 3 1d'eau déminéralisée. On effectue l'élution avec un mélanged'eau et d'isopropanol dans la technique du gradient (pro-portions d'alcool allant de 0 à 50 %). Avec 15 à 25 % d'iso-propanol, la substance A 1437 B pure est séparée du supportpar lavage. Cet effluent de la colonne est recueilli séparé-ment, concentré sous vide et lyophilisé. Il en résulte 4,8 gde A 1437 B avec un degré de pureté de 97 %. L'éliminationdes sels correspondants à partir des fractions contenantA 1437 D donnent 3,1 g de l'antibiotique. Degré depureté: 98 %.

Exemple 4a: Production des lipopeptides A 1437 λ et CLa production s'effectue comme en décrit dans l'exemple 3a, seulement on remplace la L-valine, dans lemilieu de production, par 4 g/1 de L-leucine, et on effectuela fermentation dans un bioréacteur de 50 1. Le rendementest de 1,3 g/1 de peptide brut (= 65 g) .

Exemple 4b: Isolement des lipopeptides A 1437 A et C

On a dissous 10 g du produit brut dans 100 ml d'eau distillée et on les a traités selon le schéma donné ci-après. 1 0066 - 28 -

Schéma de traitement: 10 g de peptide brut dans 100 ml d'eau distilléeΨ

Adsorption sur Q-Sepharose fast flow (Pharmacia) (colonne de 5 x 20 cm)ψ

Dilution avec le gradient suivant:

Tampon A: NaH2PO4 1 mM dans du méthanol à 50 %, pH 5,9

Tampon B: NaH2PO4 100 mM dans du méthanol à 50 %, pH 5,3

20 minutes: tampon A —> en 60 minutes à 25 % de tampon B,encore 30 minutes à 25 % de tampon B

Lyophilisation des fractions A et C de A 1437 et dissolutiondans l'éluant ψ

Elimination des sels sur Biogel P2 (75-150 gm) de la sociétéBiorad (colonne de 7 x 20 cm) ψ Ψ 1,6 g de lipopeptide A 1437 A 1,2 g de lipopeptide A 1437 C(à 80 t) (à 80 %) ψ Ψ

Chromatographie par perméation de gel sur Nucléosil® C18 (7 gm) (colonne de 20 x 250 mm, injection: 200 mg) élution avec legradient suivant:

Tampon A: eau bidistillée, 0,1 % d'acide trifluoroacétique (TFA)Tampon B: acétonitrile 10 minutes: tampon B —> en 60 min à 90 % de tampon B à un débit de 10 ml/min ψ ψ

Lyophilisation des fractions A et C de A 1437 Aψ ψ 150 mg de A 1437 A (degré de 154 mg de A 1437 C (degrépureté > 95 %) de pureté > 95 %) 1 0066 - 29 -

Exemple 5a: Production des lipopeptides A 1437 E, F, G et H

La production s'effectue comme décrit dansl'exemple 3a, seulement on remplace la L-valine, dans lemilieu de production, par 1,5 g/1 de L-isoleucine et oneffectue la fermentation dans un bioréacteur de 50 1. Lerendement est de 1,4 g/1 de peptide brut (70 g).

Exemple 5b: Dissociation du peptide brut par chromatographie d'échange d'ions

Dans la colonne telle que décrite dans l'exemple 3a,on dissocie conformément à l'exemple 3a 25 g du produit brutlipopeptidique obtenu selon l'exemple 5a.

Le lipopeptide A 1437 F est élué avec du tampon 14 à 19 mM(rendement: 1,8 g), le lipopeptide A 1437 E est élué avec du tampon 18 à 25 mM(rendement: 1,3 g), le lipopeptide A 1437 H est élué avec du tampon 35 à 50 mM(rendement: 2,7 g) et le lipopeptide A 1437 G est élué avec du tampon 64 &amp; 82 mM(rendement: 1,9 g).

Les fractions correspondantes sont réunies et sépa-rées du méthanol sous vide.

Exemple 5c: Purification sur phase inversée RP-18 des compo-sants provenant de l'exemple 5b

On garnit avec du LiChrosorb G RP-18®, 10 μπι, unecolonne de HPLC préparative d'une capacité de 500 ml (5,1 cmde diamètre interne χ 25 cm de hauteur) et on y injecte lasolution de A 1437 G contenant des sels et contenant 1,9 gde l'antibiotique. On effectue l'élution dans la techniquedu gradient avec de l'acétonitrile à 5 % dans du tamponphosphate de potassium 10 mM, pH 7,0, à de l'acétonitrile à36 % dans du tampon phosphate de potassium 10 mM, pH 7,0. Lelipopeptide A 1437 G est obtenu avec 24-26 % d'acétonitrile.Après concentration sous vide, élimination des sels sur100 ml de résine d'adsorption Dianion HP-20® dans un systèmed'eau/50 % d'isopropanol, et lyophilisation, on obtient 1 0066 - 30 - 1,1 g de lipopeptide A 1437 G ayant un degré de pureté de99 %.

La purification ultérieure correspondante de la solu-tion de A 1437 H obtenue selon l'exemple 5b s'effectue avecle gradient de solvant acétonitrile 10 à 50 % dans du tamponphosphate de potassium 10 mM, pH 7,0. L'élution de l'anti-biotique s'effectue avec des proportions de solvant de 37 à39 %. Après concentration des fractions correspondantes etélimination des sels sur Dianion HP-20®, et lyophilisation,on obtient 2,2 g du lipopeptide A 1437 H à un degré depureté de plus de 98 %.

Exemple 5d: Purification sur gel MCI des antibiotiques lipo-peptidiques A 1437 E et F provenant del'exemple 5b

On injecte sur 1 1 de gel MCI CHP 20P (Mitsubishi

Kasei Corp.) la solution de A 1437 F contenant des sels etcontenant 1,8 g de l'antibiotique, obtenu selonl'exemple 5b. Les dimensions de la colonne sont de 6 cm dediamètre interne x 35 cm de hauteur. Après avoir chargé lesupport avec le produit à dissocier et l'avoir lavé avec dutampon A (tampon phosphate de potassium 5 mM, pH 7,0, avec20 % d'acétonitrile), on effectue l'élution, en utilisant latechnique du gradient, contre le tampon B (tampon phosphatede potassium 5 mM, pH 7,0, avec 70 % d'acétonitrile) . Desproportions de solvant de 34 à 35 % conduisent à l'élutionde l'antibiotique pur. Après concentration sous vide et éli-mination des sels sur Dianion HP-20 , on obtient 1,4 g delipopeptide A 1437 F, avec un degré de pureté de plus de98 %. Le processus analogue avec le produit brut A 1437 E del'exemple 5a donne 1 g de lipopeptide A 1437 E, avec undegré de pureté de plus de 98 %.

Exemple 6a: Production du lipopeptide A 1437 K

La production s'effectue comme décrit dans l'exemple 4a, seulement on remplace la N-valine, dans lemilieu de production, par 500 mg/1 d'acide L-a-amino- - 31 - 10066 butyrique (ou 1 g/1 du racémique) et on effectue la fermen- tation dans un bioréacteur de 10 1. Le rendement est de 1,1 g/1 de peptide brut (= 10 g).

Exemple 6b: Isolement du lipopeptide λ 1437 K

On a dissous 10 g du produit brut dans 100 ml d'eau distillée et on les a traités selon le schéma ci-dessous.Schéma de traitement (A 1437 K) - 10 g de peptide brut dans 100 ml d'eau distillée. - Adsorption sur Q-Sepharose fast flow (colonne de 3.5 x 17 cm) . - Elution avec le gradient suivant:

Tampon A: NaH2OPO4 1 mM dans du méthanol à 50 %, pH 5,9,Tampon B: NaH2PO4 100 mM dans du méthanol à 50 %, pH 5,3,20 minutes: Tampon A —> en 45 minutes jusqu'à 25 % detampon B, encore 45 minutes avec 25 % de tampon B. - Lyophilisation des fractions A 1437 K.

Elimination des sels sur Biogel P2 (75-150 Mm) (colonne de 7 x 20 cm) . 700 mg de A 1437 K (60 %) . - Chromatographie en phases inversées sur Nucleosil C18 7 μιη(colonne de 20 x 250 mm) .

Injection: 50 mg du produit purifié au préalable.

Elution avec le gradient suivant:

Tampon A: eau distillée, 0,1 % de TFA,

Tampon B: acétonitrile, 10 minutes: Tampon A/5 % de tampon B —> en 60 minutes jus-qu'à 70 % de tampon B à un débit de 10 ml/minute. - Lyophilisation des fractions de A 1437 K. 5.6 mg de A 1437 (> 95 %).

Exemple 7a: Production des lipopeptides A 1437 L et MLa production s'effectue comme décrit dans l'exemple 4a, seulement on remplace la L-valine, dans lemélange de production, par 500 mg/1 de L-norvaline (ou 1 g/1du racémique) et on effectue la fermentation dans un bio- , réacteur de 10 1. Le rendement est de 1,2 g/1 de peptide 1 0066 - 32 - brut (= 12 g) .

Exemple 7b: Isolement des lipopeptides A 1437 L et M

On dissout 10 g du produit dans 100 ml d'eau distil-lée et on les traite selon le schéma ci-dessous.

Schéma de traitement: - 10 g de peptide brut dans 100 ml d'eau distillée. - Adsorption sur Q-Sepharose fast flow (colonne de 3,5 x 17 cm). - Elution avec le gradient suivant:

Tampon A: NaH2PO4 1 mM dans du méthanol à 50 %, pH 5,9Tampon B: NaH2PO4 100 mM dans du méthanol à 50 %, pH 5,320 minutes: tampon A —> en 45 minutes jusqu'à 25 % detampon B, encore 45 minutes à 25 % de tampon B. - Lyophilisation des fractions A 1437 L et M. - Elimination des sels sur Biogel P2 (75-150 jum) (colonne de 7 x 20 cm). 900 mg de A 1437 L et M (environ 60 %) . - Chromatographie en phases inversées sur Nucleosil Clg7 um (colonne de 20 x 250 mm) .

Injection: 50 mg du produit purifié au préalable.

Elution avec le gradient suivant:

Tampon A: eau bidistillée, 0,1 % de TFA,

Tampon B: acétonitrile, 10 minutes: tampon A/5 % de tampon B —> en 60 minutes jus-qu'à 70 % de tampon B, à un débit de 10 ml/minute.

- Lyophilisation des fractions A 1437 L et M 5,8 mg de A 1437 L (> 95 %) ; 6,7 mg de A 1437 M (> 95 %).Exemple 8: Système HPLC pour la détection des lipopeptides A 1437

Le système décrit ci-dessous permet la séparation etla détermination quantitative des lipopeptides dans lemélange brut ou dans le filtrat de culture; les temps derétention sont compris entre 11,5 minutes (A 1437 E) etenviron 15,9 minutes (A 1437 H). 1 0066 - 33 -

Eluant: A tampon phosphate de potassium, pH 7,0, 10 mM B acétonitrile A (%) 80 B (%) 20 Gradient: t (min) Débit (ml/min) 1,5 0 5 15 1,5 50 50 15,5 2 0 100 16,5 2 0 100 17 1,5 80 20 22 1,5 80 20 10 Colonne: Shandon ODS Hypersil RP 18 (120 x 4,6 mm avec une précolonne de 20 x 4,6 mm) ou Nucleosil 120 RP 18 (120 x 4,6 mm avec une pré- colonne de 20 x 4,6 mm). Débit: 1,5 ml/min 15 Détection: 210 nmInjection: 10 μΐ.

Exemple 7: Comparaison entre Actinoplanes nipponensisATCC 31145 et Actinoplanes sp. DSM 7358

On prépare d'abord une préculture des deux souches 20 comme décrit dans l'exemple lb, et on les utilise pour ense-mencer les milieux de production suivants:

Milieu 1: tel que décrit dans l'exemple 3a

Milieu 2: comme le milieu 1 mais sans L-valine

Milieu 3: glucose 30 g/1, farine de soja 20 g/1, Fe2(SO4)3 25 0,3 g/1, MnCl2x4H2O 0,3 g/1 et CoCl2x6H20, pH 7,3 dans chaque cas 100 ml de milieu dans un erlenmeyer de300 ml.

On effectue l'incubation à 30°C sur un agitateurrotatif à secousses. Au bout de 48, 96 et 144 heures, on 30 détermine par HPLC (voir exemple 6) la concentration des lipopeptides A 1437 dans le filtrat de culture. Dans le casde la souche Actinoplanes nipponensis ATCC 31145, aucunlipopeptide n'est décelable dans le milieu 2 et le milieu 3.Dans le milieu 1, quelques peptides peuvent être détectés en 35 . très faible quantité au bout de 144 heures. En prenant pour 1 0066 - 34 - base une extinction spécifique identique de ces composés parcomparaison avec les peptides A 1437, la quantité formée estinférieure par un facteur d'au moins 100 (< 1 mg/1) à laconcentration de A 1437 B, tel que ce composé est synthétisé 5 dans le même temps par la souche Actinoplanes sp. DSM 7358dans le milieu 1.

Exemple 8: Activité des lipopeptides A 1437

La sensibilité importante de germes aux lipopeptides A 1437 est déterminée à l'aide de l'essai de dilution en 10 milieu gélosé. Comme milieu gélosé, on utilise de la gélosede Müller-Hinton, à laquelle on ajoute 10 % de sang de che-val dans le cas de S. pyogenes et des entérocoques. Lesplaques contenant les antibiotiques sont ensemencées avec unappareil d'ensemencement multicanal [5xl04 UFC (unités for- 15 mant colonie) d'une culture stationnaire de la souche res-pective par cellule d'ensemencement]. Les valeurs de la con-centration minimale inhibitrice (CMI) sont déterminées à37°C. La CMI est définie comme la concentration dans l'anti-biotique à laquelle aucune croissance visible des germes 20 n'est décelable après 24 heures d'incubation. Les résultatssont récapitulés dans le tableau 2. L'amphomycine utiliséeen tant que témoin a été fournie par Boehringer-Mannheim(RFA). L'amphomycine y est disponible en tant que produit dechimie fine. 1 0066 - 35 -

Tableau 2

Substances A 1437: activité in vitro (spectre AB);concentration en gg/ml, A 1437 A 0,391 0,781 0,391 1,56 0,391 3,13 A 1437 B 0,098 0,195 0,098 0,195 0,049 0,391 A 1437 C 0,195 0,781 0,391 3,13 0,781 3,13 A 1437 D 0,049 0,195 0,049 0,781 0,391 0,781 A 1437 E 0,098 0,195 0,094 0,098 0,025 0,195 A 1437 F 0,098 0,391 0,195 1,56 0,781 1,56 A 1437 G 0,098 0,195 0,049 0,088 0,025 0,195 A 1437 H 0,049 0,098 0,049 0,195 0,049 0,195 Amphomycine 0,195 0,781 0,391 1,56 0,391 1,56

Substances A 1437,: activité in vitro (souches résistantes àla vancomycine); concentration en ug/ml

Enterococcusfaecium VR1 Enterococcusfaecium VR2 Enterococcus pyogenes A 1437 A non déterminé A 1437 B 1 1 0,5 J A 1437 C 4 4 ' -I 4 A 1437 D 2 2 1 A 1437 E 4 4 1 A 1437 F 4 4 1 ! A 1437 G 0,25 0,25 0,125 A 1437 H 1 1 0,5 Amphomycine 4 * 4 2 |

Les composés K, L, M ont une activité in vitro compa-rable à celle des composés A à H. 1 0066 - 36 -

Exemple 9a: Caractérisation de λ 1437 D

Le lipopeptide A 1437 D est isolé sous forme d'un solide amorphe.

Pouvoir rotatoire: +35° (c = 0,1; méthanol) HPLC: temps de rétention: 15,1 minutes

Aminoacides: 2 restes acide aspartique1 reste asparagine 1 reste β-méthylaspartate 2 restes glycine 2 restes acide 2,3-diaminobutyrique1 reste proline1 reste acide pipécolique1 reste valine SM-FAB: m/e * 1303, 6952 [M + H,+]

Masse moléculaire: 1302, 6884 (CcoHo.N,.0, Λ) 59 94 14 19 SM-CID: rn/z = 356, 491, 517, 520, 741, 761, 938, 982IR (KBr): V = 3420 (large), 2930, 1660, 1530, 1450, 1400 cm"1

Exemple 9b: Caractérisation de A 1437 B

Le lifopeptide A 1437 B est isolé sous forme d'un solide amorphe.

Pouvoir rotatoire: +27° (c = 0,1; méthanol) HPLC: temps de rétention: 12,8 minutes

Aminoacides: : restes acide aspartiquereste (3-méthylaspartate : restes glycine : restes acide 2,3-diaminobutyrique1 reste proline1 reste acide pipécolique1 resta valine SM-FAB: m/e = (M + H) + ]

Masse moléculaire: 1303 (ε59Η93Ν13θ2θ) SM-CID: m/z = 356, 407. 518, 521, 741, 762, 938, 982IR (KBr): U = 3420 (larqe), 2925, 1650, 1535, 1450, 1400 cm -1 1 0066 - 37 -

Exemple 9c: Caractérisation de A 1437 C

Le lipopeptide A 1437 C est isolé sous forme d'un solide amorphe.

Pouvoir rotatoire: +30° (c = 0,1; méthanol) HPLC: temps de rétention: 14,1 minutes

Aminoacides: 2 restes acide aspartique1 reste asparagine 1 reste 0-méthylaspartate 2 restes glycine 2 restes acide 2,3-diaminobutyrique1 reste proline1 reste acide pipécolique1 reste valine

Masse moléculaire: 1288 (C58Hg2N14O19) SM-CID: m/z = 356, 392, 503, 741, 747, 938, 981 IR (KBr): v = 3420 (large), 2930, 1660, 1530, 1450, 1400 cm'1

Exemple 9d: Caractérisation de A 1437 A

Le lipopeptide A 1437 A est isolé sous forme d'un solide amorphe.

Pouvoir rotatoire: +30° (c = 0,1; méthanol) HPLC: temps de rétention: 11,8 minutes

Aminoacides: 3 restes acide aspartique 1 reste 0-méthylaspartate 2 restes glycine 2 restes^ acide 2,3-diaminobutyrique1 reste proline1 reste acide pipécolique1 reste valine

Masse moléculaire: 1289 (CcqHq.N, _O_n) □o yi, u 20 SM-CID: M/z = 356, 478, 504, 507, 741, 748, 938, 981ÏR (KBr): v = 3420 (large), 2925, 1650, 1535, 1450, 1400 cm -1 1 0066 - 38 - 1288 <C58H92N14°19)

Exemple 9e: Caractérisation de A 1437 F

Le lipopeptide A 1437 F est isolé sous forme d'un solide amorphe.

Pouvoir rotatoire: +31° (c = 0,1; méthanol) HPLC: temps de rétention: 13,8 minutes

Aminoacides: 2 restes acide aspartique1 reste asparagine 1 reste β-méthylaspartate 2 restes glycine 2 restes acide 2,3-diaminobutyrique1 reste proline1 reste acide pipécolique1 reste valineNasse moléculaire: SM-CID: m/Z = 356, 392, 503, 506, 741, 747, 938, 981IR (KBr): V = 3420 (large), 2930, 1660, 1530, 1450, 1400 cm"1

Exemple 9f: Caractérisation de A 1437 E

Le lipopeptide A 1437 E est isolé sous forme d'un solide amorphe. HPLC: temps de rétention: 11,5 minutes

Aminoacides: 3 restes acide aspartique 1 reste R-méthylaspartate 2 restes glycine 2 restes acide .2,3-diaminobutyrique1 reste proline1 reste acide pipécolique1 reste valine

Masse moléculaire: 1289 (C58H9iNi3°2<P SM-CID: m/z = 356, 393, 504, 507, 741, 748, 938, 981IR (KBr): V = 3420 (large), 2925, 1650, 1535, 1450, 1400 cm-1

Exemple 9g: Caractérisation de A 1437 H

Le lipopeptide A 1437 H est isolé sous forme d'un solide amorphe. 1 0066 - 39 -

Pouvoir rotatoire: +32° (c - 0,1; inéthanol) HPLC: temps de rétention: 15,9 minutes

Aminoacides: 2 restes acide aspartique1 reste asparagine 1 reste β-méthylaspartate 2 restes glycine 2 restes acide 2,3-diaminobutyrique1 reste proline1 reste acide pipécolique1 reste valine

Masse moléculaire: 1316 (C-._H N.O_) 60 96 14 19' SM-CID: m/2 = 356, 420, 531, 534, 741, 775, 938, 981IR (KBr): v = 3420 (large), 2930, 1660, 1530, 1450, 1400 cm-1

Exemple 9h: Caractérisation de λ 1437 G

Le lipopeptide A 1437 G est isolé sous forme d'un solide amorphe.

Pouvoir rotatoire: +34° (c = 0,1; méthanol) HPLC: temps de rétention: 13,6 minutes

Aminoacides: 3 restes acide aspartique 1 reste β-méthylaspartate 2 restes glycine 2 restes acide 2,3-diaminobutyrique1 reste proline1 reste acide pipécolique1 reste valine

Masse moléculaire: 1217 (Ο6θΗ95Ν13Ο2θ) SM-CID: m/z = 356, 421, 532, 535, 741, 776, 938, 981IR (KBr): V = 3420 (large), 2925, 1650, 1535, 1450, 1400 cm'1

Exemple 9i: Caractérisation de A 1437 K

Le lipopeptide A 1437 K est isolé sous forme d'un solide amorphe. HPLC: temps de rétention: 12,5 minutes 1 0066 - 40 -

Aminoacides: 3 restes acide aspartique 1 reste 0-méthylaspartate 2 restes glycine 2 restes acide 2,3-diaminobutyrique1 reste proline1 reste acide pipécolique1 reste valine SM-FAB: m/e = [M + H)+]

Masse moléculaire: 1299 (C58Hg1N1302o^ SM-CID: m/z = 393, 504, 507, 741, 748, 938, 981 IR (KBr): v = 3420 (large), 2925, 1650, 1535, 1450, 1400 cm'1

Exemple 9j: Caractérisation de A 1437 L

Le lipopeptide A 1437 L est isolé sous forme d'un solide amorphe. HPLC: temps de rétention: 13,0 minutesAminoacides: 3 restes acide aspartiquereste 0-méthylaspartaterestes glycine restes acide 2,3-diaminobutyriquereste prolinereste acide pipécolique 1 2 2 1 1 1 reste valine + . '59H93N13°20^ SM-FAB: m/e = [M + H) ]

Masse moléculaire: 1289 (C^ SM-CID: m/z = 497, 518, 741, 761, 938, 981IR (KBr): v = 3420 (large), 2925, 1650, 1535, 1450, 1400 cm-1

Exemple 9k: Caractérisation de A 1437 M

Le lipopeptide A 1437 M est isolé sous forme d'un solide amorphe. HPLC: temps de rétention: 9,8 minutes

Aminoacides: 3 restes acide aspartique 1 reste β-méthylaspartate 2 restes glycine 1 0066 - 41 - 10 2 restes acide 2,3-diaminobutyrique1 reste proline1 reste pipécoline1 reste valine SM-FAB: m/e = [M + H)+]

Masse moléculaire: 1275 (C57Hg9N13O20) SM-CID: rn/z = 379, 490, 493, 724, 741, 938, 981 IR (KBr): v = 3420 (large), 2925, 1650, 1535, 1450, 1400 cm-113

Exemple 10: RMN- C - Déplacements chimiques

Le tableau donne les déplacements chimiques de

RMN-13C des signaux CH de A 1438 B 1 0066 - 42 - 10 I Attri-but ion Dab Gly MeAsp Gly Asp Asp Asp Dab Val Pro Pip | NH/Ca 8,30 8,43 8,19 8,12 8,09 7,96 8,15 7,87 7,30 4,13 4,62| a 56,00 44,60 41,20 44,70 52,00 53,10 53,00 55,60 59,20 62,40 56,80 β 50,10 14,40 36,10 35,60 36,30 47,80 31,30 30,80 27,20 Z 16,00 20,10 18,9 19,7 26,00 20,60 δ 49,40 24,90 <r 45,00 1 0066 - 43 -

Pour permettre une comparaison avec les données deRMN-^H, on a indiqué les combinaisons chimiques NH dessignaux NH ou, pour Pip et Pro, les déplacements CaH dessystèmes de spin correspondants.

Claims (14)

10066 - 44 - REVENDICATIONS

1. Lipopeptides caractérisés en ce que l'on cultive par fermentation AcCinoplanes sp. dans un milieu de culture jusqu'à l'accumulation dans le milieu de culture d'un ou plusieurs lipopeptides de formule I1 2 R -R -Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro II-1 dans laquelle R1 représente un acide gras ou acide gras hydroxylé à une ouplusieurs insaturations, saturé ou, indépendamment decela, ramifié ou non ramifié, ayant une longueur dechaîne de 6 à y compris 22 atomes de carbone, et 2 R représente Asp ou Asn, et éventuellement on purifie un ou plusieurs lipopeptides deformule I à partir du milieu de culture, à l'exclusion dulipopeptide de formule I dans lequel R1 représente i et C 0 0 H 2 R représente Asp.

2. Lipopeptides selon la revendication 1, caractéri-sés en ce que R1 représente un radical ayant une longueur dechaîne de 10 à y compris 20 atomes de carbone.

3. Lipopeptides selon la revendication 1, caractéri-sés en ce que RA représente un radical ayant une longueur dechaîne de 12, 13, 14 ou 15 atomes de carbone.

4. Lipopeptides, caractérisés en ce que l'on cultivepar fermentation Actinoplanes sp. dans un milieu de culture,jusqu'à l'accumulation dans le milieu de culture d'un ouplusieurs lipopeptides choisis parmi: a) i-acide gras en C1^-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro, b) i-acide gras en C14-Asp-Dab-P ip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro, c) i-acide gras en C _-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly- i-> I- Dab-Val-Pro, 10066 45 d) i-acide gras en C^-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro, e) ai-acide gras en C13-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro, f) ai-acide gras en C15-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro, g) ai-acide gras en C1 s-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro, h) n-acide gras en C12-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro, --——4 i) n-acide gras en C.| 3-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro, j) n-acide gras en C14-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly- Dab-Val-Pro, -1 éventuellement on purifie un ou plusieurs de ces lipo-peptides à partir du milieu de culture.

dans laquelle 2 R = Asp ou 00H R2 = Asp COOH OU Asn H ou Asn COOH 2 1 0066 - 46 - OU

R2 = Asn ou

R2 = Asp ou

2 R représente Asp dans les trois cas cités en dernier.

6. Lipopeptides selon la revendication 1 ou 4,caractérisés en ce que l'on cultive par fermentationActinoplanes sp. DSM 7358.

7. Procédé pour la production d'un ou plusieurs lipo-peptides de formule I selon une ou plusieurs des revendica-tions 1 à 3, d'un ou plusieurs lipopeptides selon la reven-dication 4 ou d'un ou plusieurs lipopeptides de formule IIselon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on cultivepar fermentation Actinoplanes sp. dans un milieu de culture,jusqu'à l'accumulation dans le milieu de culture d'un ouplusieurs lipopeptides, et éventuellement on purifie un ouplusieurs lipopeptides à partir du milieu de culture.

8. Procédé pour la production d'un lipopeptide, • caractérisé en ce que l'on cultive par fermentation 1 0066 - 47 - Actinoplanes sp. dans un milieu de culture jusqu'à l'accumu-lation dans le milieu de culture du lipopeptide de for-mule III R1-R2-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro IIIdans laquelleR1 représente

et 2 R représente Asp, et éventuellement on purifie le lipopeptide de formule III àpartir du milieu de culture.

9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caracté-risé en ce que l'on effectue la purification en faisant pré-cipiter les lipopeptides dans le milieu de culture, à l'aided'acides, à pH 0,5 à y compris 4, éventuellement on purifieensuite les lipopeptides obtenus à partir de la précipita-tion, par chromatographie sur des échangeurs d'anions ouchromatographie sur une matrice hydrophobe, les deux chroma-tographies pouvant être effectuées l'une à la place del'autre ou successivement en un ordre quelconque.

10. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caracté-risé en ce que l'on cultive par fermentation Actinoplanessp. DSM 7358.

11. Médicament contenant un ou plusieurs lipo-peptides de formule I selon la revendication 1 et éventuel-lement un véhicule pharmaceutique.

12. Médicament contenant le lipopeptide de for-mule III selon la revendication 8 et éventuellement un véhi-cule pharmaceutique.

13. Utilisation d'un lipopeptide de formule I selonla revendication 1, en tant que substance pharmacologique-ment active, en particulier en tant qu'antibiotique contredes bactéries Gram positives, de façon particulièrement pré-férée contre des bactéries résistantes aux glycopeptides. 1 0066 - 48 -

14. Utilisation du lipopeptide de formule I selon larevendication 8, en tant que substance pharmacologiquementactive, en particulier en tant qu'antibiotique contre desbactéries Gram positives, de façon particulièrement préférée 5 contre des bactéries résistantes aux glycopeptides.

15. Actinoplanes sp. DSM 7358.