KR0174264B1

KR0174264B1 - 약리학적 작용을 갖는 악티노플레인스 종으로부터의 리포펩타이드, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR0174264B1
Application number: KR1019940012795A
Authority: KR
Inventors: 함만 페터; 마이베스 요하네스; 자이베르트 게르하르트; 베르테시 라스츨로; 빙크 요아힘; 마르쿠스 아스트리트
Original assignee: 짜우너 루츠; 훽스트 아크티엔게젤샤프트
Priority date: 1993-06-08
Filing date: 1994-06-08
Publication date: 1999-02-01
Also published as: ATE174604T1; ES2127312T3; CA2125376A1; PL303716A1; PL179581B1; GR3029591T3; CY2190B1; EP0629636A1; EP0864584A1; FI942660A; HK1012009A1; DE59409616D1; EP0629636B1; AU6462094A; AU672691B2; JPH0797394A; ZA943983B; DK0629636T3; RU2117672C1; KR100319563B1

Abstract

본 발명은 발효 동안 악티노플레인스 종에 의해 합성되어 배양 배지로 방출되는, 매우 상동성인 아미노산 서열을 갖지만 상이한 지방산 잔기(지질 부분)를 갖는 리포펩타이드, 배양 배지로부터 리포펩타이드를 분리하고 이를 정제하는 방법, 특히 그램-양성 세균에 대한 약리학적 활성물질로서의 리포펩타이드의 용도 및 상기 리포펩타이드를 생산하기 위한 악티노플레인스종 DSM 7358에 관한 것이다.

Description

약리학적 작용을 갖는 악티노플레인스 종으로부터의 리포펩타이드, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약제학적 조성물

본 발명은 발효중에 악티노플레인스(Actinoplanes)종에 의해 합성되어 배양 배지로 방출되는 매우 상동성인 아미노산 서열을 갖지만 지방산 잔기(지질 부위)에 있어서는 상이한 리포펩타이드, 배양 배지로부터 리포펩타이드를 분리하고 이를 정제하는 방법, 특히 그램-양성 세균에 대한 약리학적 활성물질로서의 리포펩타이드의 용도 및 상기 리포펩타이드를 생산하기 위한 악티노플레인스종 DSM 7358에 관한 것이다.

미생물로부터의 2차 대사산물은 감염성 질환의 치료에 성공적으로 사용된다. 2차 대사산물은 저분자량 화합물이며, 이의 생산은 1차 대사로부터 분지된 생합성적 일방경로중 생성되며 특정 생산자에 대한 이의 기능은 불명료하다. 현재까지 다양한 미생물(특히 진균 및 스트렙토마이세스 속의 세균)의 배양물로부터 분리된 약 8,000개 2차 대사산물이 공지되어 있다.

이들 2차 대사산물이 사용되는 주요분야는 감염성 질환의 치료이다. 하지만, 광범위한 사용으로 인해, 빈번히 내성이 생겨남으로써 새로운 작용 기작을 갖는 신규한 항생제 및 활성 물질에 대한 지속적 필요성이 요구되었다[참조: Neu H.C., Science 257, 1992, pages 1064-1073].

추가로, 미생물 활성물질의 적용영역은 감염성 질환중에 포함되지 않는 질환(예를 들면, 종양 치료, 면역 조절 또는 지질 대사 조절) 및 농작물 보호(제조제 및 살충제)에까지 확장되었다. 하지만, 사용되는 활성 물질은 여전히 빈번하게 불만족스러운 작용수준, 과다한 독성 및/또는 바람직하지 않은 부작용을 특징으로 하는 단점을 수반한다.

본 발명의 리포펩타이드와 이의 아미노산 성분이 서열에 있어 동일하거나, 아미노산 조성에 있어 동일하거나 매우 유사한 리포펩타이드가 문헌에 기술되어 있다. 하지만, 이들 리포펩타이드는 본 발명의 리포펩타이드와는 지질 부위에 있어 기본적으로 상이하다.

상기 언급된 리포펩타이드의 예는 하기와 같다:

- 암포마이신 안티바이옷(Amphomycin Antibiot)[J. Antibiotics, 38, page 517 (1965)];

- 글루마마이신(Glumamycin)[J. Antibiotics, 38, page 517 (1965)];

- 자오마이신(Zaomycin)[J. Antibiot. Ann., Page 194 (1960)];

- 아스파르토신(Aspartocin)[Antibiot. Ann., 194 (1960)];

- 수히마이신(Tsuhimycin)[J. Antibiotics, 21, page 439 (1968)];

- 라스파르토마이신(Laspartomycin)[J. Antibiotics 21, page 55 (1968)].

암포마이신-형 리포펩타이드라고도 불리우는 이들 리포펩타이드는 스트렙토마이세스속의 미생물에 의해 합성된다. 이들은 그램-양성 세균, 예를 들면 스트렙토-(Strepto-), 스타필로-(Staphylo-) 및 엔테로콕시(Enterococci)에 대해 항생제 활성을 나타낸다. 특히, 스타필로- 및 엔테로콕쿠스속의 균주가 최근 점차적으로 문제를 유발하는 유기체인 것으로 입증되었다. 숙련된 연구자는 문제의 유기체가, 통상의 항생제[예를 들면, β-락탐 항생제 또는 글리코펩타이드 항생제(예: 반코마이신 또는 테이코플라닌)]에 대한 내성 때문에 현재 효율적으로 조절이 불가능한 미생물인 것으로 이해하고 있다.

내성이 발생한 미생물 균주의 한 그룹의 예로 메티실린-내성 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주(MRSA 균주로 약칭)를 포함한다. 이들 MRSA 균주는 메티실린뿐 아니라 기타 항생제(예를 들면 반코마이신)에도 종종 발달된 내성을 갖는 것으로 현재 공지되어 있다.

스트렙토마이세스로부터의 상기 화합물 이외에, 악티노플레인스 니포넨시스(Actinoplanes nipponensis) ATCC 31145로부터의 화합물이 공지되어 있으며 기술된 이의 작용 영역 및 생리 화학적 특성을 보건대, 본 발명에 따른 리포펩타이드와 구조적 유사성을 지니며, 이는 화합물 41.012(미합중국 특허 제4,000,397호)로 불리운다. 다양한 배양 조건하에서의 악티노플레인스 니포넨시스 ATCC 31145의 발효로 항상 비교적 낮은 수율로 화합물 41.012를 수득하게 된다.

본 발명의 목적은 개선된 특성을 갖는 미생물의 천연 물질을 탐색하고자 함이다.

이러한 목적은 본 발명에 따라, 악티노플레인스종을 탄소 공급원 및 질소공급원과 통상의 유기염이 있는 영양 용액 중에서 리포펩타이드, 바람직하게는 리포펩타이드 A1437이 배양 배지 내에 축적될 때까지 발효시키고, 이어서 배양 배지로 부터 리포펩타이드를 분리하며, 경우에 따라, 혼합물을 이의 각각의 성분으로 분리시킴으로써 성취된다. 리포펩타이드는 약리학적 활성을 가짐으로써 치료학적 효능을 갖고, 그램-양성 세균, 바람직하게는 글리코펩타이드-내성 균주에 대해 작용하는 항생제로서 사용될 수 있다.

따라서 본 발명은 하기에 관한 것이다.

1. 악티노플레인스종을, 하나 이상의 서열식(Ⅰ)의 리포펩타이드가 배양 배지 내에 축적될 때까지 배양 배지내에서 발효시키고, 경우에 따라 하나 이상의 서열식(Ⅰ)의 리포펩타이드를 배양 배지로부터 정제시킨 리포펩타이드.

상기식에서, R¹은 탄소수 6 내지 22의 단일 또는 다중 불포화, 포화 또는 이와 독립적으로, 측쇄 또는 비측쇄 지방산 또는 하이드록시 지방산이고, R²는 Asp 또는 Asn이며, 단 R¹이이고 R²가 Asp인 서열식(Ⅰ)의 리포펩타이드는 제외한다.

2. 악티노플레인스종을, 하기로 이루어진 그룹 중의 하나 이상의 리포펩타이드가 배양배지에 축적될 때까지 배양 배지내에서 발효시키고, 경우에 따라, 하나 이상의 이들 리포펩타이드를 배양 배지로부터 정제시킨 리포펩타이드:

a) iC₁₃- 지방산-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro,

b) iC₁₄- 지방산-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro,

c) iC₁₃- 지방산-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro,

d) iC₁₄- 지방산-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro,

e) aiC₁₃- 지방산-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro,

f) aiC₁₅- 지방산-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro,

g) aiC₁₅- 지방산-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro,

h) nC₁₂- 지방산-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro,

i) nC₁₃- 지방산-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro,

j) nC₁₄- 지방산-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro.

3. 서열식(Ⅱ)의 리포펩타이드

상기식에서,

4. 악티노플레인스종을, 하나 이상의 리포펩타이드가 배양 배지내에 축적될 때까지 배양 배지내에서 발효시키고, 경우에 따라, 하나 이상의 리포펩타이드를 배양 배지로부터 정제시킴을 특징으로 하여, 상기 1에서 정의한 하나 이상의 서열식(Ⅰ)의 리포펩타이드, 상기 2에서 정의한 하나 이상의 리포펩타이드, 또는 상기 3에서 정의한 하나 이상의 서열식(Ⅱ)의 리포펩타이드를 제조하는 방법.

5. 약리학적 활성 물질로서, 특히 그램-양성 세균, 특히 바람직하게는 글리코펩타이드-내성 세균에 대한 항생제로서의 서열식(Ⅰ)의 리포펩타이드의 용도.

6. 약리학적 활성 물질로서, 특히 그램-양성 세균, 특히 바람직하게는 글리코펩타이드-내성 세균에 대한 항생제로서의 서열식(Ⅲ)의 리포펩타이드의 용도.

상기식에서, R¹은이고, R²는 Asp이다.

7. 악티노플레인스종 DSM 7358.

본 발명은 특히 이의 바람직한 양태로 하기에 상세하게 기술된다. 본 발명은 특허청구범위의 기술사항에 의해 추가로 정의된다.

용어 정의:

Dab: 2,3-디아미노부티르산;

Pip:피페콜산(유사어 = 호모프롤린);

MeAsp : β-메틸아스파르테이트;

Gly: 글리신;

Asn: 아스파라긴;

Asp: 아스파르트산;

Val: 발린;

Pro: 프롤린;

n: 정상/비측쇄

CID: 충돌 유도된 분해.

약호 i는 이소를, ai는 앤티-이소(ante-iso)를 의미한다. 이들 정의는 지방산의 맥락에서 숙련가에게 공지되어 있다[참조; Biochemistry, Zubay, published by Addison Wesley in London, Amsterdam, 1983].

달리 지시하지 않는한, 모든 % 데이타는 중량에 관한 것이다. 달리 지시하지 않는한, 액체 혼합비는 용적과 관련된다.

본 발명에 따른 방법은 실험실 규모(ml 내지 ℓ 영역)의 발효 및 산업적 규모(㎥ 규모)로 사용될 수 있다.

악티노플레인스종을 토양 샘플로부터 분리한다. 토양으로부터의 정제를 위해 생리학적 NaCl 용액(0.9%)을 사용하여 토양을 현탁시켜 일련의 희석물을 제조한다. 다양한 희석물(10⁰-10⁶)을 연속적으로 악티노마이세스 영양 배지상에 도말한다. 배양물을 30℃에서 2 내지 14일간 배양하여 악티노마이세스 콜로니를 수득하고, 이를 도말하고 다수의 연속 정제 단계로 이를 분리한다.

숙련가에게 공지된 방법을 사용하여 형태학적 및 분류학적 기준을 토대로 하여 속을 결정한다. 악티노플레인스 속의 특징적인 특성은 이동성 포자이다.

연속적 분리 및 정제 단계를 기본으로 하여, 악티노플레인스종으로부터 본 발명에 따른 하나 이상의 리포펩타이드 화합물, 바람직하게는 리포펩타이드 A 1437 A, B, C, D, E, F, G, H, K, L 및/또는 M을 배양 배지내로 효과적으로 방출하는 콜로니를 분리할 수 있고 이를 주요 생산자로 일컫는다.

주요 생산자란 본 발명에 따른 하나 이상의 리포펩타이드 화합물을 동일한 악티노플레인스종의 분리물의 경우 보다 10 내지 100배의 양으로 생산하거나 배양배지로 방출하는 분리물을 의미한다.

악티노플레인스종의 강력한 생산 콜로니가 증식되었다. 이 분리물은 부다페스트 조약하에 1992년 12월 16일 기탁기관[Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, 3300 Braunschweig, Germany]에 악티노플레인스종 DSM 7358로 기탁되었다.

악티노플레인스종 DSM 7358은 오렌지색 균사체를 가지며 구형 포자낭에 의해 특징지워진다.

탄소 공급원 및 질소 공급원 및 통상의 무기염을 함유하는 영양용액(또한 배양배지라고도 함) 중에서, 악티노플레인스종, 바람직하게는 DSM 7358은 본 발명에 따른 하나 이상의 리포펩타이드 화합물을 생산한다.

또한 균주 DSM 7358 대신 본 발명에 따른 하나 이상의 리포펩타이드 화합물을 합성하는 이의 돌연변이체 및 변이체를 사용하는 것이 가능하다. 이러한 유형의 돌연변이체는 공지된 방법에 의해, 즉 물리적 수단, 예를 들면 자외선 또는 X-선과 같은 조사에 의해, 또는 화학적 돌연변이원, 예를 들면 에틸 메탄설포네이트(EMS), 2-하이드록시기-메톡시벤조페논(MOB) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG)에 의해 생성될 수 있다.

본 발명에 따른 하나 이상의 리포펩타이드 화합물을 합성하는 돌연변이체 및 변이체의 스크리닝은 하기 개요에 따라 이루어진다:

발효후 균사체 제거;

pH 1 내지 2, 4℃에서 리포펩타이드의 침전;

H₂O/MeOH(1:1)중 침전물의 용해;

HPLC, TLC 또는 억제 영역 시험에 의한 분석

하기 기술하게될 발효 조건은 악티노플레인스종, 기탁된 분리물 DSM 7358 및 돌연변이체 및 변이체에 적용된다.

탄소 공급원 및 질소 공급원 및 통상의 무기염을 함유하는 영양용액 중에서, 악티노플레인스종, 바람직하게는 DSM 7358은 본 발명에 따른 하나 이상의 리포펩타이드 화합물, 바람직하게는 리포펩타이드 A 1437 A 내지 H 및 K, L 및 M을 생산한다.

호기성 발효에 바람직하고 적합한 탄소 공급원은 동화성 탄수화물 및 당 알콜(예: 글루코스, 락토오스 또는 D-만니톨) 및 탄수화물-함유 천연 생성물(예: 맥아 추출물)이다. 적합한 질소-함유 영양소에는 아미노산, 펩타이드 및 단백질과 이들의 분해 생성물(펩톤 또는 트립톤); 추가로 고기 추출물; 예를 들면 옥수수, 밀, 콩, 대두 또는 목화 작물의 분쇄된 종자; 알콜 생성물로부터의 증류잔사; 고기 분말(meat meal) 또는 효모 추출물; 또는 암모늄염 및 질산염이 있다. 영양용액이 함유할 수 있는 무기염은 예를 들면, 알칼리금속 또는 알칼리 토금속, 철, 아연, 코발트 및 망간의 염산염, 탄산염, 황산염 또는 인산염이다.

본 발명에 따른 리포펩타이드의 제조는 특히, 약 0.1 내지 5%, 바람직하게는 0.3 내지 2% 고기 추출물 및 0.2 내지 5%, 바람직하게는 0.5 내지 2% 슈크로스 및 0.05 내지 5g/ℓ, 바람직하게는 0.1 내지 0.5g/ℓ 효모 추출물 및 0.05 내지 2g/ℓ, 바람직하게는 0.1 내지 1g/ℓ 황산마그네슘 및, 0.05 내지 10g/ℓ, 바람직하게는 0.1 내지 1g/ℓ 이인산수소화 칼륨 또는 나트륨 및 0 내지 100μM, 바람직하게는 5 내지 20μM 염화제이철을 함유하는 영양용액중에서 특히 잘 이루어진다. %데이타는 각각의 경우 완전 영양용액의 중량을 기준으로 한다.

이러한 영양용액 중에서, 악티노플레인스종, 바람직하게는 악티노플레인스 DSM 7358은 본 발명에 따른 리포펩타이드 혼합물을 생산한다. 혼합물은 바람직하게는 11가지 상이한 검출가능한 리포펩타이드로 구성된다. 이들 리포펩타이드는, A, B, C, D, E, F, G, H, K, L 및 M으로 불리운다. 이들은 하기 특성을 나타낸다.

리포펩타이드 A 1437 A는 A 1437 C와 마찬가지로, 현재까지의 암포마이신 유형의 리포펩타이드에서는 공지되어 있지 않았던 이소-C₁₃지방산을 함유한다. A 1437 A의 아미노산 서열은 암포마이신의 아미노산 서열과 상응하지만, 앤티-이소-C₁₃-지방산을 함유한다. A 1437 C의 아미노산 조성 및 서열은 다른 리포펩타이드로부터는 공지되어 있지 않다.

A 1437 B는 A 1437 D에서와 마찬가지로, 이소-C₁₄유형의 지방산, 즉 쓰시마이신으로부터 공지된 지방산을 함유한다. 하지만, A 1437 D는 선행분야에서 공지된 리포펩타이드와 아미노산 조성 및 서열에 있어 상이한 반면, A 1437 B는 암포마이신의 아미노산 서열을 함유한다. 문헌에 따르면, 암포마이신, 자오마이신 및 쓰시마이신은 아미노산 조성에 있어 동일하다.

악티노플레인스종, 특히 악티노플레인스 DSM 7358로부터의 A 1437 E는 스트렙토마이세스로부터의 공지된 암포마이신과 동일하다.

A 1437 F는 앤티-이소-C₁₃-지방산을 포함함으로써, 암포마이신으로부터 공지된 바와 동일한 유형의 지방산을 함유한다. 이의 아미노산 서열 및 조성은 선행분야로부터 공지되어 있지 않다.

리포펩타이드 A 1437 G 및 A 1437 H는 각각, 아스파르 토신에서와 마찬가지로, 앤티-이소-C₁₅-지방산을 갖는다. A 1437 G의 아미노산 서열은 암포마이신의 서열과 상응한 반면, A 1437 H의 서열 및 조성은 선행분야로부터 공지되어 있지 않다.

A 1437 K, L 및 M은 C₁₂내지 C₁₄쇄길이의 비측쇄화 지방산을 갖는다. 언급한 3가지 리포펩타이드의 아미노산 서열은 암포마이신의 아미노산 서열과 상응한다.

리포펩타이드 A 1437 A 내지 H는 모두 아미노 말단에 위치한 Dab의 β-아미노 작용기로의 C-말단 프롤린의 카복실 작용기의 결합을 갖는다. 이 결합은로 표현된다.

본 발명에 따른 하나 이상의 리포펩타이드의 정량면에서의 함량은 영양 용액 조성에 따라 매우 다양할 수 있다. 또한, 배지 조성에 의해 각각의 리포펩타이드의 합성을 조절함으로써 미생물은 리포펩타이드를 전혀 생산하지 않거나 검출 한계 이하의 양으로 리포펩타이드를 생산할 수 있다.

악티노플레인스종, 바람직하게는 DSM 7358로부터의 배양 배지는 단일 또는 다중 불포화, 포화 또는, 이와 독립적으로, 측쇄화 또는 비측쇄화된, 탄소원자 6 내지 22개, 바람직하게는 탄소원자 10 내지 20개, 특히 바람직하게는 탄소원자 13, 14 또는 15개 쇄 길이의 지방산 또는 하이드록시 지방산을 갖는 리포펩타이드를 함유한다.

이러한 유형의 지방산은 문헌[참조; Rompp Chemie Lexikon, Prof. Falbe and Prof. Regitz, 9th edition, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York 또는 The Encyclopedia of Chemistry, C.A. Hempel and G.G. Hawley, 3rd edition, Van Nostrand Reinhold Company, New York]으로부터 숙련가들에게 공지되어 있다.

하기 지방산 리스트는 실시예를 통해 어떠한 것도 완전하게 청구하지 않으며 제한적이지 않다.

본 발명에 따른 리포펩타이드에 대한 포화된 비측쇄화 지방산의 예는 카프론산, 에난틴산, 카프릴산, 펠라르곤산, 카프린산, 운데칸산, 라우르산, 트리데카노산, 미리스틴산, 펜타데카노산, 팔미트산, 마아가린산, 스테아린산, 노나데카노산, 아라킨산 및 베헨산이다.

본 발명에 따른 리포펩타이드상의 포화 측쇄화 지방산의 예는 이소부티르산 또는 이소발레르산 또는 앤티-이소 배위의 상응하는 산이다.

본 발명에 따른 리포펩타이드상의 단일 불포화 비측쇄화 지방산의 예는 아크릴산 또는 크로톤산이다.

본 발명에 따른 리포펩타이드상의 이중 불포화된 비측쇄화 지방산의 예는 소르빈산이다.

본 발명에 따른 리포펩타이드상의 삼중 불포화된 비측쇄 지방산의 예는 리놀렌산 또는 일레오스테아린산이다.

본 발명에 따른 리포펩타이드상의 4중 불포화 비측쇄화 지방산의 예는 아라키돈산이다.

본 발명에 따른 리포펩타이드상의 5중 불포화 비측쇄화 지방산의 예는 클루파노덴산이다.

본 발명에 따른 리포펩타이드상의 6중 불포화 비측쇄화 지방산의 예는 도코사헥사에노산이다.

추가로, 다중적으로 측쇄화된 지방산(예: 2,4,6,8-테트라메틸데카노산)을 갖는 리포펩타이드가 또한 배양 배지중에 생성될 수 있다.

본 발명에 따른 리포펩타이드상의 하이드록시 지방산의 예는 탄소쇄의 제2 및 3 및/또는 말단의 위치에서 하이드록실화되고 이소 또는 앤티-이소 배위를 갖는 지방산이다.

상기한 영양 용액에 0.01 내지 5%, 바람직하게는 0.02 내지 0.1% L-발린 첨가시, 균주 악티노플레인스종은 리포펩타이드 A 1437 B 및 D를 우선적으로 생산한다. 상기한 영양 용액에 0.01 내지 5%, 바람직하게는 0.1 내지 0.5% L-류신 첨가시, 균주 악티노플레인스종은 리포펩타이드 A 1437 A 및 C를 우선적으로 생산한다. 상기한 영양 용액에 0.01 내지 5%, 바람직하게는 0.05 내지 0.5% L-이소로이신 첨가시, 균주 악티노플레인스종은 특히 리포펩타이드 A 1437 E, F, G 및 H를 생산한다. 상기한 영양 용액에 0.01 내지 5%, 바람직하게는 0.05 내지 0.5% L-α-아미노부티르산 첨가시, 균주 악티노플레인스종은 리포펩타이드 K를 우선적으로 생산한다. 상기한 영양 용액에 0.01 내지 5%, 바람직하게는 0.05 내지 0.5%, L-노르발린 첨가시, 균주 악티노플레인스종은 리포펩타이드 L 및/또는 M을 우선적으로 생산한다. 바람직한 균주 DSM 7358에도 동일하게 적용된다.

이들 아미노산 이외에도 적절한 농도의 상기 아미노산에 상응하는 α-케토산 (α-케토이소발레레이트, α-케토이소카프로에이트, α-케토-β-메틸발레레이트, α-케토발레레이트) 또는 이의 상응하는 산(이소부티레이트, 이소발레레이트, α-메틸부티레이트, n-부티레이트, 프로피오네이트, 발레레이트) 또는 지방산 생합성을 방해할 수 있는 기타 물질을 사용할 수 있다.

미생물 배양은 호기적으로, 즉, 예를 들면 진탕 플라스크 또는 발효조내에서, 경우에 따라 공기 또는 산소를 도입하며 진탕시키거나 교반시키며 잠수시킨 상태에서 이루어진다. 이는 약 18 내지 35℃, 바람직하게는 약 25 내지 35℃, 특히 28 내지 32℃의 온도범위에서 수행될 수 있다. pH 범위는 6 내지 8, 바람직하게는 6.5 내지 7.5이어야한다. 미생물은 이러한 조건하에 통상 24 내지 300시간, 바람직하게는 36 내지 140시간 동안 배양된다.

배양은 유리하게는 여러 단계로 수행되는데, 즉, 먼저 하나 이상의 예비배양 물을 액체 영양 배지중에서 제조한 후 실제 생산배지인 주요 배양물로 예를 들면 1:10의 용적비로 옮긴다. 예비 배양물은, 예를 들면 균사체를 영양 용액으로 옮기고 이를 약 36 내지 120시간, 바람직하게는 48 내지 72시간 동안 생장시킴으로써 수득된다. 균사체는, 예를 들면 균주를 약 3 내지 40일, 바람직하게는 4 내지 10일 동안, 고체 또는 액체 영양 배지, 예를 들면 효모-맥아 한천 또는 영양 브로쓰 한천(주요 성분으로 펩톤, 염화나트륨 및 한천이 가해진 미생물용 표준 배지 Difco 제공)상에서 성장시킴으로써 수득될 수 있다.

발효 진행은 배양물의 pH 또는 균사체의 용적 및 크로마토그래피 방법, 예를 들면 박층 크로마토그래피 또는 고압 액체 크로마토그래피에 의해, 또는 생물학적 활성을 시험함으로써 모니터될 수 있다. 균사체 및 배양 여액 모두 본 발명에 따른 큰 화합물을 함유하지만, 대부분(90% 이상)이 배양 여액중에 존재한다.

하기 기술하는 분리 방법을 사용하여 본 발명에 따른 리포펩타이드, 바람직하게는 리포펩타이드 A 1437 A 내지 H 및 K, L 및 M을 정제한다.

배양 배지로부터 본 발명에 따른 리포펩타이드의 분리 또는 정제는 천연 물질의 화학적, 생리학적 및 생물학적 특성을 고려하여 공지의 방법으로 수행된다. 배양 배지 또는 각각의 분리 단계에서의 항생제 농도는 예를 들면 실리카겔 상에서 이동상으로서 이소프로판올/25% 농도의 NH₃을 사용하는 박층 크로마토그래피 또는 HPLC에 의해 시험할 수 있다. 박층 크로마토그래피에 의한 분획화에 있어, 예를 들면 아니스 알데하이드와 같은 발색 시약으로 검출하는데, 이 경우 생산된 물질의 양을 보정 용액과 비교하는 것이 편리하다.

본 발명에 따른 리포펩타이드를 분리하기 위하여, 균사체를 먼저 배양 브로쓰로부터 통상의 방법에 의해 분리한 후, 연속적으로 배양 여액을 바람직하게는 4℃ 및 pH 0.5 내지 pH 4, 바람직하게는 pH 1.5 내지 pH 2.5로 조정한다. pH 조절로 인한 리포펩타이드 A 1437의 침전은 모든 시판되는 산에 의해 발생할 수 있다. 용액을 16시간까지, 바람직하게는 4시간까지 배양하고, 연속적으로 수득된 침전물을 원심분리에 의해 제거한다.

모든 리포펩타이드를 함유하는 침전물을 2회 증류시킨 물의 본래 용적의 1/20 중에 재현탁시키고 NaOH로 pH 6 내지 7로 조정한다. 이로써 침전물은 완전히 용해되고, 용액을 -20℃로 냉각후 동결건조시킨다. 이후 조생성물로 지칭되는 동결 건조물은 5 내지 30% 리포펩타이드를 함유하고, 연속적인 분리에 사용한다.

본 발명에 따른 하나 이상의 리포펩타이드의 추가 정제는 적합한 물질, 바람직하게는, 예를 들면 실리카겔, 산화알루미늄, 이온교환기 또는 흡수 수지 및 특히 바람직하게는 강 염기성 또는 약염기성 음이온 교환기 상에서 크로마토그래피하여 수행한다. 아미노 말단에 위치한 아미노산으로서 Asp 또는 Asn을 함유하는 리포펩타이드는 이러한 크로마토그래피를 통해 분리된다. 리포펩타이드의 크로마토그래피를 완충 수용액 또는 수성 및 알콜성 용액의 혼합물로 수행한다.

완충 수용액은, 예를 들면, 물, 0 내지 1M, 바람직하게는 1 내지 100mM 농도의 인산염 완충액, 아세트산암모늄, 시트레이트 완충액, 보레이트 완충액을 의미하고, 1 내지 100mM 농도의 인산염 완충 용액이 특히 바람직하게 사용된다.

수성 또는 알콜성 용액의 혼합물은 물과 혼화성인 모든 유기용매, 바람직하게는 10 내지 80% 용매, 바람직하게는 40 내지 60% 용매 농도의 메탄올, 아세토니트릴 또는 유기용매와 혼화성인 그밖의 모든 완충 수용액을 의미한다. 사용되는 완충액은 상기한 바와 동일하다.

상이한 지방산을 기준으로 하는 리포펩타이드의 분리는 예를 들면 MCI(일본국, 미쓰비시사의 흡수 수지)상에서 역상 크로마토그래피를 사용하여 수행한다. 소수성 물질상에서의 역상 크로마토그래피, 바람직하게는 RP-8 또는 RP-18상 크로마토그래피가 특히 바람직하다. 또한, 실리카겔 크로마토그래피를 사용하여 분리를 수행할 수 있다.

리포펩타이드의 크로마토그래피는 완충되거나 산성화된 수용액 또는 수용액과 알콜 또는 물과 혼화성인 기타 유기 용매와의 혼합물을 사용하여 수행한다. 아세토니트릴을 유기용매로서 사용하는 것이 바람직하다.

완충되거나 산성화된 수용액은 예를 들면, 0 내지 0.5M 농도의 물, 인산염 완충액, 아세트산암모늄, 시트레이트 완충액, 보레이트 완충액 및 바람직하게는 0 내지 1% 농도의 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산 또는 당해 숙련가에게 공지된 모든 시판되는 산을 의미한다. 0.1% 농도가 특히 바람직하다.

크로마토그래피는 100% 물로 출발하여 100% 용매로 종결하는 구배로 수행하는데, 40 내지 60% 아세토니트릴 선형 구배가 바람직하게 적용된다.

2가지 상기한 크로마토그래피(아미노산 Asp 또는 Asn 및 지방산 유형에 따른 리포펩타이드를 분리하는 크로마토그래피)의 순서는 역전될 수 있다. 제1단계에서 상이한 아미노산에 따라 리포펩타이드를 분리하고 연속적으로 지방산 유형에 따라 이들을 분리하는 것이 바람직할 수 있다.

상기한 조생성물이 동일한 지방산을 갖는 리포펩타이드를 함유하는 경우, 상기 크로마토그래피(상이한 지방산을 기초로 하는 리포펩타이드의 분리)를 사용하여 리포펩타이드를 탈염시키고 좀 더 정제한다.

가능한 대안은 또한 겔 크로마토그래피 또는 소수성 상 위에서의 크로마토그래피이다.

겔 크로마토그래피는 폴리아크릴아미드 또는 혼합된 중합체 겔, 즉, 예를 들면 바이오겔(Biogel)-P2(Biorad 공급) 또는 프락토겔(Fractogel) TSK HW40(Merck, Germany or Toso Haas, USA 공급)상에서 수행한다.

본 발명에 따른 리포펩타이드는 pH 4 내지 8, 특히 5 내지 7 범위의 용액 및 고체상태에서 안정하므로, 통상의 약제학적 제형으로 혼입될 수 있다.

본 발명에 따른 하나 이상의 리포펩타이드 화합물은 중요한 약리학적 특성으로 인해 약제로서 사용하기에 적합하다.

본 발명에 따른 물질은 그램-양성 세균, 특히 바람직하게는 글리코펩타이드-내성 균주에 대한 항생제로서 약리학적 활성을 갖는다.

항생제에 대한 추가의 내성을 나타내는 페니실린- 또는 메티실린-내성 균주(MRSA 균주)에 대한 치료학적으로 적절한 작용은 반코마이신 또는 테이코플라닌 같은 글리코펩타이드에 의해서만 종종 소유된다. 하지만, 이들 항생제에 대해 내성을 갖는 균주가 더욱 많이 나타나고 있다[참조; FEMS Microbiol. Lett. 98(1992) 109 to 116]. 본 발명에 따른 하나 이상의 리포펩타이드 화합물은 이러한 문제의 유기체에 대해 탁월한 효과를 또한 나타낸다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 하나 이상의 리포펩타이드 화합물의 약제학적 제형에 관한 것이다.

원칙적으로 본 발명에 따른 하나 이상의 리포펩타이드 화합물, 바람직하게는 하나 이상의 리포펩타이드 A 1437 A-H 화합물을 비희석된 상태 그대로 투여할 수 있다. 적합한 보조 물질 또는 담체 물질과 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다. 가축 약제인 경우 사용될 수 있는 담체 물질은 통상의 사료 혼합물을 포함하고, 사람 약제인 경우 모든 약제학적 혼화성 담체 물질 및/또는 보조 물질을 포함한다.

본 발명에 따른 약제는 일반적으로 경구 또는 비경구적으로 투여되며, 직장 투여도 또한 원칙적으로 가능하다. 적합한 고체 또는 액체 약제학적 제제의 예에는 입제, 산제, 정제, 제피정제, (마이크로)캅셀, 좌약, 시럽, 유제, 현탁제, 에어로졸, 점적제 또는 앰풀형태의 주사액제가 있으며, 또한 활성물질을 지속적으로 방출시키는 제품으로써, 이의 제조시 보통 비히클 및 부가제 및/또는 보조제, 즉 붕해제, 결합제, 피복제, 팽윤제, 활탁제 또는 윤활제, 향미제, 감미제 또는 가용화제가 사용되는 제품도 포함된다. 빈번히 사용되는 것으로서 언급될 수 있는 비히클 또는 보조물질의 예에는 탄산마그네슘, 이산화티탄, 락토오스, 만니톨 및 기타 슈가, 탈크, 락트알부민, 젤라틴, 전분, 비타민, 셀룰로스 및 이의 유도체, 동물성 또는 식물성 오일, 폴리에틸렌글리콜 및 용매(예: 멸균수, 알콜, 글리세롤 및 다가 알콜)가 있다.

적절한 경우, 경구투여를 위한 투여 단위인 경우, 예를 들면 미립자 형태의 활성물질을 적합한 중합체 또는 왁스등에 매몰 또는 피복시켜 마이크로캅셀화함으로써 장시간에 걸쳐 방출을 지연시키거나 연장시킬 수 있다.

약제학적 생성물은, 각각의 단위가 활성성분으로서 특정 용량의 본 발명에 따른 하나 이상의 리포펩타이드 화합물을 함유하는 투여 단위로 제조되고 투여됨이 바람직하다.

정제, 캅셀 및 좌약과 같은 고체 투여형인 경우, 이러한 용량은 1일 약 200mg 이하일 수 있으나, 바람직하게는 약 0.1 내지 100mg이고, 앰풀형태의 주사액제인 경우, 1일 약 200mg 이하, 바람직하게는 약 0.5 내지 100mg일 수 있다.

투여되는 1일 용량은 포유동물의 체중, 연령, 성별 및 질환에 의존한다. 하지만, 특정한 경우에 있어, 보다 높거나 낮은 1일 용량 또한 적절할 수 있다. 1일 용량의 투여는 단일 투여 단위 형태로 단일투여하거나 보다 적은 투여 단위로 다중 투여하거나 또는 특정 간격을 두고 분할된 용량을 다중 투여함으로써 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 약제는 본 발명에 따른 하나 이상의 리포펩타이드 화합물을 통상의 비히클 및 경우에 따라 부가제 및/또는 보조물질을 사용하여 적합한 투여형으로 전환시켜 제조한다.

[독성 시험 데이타]

본 발명에 따른 리포펩타이드 A 1437 D는 마우스에 정맥내 적용시킨 경우 LD₅₀값이 140mg/kg이었다. 통상적 투여용량에서 본 발명의 화합물은 무-독성이었다.

리포펩타이드 항생제의 추가의 독성 특징은 시험관내 용혈 활성에서 보다 명확히 밝혀진다.

[시험관내 용혈의 측정]

붉은털 원숭이의 신선한 정맥 혈액을 사용하여 용혈 활성을 측정한다. 당해 혈액을 헤파린으로 처리된 시험관내에 수집하고, 12개의 폴리에틸렌 시험관에 200㎕ 분액으로 분배한다. 1분액은 증류수 200㎕에 가하고(100% 표준물), 1분액은 생리학적 염수 용액(0.9% NaCl) 200㎕와 혼합한다(0% 표준물) 3200, 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 및 6.25mg/ℓ 농도의, 생리학적 염수 용액중의 본 화합물의 희석액 200㎕을 나머지 시험관에 가한다. 상기 시험관들을 부드럽게 교반한 후 37℃에서 3시간 동안 항온처리한다. 항온처리 후 증류수 5ml를 상기 100% 표준물에 가하고 생리학적 염수 5ml를 나머지 시험관에 가한다. 이후, 모든 시험관을 5분간 700g로 원심분리한다. 분광계(파장 540nm)로 상층액의 흡광도를 측정하여 용혈을 측정한다. 완전히 용혈되는 상기 표준물의 흡광도의 등급을 100%로 정한다. 시험 화합물의 희석액 및 0% 표준물의 흡광도를 측정하여 양성 표준율(%)로서 등급을 매긴다(최대 유도성 용혈).

리포펩타이드 A 1437 B 및 A 1437 D의 용혈 활성에 대한 디아그램은 하기와 같다:

본 발명은 하기 실시예에서 좀더 설명된다. % 데이타는 중량에 관한 것이다. 달리 명시하지 않는한, 액체의 혼합비는 용적에 관한 것이다.

[실시예]

1a)악티노플레인스종 DSM 7358의 글리세롤 배양물 제조

멸균된 300ml 삼각 플라스크내의 영양 용액(4g/ℓ 효모 추출물, 15g/ℓ 가용성 전분, 1g/ℓ KHPO, 0.5g/ℓ MgSOx 7HO 및 물로 1000ml가 되게한다. 멸균전 pH 7.0) 100ml에 균주 악티노플레인스종 DSM 7358을 접종하고 30℃, 150rpm의 회전 진탕기상에서 7일간 배양한다. 이 배양물 1.5ml를 연속적으로 80% 농도의 글리세롤 2.5ml로 희석시킨 후 -20℃에서 저장한다.

1b)삼각 플라스크중의 악티노플레인스종 DSM 7358의 예비배양물 또는 배양물의 제조

영양 용액(30g/ℓ 슈크로스, 2g/ℓ KNO, 1g/ℓ KHPO, 0.5g/ℓ MgSOx 7HO, 0.5g/ℓ KCl, 0.01g/ℓ FeSOx 7HO, 2g/ℓ 효모추출물, 5g/ℓ 펩톤) 100ml를 함유하는 멸균 300ml 삼각 플라스크에 사면관에서 생장시킨 배양물(2% 한천이 가해진 동일한 영양 용액) 또는 글리세롤 배양물(실시예 1a) 1ml를 접종하고 진탕기내에서 180rpm으로 30℃에서 배양한다. 약 120시간후에 본 발명에 따른 하나 이상의 리포펩타이드 화합물 최대 생산이 이루어진다. 동일 영양 용액 보다 48 내지 96시간 더 숙성된 침수 배양물(약 10% 접종물)은 10 내지 200ℓ 발효조를 접종하기에 충분하다.

2) 악티노플레인스종 DSM 7358의 비교 특성화

균주 악티노플레인스종 DSM 7358은 셜링 및 고틀리엡 ISP 방법[참조; Shirling and Gottlieb ISP method, Int. J. of Sys. Bacteriol. 16, 3(1966) 313-340]에 의해 밀관된 균주를 사용한 비교에 의해 특성화된다. 결과(표 2)는 균주 악티노플레인스종 DSM 7358이 기타 균주와 형태학적으로 및 그의 생리학적인 면에 있어 상이함을 나타낸다.

3a) 리포펩타이드 A 1437 B 및 D의 제조

500ℓ 발효조를 하기 조건하에 작동시킨다:

영양배지: 11g/l 슈크로스

6g/l 고기 추출물

0.3g/l 효모 추출물

0.6g/l MgSO

0.1g/l KHPO

10μM FeClx 6HO

0.6g/l L-발린

pH 7.3(멸균전)

배양시간: 120시간

배양온도: 30℃

교반기 속도: 50rpm

공기공급: 150l/분

기포형성은 에탄올성 폴리올 용액을 반복하여 가함으로써 억제될 수 있다. 약 96 내지 120시간후에 최대생산이 이루어진다.

악티노플레인스종 DSM 7358의 발효가 완결된 후, 배양 브로쓰를 약 2%, 여과 보조물(예를 들면 셀라이트(Celite))을 가하여 여과시키고 배양 여액을 4℃로 냉각시킨 후 pH를 1.5로 조정한다. 4시간후, 혼합물을 10,000g로 원심분리시키고 침전물을 증류수 중에서 재현탁시킨다. 현탁액을 중성화하여 상기 물질을 용액으로 만든다. 용액을 동결시키고 건조시킨다. 수율은 조생성물 약 1.5g/ℓ(=750g)이다.

3b) 이온 크로마토그래피에 의한 조생성물(B + D 함유)의 분획화

3.2ℓ 크로마토그래피 컬럼(10cm IDx40cm H)을 DEAE-^R세파로스 패스트 플로우로 충전시키고 40% 메탄올중 10mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0, 완충액 A)으로 평형화한다. 그런 다음, 물 3.5ℓ 중에 용해된 A 1437 B 조생성물(실시예 3a와 같이 수득) 25g을 컬럼상에 로오딩하고 물 1ℓ, 이후 완충액 A 6ℓ로 세척한다. 조생성물중의 불순물은 유동 투과물(flow-through) 및 수성 세척물 중에 존재한다. 연속적으로, 40% 메탄올 중 10 내지 100mM 인산칼륨(pH 7.0)구배를 적용한다. A 1437 D 펩타이드를 25 내지 35mM 인산칼륨으로 용출시키고, 항생제 A 1437 B를 40 내지 55mM 인산칼륨으로 수득한다. 적절한 분획으로부터 진공 중에서 메탄올을 제거한다. 1ℓ 용량의 컬럼[Dianion HP-20 컬럼, Mitsubishi, Japan]을 탈염하는데 사용한다. 순수한 B 펩타이드를 함유하는 분획 9ℓ를 컬럼상으로 로오딩하고 연속하여 탈이온수 3ℓ로 세척한다. 물/이소프로판올을 구배방법(0 내지 50% 알콜 함량)에 의해 용출을 위해 사용한다. 순수한 A 1437 B를 15 내지 25% 이소프로판올로 지지체로부터 세척 제거한다. 컬럼으로부터의 이러한 용출액을 별도로 수집하고, 진공농축하여 동결건조시킨다. 결과는 순도 97%인 A 1437 B 4.8g이다. A 1437 D를 함유하는 분획을 상응하게 탈염시켜 항생제 3.1g을 수득한다(순도 98%).

4a) 리포펩타이드 A 1437 및 C의 제조

생산배지 중의 L-발린을 4g/ℓ L-류신으로 대체하고 50ℓ 생반응기내에서 발효를 수행하는것 이외에 3a에 기술한 바와 같이 제조한다. 수율은 1.3g/ℓ 조 펩타이드이다(=65g)이다.

4b) 리포펩타이드 A 1437 A 및 C의 분리

조생성물 10g을 증류수 100ml중에 용해하고 하기 개략도에 따라 후처리한다.

후처리개략도:

증류수 100ml중 조 펩타이드 10g

↓

Q-세파로스 패스토 플로우(Pharmacia 공급)(5 x 20cm 컬럼)상에 흡착

↓

하기 구배에 따라 용출:

완충액 A: 50% 메탄올중 1mM NaH₂PO₄, pH 5.9

완충액 B: 50% 메탄올중 100mM NaH₂PO₄, pH 5.3

20분: 완충액 A → 60분후 25% 완충액 B, 추가로 30분후 25% 완충액 B에서;

A 1437 A 및 C 분획의 동결건조 및 이동상중 용해

↓

바이오래드에 의해 공급된 바이오겔 P2(Biogel P2, 100 내지 200메쉬, 7 x 20cm 컬럼)상에서 탈염

↓

1.6g의 리포펩타이드 A 1437 A(80% 순도) 1.2g의 리포펩타이드 A 1437 C(80% 순도)

↓

뉴클레오실(Nucleosil) C18(7㎛)상에서 RP 크로마토그래피(20x250mm 컬럼, 200mg 로오딩)

하기 구배로 용출:

완충액 A: 2회 증류시킨 물, 0.1% TFA

완충액 B: 아세토니트릴

10분: 완충액 B → 60분 후 10ml/분의 유속에서 90%, 완충액 B로

A 1437 A 및 C 분획의 동결건조

↓ ↓

A 1437A(순도95%) 150mg, A 1437 C(순도95%) 154mg

5a) 리포펩타이드 A 1437 E, F, G 및 H의 제조

생산 배지중의 L-발린을 1.5g/ℓ L-이소루이신으로 대체하고 50ℓ 생반응기 내에서 발효를 수행하는 것을 제외하고 실시예 3a에 기술한 바와 같이 제조한다. 수율은 조 펩타이드 1.4g/ℓ(70g)이다.

5b) 이온 크로마토그래피에 의한 조 펩타이드의 분획화

실시예 5a에서와 같이 수득된 리포펩타이드 조 생성물 25g을 실시예 3a에 기술된 컬럼상에서 실시예 3a에 따라 분획화한다.

리포펩타이드 A 1437 F(수율: 1.8g)를 14 내지 19mM 완충액으로 용출시키고, A 1437 E(수율: 1.3g)을 18 내지 25mM 완충액으로 용출시키며, A 1437 H(수율: 2,7g)을 35 내지 50mM 완충액으로 용출시키고, A 1437 G(수율: 1.9g)을 64 내지 82mM 완충액으로 용출시킨다.

상응하는 분획을 합하고 메탄올을 진공하에 제거한다.

5c) 역상 RP-18상에서 실시예 5b로부터의 성분 정제

500ml 용량의 예비 HPLC 컬럼(5.1cm(ID) x 25cmH)을LiChrosorbG RP-18, 10㎛로 충전하고 항생제 A 1437 G 1.9g을 함유하는 염-함유 용액을 로오딩한다. 10mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)중 5% 아세토니트릴 내지 10mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)중의 36% 아세토니트릴을 사용한 구배 방법에 의해 용출시킨다. 리포펩타이드 A 1437 G는 24 내지 26% 아세토니트릴로 수득된다. 진공중에 농축시키고, 물/50% 이소프로판올 시스템중^RDianion HP-20 흡수 수지 100ml상에서 탈염시키고 동결-건조시킴으로써 순도 99%의 리포펩타이드 A 1437 G 1.1g을 수득한다.

실시예 5b에서와 같이 수득한 A 1437 H 용액의 상응하는 연속 정제는 10mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 중 10 내지 50% 아세토니트릴의 용매 구배로 수행된다. 항생제를 37 내지 39% 함량의 용매로 용출시킨다. 적절한 분획을 농축시키고Dianion; HP-20 상에서 탈염시키고, 동결건조하여 98%, 이상의 순도를 갖는 리포펩타이드 A 1437 H 2.2g을 수득한다.

5d) MCI 겔 상에서 실시예 5b로부터의 리포펩타이드 항생제 A 1437 E 및 F의 정제

실시예 5b에서와 같이 수득된 항생제 A 1437F 1.8g을 함유하는 염-함유 용액을 MCI 겔 CHP 20P(Mitsubishi Kasei Corp.) 1ℓ 상으로 로오딩한다. 컬럼 크기는 6cm ID x 35cm H이다. 지지체를 분리할 물질로 로오딩한 후 이를 완충액 A(5mM 인산칼륨 완충액, pH 7.0, 20% 아세토니트릴)로 세척하고 완충액 B(5mM 인산칼륨 완충액, pH 7.0, 70% 아세토니트릴)로 구배하는 방법으로 용출시킨다. 34 내지 35% 함량의 용매로 순수한 항생제를 용출시킨다. 진공농축하고Dianion HP-20 상에서 탈염하여 98% 이상의 순도로 리포펩타이드 A 1437 F 1.4g을 수득한다. 실시예 5a로부터의 A 1437 E 조 생성물로 유사한 절차를 거쳐 98% 이상의 순도로 리포펩타이드 A 1437 E 1g을 수득한다.

6a) 리포펩타이드 A 1437 K의 제조

생산 배지중의 L-발린을 500mg/ℓ L-α-아미노부티르산(또는 1g/ℓ 라세미체)으로 대체하고 10ℓ 생반응기 내에서 발효를 수행하는 것을 제외하고, 실시예 4a에서 기술한 바와 같이 제조한다. 수율은 조 펩타이드 1.1g/l(=10g)이다.

6b) 리포펩타이드 A 1437 K의 분리

조 생성물 10g을 증류수 100ml중에 용해시키고 하기 개략도에 따라 후처리한다.

후처리 개략도(A 1437 K)

- 증류수 100ml중 조 펩타이드 10g

- Q-세파로스 패스트 플로우상에 흡착(3.5 x 17cm 칼럼)

- 하기 구배로 용출

완충액 A: 50% 메탄올중 1mM NaH₂PO₄, pH 5.9

완충액 B: 50% 메탄올중 100mM NaH₂PO₄, pH 5.3

20분: 완충액 A → 45분 후 25% 완충액 B로, 추가로 25% 완충액 B에서 45분

- A 1437 K 분획의 동결 건조

바이오겔 P2(100 내지 200메쉬)(7 x 20cm 컬럼) 상에서 탈염

A 1437 K 700mg(60% 순도)

- 뉴클레오실 C₁₈7㎛(20 x 250mm 컬럼) 상에서 RP 크로마토그래피

로오딩: 예비정제된 생성물 50mg

하기 구배로 용출

완충액 A: 2회 증류된 물, 0.1% TFA

완충액 B: 아세토니트릴

10분: 완충액 A/5% 완충액 B→60분 후 10ml/분의 유속에서 70% 완충액 B로

- A 1437 K 분획의 동결 건조

A 1437 K 5.6mg(순도 95%)

7a) 리포펩타이드 A 1437 L 및 M의 제조

생산 혼합물중 L-발린을 500mg/ℓ L-노르발린(또는 1g/ℓ 라세미체)으로 대체하고 10ℓ 생반응기에서 발효를 수행하는 것을 제외하고, 실시예 4a에 기술한 바대로 제조한다. 수율은 조 펩타이드 1.2g/ℓ(=12g)이다.

7b) 리포펩타이드 A 1437 L 및 M의 분리

후처리개략도:

- 증류수 100ml중 조 펩타이드 10g

- Q-세파로스 패스트 플로우(3.5 x 17cm 컬럼) 상에 흡착

- 하기 구배로 용출:

완충액 A: 50% 메탄올중 1mM NaH₂PO₄, pH 5.9

완충액 B: 50% 메탄올중 100mM NaH₂PO₄, pH 5.3

- A 1437 L 및 M 분획의 동결 건조

- 바이오겔 P2(100 내지 200메쉬)(7 x 20cm 컬럼) 상에서 탈염

A 1437 L 및 M 900mg(약 60% 순도)

로오딩: 예비정제된 생성물 50mg

하기 구배로 용출:

완충액 A: 2회 증류된 물, 0.1% TFA

완충액 B: 아세토니트릴

10분: 완충액 A/5% 완충액 B→60분 후 유속 10ml/분에서 70% 완충액 B로

- A 1437 L 및 M 분획의 동결 건조

A 1437 L(95% 이상의 순도) 5.8mg, A 1437 M(95% 이상의 순도) 6.7mg

8) A 1437 리포펩타이드를 검출하기 위한 HPLC 시스템

하기 시스템은 조 혼합물 및 배양 여액 중의 리포펩타이드를 분리시키고 정량화시킬 수 있다: 체류 시간은 11.5분(A 1437 E) 및 약 15.9분(A 1437 H)이다.

이동상: A 인산칼륨 완충액 pH 7.0, 10mM

B 아세토니트릴

컬럼: Shandon ODS Hypersil RP 18(120 x 4.6mm 및 20 x 4.6mm 예비 컬럼) 또는 Nucleosil 120 RP 18(120 x 4.6mm 및 20 x 4.6mm 예비컬럼)

유속: 1.5ml/분

검출: 210nm

주입량: 10μl

9) 악티노플레인스 니포넨시스 ATCC 31145와 악티노플레인스종 DSM 7358의 비교

먼저 실시예 1b에 기술한 바와 같은 2가지 균주의 예비 배양물을 생장시키고 하기 생산 배지를 접종하는데 사용한다.

배지 1: 실시예 3a에 기술한 바와 같다.

배지 2: L-발린을 함유하지 않은 배지 1

배지 3: 30g/ℓ 글루코스; 20g/ℓ 대두 곡분; 0.3g/ℓ Fe₂(SO₄)₃; 0.3g/ℓ MnCl₂x 4H₂O 및 CoCl₂x 6H₂O, pH 7.3(각각의 경우 300ml 삼각 플라스크중 배지 100ml)

배양은 회전 진탕기내에서 30℃에서 이루어진다. 배양 여액중 A 1437 리포펩타이드의 농도는 48, 96 및 144시간 후 HPLC(실시예 8)로 측정한다. 균주 악티노플레인스 니포넨시스 ATCC 31145가 있는 배지 2 및 배지 3에서는 어떠한 리포펩타이드도 검출되지 않는다. 배지 1에서는 144시간 후에 매우 소량의 펩타이드를 약간 검출할 수 있다. 이들 화합물의 특이적 소멸이 A 1437 펩타이드의 그것과 동일하다는 가정하에, 생산되는 양은 동일 시간 이후 배지 1에서 균주 악티노플레인스종 DSM 7358에 의해 합성되는 A 1437 B의 농도 보다도 100배 이상 낮다( 1mg/ℓ).

10) A 1437 리포펩타이드의 효과

A 1437 리포펩타이드에 대한 관련 유기체의 감수성은 한천 희석 시험에 의해 측정된다. 사용된 한천은 뮐러-힌톤 한천으로, 에스. 피오게네스(S. Pyogenes) 및 엔테로콕시(Enterococci)의 경우, 10% 말 혈액을 가한다. 항생제-함유 평판을 다중 채널 접종기(특정 균주의 정상 배양물의 접종 부위당 5 x 10⁴cfu)를 사용하여 접종한다. MIC 값(최소 억제 농도)을 37℃에서 판독한다. MIC는 24시간 배양후 유기체의 가시적 생장이 검출되지 않는 항생제 농도로서 정의된다. 결과는 표 3에 요약되어 있다. 대조군으로서 사용된 암포마이신은 베링거 만하임(독일연방공화국)으로부터 수득한다. 암포마이신은 이로부터 우수한 화학제로서 수득될 수 있다.

화합물 K, L 및 M은 화합물 A 내지 H의 활성에 필적하는 시험관내 활성을 나타낸다.

실시예 11a: A 1437 D의 특성화

리포펩타이드 A 1437 D를 비결정성 고체로서 분리한다.

광학 회전: +35°(c=0.1; 메탄올)

HPLC: 체류시간: 15.1분

아미노산: 2 아스파르트산

1 아스파라긴

1 β-메틸아스파르테이트

2 글리신

2 2,3-디아미노부티르산

1 프롤린

1 피페콜산

1 발린

FAB-MS: m/e=1303.6952[(M+H)]

분자 질량: 1302.6884(CHNO)

CID-MS: m/z=356, 491, 517, 520, 741, 761, 938, 982

IR(KBr): ν=3420(br) cm, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400.

실시예 11b: A 1437 B의 특성화

리포펩타이드 A 1437 B를 비결정성 고체로서 분리한다.

광학 회전: +27°(c=0.1; 메탄올)

HPLC: 체류시간: 12.8분

아미노산: 3 아스파르트산

1 β-메틸아스파르테이트

2 글리신

2 2,3-디아미노부티르산

1 프롤린

1 피페콜산

1 발린

FAB-MS: m/e=[(M+H)]

분자 질량: 1303(CHNO)

CID-MS: m/z=356, 407, 518, 521, 741, 762, 938, 982

IR(KBr): ν=3420(br) cm, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

실시예 11c: A 1437 C의 특성화

리포펩타이드 A 1437 C를 비결정성 고체로서 분리한다.

광학 회전: +30°(c=0.1; 메탄올)

HPLC: 체류시간: 14.1분

아미노산: 2 아스파르트산

1 아스파라긴

1 β-메틸아스파르테이트

2 글리신

2 2,3-디아미노부티르산

1 프롤린

1 피페콜산

1 발린

분자 질량: 1288(CHNO)

CID-MS: m/z=356, 392, 503, 741, 747, 938, 981

IR(KBr): ν=3420(br) cm, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400.

실시예 11d: A 1437 A의 특성화

리포펩타이드 A 1437 A를 비결정성 고체로서 분리한다.

광학 회전: +30°(c=0.1; 메탄올)

HPLC: 체류시간: 11.8분

아미노산: 3 아스파르트산

1 β-메틸아스파르테이트

2 글리신

2 2,3-디아미노부티르산

1 프롤린

1 피페콜산

1 발린

분자 질량: 1289(CHNO)

CID-MS: m/z=356, 478, 504, 507, 741, 748, 938, 981

IR(KBr): ν=3420(br) cm, 2925, 1650, 1535, 1400.

실시예 11e: A 1437 F의 특성화

리포펩타이드 A 1437 F를 비결정성 고체로서 분리한다.

광학 회전: +31°(c=0.1; 메탄올)

HPLC: 체류시간: 13.8분

아미노산: 2 아스파르트산

1 아스파라긴

1 β-메틸아스파르테이트

2 글리신

2 2,3-디아미노부티르산

1 프롤린

1 피페콜산

1 발린

분자 질량: 1288(CHNO)

CID-MS: m/z=356, 392, 503, 506, 741, 747, 938, 981

IR(KBr): ν=3420(br) cm, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400.

실시예 11f: A 1437 E의 특성화

리포펩타이드 A 1437 E를 비결정성 고체로서 분리한다.

HPLC: 체류시간: 11.5분

아미노산: 3 아스파르트산

1 β-메틸아스파르테이트

2 글리신

2 2,3-디아미노부티르산

1 프롤린

1 피페콜산

1 발린

분자 질량: 1289(CHNO)

CID-MS: m/z=356, 393, 504, 507, 741, 748, 938, 981

IR(KBr): ν=3420(br) cm, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

실시예 11g: A 1437 H의 특성화

리포펩타이드 A 1437 H를 비결정성 고체로서 분리한다.

광학 회전: +32°(c=0.1; 메탄올)

HPLC: 체류시간: 15.9분

아미노산: 2 아스파르트산

1 아스파라긴

1 β-메틸아스파르테이트

2 글리신

2 2,3-디아미노부티르산

1 프롤린

1 피페콜산

1 발린

분자 질량: 1316(CHNO)

CID-MS: m/z=356, 420, 531, 534, 741, 775, 938, 981

IR(KBr): ν=3420(br) cm, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400.

실시예 11h: A 1437 G의 특성화

리포펩타이드 A 1437 G를 비결정성 고체로서 분리한다.

광학 회전: +34°(c=0.1; 메탄올)

HPLC: 체류시간: 13.6분

아미노산: 3 아스파르트산

1 β-메틸아스파르테이트

2 글리신

2 2,3-디아미노부티르산

1 프롤린

1 피페콜산

1 발린

분자 질량: 1317(CHNO)

CID-MS: m/z=356, 421, 532, 535, 741, 776, 938, 981

IR(KBr): ν=3420(br) cm, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

실시예 11i: A 1437 K의 특성화

리포펩타이드 A 1437 K를 비결정성 고체로서 분리한다.

HPLC: 체류시간: 12.5분

아미노산: 3 아스파르트산

1 β-메틸아스파르테이트

2 글리신

2 2,3-디아미노부티르산

1 프롤린

1 피페콜산

1 발린

FAB-MS: m/e=[(M+H)]

분자 질량: 1299(CHNO)

CID-MS: m/z=393, 504, 507, 741, 748, 938, 981

IR(KBr): ν=3420(br) cm, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

실시예 11j: A 1437 L의 특성화

리포펩타이드 A 1437 L를 비결정성 고체로서 분리한다.

HPLC: 체류시간: 13.0분

아미노산: 3 아스파르트산

1 β-메틸아스파르테이트

2 글리신

2 2,3-디아미노부티르산

1 프롤린

1 피페콜산

1 발린

FAB-MS: m/e=[(M+H)]

분자 질량: 1289(CHNO)

CID-MS: m/z=407, 518, 741, 761, 938, 981

IR(KBr): ν=3420(br) cm, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

실시예 11k: A 1437 M의 특성화

리포펩타이드 A 1437 M을 비결정성 고체로서 분리한다.

HPLC: 체류시간: 9.8분

아미노산: 3 아스파르트산

1 β-메틸아스파르테이트

2 글리신

2 2,3-디아미노부티르산

1 프롤린

1 피페콜산

1 발린

FAB-MS: m/e=[(M+H)]

분자 질량: 1275(CHNO)

CID-MS: m/z=379, 490, 493, 724, 741, 938, 981

IR(KBr): ν=3420(br) cm, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

실시예 12 : C13 화학적 이동

하기 표는 A 1437 B의 CH 시그날의 C13 화학적 이동을 나타낸다.

H 데이타와의 비교를 가능하게 하기 위하여, NH 시그날의 NH 화학적 이동 및 상응하는 스핀 시스템의 Pip 및 Pro에 대한 CαH 이동 또한 나타내었다.

Claims

하기 서열식(Ⅰ')의 리포펩타이드.

상기식에서, R¹은 탄소수 6 내지 22의 단일 또는 다중 불포화, 포화 또는 이와는 독립적인 측쇄 또는 비측쇄 지방산 또는 하이드록시 지방산이다.
제1항에 있어서, R¹이 탄소수 10 내지 20의 쇄 길이를 갖는 리포펩타이드.
제1항에 있어서, R¹이 탄소수 12, 13, 14 또는 15의 쇄 길이를 갖는 리포펩타이드.
제1항에 있어서, R¹이 a) iC₁₃-지방산 b) iC₁₄-지방산 c) aiC₁₃-지방산 또는 d) aiC₁₅-지방산인 리포펩타이드.
제4항에 있어서,
악티노플레인스(Actinoplanes)종을 하나 이상의 리포펩타이드가 배양 배지내에 축적될 때까지 배양 배지내에서 발효시킨 후, 이 배양 배지로부터 하나 이상의 리포펩타이드를 정제시킴을 특징으로 하여, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 서열식(Ⅰ')의 리포펩타이드를 제조하는 방법.
제6항에 있어서, pH 0.5 내지 4에서 산을 사용하여 배양 배지로부터 리포펩타이드를 침전시킨 후, 침전물로부터 수득된 리포펩타이드를, 선택적 또는 연속적으로 음이온 교환기 또는 소수성 매트릭스 상에서 크로마토그래피하여 정제 단계를 수행하는 방법.
제6항에 있어서, 악티노플레인스 종 DSM 7358을 발효시키는 방법.
제1항에 따른 하나 이상의 서열식(Ⅰ')의 리포펩타이드를 함유하는, 글리코펩타이드-내성 세균에 대한 항생제로서 사용하기에 유용한 약제학적 조성물.
악티노플레인스 종 DSM 7358.
제9항에 있어서, 글리코펩타이드-내성 세균이 그램-양성 세균인 약제학적 조성물.