PL179581B1

PL179581B1 - kompozycja farmaceutyczna oraz substancja farmakologicznie czynna PL PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL179581B1
Application number: PL94303716A
Authority: PL
Inventors: Peter Hammann; Johannes Meiwes; Gerhard Seibert; Laszlo Vertesy; Joachim Wink; Astrid Markus
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1993-06-08
Filing date: 1994-06-06
Publication date: 2000-09-29
Also published as: DE59407475D1; JP2660161B2; KR950000890A; IL109917A0; PL303716A1; ATE174604T1; HU9401465D0; MA23216A1; SK281830B6; ZA943983B; KR100319563B1; CY2190B1; GR3029591T3; FI942660A; DK0864584T3; KR0174264B1; GR3035204T3; PT864584E; PL180230B1; DE59409616D1

Abstract

1. Lipopeptydy o wzorze 1, w którym R1 oznacza jednokrotnie albo wielokrot- nie nienasycony, nasycony albo niezaleznie od tego rozgaleziony albo nierozgaleziony lan- cuch kwasu tluszczowego, albo kwasu hydro- ksytluszczowego o dlugosci lancuchów 6 do 22 wlacznie atomów wegla. WZÓ R 1 PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są zatem:

Lipopeptydy o wzorze 1, w którym

R¹ oznacza jednokrotnie albo wielokrotnie nienasycony, nasycony albo niezależnie od tego rozgałęziony, albo nierozgałęziony łańcuch kwasu tłuszczowego, albo kwasu hydroksytłuszczowego o długości łańcuchów 6 do 22 włącznie atomów węgla.

W lipopeptydach o wzorze 1, R¹ oznacza korzystnie łańcuch zawierający 10 do 20 włącznie atomów węgla a zwłaszcza łańcuch zawierający 12-15 atomów węgla.

Korzystne są lipopeptydy o wzorze 1, w którym R¹ oznacza łańcuch

a) kwasu iC|₃-tłuszczowego,

b) kwasu iC₁₄-tłuszczowego,

c) kwasu aiC₁₃-tłuszczowego,

d) kwasu aiC|₅-tłuszczowego, a zwłaszcza R¹ oznacza grupę o wzorze 2 albo grupę o wzorze 3, albo grupę o wzorze 4, albo grupę o wzorze 5.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania lipopeptydów o wzorze 1, w którym podstawniki mają w/w znaczenie charakteryzujący się tym, że fermentuje się Actinoplanes sp. w pożywce aż do nagromadzenia się w tej pożywce jednego albo więcej lipopeptydów i oczyszcza się z pożywki lipopeptydy o wzorze 1.

Oczyszczanie przeprowadza się, wytrącając lipopeptydy z pożywki stosując kwasy, przy pH 0,5 do 4 włącznie, potem ewentualnie otrzymane z wytrącenia lipopeptydy oczyszcza się przez chromatografię na wymieniaczach anionowych albo chromatografię na hydrofobowej matrycy, przy czym obydwie chromatografie przeprowadza się alternatywnie albo jedną po drugiej w dowolnej kolejności.

W sposobie według wynalazku fermentuje się Actinoplanes sp. DSM 7358.

Przedmiotem wynalazku jest również substancja farmakologicznie czynna, zwłaszcza jako antybiotyk przeciw bakteriom Gram-dodatnim, szczególnie korzystnie przeciw bakteriom opornym wobec gljkopeptydu, charakteryzująca się tym, że zawiera lipopeptyd o wzorze 1, w którym R' oznacza jednokrotnie albo wielokrotnie nienasycony, nasycony albo niezależnie od tego rozgałęziony albo nierozgałęziony łańcuch kwasu tłuszczowego, albo kwasu hydroksytłuszczowego o długości łańcuchów 6 do 22 włącznie atomów węgla.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera jeden albo więcej lipopeptydów o wzorze 1, w którym R¹ oznacza jednokrotnie albo wielokrotnie nienasycony, nasycony albo niezależnie od tego rozgałęziony albo nierozgałęziony łańcuch kwasu tłuszczowego, albo kwasu hydroksytłuszczowego o długości łańcuchów 6 do 22 włącznie atomów węgla i ewentualnie farmaceutyczne nośniki.

Niżej wynalazek opisany jest szczegółowo, a zwłaszcza jego korzystne postacie wykonania. Poza tym wynalazek jest określony przez treść zastrzeżeń patentowych.

Określenie pojęć:

- Dab oznacza kwas 2,3-diaminomasłowy,

- Pip oznacza kwas pipekolinowy (synonim - homoprolina),

- MeAsp oznacza β-metyloasparaginian,

- Gly oznacza glicynę,

- Asn oznacza asparaginę,

- Asp oznacza kwas asparginowy,

- Val oznacza walinę,

179 581

- Pro oznacza prolinę,

- n oznacza normalny/nierozgałęziony, a

- CID oznacza “rozpad wywołany zderzeniami”.

Skrót “i” oznacza “izo”, natomiast “ai” oznacza “ante-izo”. Te oznaczenia znane są specjaliście w związku z kwasami tłuszczowymi (Biochemistry, Zubay, wydawnictwo Addison Wesley w Londynie, Amsterdamie, 1983).

Wszystkie dane procentowe odnoszą się do ciężaru, jeżeli nie podano inaczej. Stosunki w mieszaninach w przypadku cieczy odnoszą się do objętości, o ile nie podano inaczej.

Sposób według wynalazku można stosować do fermentacji w skali laboratoryjnej (zakres mililitra do litra) i dla skali przemysłowej (skala w metrach sześciennych).

Acinoplanes sp. wyodrębnia się z próby ziemi. W celu oczyszczenia z ziemi przeprowadza się ją w zawiesinę przy wytworzeniu szeregu rozcieńczeń fizjologicznym roztworem NaCl (0,9%). Różne rozcieńczenia (10° -10⁶) nanosi się następnie na pożywki Actinomyceten. Po wylęgnięciu kultur w temperaturze 30°C w okresie 2 do 14 dni powstają kolonie Actinomyceten, które można odosobnić i wyodrębnić przez szereg następujących po sobie etapów oczyszczania.

Oznaczanie gatunków przeprowadza się za pomocą morfologicznych i taksonomicznych kryteriów według metod znanych przez specjalistę. Dla gatunku Actinopłąnes charakterystyczne są przede wszystkim ruchliwe zarodniki.

Na podstawie następujących po sobie etapów wyodrębniania i oczyszczania można wyodrębnić z Actinopłąnes sp. kolonię, która bardzo skutecznie oddaje do pożywki jeden albo więcej związków lipopeptydowych, korzystnie lipopeptydy A1437 A, B, C, D, E, F, G, Η, K, L i/albo M, i jest określana jako główny producent.

Jako główny producent określa się izolat, który produkuje albo oddaje do pożywki jeden albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku w 10- do 100-krotnie zwiększonej ilości w porównaniu do izolatów takiego samego rodzaju Actinopłąnes.

Silnie produkującą kolonię Actinopłąnes sp. rozmnaża się. Izolat zdeponowano w Niemieckim Zbiorze Mikroorganizmów i Kultur Komórkowych GmbH, Mascheroder Veg IB, 3300 Braunschweig, Niemcy, według zasad Budapesztańskiej Umowy dnia 18 czerwca 1990 pod następującym numerem: Actinopłąnes sp. DSM 7358.

Actinopłąnes sp. DSM 7358 ma grzybnię o barwie pomarańczowej i charakteryzuje się kulistymi sporangiami.

W płynnej pożywce (określonej również jako pożywka), która zawiera źródło węgla i źródło azotu oraz zwykłe sole nieorganiczne, Actinopłąnes sp., szczególnie DSM 7358, produkuje jeden albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku.

Zamiast szczepu DSM 7358 można używać również jego mutanty i warianty, które syntetyzująjeden albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku. Takie mutanty można wytwarzać w zasadzie znanym sposobem za pomocą środków fizycznych, na przykład przez naświetlanie, jak promieniami ultrafioletowymi albo rentgenowskimi, albo chemicznymi mutagenami, takimi jak na przykład etyłometanosułfonian (EMS), 2-hydroksy-4-metoksybenzofenon (MOB) albo N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (MNNG).

Skrining według mutantów i wariantów syntetyzujących jeden albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku następuje według poniższego schematu:

- oddzielenie grzybni po fermentacji,

- wytrącenie lipopeptydów przy pH 1 do 2 (w temperaturze 4°C),

- rozprowadzenie osadu w H₂O/MeOH (1:1),

- analiza za pomocą HPLC, DC albo za pomocą badania biologicznej aktywności (Hemmhoftest).

Opisane wyżej warunki fermentacji dotyczą Actinopłąnes sp., zdeponowanego izolatu DSM 7358 oraz mutantów i ich wariantów.

W pożywce płynnej, która zawiera źródło węgla i źródło azotu oraz zwykłe nieorganiczne sole, Actinopłąnes sp., korzystnie DSM 7358, produkuje jeden albo więcej związków lipopeptydów, korzystnie jednak lipopeptydy A 1437 A-H oraz K, L, M.

179 581

Jako korzystne źródła węgła dla aerobowej fermentacji nadają się dające się asymilować węglowodany i alkohole cukrowe jak glukoza, laktoza albo D-mannit oraz produkty naturalne zawierające węglowodany, jak np. ekstrakt słodowy. Jako substancje odżywcze zawierające azot wchodzą w rachubę aminokwasy, peptydy i proteiny jak również produkty ich rozkładu jak peptony albo tryptony, dalej ekstrakty mięsne, zmielone nasiona, na przykład kukurydzy, pszenicy, fasoli, soi albo roślin bawełny, pozostałości podestylacyjne z wytwarzania alkoholi, mączki mięsne albo ekstrakty drożdżowe, albo także sole amonowe i azotany. Odnośnie nieorganicznych soli pożywka płynna może zawierać na przykład chlorki, węglany, siarczany albo fosforany metali alkalicznych albo metali ziem alkalicznych, żelaza, cynku, kobaltu i manganu.

Wytwarzanie łipopeptydów według wynalazku przeprowadza się szczególnie dobrze w pożywce płynnej, która zawiera około 0,1 do 5%, korzystnie 0,3 do 2% ekstraktu mięsnego i 0,2 do 5%, korzystnie 0,5 do 2% sacharozy i 0,05 do 5 g/1, korzystnie 0,1 do 0,5 g/1 ekstraktu drożdżowego i 0,05 do 2 g/1, korzystnie 0,1 do 1 g/1 siarczanu magnezu i 0,05 do 10 g/1, korzystnie 0,1 do 1 g/1 diwodorofosforanu potasu albo sodu i 0 do 100 μΜ, korzystnie 5 do 20 μΜ chlorku żelazowego. Dane procentowe odnoszą się każdorazowo do ciężaru całej pożywki płynnej.

W tej pożywce płynnej Actinoplanes sp., korzystnie Actinoplanes DSM 7358 tworzy mieszaninę złożonąz łipopeptydów. Mieszanina składa się szczególnie z 11 różnych, wykrywalnych łipopeptydów. Te lipopeptydy według wynalazku określono jako A 1437C, D, F i H. Ich charakterystykę przedstawia poniższa tabela.

Tabela

Nazwa lipopeptydu	R¹	Masa cząsteczkowa
A 1437 C	wzór 2	1289
A 1437 D	wzór 3	1303
A 1437 F	wzór 4	1289
A 1437 H	wzór 5	1317

Lipopeptyd A 1437 C, zawiera nieznany dotychczas w lipopeptydach typu Amphomycin kwas izo-C₁₃-tłuszczowy. Skład i sekwencja aminokwasowa w A 1437 C nie są znane z innych łipopeptydów.

Lipopeptyd A 1437 D, zawiera kwas tłuszczowy typu izo-C_I4, a zatem kwas tłuszczowy znany z Tsushimycin'y. [Shoji et al., The Journal of Antibiotics 21,439 (1968)].

A 1437 D różni się jednak w swym składzie i sekwencji aminokwasowej od łipopeptydów znanych dotychczas ze stanu techniki. Skład aminokwasowy Amphomycin'y, Glumamycin'y, Zeomycin'y i Tsushimycnfy jest według literatury identyczny. [Strong et al., Antimicrobal Agents and Chemotherapy 1970,42; Bodanszky et al., J. Am. Chem. Soc. 95,2352 (1973), Inoue, Buli. Chem. Soc. Jap. 35, 1556 (1962)].

Lipopeptyd A 1437 F składa się z kwasu ante-izo-C₎₃-tłuszczowego, a zatem zawiera taki sam typ kwasu tłuszczowego jak znany z Amphomycin'y. Jego sekwencja aminokwasowa i skład aminokwasowy nie są znane ze stanu techniki.

Lipopeptyd A 1437 H ma każdorazowo, równie jak Aspartocin'a, kwas ante-izo-C) ₅-tłuszczowy. Sekwencja i skład w A 1437 H nie są znane ze stanu techniki.

Lipopeptydy A 1437 C, D, F i H wszystkie mają połączenie funkcji karboksylowej C-końcowej prołiny z β-aminofunkcją zlokalizowanego aminokońcowo Dab. To połączenie przedstawione jest przez “lj” we wzorze 1.

Obok łipopeptydów według wynalazku tworzy Actinoplanes sp, korzystnie Actinoplanes DSM 7358, poniżej scharakteryzowane lipopeptydy A, B, E, G, K, L i M o wzorze ogólnym 1 A.

179 581

T abe 1 a

Nazwa lipopeptydu	R¹	Masa cząsteczkowa
A 1437 A	wzór 2	1290
A 1437 B	wzór 3	1304
A 1437 E	wzór 4	1290
A 1437 G	wzór 5	1318
A 1437 K	wzór 6	1318
A 1437 L	wzór 7	1318
A 1437M	wzór 8	1318

Lipopeptyd A 1437 A, zawiera jeszcze nieznany dotychczas w lipopeptydach typu Amphomycin kwas izo-C₁₃-tłuszczowy. Sekwencja aminokwasowa w A 1437 A odpowiada sekwencji aminokwasowej Amphomyciriy, która zawiera jednak kwas ante-izo-C₁₃-thiszczowy. [Bodanszky et al., J. Am. Chem. Soc. 95,2352 (1973)].

Lipopeptyd A 1437 B, zawiera kwas tłuszczowy typu izo-C_I4, a zatem kwas tłuszczowy znany z Tsushimyciriy. [Shoji et al., The Journal of Antibiotics 21,439 (1968)]. Lipopeptyd A 1437 B ma sekwencję aminokwasową Amphomyciriy. [Bodanszky et aL, J. Am. Chem. Soc. 95,2352(1973)].

Lipopeptyd A1437 E z Actinoplanes sp., zwłaszcza z Actinoplanes DSM 7558, jest identyczny z Amphomycirią znaną ze Streptomyceten.

Lipopeptyd A 1437 G ma każdorazowo, również jak Aspartociria (Hausmann et al. Antimicrobal Agents and Chemotherapy 1963,352) kwas ante-izo-C₁₅-tłuszczowy. Sekwencja aminokwasowa w A 1437 G odpowiada sekwencji aminokwasowej Amphomyciriy [Bodanszky et al., J. Am. Chem. Soc. 95, 2352 (1973)].

Lipopeptydy A 1437 K, L i M mająnierozgałęzione kwasy tłuszczowe o długości łańcucha C₁₂ - C₁₄. Sekwencja aminokwasowa tych trzech wymienionych lipopeptydów odpowiada sekwencji aminokwasowej Amphomyciriy.

Lipopeptydy A 1437 A, B, E i G wszystkie mająpołączenie funkcji karboksylowej C-końcowej proliny z β-aminofunkcją zlokalizowanego aminokońcowo Dab. To połączenie przedstawione jest przez “lj ” we wzorze 1.

Zależnie od składu pożywki płynnej może zmieniać się ilościowy udział jednego albo więcej lipopeptydów według wynalazku. Poza tym przez skład pożywek może sterować syntezą poszczególnych lipopeptydów tak, że lipopeptyd nie jest w ogóle wytwarzany bądź jest wytwarzany w ilości poniżej granicy wykrywalności mikroorganizmu:

Pożywka Actinoplanes sp., zwłaszcza DSM 7358, zawiera lipopeptydy z jednokrotnie albo wielokrotnie nienasyconym, nasyconym albo niezależnie od tego rozgałęzionym, albo nierozgałęzionym kwasem tłuszczowym, albo kwasem hydroksytłuszczowym o długości łańcucha 6 do 22 włącznie atomach węgla, korzystnie o 10 do 20 włącznie atomach węgla, szczególnie korzystnie o 13, 14 albo 15 atomach węgla.

Specjalista zna tego rodzaju kwasy tłuszczowe, tak np. z Rómpp Chemie Lexikon, Prof, Falbe und Prof. Regitz, 9. wydanie, wydawnictwo Georg Thieme Stuttgart, Nowy Jork albo z The Encyclopedia of Chemistry C.A. Hampel and G.G. Hawłey, 3. wydanie, Van Nostrand Reinhold Company, Nowy Jork.

Następujące wyliczenie kwasów tłuszczowych jest przykładowe, nie wnosi żadnego zastrzeżenia do kompletności i nie stanowi żadnego ograniczenia.

Nasycone, nierozgałęzione kwasy tłuszczowe w lipopeptydach według wynalazku stanowią przykładowo kwas kapronowy, enantowy, kaprylowy, pelargonowy, kaprynowy, undekanowy, laurynowy, tridekanowy, mirystynowy, pentadekanowy, palmitynowy, margarynowy, stearynowy, nonadekanowy, arachidynowy, behenowy.

179 581

Nasycone, rozgałęzione kwasy tłuszczowe w lipopeptydach według wynalazku stanowią przykładowo kwas izomasłowy albo kwas izowalerianowy, albo odpowiednie kwasy w konfiguracji “ante-izo”.

Jednokrotnie nienasycone, nierozgałęzione kwasy tłuszczowe w lipopeptydach według wynalazku stanowią przykładowo kwas akrylowy albo krotonowy.

Dwukrotnie nienasycony, nierozgałęziony kwas tłuszczowy w lipopeptydach według wynalazku stanowi przykładowo kwas sorbowy.

Trzykrotnie nienasycone, nierozgałęzione kwasy tłuszczowe w lipopeptydach według wynalazku stanowią przykładowo kwas linolenowy albo kwas elaeostearynowy.

Czterokrotnie nienasyconym, nierozgałęzionym kwasem tłuszczowym w lipopeptydach według wynalazku jest przykładowo kwas arachidonowy.

Pięciokrotnie nienasyconym, nierozgałęzionym kwasem tłuszczowym w lipopeptydach według wynalazku jest przykładowo kwas klupanodenowy.

Sześciokrotnie nienasyconym, nierozgałęzionym kwasem tłuszczowym w lipopeptydach według wynalazku jest przykładowo kwas dokozaheksaenowy.

Poza tym w pożywce mogą pojawiać się lipopeptydy z wielokrotnie rozgałęzionymi kwasami tłuszczowymi, jak np. z kwasem 2',4',6',8-tetrametylodekanowym.

Kwasy hydroksytłuszczowe w lipopeptydach według wynalazku stanowiąna przykład hydroksylowane w pozycji 2' i 3' i/albo na końcu łańcucha węglowego kwasy tłuszczowe w konfiguracji “izo” albo “ante-izo”.

Przy dodaniu 0,01 do 5%, korzystnie 0,02 do 0,1% L-waliny do opisanej wyżej pożywki płynnej szczep Actinoplanes sp. tworzy korzystnie lipopeptydy A 1437 B i D. Przy dodaniu 0,01 do 5%, szczególnie 0,1 do 0,5% L-leucyny do wyżej opisanej pożywki płynnej szczep Actinoplanes sp. tworzy korzystnie lipopeptydy A 1437 A i C. Przy dodaniu 0,01 do 5%, szczególnie 0,05 do 0,5% L-izoleucyny do wyżej opisanej pożywki płynnej szczep Actinoplanes sp. tworzy przede wszystkim lipopeptydy A 1437 E, F, G i H. Przy dodaniu 0,01 do 5%, szczególnie, 0,05 do 0,5% kwasu L-a-aminomasłowego do opisanej wyżej pożywki płynnej szczep Actinoplanes sp. tworzy korzystnie lipopeptydy K. Przy dodaniu 0,01 do 5%, zwłaszcza 0,05 do 0,5% L-norwaliny do opisanej wyżej pożywki płynnej szczep Actinoplanes sp. tworzy korzystnie lipopeptydy L i/albo M. To samo dotyczy korzystnego szczepu DSM 7358.

Obok tych aminokwasów można stosować także odpowiednie α-ketonokwasy wymienionych aminokwasów (a-ketonoizowalerianian, α-ketonoizokapronian, a-ketono-[J-metylowalenanian, α-ketonowalerianian) albo odpowiadające im kwasy (izomaślan, izowalerianian, a-metylomaślan, n-maślan, propionian, walerianian) w odpowiednich stężeniach, albo dalsze substancje, które mogą ingerować w biosyntezę kwasów tłuszczowych.

Hodowlę mikroorganizmu prowadzi się aerobowo, a więc na przykład wgłębienie przy wstrząsaniu albo mieszaniu w kolbach do wstrząsania albo fermentorach, ewentualnie przy wprowadzaniu powietrza albo tlenu. Można ją przeprowadzać w zakresie temperatur około 18 do 35°C, korzystnie około 25 do 35°C, a szczególnie w temperaturze 28 do 32°C. Zakres wartości pH powinien znajdować się pomiędzy 6 i 8, korzystnie pomiędzy 6,5 i 7,5.

Hodowlę mikroorganizmu w tych warunkach prowadzi się na ogół w ciągu 24 do 300 godzin, korzystnie 36 do 140 godzin.

Korzystnie hodowlę prowadzi się w kilku etapach, to znaczy najpierw wytwarza się w pożywce płynnej jedną albo więcej kultur wstępnych, które potem przeszczepia się do właściwej pożywki produkcyjnej, głównej hodowli, na przykład w stosunku objętościowym 1:10. Kulturę wstępną otrzymuje się na przykład w ten sposób, że grzybnię przeszczepia się do pożywki płynnej i pozostawia do rośnięcia przez około 36 do 120 godzin, korzystnie 48 do 72 godzin. Grzybnię można otrzymać przykładowo tak, że szczep pozostawia się do rośnięcia przez około 3 do 40 dni, korzystnie 4 do 10 dni, na stałej albo płynnej pożywce, na przykład drożdże-słód-agar, albo odżywczy bulion-agar (standardowe pożywki dla mikroorganizmów z głównymi składnikami peptonem, solą kuchenną i agarem, np. firmy Difco).

179 581

Przebieg fermentacji można nadzorować za pomocą wartości pH kultur albo objętości grzybni oraz metodami chromatograficznymi, jak np. DC albo HPLC, albo przez badanie biologicznej aktywności. Związek według wynalazku zawarty jest zarówno w grzybni jak też w przesączu kultury, jednak największa część (> 90%) znajduje się w przesączu kultury.

Niżej opisany sposób wyodrębniania służy do oczyszczania lipopeptydów według wynalazku, korzystnie jednak dla lipopeptydów A 1437 C, A 1437 D, A 1437 F i A 1437 H.

Wyodrębnianie albo oczyszczanie lipopeptydu według wynalazku z pożywki prowadzi się znanymi metodami uwzględniając chemiczne, fizyczne i biologiczne właściwości naturalnych surowców. W celu testowania stężenia antybiotyków w pożywce albo w poszczególnych etapach wyodrębniania można stosować chromatografię DC, na przykład na żelu krzemionkowym stosując jako eluent izopropanolowy 25% roztwór NH₃ albo HPLC. Wywoływanie w przypadku rozdzielania za pomocą DC można prowadzić na przykład barwiącymi odczynnikami jak aldehydem anyżowym, przy czym ilość utworzonej substancji porównuje się celowo z roztworem wzorcowym.

W celu wyodrębnienia lipopeptydów według wynalazku najpierw zwykłymi sposobami oddziela się grzybnię od brzeczki hodowlanej i następnie przesącz hodowlany ustawia się, korzystnie w temperaturze 4°C, na wartość pH 0,5 do 4 włącznie, korzystnie na pH 1,5 do 2,5 włącznie. Do ustawienia wartości pH, a zatem do wytrącenia lipopeptydów A 1437 można stosować wszystkie znajdujące się w handlu kwasy. Roztwór inkubuje się do 16 godzin, korzystnie do 4 godzin i następnie odwirowuje powstały osad.

Osad zawierający całość lipopeptydów ponownie przeprowadza się w stan zawiesiny w 1/20 pierwotnej objętości wody dwukrotnie destylowanej i za pomocąNaOH doprowadza do pH 6 do 7. Przy tym osad przechodzi całkowicie do roztworu, który oziębia się do temperatury -20°C i poddaje liofilizacji. Liofilizat, określany dalej jako surowy produkt, zawiera 5 do 30% lipopeptydów i stosuje się go do dalszego wyodrębniania.

Dalsze oczyszczanie jednego albo więcej lipopeptydów według wynalazku przeprowadza się drogą chromatografii na odpowiednich materiałach, korzystnie na przykład na żelu krzemionkowym, tlenku glinu, wymieniaczach jonowych albo żywicach adsorpcyjnych, a całkiem szczególnie korzystnie na mocno albo słabo zasadowych wymieniaczach anionowych. Za pomocą tej chromatografii oddziela się lipopeptydy, które zawierają Asp albo Asn jako aminokońcowo zlokalizowany aminokwas. Chromatografię lipopeptydów prowadzi się zbuforowanymi roztworami wodnymi albo mieszaninami wodnych i alkoholowych roztworów.

Przez zbuforowane roztwory wodne rozumie się np. wodę, bufor fosforanowy, octan amonu, bufor cytrynianowy, bufor boranowy w stężeniu 0 do 1M, korzystnie 1 do 100 mM, szczególnie korzystnie stosuje się zbuforowane fosforanem roztwory w stężeniu 1 do 100 mM.

Przez mieszaniny wodnych albo alkoholowych roztworów rozumie się wszystkie mieszające się z wodą organiczne rozpuszczalniki, korzystnie metanol, acetonitryl, o stężeniu 10 do 80% rozpuszczalnika, korzystnie 40 do 60% rozpuszczalnika albo również wszystkie zbuforowane roztwory wodne, które są mieszalne z organicznymi rozpuszczalnikami. Odpowiednimi tu buforami są takie same bufory jak podano wyżej.

Oddzielanie lipopeptydów na podstawie ich różnych kwasów tłuszczowych prowadzi się za pomocą chromatografii z odwróconymi fazami, na przykład MCI® (żywica adsorpcyjna firmy Mitsubishi, Japonia). Szczególnie korzystna jest chromatografia z odwróconymi fazami na hydrofobowych materiałach, korzystnie chromatografia na fazach RP-8 albo RP-18. Poza tym oddzielenie może następować za pomocą chromatografii na żelu krzemionkowym.

Chromatografię lipopeptydów przeprowadza się zbuforowanymi albo zakwaszonymi wodnymi roztworami, albo mieszaninami wodnych roztworów z alkoholami, albo innymi rozpuszczalnikami organicznymi mieszającymi się wodą. Jako organiczny rozpuszczalnik stosuje się korzystnie acetonitryl.

Przez zbuforowane albo zakwaszone roztwory wodne rozumie się np. wodę, bufor fosforanowy, octan amonu, bufor cytrynianowy, bufor boranowy w stężeniu 0 do 0,5 M oraz kwas

179 581 mrówkowy, kwas octowy, kwas trifluorooctowy albo wszystkie znajdujące się w handlu, znane specjaliście kwasy, korzystnie w stężeniu 0 do 1%, szczególnie korzystnie 0,1%.

Chromatografię prowadzi się z gradientem, który rozpoczyna się ze 100% wody i kończy ze 100% rozpuszczalnika, korzystny jest liniowy gradient 40 do 60% actonitrylu.

Kolejność obydwu uprzednio wymienionych chromatografii (chromatografia w celu oddzielenia lipopeptydów według aminokwasów Asp albo Asn i według kwasu tłuszczowego) jest odwracalna. Korzystne jest oddzielanie lipopeptydów według różnych aminokwasów w pierwszym etapie i następnie dopiero oddzielenie ich według typu kwasu tłuszczowego.

Jeżeli wymieniony wyżej surowy produkt zawiera lipopeptydy o jednorodnym kwasie tłuszczowym, opisaną wyżej chromatografię (oddzielnie lipopeptydów na podstawie różnych kwasów tłuszczowych) stosuje się do odsalania i dalszego oczyszczania lipopeptydów.

Alternatywnie można prowadzić również chromatografię żelową na hydrofobowych fazach.

Chromatografię żelową przeprowadza się na żelach poliakryloamidowych albo żelach z mieszanych polimerów, jak na przykład Biogel-P 2® (firmy Biorad) albo Fractogel TSK HW 40® (firmy Merck, Niemcy albo Toso Haas, USA).

Lipopeptydy według wynalazku są trwałe w stanie stałym i w roztworach w zakresie pH pomiędzy 4 i 8, szczególnie 5 i 7, a zatem można je wprowadzać w zwykłe preparaty galenowe.

Jeden albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku, na podstawie ich cennych właściwości farmakologicznych, można stosować jako środki lecznicze.

Substancje według wynalazku wykazują farmakologiczną skuteczność szczególnie jako antybiotyk przeciwko bakteriom Gram-dodatkiem, szczególnie korzystnie przeciwko szczepom opornym wobec glikopeptydu.

W przypadku szczepów opornych wobec penicyliny bądź Methicilińy (szczepy MRSA), które wykształciły dalsze oporności wobec antybiotyków, często tylko glikopeptydy jako Vancomycin'a albo Teicoplanińa wykazują terapeutycznie wystarczające działanie. W sposób powiększający się występują jednak szczepy oporne wobec tych antybiotyków. (FEMS Microbioł. Lett. 98 (1992) 109 do 116). Jeden albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku wykazuje doskonałe działanie również wobec tych “zarazków problemowych”.

Wynalazek dotyczy również farmaceutycznych preparatów jednego albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku.

Jeden albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku, korzystnie jeden albo więcej związków lipopeptydów A 1437 C, D, F i H, można stosować zasadniczo jako takie w substancji. Korzystne jest zastosowanie w mieszaninie z odpowiednimi substancjami pomocniczymi albo nośnikami. Jako nośniki w przypadku środków leczniczych dla zwierząt można stosować zwykłe mieszanki paszowe, a w przypadku środków leczniczych dla ludzi można stosować wszystkie farmakologicznie tolerowane nośniki i/albo substancje pomocnicze.

Zgodnie z wynalazkiem środki lecznicze stosuje się na ogół doustnie albo pozajelitowo, ale zasadniczo możliwe jest także stosowanie doodbytnicze. Odpowiednie stałe albo ciekłe galenowe postacie preparatów stanowią na przykład granulaty, proszki, tabletki, drażetki (mikro-)kapsułki, czopki, syropy, emulsje, zawiesiny, aerozole, krople albo odpowiednie do wstrzykiwania roztwory w postaci ampułek oraz preparaty o przedłużonym uwalnianiu substancji czynnej. Przy wytwarzaniu wymienionych postaci preparatów znajdują zastosowanie zazwyczaj nośniki i dodatki i/albo środki pomocnicze jak środki rozkruszające, wiążące, otoczkowe, spęczniające, poślizgowe albo smarujące, substancje smakowe, środki słodzące albo środki solubilizujące. Jako często stosowane nośniki albo substancje pomocnicze można wymienić na przykład węglan magnezu, ditlenek tytanu, laktozę, mannit oraz inne cukry, talk, białko mleka, żelatynę, skrobię, witaminy, celulozę i jej pochodne, oleje zwierzęce albo roślinne, glikole polietylenowe i rozpuszczalniki jak na przykład sterylną wodę, alkohole, glicerynę albo alkohole wielowodorotlenow e.

Jednostki dawkowe dla stosowania doustnego mogą być ewentualnie mikrokapsułkowane, aby opóźniać albo rozciągać na dłuższy czas oddawanie substancji czynnej. To mikrokapsułkowanie odbywa się przykładowo przez powleczenie albo ułożenie substancji czynnej w postaci cząstek w odpowiednie polimery, woski albo podobne.

179 581

Farmaceutyczne preparaty korzystnie wytwarza się i stosuje w jednostkach dawkowych, przy czym każdajednostka jako czynny składnik zawiera określoną dawkę jednego albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku. W przypadku jednostek dawkowych jak tabletek, kapsułek i czopków dawka ta może wynosić do około 200 mg, korzystnie jednak około 0,1 do 100 mg, a w przypadku roztworów do wstrzykiwania w postaci ampułek do około 200 mg, korzystnie jednak około 0,5 do 100 mg, na dzień.

Przeznaczona do zastosowania dawka dzienna zależy od ciężaru ciała, wieku, rodzaju i stanu ssaka. Ewentualnie można jednak stosować wyższe albo niższe dawki dzienne. Dziennądawkę można stosować zarówno przez jednorazowe podanie w postaci pojedynczej jednostki dawkowej albo w kilku mniejszych jednostkach dawkowych, jak również przez wielokrotne podawanie podzielonych dawek w określonych odstępach.

Środki lecznicze według wynalazku wytwarza się w ten sposób, że jeden albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku razem ze zwykłymi nośnikami oraz ewentualnie substancjami dodatkowymi i/albo pomocniczymi przeprowadza się w odpowiednie albo odpowiednią postać podawania.

Poniższe przykłady objaśniają dalej wynalazek, przy czym dane procentowe odnoszą się do ciężaru. Stosunki w mieszaninach w przypadku cieczy odnoszą się do objętości, o ile nic innego nie zaznaczono.

Przykłady la) Wytwarzanie kultury glicerynowej Actinoplanes sp. DSM 7358

100 ml pożywki płynnej (4 g/1 ekstraktu drożdżowego, 15 g/1 rozpuszczalnej skrobi, 1 g/1 K₂HPO₄,0,5 g/1 MgSO₄ x 7 H₂O, uzupełnione wodą do 1000 ml, wartość pH przed sterylizacją7,0) zaszczepia się w sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 300 ml szczepem Actinoplanes sp. DSM 7358 i inkubuje przez 7 dni w temperaturze 30°C i przy 150 obrotach/min na obrotowej wstrząsarce. Następnie 1,5 ml tej kultury rozcieńcza się przy użyciu 2,5 ml 80% gliceryny i składuje w temperaturze -20°C.

Ib) Wytwarzanie w kolbie Erlenmeyera kultury albo kultury wstępnej Actinoplanes sp. DSM 7358

100 ml płynnej pożywki o następującym składzie: 30 g/1 sacharozy, 2 g/1 KNO₃, 1 g/1 K₂HPO₄,0,5 g/1 MgSO₄ x 7 H₂0,0,5 g/1 KC1,0,01 g/1 FeSO₄ x 7 H₂0,2 g/1 ekstraktu drożdźowego, 5 g/1 peptonu zaszczepia się w sterylnej kolbie Erlemeyera o pojemności 300 ml kulturą wyrośniętą w skośnych rurkach (taka sama pożywka płynna, jednak z 2% agaru) albo za pomocą 1 ml kultury glicerynowej (patrz przykład la) i inkubuje na wstrząsarce przy 180 obrotach/min i w temperaturze 30°C. Maksymalną produkcję jednego albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku osiąga się po około 120 godzinach. Do zaszczepienia fermentorów o pojemności 10 i 2001 wystarcza uzyskana po 48 do 96 godzinach wgłębna kultura (ilość szczepiąca około 10%) z takiej samej pożywki płynnej.

II. Porównawcza charakterystyka Actinoplanes sp. DSM 7358

W celu scharakteryzowania szczepu Actinoplanes sp. DSM 7358 przeprowadza się porównanie z blisko spokrewnionymi szczepami metodą ISP według Shirling'a i Gottlieb'a (Int. J. of Sys. Bacteriol. 16,3 (1966) 313 do 349). Wyniki przedstawione są w tabeli 1 i pokazują one, że szczep Actinoplanes sp. DSM 7358 różni się od innych szczepów morfologicznie i pod względem swej fizjologii.

Tabela 1

	Actinoplanes sp. DSM 7358	A. utahensis NR.RL 12052	A. brasiliensis ATCC 25844	A. nipponensis ATCC 311455
1	2	3	4	5
Grzybnia powietrzna	-	-	+ (ISP 3)	-
Sporangia	+	+	+	+
Pożywka
ISP 2	pomarańczowa	pomarańczowa	żółto-pomarańczowa	pomarańczowa

179 581

c.d. tabeli 1

1	2	3	4	5
ISP 3	pomarańczowa	pomarańczowa	żółto-pomarańczowa	pomarańczowa
ISP 4	pomarańczowa	pomarańczowa	żólto-pomarańczowa	pomarańczowa
ISP 5	pomarańczowa	pomarańczowa	żółto-pomarańczowa	pomarańczowa
ISP 6	pomarańczowa	pomarańczowa	żółto-pomarańczowa	pomarańczowa
	czerwony egzopigment	brunatno-czerwony egzopigment	czerwony egzopigment	czerwony egzopigment
Melanina	-	-	(+)	(+)
Glukoza	+	+	+	+
Arabinoza	+	+	+	4-
Sacharoza	+	+	+	-+-
Ksyloza	+	+	(+)	-
Inozytol	+	+	(+)	(+)
Mannit	+	+	+	-
Fruktoza	+		+	-
Ramnoza	4-	+	+	+
Rafinoza	+	+	(+)	-
Celuloza	+	+	(+)	-
Melibioza	-	-	-	-
Amigdalina	-	+	4-	+
Żelatyna (hydroliza)	+	+	+
Cytrynian (hydroliza)	-	-	+	-
Mocznik (hydroliza)	+	-	-	-
Argininohydrolaza	+	-	-	-
β-galaktozydaza	-	-	-	-
Tryptofanaza	-	-	-	-
Lizynodekarboksylaza	+	-	-	-
Acetoina (tworzenie się)	+	+	+	+
Indol (tworzenie się)	-	-	-	-
H₂S (tworzenie się)	-	-	-	-
Tolerancja NaCl	0 - 2,5%	0 - 2,5%	0 - 2,5%	0 - 2,5%

Ilia) Wytwarzanie lipopeptydów A 1437 B i D

Fermentor o pojemności 500 1 pracuje w następujących warunkach:

Pożywka: 11 g/1 sacharozy g/1 ekstraktu mięsnego

0,3 g/1 ekstraktu drożdżowego

0,6 g/1 MgSO₄

0,1 g/1 KH₂PO₄ μΜ FeCl₃ x 6H₂O

0,6 g/1 L-waliny pH 7,3 (przed sterylizacją)

179 581

Czas inkubacji: 120 godzin

Temperatura inkubacji: 30°C

Szybkość mieszania: 50 obrotów/min

Napowietrzanie: 150 1 min'¹

Przez kilkakrotne dodanie etanolowego roztworu poliolu można powstrzymać tworzenie się piany. Maksimum produkcji osiąga się po około 96 do 120 godzinach.

Po zakończeniu fermentacji Actinoplanes sp. DSM 7358 sączy się brzeczkę kultury przy dodaniu około 2% środka pomocniczego do sączenia (np. Celite®), przesącz kultury oziębia się do temperatury 4°C i doprowadza do pH 1,5. Po 4 godzinach odwirowuje się przy 10000 g i osad powtórnie przeprowadza w stan zawiesiny w wodzie destylowanej. Przez zobojętnienie zawiesiny wymieniona substancja przechodzi do roztworu. Roztwór zamraża się i liofilizuje. Wydajność surowego produktu wynosi około 1,5 g/1 (= 750 g).

IHb) Jonochromatograficzne rozdzielanie surowego produktu (zawiera B + D)

3,21 kolumnę chromatograficzną (średnica wewnętrzna 10 cm, wysokość 40 cm) napełnia się DEAE® Sepharose Fast Flow i równoważy za pomocą 10 mM fosforanu potasu-bufor, pH 7,0 w 40% metanolu (bufor A). Potem 25 g A 1437 B surowego produktu (uzyskanego według przykładu Ula), rozpuszczonego w 3,5 1 wody, nanosi się na kolumnę i przemywa za pomocą 11 wody, następnie za pomocą 61 buforu A. W przesączu i w wodzie płuczącej znajdują się zanieczyszczenia surowego produktu. Potem dodaje się 10 do 100 mM fosforan potasu, pH 7, gradientowe w 40% metanolu. Za pomocą25 do 35 mM fosforanu potasu eluuje się A 1437 D-peptyd i przy użyciu 40 do 55 mM fosforanu potasu uzyskuje się antybiotyk A 1437 B. Odpowiednie frakcje uwalnia się pod zmniejszonym ciśnieniem od metanolu. W celu odsolenia stosuje się kolumną mieszczącą 1 1® Dianiofru HP-20 (Mitsubishi, Japonia). Teraz nanosi się na kolumnę 9 1 frakcji zawierających czysty peptyd B i następnie przemywa przy użyciu 3 1 odsolonej wody. Eluuje się układem woda-propanol w sposobie gradientowym (0 do 50% udziałów alkoholu). Przy użyciu 15 do 25% izopropanolu przemywa się od nośnika czysty A 1437 B. Ten wypływ z kolumny zbiera się oddzielnie, zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem i liofilizuje. Otrzymuje się 4,8 g A1437 B o 97% czystości. Odpowiednie odsolenie frakcji zawierających A1437 D daje 3,1 antybiotyku o czystości 98%.

IVa) Wytwarzanie lipopeptydów A 1437 A i C

Wytwarzanie wykonuje się w sposób opisany pod Ilią jedynie L-walinę w pożywce produkcyjnej zastępuje się przez 4 g/1 L-leucyny i fermentację przeprowadza się w fermentorze o pojemności 50 1. Wydajność surowego peptydu wynosi 1,3 g/1 (= 65 g).

IVb) Wyodrębnianie lipopeptydów A 1437 A i C g surowego produktu rozpuszcza się w 100 ml destylowanej wody i przerabia odpowiednio do poniższego schematu.

Schemat przerobu:

g surowego peptydu w 100 ml destylowanej wody adsorpcja na Q-Sepharose fast flow (firmy Pharmacia) (kolumna 5 x 20 cm)

T elucja z następującym gradientem:

bufor A: NaH₂PO₄ 1 mM w 50% metanolu, pH 5,9 bufor B: NaH₂PO₄ 100 mM w 50% metanolu, pH 5,3 minut: bufor A —> w 60 minut na 25% buforu B, dalsze minut przy 25% buforu B T liofilizacja frakcji A 1437 A albo C i rozpuszczenie w eluencie

179 581 odsalanie na Biogefu P2 (wymiar sita 100 - 200) firmy Biorad (kolumna 7 x 20 cm)

Φ i

1,6 g lipopeptydu A 1437 A 1,2 g lipopeptydu A 1437 C (80%) (80%) j, ;

chromatografia RP na NucleosiFu® C_lg (7 pm) (kolumna 20 x 250 mm, naniesienie 200 mg) elucja z następującym gradientem bufor A: woda dwukrotnie destylowana, 0,1% TFA bufor B: acetonitryl minut: bufor B -» w 60 minut na 90% buforu B przy przepływie 10 ml/min liofilizacja frakcji A 1437 A albo C i Φ

150 mg A 1437 A 154 mg A 1437 C (czystość >95%) (czystość >95%)

Va) Wytwarzanie lipopeptydów A 1437 E, F, G i H

Wytwarzanie prowadzi się w sposób opisany w przykładzie Ilia, jedynie L-walinę zastępuje się w pożywce produkcyjnej przez 1,5 g/1 L-izoleucyny i fermentację przeprowadza się w fermentorze o pojemności 50 1. Wydajność surowego produktu wynosi 1,4 g/1 (70 g).

Vb) Jonochromatograficzne rozdzielanie surowego produktu

Na kolumnie, jak opisana w przykładzie Hlb, rozdziela się 25 g lipopeptydu - surowego produktu, uzyskanego według przykładu Va, odpowiednio do przykładu Ilia.

Za pomocą do 19 mM buforu eluuje się lipopeptyd A 1437 F (wydajność: 1,8 g) do 25 mM buforu eluuje się A 1437 E (wydajność: 1,3 g) do 50 mM buforu eluuje się A 1437 H (wydajność: 2,7 g) i do 82 mM buforu eluuje się A 1437 G (wydajność: 1,9 g).

Odpowiednie frakcje zbiera się i pod zmniejszonym ciśnieniem uwalnia od metanolu.

Vc) Oczyszczanie składników z przykładu Vb na odwróconych fazach RP-18

Preparatywną kolumnę HPLC (o średnicy wewnętrznej 5,1 cm i wysokości 25 cm) mieszczącą 500 ml wypełnia się sorbentem ®LiChrosorb G RP-18,10 pm, i nanosi roztwór zawierającego sole A 1437 Gz 1,9 g antybiotyku. Eluuje się w sposobie gradientowym z 5% acetonitrylu w 10 mM fosforanie potasu - bufor, pH 7,0 do 36% acetonitrylu w 10 mM fosforanie potasu, pH 7,0. Z 24 do 26% acetonitrylu uzyskuje się lipopeptyd A 1437 G. Po zatężeniu pod zmniejszonym ciśnieniem, odsoleniu na 100 ml żywicy adsorpcyjnej ®Dianion HP-20 w układzie woda/50% izopropanolu i liofilizacji otrzymuje się 1,1 glipopeptyduA 1437 Go 99% czystości.

Odpowiednie oczyszczenie końcowe uzyskanego według przykładu Vb roztworu A 1437 H odbywa się z gradientem rozpuszczalnika 10 do 50% acetonitrylu w 10 mM fosforanie potasu-bufor, pH 7,0. Elucja antybiotyku następuje z 37 do 39% udziału rozpuszczalnika. Zatężenie odpowiednich frakcji i odsolenie na ®Dianion'ie HP-20 oraz liofilizacja dają 2,2 g lipopeptydu A 1437 H o ponad 98% czystości.

Vd) Oczyszczanie lipopeptydo-antybiotyków A 1437 E i F z przykładu Vb na żelu MCI

Uzyskany według przykładu Vb zawierający sole roztwór A 1437 F z 1,8 g antybiotyku nanosi się na 1 1 żelu MCI CHP 20P (Mitsibishi Kasei Corp.). Wymiary kolumny wynoszą 6 cm średnica wewnętrzna i 35 cm wysokość. Po obciążeniu nośnika materiałem przeznaczonym do rozdzielenia przemywa się buforem A (5 mM fosforan potasu-bufor, pH 7,0, z 20% acetonitrylu) i w sposobie gradientowym eluuje się wobec buforu B (5 mM fosforan potasu-bufor, pH 7,0 z 70% acetonitrylu). 34 do 35% udziały rozpuszczalnika prowadzą do elucji czystego antybiotyku.

179 581

Zatężenie pod zmniejszonym ciśnieniem i odsolenie na ®Dianion'ie HP-20 dają 1,4 g lipopeptydu A 1437 F o ponad 98% czystości. Analogiczne postępowanie z surowym produktem A 1437 E przykładu Va daje 1 g lipopeptydu A 1437 E o ponad 98% czystości.

VIa) Wytwarzanie lipopeptydu A 1437 K

Wytwarzanie prowadzi się w sposób opisany pod IVa, jedynie L-walinę zastępuje się w pożywce produkcyjnej przez 500 mg/1 kwasu L-a-aminomasłowego (albo 1 g/1 racematu) i fermentację przeprowadza się w fermentorze o pojemności 101. Wydajność surowego peptydu wynosi 1,1 g/l(= lOg).

VIb) Wyodrębnianie lipopeptydu A 1437 K g surowego produktu rozpuszcza się w 100 ml dwetylowanej wody i przerabia odpowiednio do niżej podanego schematu.

Schemat przerobu (A 1437 K):

- 10 g surowego peptydu w 100 ml destylowanej wody

- adsorpcja na Q-Sepharose fast flow (kolumna 3,5 x 17 cm)

- elucja z następującym gradientem bufor A: NaH₂PO₄ 1 mM w 50% metanolu, pH 5,9 bufor B: NaH₂PO₄ 100 mM w 50% metanolu, pH 5,3 minut: bufor A —> w 45 minut na 25% buforu B, dalsze 45 minut przy 25% buforu B

- liofilizacja frakcji A 1437 K

- odsalanie na BiogeFu P2 (wymiar sita 100-200) (kolumna 7 x 20 cm) 700 mg A 1437 K (60%)

- chromatografia RP na Nucleosifu C_i8 7 pm (kolumna 20 x 250 mm) naniesienie: 50 mg wstępnie oczyszczonego produktu elucja z następującym gradientem bufor A: woda dwukrotnie destylowana, 0,1% TFA bufor B: acetonitryl minut: bufor A / 5% bufor B —> w 60 minut na 70% buforu B przy przepływie 10 ml/min

- liofilizacja frakcji A 1437 K

5,6 mg A 1437 (> 95%)

VHa) Wytwarzanie lipopeptydów A 1437 L i M

Wytwarzanie prowadzi się w sposób opisany pod Γ/a, tylko L-walinę w mieszaninie produkcyjnej zastępuje się przez 500 mg/1 L-norwaliny (albo 1 g/1 racematu) i fermentację przeprowadza się w fermentorze o pojemności 101. Wydajność surowego peptydu wynosi 1,2 g/1 (= 12 g).

VIIb) Wyodrębnianie lipopeptydów A 1437 L i M g surowego produktu rozpuszcza się w 100 ml destylowanej wody i przerabia odpowiednio do poniższego schematu

Schemat przerobu:

- 10 g surowego peptydu w 100 ml destylowanej wody

- adsorpcja na Q-Sepharose fast flow (kolumna 3,5 x 17 cm)

- elucja z następującym gradientem:

bufor A: NaH₂PO₄ 1 mM w 50% metanolu, pH 5,9 bufor B: NaH₂PO₄ 100 mM w 50% metanolu, pH 5,3 minut: bufor A—> w 45 minut na 25% buforu B, dalsze minut przy 25% buforu B

- liofilizacja frakcji A 1437 L i M

- odsalanie na Biogefu P2 (wymiar sita 100 - 200) (kolumna 7 x 20 cm)

900 mg A 1437 L i M (około 60%)

- chromatografia RP na Nucleosifu C_l8 7 pm (kolumna 20 x 250 mm)

179 581 naniesienie: 50 mg wstępnie oczyszczonego produktu elucja z następującym gradientem:

bufor A: woda dwukrotnie destylowana, 0,1% TFA bufor B: acetonitryl minut: bufor A / 5% bufor B -> w 60 minut na 70% buforu B przy przepływie 10 ml/min

- liofilizacja frakcji A 1437 L i M

5,8 mg A 1437 L > 95%) 6,7 mg A 1437 M (> 95%) νίΠ) Układ HPLC do wykrywania lipopeptydów A 1437

Opisany niżej układ pozwala na oddzielenie i oznaczenie ilościowe lipopeptydów w surowej mieszaninie albo w przesączu kultury; czasy retencji wynoszą pomiędzy 11,5 minut (A 1437 E) i około 15,9 minut (A 1437 H).

Eluent: A fosforan potasu-bufor pH 7,0, 10 mM

B acetonitryl

Gradient: t (min)	Przepływ (ml/min)	A (%)	B (%)
0	1,5	80	20
15	1,5	50	50
15,5	2	00	100
16,5	2	00	100
17	1,5	80	20
22	1,5	80	20

Kolumna: Shandon ODS Hypersil RP 18 (120 x 4,6 mm z kolumną wstępną 20 x 4,6 mm) albo

Nucleosil 120 RP 18 (120 x 4,6 mm z kolumną wstępną x 4,6 mm)

Przepływ: 1,5 ml/min

Wywoływanie: 210 nm

Iniekcja: 10 μΐ

IX) Porównanie pomiędzy Actinopłanes nipponensis ATCC 31145 i Actinoplanes spec. DSM 7358

Z obydwu szczepów hoduje się najpierw, jak opisano w przykładzie Ib, kulturę wstępną którą stosuje się do zaszczepiania następujących pożywek produkcyjnych.

Pożywka 1: jak opisana w przykładzie Ilia

Pożywka 2: jak pożywka 1 jednak bez L-waliny Pożywka 3: glukoza 30 g/I, mączka sojowa 20 g/1, Fe₂(SO₄)₃ 0,3 g/1, MnCl₂ x 4H₂O 0,3 g/1 i CoCl₂ x 6H₂O pH 7,3 każdorazowo 100 ml pożywki w kolbach Erlenmeyera o pojemności 300 ml.

Inkubację prowadzi się w temperaturze 30°C na obrotowej wstrząsarce. Po upływie 48,96 i 144 godzin oznacza się stężenie lipopeptydów A 1437 w przesączu kultury za pomocą HPLC (patrz przykład VI). W pożywce 2 i pożywce 3 w przypadku szczepu Actinoplanes nipponensis 31145 żaden lipopeptyd nie jest wykrywalny. W pożywce 1 po 144 godzinach wykrywane sąniektóre peptydy w bardzo małych ilościach. Jeżeli weźmie się za podstawę identyczną właściwą absorbancję tych związków w porównaniu do peptydów A 1437, to utworzona ilość znajduje się o co najmniej czynnik 100 (< 1 mg/1) poniżej stężenia A 1437 B, jaki syntetyzowany jest przez szczep Actinoplanes spec. DSM 7358 w pożywce 1 po takim samym czasie.

179 581

X) Działanie łipopeptydów A 1437

Czułość istotnych zarazków wobec łipopeptydów A 1437 oznacza się za pomocą testu rozcieńczania agaru. Jako agar stosuje się agar Muller-Hinton'a, do którego w przypadku S. pyogenes i Enterococcen dodaje się 10% krwi konia. Płytki zawierające antybiotyk zaszczepia się wielokanałowym przyrządem do szczepienia (5 χ 10⁴ cfu/miejsce szczepienia, stacjonarnej kultury każdorazowego szczepu). Wartości MHK (minimalne stężenie hamujące) odczytuje się przy temperaturze 37°C. Jako wartość MHK określa się stężenie antybiotyku, przy którym po 24 godzinach inkubacji nie jest wykrywalny żaden dostrzegalny wzrost zarazków.

Wyniki przedstawione są w tabeli 2. Stosowaną jako kontrola Amphomycin'ę otrzymano od firmy Boehringer Mannheim (Niemcy). Amphomycin'a jest tam do nabycia jako odczynnik wysokowartościowy.

Tabela 2

Substancje A 1437: Aktywność in vitro (widmo AB); stężenie w pg/ml

A 1437 A	0,391	0,781	0,391	1,56	0,391	3,13
A 1437 B	0,098	0,195	0,098	0,195	0,049	0,391
A 1437 C	0,195	0,781	0,391	3,13	0,781	3,13
A 1437 D	0,049	0,195	0,049	0,781	0,391	0,781
A 1437 E	0,098	0,195	0,094	0,098	0,025	0,195
A 1437 F	0,098	0,391	0,195	1,56	0,781	1,56
A 1437 G	0,098	0,195	0,049	0,088	0,025	0,195
A 1437H	0,049	0,098	0,049	0,195	0,049	0,195
Amphomycin	0,195	0,781	0,391	1,56	0,391	1,56

Substancje A 1437: Aktywność in vitro (szczepy oporne wobec Yancomycirfy); Stężenie w pg/ml

	Enterococcus faecium VR1	Enterococcus faecium VR2	Streptococcus pyogenes
A 1437 A	nie oznaczone
A 1437 B	1	1	0,5
A 1437 C	4	4	4
A 1437 D	2	2	1
A 1437 E	4	4	1
A 1437 F	4	4	1
A 1437 G	0,25	0,25	0,125
A 1437H	1	1	0,5
Amphomycin	4	4	2

Związki K, L, M wykazują aktywność in vitro porównywalną ze związkami A - H.

Przykład XIa. Charakterystyka lipopeptydu A 1437 D

Lipopeptyd A 1437 D wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą

Wartość skręcalności: + 35° (c = 0,1; metanol)

HPLC: czas retencji: 15,1 minut

179 581

Aminokwasy: 2 kwasy asparaginowe asparagina β-metyloasparginian glicyny kwasy 2,3-diaminomasłowe prolina kwas pipekolinowy walina

FAB-MS: m/e = 1303, 6952 /(M+H)⁺/

Masa cząsteczkowa: 1302, 6884 (C₅₉H₉₄N₁₄O₁₉)

CID-MS: m/z = 356, 491, 517, 520, 741, 761, 938, 982

IR (Kbr): v = 3420 (br) cm'¹, 2930, 1660, 1530, 1450,1400.

Przykład XIb. Charakterystykalipopeptydu A 1437B

Lipopeptyd A 1437 B wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą

Wartość skręcalności: + 27° (c = 0,1; metanol)

HPLC: czas retencji: 12,8 minut

Aminokwasy : 3 kwasy asparaginowe β-metyloasparaginian glicyny kwasy 2,3-diaminomasłowe prolina kwas pipekolinowy walina

FAB-MS: m/e - /(M+H)⁺/

Masa cząsteczkowa: 1303 (C_S9H₉₃N_l3O₂₀)

CID-MS: m/z = 356,407, 518, 521, 741, 762, 938, 982

IR (KBr): δ = 3420 (br) cm'¹, 2925, 1650,1535, 1450, 1400.

Przykład XIc. Charakterystyka lipopeptydu A 1437 C

Lipopeptyd A 1437 C wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą

Wartość skręcalności: + 30° (c = 0,1; metanol)

HPLC: czas retencji: 14,1 minut

Aminokwasy: 2 kwasy asparaginowe asparagina β-metyloasparaginian glicyny kwasy 2,3-diaminomasłowe prolina kwas pipekolinowy walina

Masa cząsteczkowa: 1288 (CjgH^N^O^)

CID-MS: O m/z = 356, 392, 503, 741, 747, 938,981

IR (KBr): v= 3420 (br) cm'¹,2930,1660,1530, 1450, 1400.

Przykład XId. CharakterystykalipopeptyduA 1437A

Lipopeptyd A 1437 A wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą

Wartość skręcalności: + 30° (c = 0,1; metanol)

HPLC: czas retencji: 11,8 minut

Aminokwasy: 3 kwasy asparaginowe β-metyloasparaginian glicyny kwasy 2,3-diaminomasłowe prolina kwas pipekolinowy walina

179 581

Masa cząsteczkowa: 1289 (C_5gH_9IN₁₃O₂₀)

CID-MS: m/z = 356, 478, 504, 507, 741, 748, 938, 981

IR (KBr): v = 3420 (br) cm-', 2925, 1650,1535, 1450, 1400.

Przykład XIe. Charakterystykalipopeptydu A 1437F

Lipopeptyd A 1437 F wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą

Wartość skręcalności: + 31° (c = 0,1; metanol)

HPLC: czas retencji: 13,8 minut

Masa cząsteczkowa: 1288 (C₅₈H₉₂N₁₄O_l9)

CID-MS: m/z = 356, 392, 503, 506, 741, 747, 938, 981

IR (KBr): v= 3420 (br) cm*¹,2930,1660, 1530, 1450, 1400.

Przykład XIf. Charakterystyka lipopeptydu A 1437 E

Lipopeptyd A 1437 E wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą

HPLC: czas retencji: 11,5 minut

Masa cząsteczkowa: 1289 (C₅₈H₉₁N_t3O₂₀)

CID-MS: m/z - 356, 393, 504, 507, 741, 748, 938, 981

IR (KBr): v= 3420 (br) cm-', 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

Przykład XIg. Charakterystyka lipopeptydu A 1437 H

Lipopeptyd A 1437 H wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą

Wartość skręcalności: + 32° (c = 0,1; metanol)

HPLC: czas retencji: 15,9 minut

Masa cząsteczkowa: 1316 (C^H^N^O^)

CID-MS: m/z = 356,420, 531, 534, 741, 775, 938, 981

IR (KBr): v= 3420 (br) cm'¹, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400.

Przykład XIh. Charakterystyka lipopeptydu A 1437 G

Lipopeptyd A 1437 G wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą

Wartość skręcalności: + 34° (c = 0,1; metanol)

HPLC: czas retencji: 13,6 minut

179 581

Masa cząsteczkowa: 1317 (C₆₀H₉₅N₁₃O₂₀)

CID-MS: m/z = 356, 421, 532, 535, 741, 776, 938, 981

IR (KBr): v = 3420 (br) cm'¹, 2925,1650,1535,1450,1400.

Przykład XIi. Charakterystyka lipopeptydu A 1437 K

Lipopeptyd A 1437 K wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą

HPLC: czas retencji: 12,5 minut

Aminokwasy: 3 kwasy asparaginowe β-metyloasparaginian glicyny kwasy 2,3-diaminomasłowe prolina pipekolina walina

FAB-MS: m/e = /(M+H)⁺/

Masa cząsteczkowa: 1299 (C₅₈H9]N₁₃O₂₀)

CID-MS: m/z = 393, 504, 507, 741, 748, 938, 981

IR (KBr): v= 3420 (br) cm-', 2925,1650,1535,1450, 1400.

Przykład XIj. Charakterystyka lipopeptydu A 1437 L

Lipopeptyd A 1437 L wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą

HPLC: czas retencji: 13,0 minut

FAB-MS: m/e = /(M+H)7

Masa cząsteczkowa: 1289 (C₅₉H₉₃N₁₃O₂₀)

CID-MS: m/z = 407, 518, 741, 761, 938, 981

IR (KBr): v= 3420 (br) cm'¹, 2925, 1650,1535,1450, 1400.

Przykład XIk. Charakterystyka lipopeptydu A 1437 M

Lipopeptyd A 1437 M wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą

HPLC: czas retencji: 9,8 minut

FAB-MS: m/e = /(M+H)7

Masa cząsteczkowa: 1275 (C₅₇H₈₉N₍₃O₂₀)

CID-MS: m/z = 379, 490, 493, 724, 741,938, 981

179 581

IR (KBr): v= 3420 (br) cm*¹, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

Przykład XII. C₁₃-chemiczneprzesunięcia

W poniższej tabeli pokazane są C₁₃-chemiczne przesunięcia sygnałów CH lipopeptydu A 1437B

Aby umożliwić porówanie z danymi *H, podano NH-chemiczne związki sygnałów NH albo dla Pip i Pro Ca- H-przesunięcia odpowiednich układów spinowych.

Tabela 3

Zaszeregowanie	Dab	Gly	MeAsp	Gly	Asp	Asp	Asp	Dab	Val	Pro	Pip
NH/Ca	8,30	8,43	8,19	8,12	8,09	7,96	8,15	7,87	7,30	4,13	4,62
a	56,00	44,60	41,20	44,70	52,00	53,10	53,00	55,60	59,20	62,40	56,80
β	50,10		14,40		36,10	35,60	36,30	47,80	31,30	30,80	27,20
Z	16,00							20,10	18,9 19,7	26,00	20,60
δ										49,40	24,90
θ											45,00

179 581

’ I

C Q

d) </)

179 581

NZOR 4

179 581

WZÓR 7

WZÓR 8

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Lipopeptydy o wzorze 1, w którym

R¹ oznacza jednokrotnie albo wielokrotnie nienasycony, nasycony albo niezależnie od tego rozgałęziony albo nierozgałęziony łańcuch kwasu tłuszczowego, albo kwasu hydroksytłuszczowego o długości łańcuchów 6 do 22 włącznie atomów węgla.
2. Lipopeptydy według zastrz. 1, znamienne tym, że R¹ oznacza łańcuch zawierający 10 do 20 włącznie atomów węgla.
3. Lipopeptydy według zastrz. 1, znamienne tym, że R¹ oznacza łańcuch zawierający 12-15 atomów węgla.
4. Lipopeptydy według zastrz. 1, znamienne tym, że R¹ oznacza łańcuch

a) kwasu iC₁₃-tłuszczowego,

b) kwasu iC|₄-tłuszczowego,

c) kwasu aiC₁₃-tłuszczowego,

d) kwasu aiC_]5-tłuszczowego,
5. Lipopeptydy według zastrz. 4, znamienne tym, że R¹ oznacza grupę o wzorze 2.
6. Lipopeptydy według zastrz. 3, znamienne tym, że R¹ oznacza grupę o wzorze 3.
7. Lipopeptydy według zastrz. 4, znamienne tym, że R¹ oznacza grupę o wzorze 4.
8. Lipopeptydy według zastrz. 4, znamienne tym, że R’ oznacza grupę o wzorze 5.
9. Sposób wytwarzania lipopeptydów o wzorze 1, w którym R¹ oznacza jednokrotnie albo wielokrotnie nienasycony, nasycony albo niezależnie od tego rozgałęziony albo nierozgałęziony łańcuch kwasu tłuszczowego, albo kwasu hydroksytłuszczowego o długości łańcuchów 6 do 22 włącznie atomów węgla, znamienny tym, że fermentuje się Actinoplanes sp. w pożywce aż do nagromadzenia się w tej pożywce jednego albo więcej lipopeptydów i oczyszcza się z pożywki lipopeptydy o wzorze 1.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że oczyszczanie przeprowadza się, wytrącając lipopeptydy z pożywki stosując kwasy, przy pH 0,5 do 4 włącznie, potem ewentualnie otrzymane z wytrącenia lipopeptydy oczyszcza się przez chromatografię na wymieniaczach anionowych albo chromatografię na hydrofobowej matrycy, przy czym obydwie chromatografie przeprowadza się alternatywnie albo jedną po drugiej w dowolnej kolejności.
11. Sposób według zastrz. 9 albo 10, znamienny tym, że fermentuje się Actinoplanes sp. DSM 7358.
12. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną i ew. farmaceutyczne nośniki, znamienna tym, że substancję aktywną stanowi jeden albo więcej lipopeptydów o wzorze 1, w którym R¹ oznacza jednokrotnie albo wielokrotnie nienasycony, nasycony albo niezależnie od tego rozgałęziony albo nierozgałęziony łańcuch kwasu tłuszczowego, albo kwasu hydroksytłuszczowego o długości łańcuchów 6 do 22 włącznie atomów węgla i ewentualnie farmaceutyczne nośniki.
13. Substancja farmakologicznie czynna, zwłaszcza jako antybiotyk przeciw bakteriom Gram-dodatnim, szczególnie korzystnie przeciw bakteriom opornym wobec glikopeptydu, znamienna tym, że zawiera lipopeptyd o wzorze 1, w którym R‘ oznacza jednokrotnie albo wielokrotnie nienasycony, nasycony albo niezależnie od tego rozgałęziony albo nierozgałęziony łańcuch kwasu tłuszczowego, albo kwasu hydroksytłuszczowego o długości łańcuchów 6 do 22 włącznie atomów węgla.

179 581

Wynalazek dotyczy lipopeptydów o homologicznych sekwencjach aminokwasowych, jednak o różnych resztach kwasów tłuszczowych (część lipidowa), które syntetyzuje się z Actinoplanes sp. podczas fermentacji i które są oddawane do pożywki, sposobu wyodrębniania lipopeptydów z pożywki i oczyszczania ich, zastosowania lipopeptydów jako farmaceutycznych substancji czynnych, zwłaszcza przeciwko bakteriom Gram-dodatnim.

Wtórne metabolity z mikroorganizmów stosuje się skutecznie do leczenia chorób zakaźnych. W przypadku wtórnych metabolitów chodzi o małocząsteczkowe związki, których tworzenie następuje na “biosyntetycznych drogach jednokierunkowych”, które odgałęziają się od pierwotnego metabolizmu, i których funkcja dla każdorazowych producentów jest niewyjaśniona. Do dzisiaj jest znanych około 8000 wtórnych metabolitów wyodrębnionych z hodowli różnych mikroorganizmów, przede wszystkim grzybów i bakterii gatunku Streptomyces.

Główną dziedziną zastosowania tych wtórnych metabolitów jest leczenie chorób zakaźnych. Jednak przez szerokie użycie ich dochodzi często do wytworzenia oporności, tak że istniej e ciągłe zapotrzebowanie na nowe antybiotyki i substancje czynne o nowych mechanizmach działania (Neu H.C., Science 257, 1992, strony 1064 - 1073).

Oprócz tego zakres wskazań mikrobiologicznych substancji czynnych rozszerzył się również na choroby, których nie zalicza się do chorób zakaźnych, np. leczenie nowotworów, immunomodulacja albo do regulowania przemiany tłuszczowej oraz na ochronę roślin jak środki chwastobójcze i owadobójcze. Stosowane substancje czynne są oczywiście często jeszcze obciążone wadami charakteryzującymi się niezadowalającymi poziomami działania, zbyt wysoką toksycznością i/lub niepożądanymi działaniami ubocznymi.

W literaturze opisane są lipopeptydy, których część aminokwasowa odnośnie sekwencji jest identyczna z lipopeptydami według wynalazku albo odnośnie składu aminokwasów jest jednakowa lub bardzo podobna do lipopeptydów według wynalazku. Te lipopeptydy różnią się jednak zasadniczo od lipopeptydów według wynalazku w części lipidowej.

Przykłady tych lipopeptydów stanowią:

- Amphomycin Antibiot. /J. Antibiotics, 38, strona 517 (1965)/,

- Glumamycin /J. Antibiotics, 38, strona 517 (1965)/,

- Zaomycin /J. Antibiot. Ann., strona 194 (1960)/,

- Aspartocin /Antibiot. Ann. 194 (1960)/,

- Tsuhimycin /J. Antibiotics, 21, strona 439 (1968)/,

- Laspartomycin /J. Antibiotics 21, strona 55 (1968)/.

Te lipopeptydy, które są określane jako lipopeptydy typu Amphomycin, syntetyzowane są przez mikroorganizmy gatunku Streptomyces. Swą antybiotyczną skuteczność rozwijają one przeciwko bakteriom Gram-dodatnim, jak np. Strepto-, Staphylo- i Enterococcus. Szczególnie szczepy gatunków Staphylo- i Enterococcus okazały się w ostatnim czasie “zarazkami problemowymi”. Przez zarazki problemowe specjalista rozumie takie mikroorganizmy, których efektywne zwalczanie na podstawie oporności nie jest możliwe powszechnie stosowanymi antybiotykami, np. β-laktamoantybiotykami albo glikopeptydo-antybiotykami, jak na przykład Vancomycin albo Teikoplanin.

Grupą szczepów mikroorganizmów, które wykształciły oporności, sąnp. oporne na Methicillin'ę szczepy Staphylococcus aureus, nazywane krótko szczepy MRSA. Tymczasem wiadomo, że te szczepy MRSA często wykształcały oporności nie tylko wobec Methicillin'y, lecz poza tym wobec dalszych antybiotyków, np. Vancomycin'y.

Pominąwszy już wymienione związki ze Streptomyceten, znany jest związek z Actinoplanes nipponensis ATCC 31 145, który na podstawie swego spektrum działania oraz opisanych właściwości fizyko-chemicznych wykazuje strukturalne podobieństwa z lipopeptydami według wynalazku i określany jest jako związek 41.012 (patent US 4.000.397). Fermentacja Actinoplanes nipponensis ATCC 31 145 w różnych warunkach hodowli prowadzi ciągle do względnie niskich wydajności związku 41.012.

Zadaniem wynalazku jest wynalezienie mikrobiologicznych surowców naturalnych o poprawionych właściwościach.

179 581

Zadanie to rozwiązano według wynalazku przez fermentację Actioplanes sp. w pożywce płynnej ze źródłem węgla i azotu oraz zwykłymi solami nieorganicznymi, aż do nagromadzenia się w pożywce lipopeptydów, korzystnie lipopeptydów A 1437, następne wyodrębnienie lipopeptydów z pożywki i ewentualnie rozdzielenie mieszaniny na jej poszczególne składniki. Lipopeptydy wykazują farmakologiczną aktywność, a zatem terapeutyczną skuteczność i można je stosować jako antybiotyki o działaniu przeciwko bakteriom Gram-dodatnim, zwłaszcza przeciwko szczepom opornym wobec glikopeptydów.