JP2660161B2 - 薬理活性を有するアクチノプラネスｓｐ．由来のリポペプチド、その生産方法およびその使用 - Google Patents
薬理活性を有するアクチノプラネスｓｐ．由来のリポペプチド、その生産方法およびその使用Info
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- C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
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- A61P31/04—Antibacterial agents
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【０００１】本発明は、アクチノプラネス（Actinoplan
es）sp.により発酵中に合成されそして培地中に放出さ
れる、極めて相同のアミノ酸配列ではあるが異なる脂肪
酸残基（脂質部分）を有するリポペプチド、それらリポ
ペプチドを培地から単離しそしてそれらを精製する方
法、それらリポペプチドの、特にグラム−陽性細菌に対
する、薬理活性物質としての使用、および前記リポペプ
チドを生産するためのアクチノプラネスsp. ＤＳＭ７３
５８に関する。
es）sp.により発酵中に合成されそして培地中に放出さ
れる、極めて相同のアミノ酸配列ではあるが異なる脂肪
酸残基（脂質部分）を有するリポペプチド、それらリポ
ペプチドを培地から単離しそしてそれらを精製する方
法、それらリポペプチドの、特にグラム−陽性細菌に対
する、薬理活性物質としての使用、および前記リポペプ
チドを生産するためのアクチノプラネスsp. ＤＳＭ７３
５８に関する。
【０００２】微生物からの二次代謝産物は感染症の治療
にうまく用いられている。二次代謝産物は低分子量化合
物であって、その生産は一次代謝から分岐した「生合成
一方通行道路（biosynthetic one-way streets）」で行
われ、またその特定の生産体に対する機能は明確となっ
ていない。今日までに、各種微生物（特にストレプトマ
イセス（Streptomyces属の細菌および真菌）の培養物か
ら単離された約８０００の二次代謝産物が知られてい
る。
にうまく用いられている。二次代謝産物は低分子量化合
物であって、その生産は一次代謝から分岐した「生合成
一方通行道路（biosynthetic one-way streets）」で行
われ、またその特定の生産体に対する機能は明確となっ
ていない。今日までに、各種微生物（特にストレプトマ
イセス（Streptomyces属の細菌および真菌）の培養物か
ら単離された約８０００の二次代謝産物が知られてい
る。
【０００３】これらの二次代謝産物の主な使用分野は感
染症の治療である。しかしながら、広く使用されている
ことから、耐性がしばしば発生するため、新しい作用機
序を有する新しい抗生物質および活性物質が絶えず必要
とされている（Neu H.C., Science 257, 1992, pp. 106
4-1073）。
染症の治療である。しかしながら、広く使用されている
ことから、耐性がしばしば発生するため、新しい作用機
序を有する新しい抗生物質および活性物質が絶えず必要
とされている（Neu H.C., Science 257, 1992, pp. 106
4-1073）。
【０００４】更に、微生物由来活性物質の適応症分野
は、感染症には包含されない疾病（例えば腫瘍治療、免
疫調整または脂質代謝調節）および収穫物防護（除草剤
および殺虫剤）にも及んでいる。しかしながら、使用さ
れる活性物質は、依然としてしばしば、不十分な効果水
準、過度の毒性および／または望ましくない副作用によ
り特徴付けられる欠点を伴っている。
は、感染症には包含されない疾病（例えば腫瘍治療、免
疫調整または脂質代謝調節）および収穫物防護（除草剤
および殺虫剤）にも及んでいる。しかしながら、使用さ
れる活性物質は、依然としてしばしば、不十分な効果水
準、過度の毒性および／または望ましくない副作用によ
り特徴付けられる欠点を伴っている。
【０００５】アミノ酸成分が、本発明のリポペプチド
と、配列上同一であるか、またはアミノ酸組成上同じか
極めて類似しているリポペプチドは文献に記載されてい
る。しかしながら、これらのリポペプチドは脂質部分に
おいて本発明のリポペプチドとは基本的に相違してい
る。
と、配列上同一であるか、またはアミノ酸組成上同じか
極めて類似しているリポペプチドは文献に記載されてい
る。しかしながら、これらのリポペプチドは脂質部分に
おいて本発明のリポペプチドとは基本的に相違してい
る。
【０００６】前述のリポペプチドの例は次のとおりであ
る： −アンホマイシン（Amphomycin）抗生物質。〔J. Antib
iotics, 38, p. 517(1965)〕； −グルママイシン（Glumamycin）〔J. Antibiotics, 3
8, p. 517(1965)〕； −ザオマイシン（Zaomycin）〔J. Antibiot. Ann., p.
194(1960)〕； −アスパルトシン（Aspartocin）〔Antibiot. Ann., 19
4(1960)〕； −ツシマイシン（Tsushimycin）〔J. Antibiotics, 21,
p. 439(1968)〕； −ラスパルトマイシン（Laspartomycin）〔J. Antibiot
ics 21, p. 55(1968)〕。
る： −アンホマイシン（Amphomycin）抗生物質。〔J. Antib
iotics, 38, p. 517(1965)〕； −グルママイシン（Glumamycin）〔J. Antibiotics, 3
8, p. 517(1965)〕； −ザオマイシン（Zaomycin）〔J. Antibiot. Ann., p.
194(1960)〕； −アスパルトシン（Aspartocin）〔Antibiot. Ann., 19
4(1960)〕； −ツシマイシン（Tsushimycin）〔J. Antibiotics, 21,
p. 439(1968)〕； −ラスパルトマイシン（Laspartomycin）〔J. Antibiot
ics 21, p. 55(1968)〕。
【０００７】これらのリポペプチドはアンホマイシン型
リポペプチドと呼ばれ、ストレプトマイセス属の微生物
によって合成される。それらはグラム−陽性細菌例えば
連鎖球菌、ブドウ球菌およびエンテロコッカスなどに対
して抗生物活性を示す。近時、とりわけブドウ球菌およ
びエンテロコッカス属がますます問題となる生物である
ことがわかってきた。当業者によれば問題となる生物と
は従来の抗生物質（例えばβ−ラクタム抗生物質または
グリコペプチド抗生物質例えばバンコマイシン（vancom
ycin）またはテイコプラニン（teikoplanin)）に対する
耐性のために現在のところ効率的にコントロールできな
い微生物のことと理解されている。
リポペプチドと呼ばれ、ストレプトマイセス属の微生物
によって合成される。それらはグラム−陽性細菌例えば
連鎖球菌、ブドウ球菌およびエンテロコッカスなどに対
して抗生物活性を示す。近時、とりわけブドウ球菌およ
びエンテロコッカス属がますます問題となる生物である
ことがわかってきた。当業者によれば問題となる生物と
は従来の抗生物質（例えばβ−ラクタム抗生物質または
グリコペプチド抗生物質例えばバンコマイシン（vancom
ycin）またはテイコプラニン（teikoplanin)）に対する
耐性のために現在のところ効率的にコントロールできな
い微生物のことと理解されている。
【０００８】耐性を生じた一群の微生物株の一例として
ＭＲＳＡ株と略記されるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌
株が挙げられる。現在、これらＭＲＳＡ株がしばしばメ
チシリンだけでなく他の抗生物質（例えばバンコマイシ
ン）に対しても耐性を生じることが知られている。
ＭＲＳＡ株と略記されるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌
株が挙げられる。現在、これらＭＲＳＡ株がしばしばメ
チシリンだけでなく他の抗生物質（例えばバンコマイシ
ン）に対しても耐性を生じることが知られている。
【０００９】ストレプトマイセス由来の前記化合物とは
別に、その作用スペクトルおよび記載された物理化学的
性質から、本発明のリポペプチドと構造類似しそして化
学的４１．０１２と称されるアクチノプラネス・ニッポ
ンエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｎｉｐｐｏｎ
ｅｓｉｓ）ＡＴＣＣ３１１４５由来の化合物が知られて
いる（米国特許第４，０００，３９７号）。アクチノプ
ラネス・ニッポンエンシスＡＴＣＣ ３１１４５を様々
な培養条件下で発酵させても常に比較的低い収量でしか
化合物４１．０１２は得られない。
別に、その作用スペクトルおよび記載された物理化学的
性質から、本発明のリポペプチドと構造類似しそして化
学的４１．０１２と称されるアクチノプラネス・ニッポ
ンエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｎｉｐｐｏｎ
ｅｓｉｓ）ＡＴＣＣ３１１４５由来の化合物が知られて
いる（米国特許第４，０００，３９７号）。アクチノプ
ラネス・ニッポンエンシスＡＴＣＣ ３１１４５を様々
な培養条件下で発酵させても常に比較的低い収量でしか
化合物４１．０１２は得られない。
【００１０】本発明の目的は改善された性質を有する微
生物由来天然物質を探索することにある。この目的は、
本発明に従って、アクチノプラネスsp.を炭素源および
窒素源のほか慣用の無機塩を含む栄養溶液中で発酵させ
てリポペプチド、好ましくはリポペプチドＡ１４３７、
を培地中に蓄積させ、次いでその培地からリポペプチド
を単離しそして適切な場合には、混合物を個別成分に分
離することにより達成される。それらリポペプチドは薬
理活性、従って治療効能を有し、そしてグラム−陽性細
菌、好ましくはグリコリポペプチド−耐性株、に対して
作用する抗生物質として用いることができる。
生物由来天然物質を探索することにある。この目的は、
本発明に従って、アクチノプラネスsp.を炭素源および
窒素源のほか慣用の無機塩を含む栄養溶液中で発酵させ
てリポペプチド、好ましくはリポペプチドＡ１４３７、
を培地中に蓄積させ、次いでその培地からリポペプチド
を単離しそして適切な場合には、混合物を個別成分に分
離することにより達成される。それらリポペプチドは薬
理活性、従って治療効能を有し、そしてグラム−陽性細
菌、好ましくはグリコリポペプチド−耐性株、に対して
作用する抗生物質として用いることができる。
【００１１】すなわち、本発明は、以下に関するもので
ある： １．アクチノプラネスsp.を培地中で発酵させて式Ｉ
ある： １．アクチノプラネスsp.を培地中で発酵させて式Ｉ
【化６】 （式中、Ｒ1は一重または多重不飽和の、飽和の、また
はそれとは無関係に分枝状のまたは非分枝状の、６〜２
２個の炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはヒドロキシ
脂肪酸であり、そしてＲ2はＡｓｐまたはＡｓｎであ
る）で示される一種またはそれ以上のリポペプチドを培
地中に蓄積させ、そして適切な場合には式Ｉで示される
一種またはそれ以上のリポペプチドを培地から精製して
得られるリポペプチド（ただし、式ＩにおいてＲ1が
はそれとは無関係に分枝状のまたは非分枝状の、６〜２
２個の炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはヒドロキシ
脂肪酸であり、そしてＲ2はＡｓｐまたはＡｓｎであ
る）で示される一種またはそれ以上のリポペプチドを培
地中に蓄積させ、そして適切な場合には式Ｉで示される
一種またはそれ以上のリポペプチドを培地から精製して
得られるリポペプチド（ただし、式ＩにおいてＲ1が
【化７】 であり、そしてＲ2がＡｓｐであるリポペプチドを除
く）。
く）。
【００１２】２．アクチノプラネスsp.を培地中で発酵
させて a) iC13-脂肪酸-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-
Dab-Val-Pro、 b) iC14-脂肪酸-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-
Dab-Val-Pro、 c) iC13-脂肪酸-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-
Dab-Val-Pro、 d) iC14-脂肪酸-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-
Dab-Val-Pro、 e) aiC13-脂肪酸-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly
-Dab-Val-Pro、 f) aiC15-脂肪酸-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly
-Dab-Val-Pro、 g) aiC15-脂肪酸-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly
-Dab-Val-Pro、 h) nC12-脂肪酸-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-
Dab-Val-Pro、 i) nC13-脂肪酸-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-
Dab-Val-Pro、 j) nC14-脂肪酸-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-
Dab-Val-Pro なる群の一種またはそれ以上のリポペプチドを培地中に
蓄積させ、そして適切な場合には、これらリポペプチド
の一種またはそれ以上を培地から精製して得られるリポ
ペプチド。
させて a) iC13-脂肪酸-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-
Dab-Val-Pro、 b) iC14-脂肪酸-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-
Dab-Val-Pro、 c) iC13-脂肪酸-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-
Dab-Val-Pro、 d) iC14-脂肪酸-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-
Dab-Val-Pro、 e) aiC13-脂肪酸-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly
-Dab-Val-Pro、 f) aiC15-脂肪酸-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly
-Dab-Val-Pro、 g) aiC15-脂肪酸-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly
-Dab-Val-Pro、 h) nC12-脂肪酸-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-
Dab-Val-Pro、 i) nC13-脂肪酸-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-
Dab-Val-Pro、 j) nC14-脂肪酸-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-
Dab-Val-Pro なる群の一種またはそれ以上のリポペプチドを培地中に
蓄積させ、そして適切な場合には、これらリポペプチド
の一種またはそれ以上を培地から精製して得られるリポ
ペプチド。
【００１３】３．式II R1-R2-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro II （式中、
【化８】
【００１４】
【化９】 で示されるリポペプチド。
【００１５】４．アクチノプラネスsp.を培地中で発酵
させて一種またはそれ以上のリポペプチドを培地中に蓄
積させ、そして適切な場合には一種またはそれ以上のリ
ポペプチドを培地から精製することより成る、１.に記
載の式Ｉで示される一種またはそれ以上のリポペプチ
ド、２.に記載の一種またはそれ以上のリポペプチド、
または３.に記載の式IIで示される一種またはそれ以上
のリポペプチドの製造方法。
させて一種またはそれ以上のリポペプチドを培地中に蓄
積させ、そして適切な場合には一種またはそれ以上のリ
ポペプチドを培地から精製することより成る、１.に記
載の式Ｉで示される一種またはそれ以上のリポペプチ
ド、２.に記載の一種またはそれ以上のリポペプチド、
または３.に記載の式IIで示される一種またはそれ以上
のリポペプチドの製造方法。
【００１６】５．式Ｉで示されるリポペプチドの、薬理
活性物質としての、特に、グラム−陽性細菌に対する、
特に好ましくはグリコペプチド−耐性細菌に対する抗生
物質としての使用。
活性物質としての、特に、グラム−陽性細菌に対する、
特に好ましくはグリコペプチド−耐性細菌に対する抗生
物質としての使用。
【００１７】６．式III R1-R2-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro III （式中、Ｒ1は
【化１０】 であり、そしてＲ2はＡｓｐである）で示されるリポペ
プチドの、薬理活性物質としての、特に、グラム−陽性
細菌に対する、特に好ましくはグリコペプチド−耐性細
菌に対する抗生物質としての使用。 ７．アクチノプラネスsp. ＤＳＭ７３５８。
プチドの、薬理活性物質としての、特に、グラム−陽性
細菌に対する、特に好ましくはグリコペプチド−耐性細
菌に対する抗生物質としての使用。 ７．アクチノプラネスsp. ＤＳＭ７３５８。
【００１８】本発明を以下、特にその好ましい態様で詳
述する。本発明は更に特許請求の範囲により規定され
る。 用語の定義： −Ｄａｂは２,３−ジアミノ酪酸を意味し； −Ｐｉｐはピペコリン酸（同義語＝ホモプロリン）を意
味し； −ＭｅＡｓｐはβ−メチルアスパルテートを意味し； −Ｇｌｙはグリシンを意味し； −Ａｓｎはアスパラギンを意味し； −Ａｓｐはアスパラギン酸を意味し； −Ｖａｌはバリンを意味し； −Ｐｒｏはプロリンを意味し； −ｎはノーマル／非分枝状を意味し、そして −ＣＩＤは動的崩壊（collisional induced decay）を
意味する。
述する。本発明は更に特許請求の範囲により規定され
る。 用語の定義： −Ｄａｂは２,３−ジアミノ酪酸を意味し； −Ｐｉｐはピペコリン酸（同義語＝ホモプロリン）を意
味し； −ＭｅＡｓｐはβ−メチルアスパルテートを意味し； −Ｇｌｙはグリシンを意味し； −Ａｓｎはアスパラギンを意味し； −Ａｓｐはアスパラギン酸を意味し； −Ｖａｌはバリンを意味し； −Ｐｒｏはプロリンを意味し； −ｎはノーマル／非分枝状を意味し、そして −ＣＩＤは動的崩壊（collisional induced decay）を
意味する。
【００１９】略語「ｉ」は「イソ（iso）」を表わし、
また「ai」は「アンテ−イソ（ante-iso）」を意味す
る。これらの定義は脂肪酸に関連して当業者に知られて
いる（Biochemistry, Zubay, Addison Weslay発行、ロ
ンドン、アムステルダム、１９８３年）。特に断りのな
い限り、すべての百分率データは重量に関するものであ
る。特に断りのない限り、液体の混合比は容量に関する
ものである。本発明による方法は実験室規模（ミリリッ
トル〜リットル範囲）および工業規模（立方メートル規
模）の発酵に用いることができる。
また「ai」は「アンテ−イソ（ante-iso）」を意味す
る。これらの定義は脂肪酸に関連して当業者に知られて
いる（Biochemistry, Zubay, Addison Weslay発行、ロ
ンドン、アムステルダム、１９８３年）。特に断りのな
い限り、すべての百分率データは重量に関するものであ
る。特に断りのない限り、液体の混合比は容量に関する
ものである。本発明による方法は実験室規模（ミリリッ
トル〜リットル範囲）および工業規模（立方メートル規
模）の発酵に用いることができる。
【００２０】アクチノプラネスsp.は土壌試料から単離
される。土壌からの精製には、土壌を生理学的ＮａＣｌ
溶液（０.９％）を用いて懸濁し連続希釈液を調製す
る。それら各種希釈液（１０0〜１０6）を次いでアクチ
ノマイセス栄養培地上にプレートする。培養物を３０℃
で２〜１４日間インキュベートして得られるアクチノマ
イセスコロニーはプレートし、そして複数の逐次精製工
程により単離することができる。属は当業者に知られた
形態学的および分類学的基準に基づいて決定される。ア
クチノプラネス属に特に特徴的なのは運動性胞子であ
る。
される。土壌からの精製には、土壌を生理学的ＮａＣｌ
溶液（０.９％）を用いて懸濁し連続希釈液を調製す
る。それら各種希釈液（１０0〜１０6）を次いでアクチ
ノマイセス栄養培地上にプレートする。培養物を３０℃
で２〜１４日間インキュベートして得られるアクチノマ
イセスコロニーはプレートし、そして複数の逐次精製工
程により単離することができる。属は当業者に知られた
形態学的および分類学的基準に基づいて決定される。ア
クチノプラネス属に特に特徴的なのは運動性胞子であ
る。
【００２１】逐次単離・精製に基づいて、アクチノプラ
ネスsp.から、本発明によるリポペプチドの一種または
それ以上の化合物、好ましくはリポペプチドＡ１４３７
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌおよび／また
はＭを培地に極めて効率的に放出し、そして主生産体と
称されるコロニーを単離することができる。
ネスsp.から、本発明によるリポペプチドの一種または
それ以上の化合物、好ましくはリポペプチドＡ１４３７
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌおよび／また
はＭを培地に極めて効率的に放出し、そして主生産体と
称されるコロニーを単離することができる。
【００２２】主生産体とは、本発明によるリポペプチド
の一種またはそれ以上の化合物を、同じアクチノプラネ
ススピーシーズの単離物の場合の１０〜１００倍の量で
生産しあるいは培地中に放出する単離物に付与される名
称である。
の一種またはそれ以上の化合物を、同じアクチノプラネ
ススピーシーズの単離物の場合の１０〜１００倍の量で
生産しあるいは培地中に放出する単離物に付与される名
称である。
【００２３】アクチノプラネスsp.の強生産性コロニー
を増殖させる。単離物はDeutsche Sammlung von Mikroo
rganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1
B, 3300 Braunschweig, ドイツに１９９０年６月１８日
にブタペスト条約規則に従って次の番号の下に寄託され
た： アクチノプラネスsp. ＤＳＭ７３５８。アクチノプラネ
スsp. ＤＳＭ７３５８は橙色菌糸体を有し、また球形胞
子嚢により特徴付けられる。
を増殖させる。単離物はDeutsche Sammlung von Mikroo
rganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1
B, 3300 Braunschweig, ドイツに１９９０年６月１８日
にブタペスト条約規則に従って次の番号の下に寄託され
た： アクチノプラネスsp. ＤＳＭ７３５８。アクチノプラネ
スsp. ＤＳＭ７３５８は橙色菌糸体を有し、また球形胞
子嚢により特徴付けられる。
【００２４】炭素源および窒素源のほか慣用の無機塩を
含む栄養溶液（培地ともいう）中で、アクチノプラネス
sp.、好ましくはＤＳＭ７３５８、は本発明によるリポ
ペプチドの一種またはそれ以上の化合物を生産する。
含む栄養溶液（培地ともいう）中で、アクチノプラネス
sp.、好ましくはＤＳＭ７３５８、は本発明によるリポ
ペプチドの一種またはそれ以上の化合物を生産する。
【００２５】ＤＳＭ７３５８株に代えて、本発明のリポ
ペプチドの一種またはそれ以上の化合物を合成するその
突然変異体（mutant）および変種（variant）を使用す
ることもできる。このタイプの突然変異体は自体知られ
た方法で、物理的手段例えば照射例えば紫外またはＸ線
照射、または化学変異原物質例えばエチルメタンスルホ
ネート（ＥＭＳ）、２−ヒドロキシ−４−メトキシベン
ゾフェノン（ＭＯＢ）またはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）により生成され
得る。
ペプチドの一種またはそれ以上の化合物を合成するその
突然変異体（mutant）および変種（variant）を使用す
ることもできる。このタイプの突然変異体は自体知られ
た方法で、物理的手段例えば照射例えば紫外またはＸ線
照射、または化学変異原物質例えばエチルメタンスルホ
ネート（ＥＭＳ）、２−ヒドロキシ−４−メトキシベン
ゾフェノン（ＭＯＢ）またはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）により生成され
得る。
【００２６】本発明のリポペプチドの一種またはそれ以
上の化合物を合成する突然変異体および変種のスクリー
ニングは次のスキームに従って行われる： −発酵後、菌糸体を除去する； −pH１〜２（４℃）でリポペプチドを沈殿させる； −その沈殿をＨ2Ｏ／ＭｅＯＨ（１：１）にとる； −ＨＰＬＣ、ＴＬＣまたは阻止ゾーン試験により分析す
る。 後述する発酵条件はアクチノプラネスsp.、寄託した単
離物ＤＳＭ７３５８およびこれらの突然変異体および変
種に適合する。
上の化合物を合成する突然変異体および変種のスクリー
ニングは次のスキームに従って行われる： −発酵後、菌糸体を除去する； −pH１〜２（４℃）でリポペプチドを沈殿させる； −その沈殿をＨ2Ｏ／ＭｅＯＨ（１：１）にとる； −ＨＰＬＣ、ＴＬＣまたは阻止ゾーン試験により分析す
る。 後述する発酵条件はアクチノプラネスsp.、寄託した単
離物ＤＳＭ７３５８およびこれらの突然変異体および変
種に適合する。
【００２７】炭素源および窒素源のほかに慣用される無
機塩を含む栄養溶液中で、アクチノプラネスsp.、好ま
しくはＤＳＭ７３５８、は本発明のリポペプチドの一種
またはそれ以上の化合物、好ましくはリポペプチドＡ１
４３７Ａ〜ＨおよびＫ、ＬおよびＭを生産する。
機塩を含む栄養溶液中で、アクチノプラネスsp.、好ま
しくはＤＳＭ７３５８、は本発明のリポペプチドの一種
またはそれ以上の化合物、好ましくはリポペプチドＡ１
４３７Ａ〜ＨおよびＫ、ＬおよびＭを生産する。
【００２８】好気発酵に適した好ましい炭素源は同化可
能な炭水化物および糖アルコール例えばグルコース、ラ
クトースまたはＤ−マンニトール、および炭水化物含有
天然物例えば麦芽エキスなどである。適当な含窒素栄養
素は次のとおりである：アミノ酸、ペプチドおよびタン
パク質およびそれらの分解物例えばペプトンまたはトリ
プトン、更には肉エキス、例えばコーン、小麦、豆（be
ans）、大豆または綿の木の種子粉砕物、アルコール生
産で得られる蒸留残渣、肉粉または酵母エキス、または
アンモニウム塩および硝酸塩など。栄養溶液が含み得る
無機塩は、例えば、アルカリ金属またはアルカリ土類金
属、鉄、亜鉛、コバルトおよびマンガンの塩化物、炭酸
塩、硫酸塩または燐酸塩である。
能な炭水化物および糖アルコール例えばグルコース、ラ
クトースまたはＤ−マンニトール、および炭水化物含有
天然物例えば麦芽エキスなどである。適当な含窒素栄養
素は次のとおりである：アミノ酸、ペプチドおよびタン
パク質およびそれらの分解物例えばペプトンまたはトリ
プトン、更には肉エキス、例えばコーン、小麦、豆（be
ans）、大豆または綿の木の種子粉砕物、アルコール生
産で得られる蒸留残渣、肉粉または酵母エキス、または
アンモニウム塩および硝酸塩など。栄養溶液が含み得る
無機塩は、例えば、アルカリ金属またはアルカリ土類金
属、鉄、亜鉛、コバルトおよびマンガンの塩化物、炭酸
塩、硫酸塩または燐酸塩である。
【００２９】本発明によるリポペプチドの生産は、約
０.１〜５％、好ましくは０.３〜２％の肉エキスおよび
０.２〜５％、好ましくは０.５〜２％のスクロースおよ
び０.０５〜５ｇ／リットル、好ましくは０.１〜０.５
ｇ／リットルの酵母エキスおよび０.０５〜２ｇ／リッ
トル、好ましくは０.１〜１ｇ／リットルの硫酸マグネ
シウムおよび０.０５〜１０ｇ／リットル、好ましくは
０.１〜１ｇ／リットルの燐酸二水素カリウムまたはナ
トリウムおよび０〜１００μＭ、好ましくは５〜２０μ
Ｍの塩化鉄（III）を含有する栄養溶液中で特に良好に
行われる。百分率データは各々、完全な栄養溶液の重量
に基づく。
０.１〜５％、好ましくは０.３〜２％の肉エキスおよび
０.２〜５％、好ましくは０.５〜２％のスクロースおよ
び０.０５〜５ｇ／リットル、好ましくは０.１〜０.５
ｇ／リットルの酵母エキスおよび０.０５〜２ｇ／リッ
トル、好ましくは０.１〜１ｇ／リットルの硫酸マグネ
シウムおよび０.０５〜１０ｇ／リットル、好ましくは
０.１〜１ｇ／リットルの燐酸二水素カリウムまたはナ
トリウムおよび０〜１００μＭ、好ましくは５〜２０μ
Ｍの塩化鉄（III）を含有する栄養溶液中で特に良好に
行われる。百分率データは各々、完全な栄養溶液の重量
に基づく。
【００３０】この栄養溶液中で、アクチノプラネスs
p.、好ましくはアクチノプラネスＤＳＭ７３５８、は本
発明のリポペプチドの混合物を生産する。その混合物
は、好ましくは、１１種の異なる検出可能なリポペプチ
ドより成る。これらのリポペプチドをＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、
Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ＬおよびＭと呼ぶ。それらは次の
特徴を有している：
p.、好ましくはアクチノプラネスＤＳＭ７３５８、は本
発明のリポペプチドの混合物を生産する。その混合物
は、好ましくは、１１種の異なる検出可能なリポペプチ
ドより成る。これらのリポペプチドをＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、
Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ＬおよびＭと呼ぶ。それらは次の
特徴を有している：
【００３１】
【表１】
【００３２】
【表２】
【００３３】リポペプチドＡ１４３７Ａは、Ａ１４３７
Ｃと同様、アンホマイシン型リポペプチドではこれまで
に知られていないイソ−Ｃ13−脂肪酸を含有している。
Ａ１４３７Ａのアミノ酸配列はアンホマイシンのそれに
対応するが、後者はアンテ−イソ−Ｃ13−脂肪酸を含有
している。Ａ１４３７Ｃのアミノ酸組成および配列は他
のリポペプチドに知られていない。
Ｃと同様、アンホマイシン型リポペプチドではこれまで
に知られていないイソ−Ｃ13−脂肪酸を含有している。
Ａ１４３７Ａのアミノ酸配列はアンホマイシンのそれに
対応するが、後者はアンテ−イソ−Ｃ13−脂肪酸を含有
している。Ａ１４３７Ｃのアミノ酸組成および配列は他
のリポペプチドに知られていない。
【００３４】Ａ１４３７Ｂは、Ａ１４３７Ｄと同様、イ
ソ−Ｃ14型の脂肪酸、従ってツシマイシンに知られた脂
肪酸を含有している。しかしながら、Ａ１４３７Ｄはそ
のアミノ酸組成および配列がこれまで従来技術から知ら
れたリポペプチドと異なるのに対し、Ａ１４３７Ｂはア
ンホマイシンのアミノ酸配列を含有している。文献によ
れば、アンホマイシン、ザオマイシンおよびツシマイシ
ンはアミノ酸組成が同一である。
ソ−Ｃ14型の脂肪酸、従ってツシマイシンに知られた脂
肪酸を含有している。しかしながら、Ａ１４３７Ｄはそ
のアミノ酸組成および配列がこれまで従来技術から知ら
れたリポペプチドと異なるのに対し、Ａ１４３７Ｂはア
ンホマイシンのアミノ酸配列を含有している。文献によ
れば、アンホマイシン、ザオマイシンおよびツシマイシ
ンはアミノ酸組成が同一である。
【００３５】アクチノプラネスsp.、特にアクチノプラ
ネスＤＳＭ７３５８、由来のＡ１４３７Ｅは、ストレプ
トマイセスに知られるアンホマイシンと同一である。
ネスＤＳＭ７３５８、由来のＡ１４３７Ｅは、ストレプ
トマイセスに知られるアンホマイシンと同一である。
【００３６】Ａ１４３７Ｆはアンテ−イソ−Ｃ13−脂肪
酸より成り、従ってアンホマイシンに知られるものと同
じ脂肪酸タイプを含有している。そのアミノ酸配列およ
び組成は従来技術に知られていない。
酸より成り、従ってアンホマイシンに知られるものと同
じ脂肪酸タイプを含有している。そのアミノ酸配列およ
び組成は従来技術に知られていない。
【００３７】リポペプチドＡ１４３７ＧおよびＡ１４３
７Ｈは各々、アスパルトシンと同様、アンテ−イソ−Ｃ
15−脂肪酸を有している。Ａ１４３７Ｇのアミノ酸配列
はアンホマイシンのアミノ酸配列に相当するのに対し、
Ａ１４３７Ｈの配列および組成は従来技術に知られてい
ない。
７Ｈは各々、アスパルトシンと同様、アンテ−イソ−Ｃ
15−脂肪酸を有している。Ａ１４３７Ｇのアミノ酸配列
はアンホマイシンのアミノ酸配列に相当するのに対し、
Ａ１４３７Ｈの配列および組成は従来技術に知られてい
ない。
【００３８】Ａ１４３７Ｋ、ＬおよびＭはＣ12〜Ｃ14の
鎖長を有する非分枝状脂肪酸を有している。それら三種
のリポペプチドのアミノ酸配列はアンホマイシンのアミ
ノ酸配列に相当する。
鎖長を有する非分枝状脂肪酸を有している。それら三種
のリポペプチドのアミノ酸配列はアンホマイシンのアミ
ノ酸配列に相当する。
【００３９】リポペプチドＡ１４３７Ａ〜Ｈはすべて、
Ｃ−末端プロリンのカルボキシル官能基の、アミノ−末
端に位置するＤａｂのβ−アミノ官能基への連結を有し
ている。この連結は、
Ｃ−末端プロリンのカルボキシル官能基の、アミノ−末
端に位置するＤａｂのβ−アミノ官能基への連結を有し
ている。この連結は、
【化１１】 で示されている。
【００４０】本発明による一種またはそれ以上のリポペ
プチドの各含量は栄養溶液の組成に依存して変わり得
る。更に、微生物があるリポペプチドを全く生産しない
か、またはそれを検出限界より低い量で生産するよう
に、個々のリポペプチドの合成を培地の組成により調節
することもできる。
プチドの各含量は栄養溶液の組成に依存して変わり得
る。更に、微生物があるリポペプチドを全く生産しない
か、またはそれを検出限界より低い量で生産するよう
に、個々のリポペプチドの合成を培地の組成により調節
することもできる。
【００４１】アクチノプラネスsp.、好ましくはＤＳＭ
７３５８、を用いて得られる培地は、一重または多重不
飽和の、飽和の、またはそれとは無関係に分枝状のまた
は非分枝状の、６〜２２個の炭素原子、好ましくは１０
〜２０個の炭素原子、特に好ましくは１３、１４または
１５個の炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはヒドロキ
シ脂肪酸を有するリポペプチドを含有する。
７３５８、を用いて得られる培地は、一重または多重不
飽和の、飽和の、またはそれとは無関係に分枝状のまた
は非分枝状の、６〜２２個の炭素原子、好ましくは１０
〜２０個の炭素原子、特に好ましくは１３、１４または
１５個の炭素原子の鎖長を有する脂肪酸またはヒドロキ
シ脂肪酸を有するリポペプチドを含有する。
【００４２】これらのタイプの脂肪酸は、例えばRoempp
Chemie Lexikon、Prof. FalbeおよびProf. Regitz、第
９版、Georg Thieme Verlag Stuttgart、New York、ま
たは、The Encyclopedia of Chemistry, C.A. Hempelお
よびG.G. Hawley, 第３版、Van Nostrand Rheinhold Co
mpany, New Yorkから当業者に知られている。
Chemie Lexikon、Prof. FalbeおよびProf. Regitz、第
９版、Georg Thieme Verlag Stuttgart、New York、ま
たは、The Encyclopedia of Chemistry, C.A. Hempelお
よびG.G. Hawley, 第３版、Van Nostrand Rheinhold Co
mpany, New Yorkから当業者に知られている。
【００４３】次の脂肪酸のリストは例示であり、完全な
ものではなく、また何の限定を表わすものではない。本
発明によるリポペプチドの飽和非分枝状脂肪酸の例は、
カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、
カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン
酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マ
ルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキン酸
およびベヘン酸である。
ものではなく、また何の限定を表わすものではない。本
発明によるリポペプチドの飽和非分枝状脂肪酸の例は、
カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、
カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン
酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マ
ルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキン酸
およびベヘン酸である。
【００４４】本発明によるリポペプチドの飽和分枝状脂
肪酸の例は、イソ酪酸またはイソ吉草酸、または「アン
テ−イソ」配置の相当する酸である。本発明によるリポ
ペプチドの一重不飽和非分枝状脂肪酸の例はアクリル酸
またはクロトン酸である。本発明によるリポペプチドの
二重不飽和非分枝状脂肪酸の一例はソルビン酸である。
本発明によるリポペプチドの三重不飽和非分枝状脂肪酸
の例は、リノレン酸またはエレオステアリン酸である。
肪酸の例は、イソ酪酸またはイソ吉草酸、または「アン
テ−イソ」配置の相当する酸である。本発明によるリポ
ペプチドの一重不飽和非分枝状脂肪酸の例はアクリル酸
またはクロトン酸である。本発明によるリポペプチドの
二重不飽和非分枝状脂肪酸の一例はソルビン酸である。
本発明によるリポペプチドの三重不飽和非分枝状脂肪酸
の例は、リノレン酸またはエレオステアリン酸である。
【００４５】本発明によるリポペプチドの四重不飽和非
分枝状脂肪酸の一例はアラキドン酸である。本発明によ
るリポペプチドの五重不飽和非分枝状脂肪酸の一例はク
ルパノドン酸である。本発明によるリポペプチドの六重
不飽和非分枝状脂肪酸の一例はドコサヘキサエン酸であ
る。更に、多重不飽和分枝状脂肪酸、例えば２，４，
６，８−テトラメチルデカン酸を有するリポペプチドが
培地中に生じることもあり得る。
分枝状脂肪酸の一例はアラキドン酸である。本発明によ
るリポペプチドの五重不飽和非分枝状脂肪酸の一例はク
ルパノドン酸である。本発明によるリポペプチドの六重
不飽和非分枝状脂肪酸の一例はドコサヘキサエン酸であ
る。更に、多重不飽和分枝状脂肪酸、例えば２，４，
６，８−テトラメチルデカン酸を有するリポペプチドが
培地中に生じることもあり得る。
【００４６】本発明によるリポペプチドのヒドロキシ脂
肪酸の例は、２および３位および／または炭素鎖末端が
ヒドロキシル化されそして「イソ」または「アンテ−イ
ソ」配置を有する脂肪酸である。
肪酸の例は、２および３位および／または炭素鎖末端が
ヒドロキシル化されそして「イソ」または「アンテ−イ
ソ」配置を有する脂肪酸である。
【００４７】０.０１〜５％、好ましくは０.０２〜０.
１％、のＬ−バリンを前記栄養溶液に添加すると、アク
チノプラネスsp.株はリポペプチドＡ１４３７Ｂおよび
Ｄを優先的に生産する。０.０１〜５％、好ましくは０.
１〜０.５％、のＬ−ロイシンを前記栄養溶液に添加す
ると、アクチノプラネスsp.株はリポペプチドＡ１４３
７ＡおよびＣを優先的に生産する。０.０１〜５％、好
ましくは０.０５〜０.５％、のＬ−イソロイシンを前記
栄養溶液に添加すると、アクチノプラネスsp.株は特に
リポペプチドＡ１４３７Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨを生産す
る。０.０１〜５％、好ましくは０.０５〜０.５％、の
Ｌ−α−アミノ酪酸を前記栄養溶液に添加すると、アク
チノプラネスsp.株はリポペプチドＫを優先的に生産す
る。０.０１〜５％、好ましくは０.０５〜０.５％、の
Ｌ−ノルバリンを前記栄養溶液に添加するとアクチノプ
ラネスsp.株はリポペプチドＬおよび／またはＭを優先
的に生産する。同じことが好ましいＤＳＭ７３５８株に
ついてもいえる。
１％、のＬ−バリンを前記栄養溶液に添加すると、アク
チノプラネスsp.株はリポペプチドＡ１４３７Ｂおよび
Ｄを優先的に生産する。０.０１〜５％、好ましくは０.
１〜０.５％、のＬ−ロイシンを前記栄養溶液に添加す
ると、アクチノプラネスsp.株はリポペプチドＡ１４３
７ＡおよびＣを優先的に生産する。０.０１〜５％、好
ましくは０.０５〜０.５％、のＬ−イソロイシンを前記
栄養溶液に添加すると、アクチノプラネスsp.株は特に
リポペプチドＡ１４３７Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨを生産す
る。０.０１〜５％、好ましくは０.０５〜０.５％、の
Ｌ−α−アミノ酪酸を前記栄養溶液に添加すると、アク
チノプラネスsp.株はリポペプチドＫを優先的に生産す
る。０.０１〜５％、好ましくは０.０５〜０.５％、の
Ｌ−ノルバリンを前記栄養溶液に添加するとアクチノプ
ラネスsp.株はリポペプチドＬおよび／またはＭを優先
的に生産する。同じことが好ましいＤＳＭ７３５８株に
ついてもいえる。
【００４８】これらのアミノ酸以外に、前記アミノ酸に
対応するα−ケト酸（α−ケトイソバレレート、α−ケ
トイソカプロエート、α−ケト−β−メチル−バレレー
ト、α−ケトバレレート）またはそれらの対応する酸
（イソブチレート、イソバレレート、α−メチルブチレ
ート、ｎ−ブチレート、プロピオネート、バレレート）
を適切な濃度で、あるいは脂肪酸生合成に関与し得るそ
の他の物質を用いることもできる。微生物の培養は好気
的に、すなわち例えば振盪フラスコまたは発酵槽中で振
盪または撹拌しながら液中で、適切な場合には空気また
は酸素を導入しながら行われる。それは、約１８〜３５
℃の温度範囲で、好ましくは約２５〜３５℃、特に２８
〜３２℃で行うことができる。pH範囲は６〜８、好まし
くは６.５〜７.５とすべきである。微生物はこれらの条
件下に一般に２４〜３００時間、好ましくは３６〜１４
０時間培養する。
対応するα−ケト酸（α−ケトイソバレレート、α−ケ
トイソカプロエート、α−ケト−β−メチル−バレレー
ト、α−ケトバレレート）またはそれらの対応する酸
（イソブチレート、イソバレレート、α−メチルブチレ
ート、ｎ−ブチレート、プロピオネート、バレレート）
を適切な濃度で、あるいは脂肪酸生合成に関与し得るそ
の他の物質を用いることもできる。微生物の培養は好気
的に、すなわち例えば振盪フラスコまたは発酵槽中で振
盪または撹拌しながら液中で、適切な場合には空気また
は酸素を導入しながら行われる。それは、約１８〜３５
℃の温度範囲で、好ましくは約２５〜３５℃、特に２８
〜３２℃で行うことができる。pH範囲は６〜８、好まし
くは６.５〜７.５とすべきである。微生物はこれらの条
件下に一般に２４〜３００時間、好ましくは３６〜１４
０時間培養する。
【００４９】培養は有利には、数段階で行われる。すな
わち、一以上の前培養液をまず液体栄養培地中で調製
し、そして次に実際の生産培地、主培養に、例えば１：
１０容量比で移す。その前培養液は、例えば菌糸体を栄
養溶液に移し、そしてそれを約３６〜１２０時間、好ま
しくは４８〜７２時間増殖させることにより得られる。
その菌糸体は、例えばその菌株を約３〜４０日間、好ま
しくは４〜１０日間、固体または液体栄養培地、例えば
酵母−麦芽寒天または栄養ブロス寒天（例えばDifcoに
より供給される、ペプトン、塩化ナトリウムおよび寒天
を主成分とする微生物用標準培地）で増殖させることに
より得ることができる。
わち、一以上の前培養液をまず液体栄養培地中で調製
し、そして次に実際の生産培地、主培養に、例えば１：
１０容量比で移す。その前培養液は、例えば菌糸体を栄
養溶液に移し、そしてそれを約３６〜１２０時間、好ま
しくは４８〜７２時間増殖させることにより得られる。
その菌糸体は、例えばその菌株を約３〜４０日間、好ま
しくは４〜１０日間、固体または液体栄養培地、例えば
酵母−麦芽寒天または栄養ブロス寒天（例えばDifcoに
より供給される、ペプトン、塩化ナトリウムおよび寒天
を主成分とする微生物用標準培地）で増殖させることに
より得ることができる。
【００５０】発酵の進行は培養液のpHまたは菌糸体の容
量に基づくほか、クロマトグラフィー的方法、例えば薄
層クロマトグラフィーまたは高圧液体クロマトグラフィ
ーによりまたは生物活性を試験することにより監視する
ことができる。菌糸体および培養濾液はいずれも本発明
の化合物を含有するが、大部分（≧９０％）は培養濾液
中にある。
量に基づくほか、クロマトグラフィー的方法、例えば薄
層クロマトグラフィーまたは高圧液体クロマトグラフィ
ーによりまたは生物活性を試験することにより監視する
ことができる。菌糸体および培養濾液はいずれも本発明
の化合物を含有するが、大部分（≧９０％）は培養濾液
中にある。
【００５１】後述の単離方法は本発明によるリポペプチ
ドの精製に用いられるが、好ましくはリポペプチドＡ１
４３７Ａ〜ＨおよびＫ、ＬおよびＭの精製に用いられ
る。
ドの精製に用いられるが、好ましくはリポペプチドＡ１
４３７Ａ〜ＨおよびＫ、ＬおよびＭの精製に用いられ
る。
【００５２】本発明によるリポペプチドの培地からの単
離および精製は、天然物質の化学的、物理的および生物
学的性質を考慮しながら既知の方法により行われる。培
地中の、あるいは個々の単離段階での抗生物質濃度は、
薄層クロマトグラフィー、例えばイソプロパノール／２
５％強度ＮＨ3を移動層とするシリカゲルでの薄層クロ
マトグラフィー、あるいはＨＰＬＣにより試験すること
ができる。薄層クロマトグラフィーによる分画におい
て、検出は発色試薬例えばアニスアルデヒドにより行う
ことができ、その場合、生成物質量は検定溶液と好都合
に比較される。
離および精製は、天然物質の化学的、物理的および生物
学的性質を考慮しながら既知の方法により行われる。培
地中の、あるいは個々の単離段階での抗生物質濃度は、
薄層クロマトグラフィー、例えばイソプロパノール／２
５％強度ＮＨ3を移動層とするシリカゲルでの薄層クロ
マトグラフィー、あるいはＨＰＬＣにより試験すること
ができる。薄層クロマトグラフィーによる分画におい
て、検出は発色試薬例えばアニスアルデヒドにより行う
ことができ、その場合、生成物質量は検定溶液と好都合
に比較される。
【００５３】本発明によるリポペプチドを単離するに
は、菌糸体をまず培養液から常法により分離し、次いで
培養濾液を、好ましくは４℃で、pH０.５〜pH４のpH、
好ましくは１.５〜pH２.５に調節する。pH調節、従って
リポペプチドＡ１４３７の沈殿は、商業的に入手し得る
いずれの酸を用いても行うことができる。その溶液を１
６時間まで、好ましくは４時間までインキュベートした
後、生成沈殿を遠心分離により除去する。
は、菌糸体をまず培養液から常法により分離し、次いで
培養濾液を、好ましくは４℃で、pH０.５〜pH４のpH、
好ましくは１.５〜pH２.５に調節する。pH調節、従って
リポペプチドＡ１４３７の沈殿は、商業的に入手し得る
いずれの酸を用いても行うことができる。その溶液を１
６時間まで、好ましくは４時間までインキュベートした
後、生成沈殿を遠心分離により除去する。
【００５４】前記のリポペプチドのすべてを含む沈殿を
もとの容量の１／２０の二回蒸留水に再懸濁しそしてＮ
ａＯＨでpH６〜７に調節する。その結果沈殿は完全に溶
解し、その溶液を−２０℃に冷却しそして凍結乾燥す
る。以下粗製生成物と呼ぶ凍結乾燥物は５〜３０％のリ
ポペプチドを含有し、そして以後の単離に用いられる。
もとの容量の１／２０の二回蒸留水に再懸濁しそしてＮ
ａＯＨでpH６〜７に調節する。その結果沈殿は完全に溶
解し、その溶液を−２０℃に冷却しそして凍結乾燥す
る。以下粗製生成物と呼ぶ凍結乾燥物は５〜３０％のリ
ポペプチドを含有し、そして以後の単離に用いられる。
【００５５】本発明による一種またはそれ以上のリポペ
プチドの更なる精製は、適当な材料での、例えばシリカ
ゲル、酸化アルミニウム、イオン交換体または吸着剤樹
脂での、格別に好ましくは強または弱塩基性陰イオン交
換体でのクロマトグラフィーにより行われる。アミノ末
端に位置するアミノ酸としてＡｓｐまたはＡｓｎを含有
するリポペプチドはこのクロマトグラフィーにより分離
される。リポペプチドのクロマトグラフィーは緩衝水性
溶液、または水性およびアルコール性溶液の混合物を用
いて行われる。
プチドの更なる精製は、適当な材料での、例えばシリカ
ゲル、酸化アルミニウム、イオン交換体または吸着剤樹
脂での、格別に好ましくは強または弱塩基性陰イオン交
換体でのクロマトグラフィーにより行われる。アミノ末
端に位置するアミノ酸としてＡｓｐまたはＡｓｎを含有
するリポペプチドはこのクロマトグラフィーにより分離
される。リポペプチドのクロマトグラフィーは緩衝水性
溶液、または水性およびアルコール性溶液の混合物を用
いて行われる。
【００５６】緩衝水性溶液とは、例えば、０〜１Ｍ、好
ましくは１〜１００mM、の濃度の、水、リン酸緩衝液、
酢酸アンモニウム、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液など
を意味し、また１〜１００mMの濃度のリン酸緩衝溶液が
特に好ましく用いられる。
ましくは１〜１００mM、の濃度の、水、リン酸緩衝液、
酢酸アンモニウム、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液など
を意味し、また１〜１００mMの濃度のリン酸緩衝溶液が
特に好ましく用いられる。
【００５７】水性またはアルコール性溶液の混合物と
は、１０〜８０％溶媒、好ましくは４０〜６０％溶媒の
濃度で、水、好ましくはメタノール、アセトニトリルと
混和し得るすべての有機溶媒を、あるいは有機溶媒と混
和し得るすべての緩衝水性溶液を意味する。使用する緩
衝液は前記と同様である。
は、１０〜８０％溶媒、好ましくは４０〜６０％溶媒の
濃度で、水、好ましくはメタノール、アセトニトリルと
混和し得るすべての有機溶媒を、あるいは有機溶媒と混
和し得るすべての緩衝水性溶液を意味する。使用する緩
衝液は前記と同様である。
【００５８】脂肪酸の相違に基づくリポペプチドの分離
は、例えばＭＣＩR（Mitsubishi社（日本）の吸着剤樹
脂）での逆相クロマトグラフィーを用いて行われる。疎
水性材料での逆相クロマトグラフィー、好ましくはＲＰ
−８またはＲＰ−１８相クロマトグラフィー、が特に好
ましい。更に、分離は、シリカゲルクロマトグラフィー
を用いて行うことができる。
は、例えばＭＣＩR（Mitsubishi社（日本）の吸着剤樹
脂）での逆相クロマトグラフィーを用いて行われる。疎
水性材料での逆相クロマトグラフィー、好ましくはＲＰ
−８またはＲＰ−１８相クロマトグラフィー、が特に好
ましい。更に、分離は、シリカゲルクロマトグラフィー
を用いて行うことができる。
【００５９】リポペプチドのクロマトグラフィーは緩衝
または酸性化水性溶液、またはアルコールとまたその他
の水と混和し得る有機溶媒との水性溶液の混合物を用い
て行われる。アセトニトリルが有機溶媒として好ましく
用いられる。緩衝または酸性化水性溶液とは、例えば、
０〜０.５Ｍの濃度の、水、リン酸緩衝液、酢酸アンモ
ニウム、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を意味するほ
か、蟻酸、酢酸、トリフルオロ酢酸または当業者に知ら
れたすべての商業的に入手し得る酸（好ましくは０〜１
％の濃度、０.１％が特に好ましい）を意味する。
または酸性化水性溶液、またはアルコールとまたその他
の水と混和し得る有機溶媒との水性溶液の混合物を用い
て行われる。アセトニトリルが有機溶媒として好ましく
用いられる。緩衝または酸性化水性溶液とは、例えば、
０〜０.５Ｍの濃度の、水、リン酸緩衝液、酢酸アンモ
ニウム、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を意味するほ
か、蟻酸、酢酸、トリフルオロ酢酸または当業者に知ら
れたすべての商業的に入手し得る酸（好ましくは０〜１
％の濃度、０.１％が特に好ましい）を意味する。
【００６０】クロマトグラフィーは水１００％で始まり
溶媒１００％で終わる勾配を用いて行われ、そして４０
〜６０％アセトニトリルの直線勾配が好ましく用いられ
る。前述の二種類のクロマトグラフィー（アミノ酸Ａｓ
ｐまたはＡｓｎにより、および脂肪酸タイプによりリポ
ペプチドを分離するクロマトグラフィー）の順序は逆に
することができる。第一段階でアミノ酸の相違に従って
リポペプチドを分離し、その後においてはじめてそれら
を脂肪酸タイプにより分離するのが好ましい。
溶媒１００％で終わる勾配を用いて行われ、そして４０
〜６０％アセトニトリルの直線勾配が好ましく用いられ
る。前述の二種類のクロマトグラフィー（アミノ酸Ａｓ
ｐまたはＡｓｎにより、および脂肪酸タイプによりリポ
ペプチドを分離するクロマトグラフィー）の順序は逆に
することができる。第一段階でアミノ酸の相違に従って
リポペプチドを分離し、その後においてはじめてそれら
を脂肪酸タイプにより分離するのが好ましい。
【００６１】前記粗製生成物が均一脂肪酸を有するリポ
ペプチドを含む場合には、前述のクロマトグラフィー
（脂肪酸の相違に基づくリポペプチドの分離）はリポペ
プチドの脱塩および更なる精製に用いられる。他の選択
肢として、ゲルクロマトグラフィーまたは疎水性相での
クロマトグラフィーを用いることもできる。
ペプチドを含む場合には、前述のクロマトグラフィー
（脂肪酸の相違に基づくリポペプチドの分離）はリポペ
プチドの脱塩および更なる精製に用いられる。他の選択
肢として、ゲルクロマトグラフィーまたは疎水性相での
クロマトグラフィーを用いることもできる。
【００６２】ゲルクロマトグラフィーは、ポリアクリル
アミドまたは混合ポリマーゲル、例えばBiogel-P2R（Bi
orad社より供給）またはFractogel TSK HW 40R（Merck
社（ドイツ）またはToso Haas（米国））などで行われ
る。本発明によるリポペプチドは固体状態、および溶液
状態で４〜８、特に５〜７のpH範囲で安定であり、従っ
て通常の医薬組成物に配合することができる。
アミドまたは混合ポリマーゲル、例えばBiogel-P2R（Bi
orad社より供給）またはFractogel TSK HW 40R（Merck
社（ドイツ）またはToso Haas（米国））などで行われ
る。本発明によるリポペプチドは固体状態、および溶液
状態で４〜８、特に５〜７のpH範囲で安定であり、従っ
て通常の医薬組成物に配合することができる。
【００６３】本発明によるリポペプチドの一種またはそ
れ以上の化合物は、価値ある薬理特性を有することか
ら、医薬として用いるのに適している。本発明による物
質は、特にグラム−陽性細菌、特に好ましくはグリコペ
プチド−耐性株に対する抗生物質としての薬理活性を有
している。
れ以上の化合物は、価値ある薬理特性を有することか
ら、医薬として用いるのに適している。本発明による物
質は、特にグラム−陽性細菌、特に好ましくはグリコペ
プチド−耐性株に対する抗生物質としての薬理活性を有
している。
【００６４】抗生物質に対して更なる耐性を生じたペニ
シリン−またはメチシリン−耐性株（ＭＲＳＡ株）に対
する治療的に十分な効果はしばしばグリコペプチド例え
ばバンコマイシンまたはテイコプラニンだけが有してい
る。しかしながらこれらの抗生物質に対してさえも耐性
のある株の出現が増えつつある（FEMS Microbiol. Let
t. 98(1992）109〜116）。本発明によるリポペプチドの
一種またはそれ以上の化合物は、これらの問題生物に対
しても優れた効果を有している。
シリン−またはメチシリン−耐性株（ＭＲＳＡ株）に対
する治療的に十分な効果はしばしばグリコペプチド例え
ばバンコマイシンまたはテイコプラニンだけが有してい
る。しかしながらこれらの抗生物質に対してさえも耐性
のある株の出現が増えつつある（FEMS Microbiol. Let
t. 98(1992）109〜116）。本発明によるリポペプチドの
一種またはそれ以上の化合物は、これらの問題生物に対
しても優れた効果を有している。
【００６５】また本発明は、本発明によるリポペプチド
の一種またはそれ以上の化合物の医薬組成物にも関す
る。本発明によるリポペプチドの一種またはそれ以上の
化合物、好ましくはリポペプチドＡ１４３７Ａ〜Ｈの一
種またはそれ以上の化合物をそれ自体未希釈のまま、投
与することは原則として可能である。適当な補助物質ま
たは担体物質との混合物として用いるのが好ましい。動
物用医薬の場合に用いることのできる担体物質は慣用の
飼料混合物より成り、また人間用医薬の場合は薬理学的
に適合し得る担体物質および／または補助物質より成
る。
の一種またはそれ以上の化合物の医薬組成物にも関す
る。本発明によるリポペプチドの一種またはそれ以上の
化合物、好ましくはリポペプチドＡ１４３７Ａ〜Ｈの一
種またはそれ以上の化合物をそれ自体未希釈のまま、投
与することは原則として可能である。適当な補助物質ま
たは担体物質との混合物として用いるのが好ましい。動
物用医薬の場合に用いることのできる担体物質は慣用の
飼料混合物より成り、また人間用医薬の場合は薬理学的
に適合し得る担体物質および／または補助物質より成
る。
【００６６】本発明による医薬は、一般に経口または非
経口投与されるが、原則として直腸に使用することもで
きる。適当な固体または液体の医薬製剤の例は、顆粒、
粉末、錠剤、被覆錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、
シロップ、乳濁液、懸濁液、エアロゾル、滴剤、または
アンプル形態の注射溶液のほか活性物質を持続放出する
製品などであり、その生産にあたっては、ビヒクルおよ
び添加剤および／または補助剤例えば崩壊剤、結合剤、
被覆剤、膨潤化剤、滑剤または潤滑剤、香味剤、甘味剤
または可溶化剤を用いるのが通常である。よく用いられ
るビヒクルまたは補助物質の例としては、炭酸マグネシ
ウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび
その他の糖、タルク、ラクトアルブミン、ゼラチン、ス
ターチ、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動植
物油、ポリエチレングリコールおよび例えば滅菌水、ア
ルコール、グリセロールおよび多価アルコールなどが挙
げられる。
経口投与されるが、原則として直腸に使用することもで
きる。適当な固体または液体の医薬製剤の例は、顆粒、
粉末、錠剤、被覆錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、
シロップ、乳濁液、懸濁液、エアロゾル、滴剤、または
アンプル形態の注射溶液のほか活性物質を持続放出する
製品などであり、その生産にあたっては、ビヒクルおよ
び添加剤および／または補助剤例えば崩壊剤、結合剤、
被覆剤、膨潤化剤、滑剤または潤滑剤、香味剤、甘味剤
または可溶化剤を用いるのが通常である。よく用いられ
るビヒクルまたは補助物質の例としては、炭酸マグネシ
ウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび
その他の糖、タルク、ラクトアルブミン、ゼラチン、ス
ターチ、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動植
物油、ポリエチレングリコールおよび例えば滅菌水、ア
ルコール、グリセロールおよび多価アルコールなどが挙
げられる。
【００６７】適当な場合には、例えば微粒状形態の活性
物質を適切なポリマー、ワックスなどで被覆または包埋
することにより、経口投与用量単位をマイクロカプセル
化して放出を遅延させたり放出を長期にわたり延ばすこ
とができる。医薬品は、好ましくは、各単位が有効成分
として特定用量の本発明によるリポペプチドの一種また
はそれ以上の化合物を含む、用量単位で生産され投与さ
れる。
物質を適切なポリマー、ワックスなどで被覆または包埋
することにより、経口投与用量単位をマイクロカプセル
化して放出を遅延させたり放出を長期にわたり延ばすこ
とができる。医薬品は、好ましくは、各単位が有効成分
として特定用量の本発明によるリポペプチドの一種また
はそれ以上の化合物を含む、用量単位で生産され投与さ
れる。
【００６８】固体用量単位例えば錠剤、カプセルおよび
坐剤などの場合には、この用量は１日あたり、約２００
mg、好ましくは約０.１〜１００mgまでとすることがで
き、またアンプル形態の注射溶液は約２００mg、好まし
くは０.５〜１００mgとすることができる。
坐剤などの場合には、この用量は１日あたり、約２００
mg、好ましくは約０.１〜１００mgまでとすることがで
き、またアンプル形態の注射溶液は約２００mg、好まし
くは０.５〜１００mgとすることができる。
【００６９】投与すべき日用量は哺乳動物の体重、年
令、性別および状態に依存する。しかしながら場合によ
ってはより高いまたはより低い用量も適切であり得る。
この日用量の投与は単一用量単位の形でまたはより小さ
な用量単位を複数用いて１回投与によって、また分割用
量を特定の間隔をおいて多数回投与することによって行
うことができる。
令、性別および状態に依存する。しかしながら場合によ
ってはより高いまたはより低い用量も適切であり得る。
この日用量の投与は単一用量単位の形でまたはより小さ
な用量単位を複数用いて１回投与によって、また分割用
量を特定の間隔をおいて多数回投与することによって行
うことができる。
【００７０】本発明による医薬は本発明によるリポペプ
チドの一種またはそれ以上の化合物を慣用のビヒクルお
よび適切な場合には添加剤および／または補助物質を用
いて適切な投与剤形に変えることにより生産される。
チドの一種またはそれ以上の化合物を慣用のビヒクルお
よび適切な場合には添加剤および／または補助物質を用
いて適切な投与剤形に変えることにより生産される。
【００７１】本発明を更に以下の実施例で説明する。特
に断らない限り、液体の混合比は容量に関するものであ
る。
に断らない限り、液体の混合比は容量に関するものであ
る。
【００７２】
１ａ） アクチノプラネスsp. ＤＳＭ７３５８のグリセ
ロール培養液の調製 滅菌３００ml三角フラスコ中の１００mlの栄養溶液（４
ｇ／リットル 酵母エキス、１５ｇ／リットル可溶性デ
ンプン、１ｇ／リットル Ｋ2ＨＰＯ4、０.５ｇ／リット
ル ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏを水で１０００mlにしたもの、
滅菌前pHは７.０）にアクチノプラネスsp. ＤＳＭ７３
５８株を接種しそして回転シェーカー上、３０℃および
１５０rpmで７日間インキュベートする。１.５mlのこの
培養液を次いで２.５mlの８０％強度グリセロールで希
釈しそして−２０℃で貯蔵する。
ロール培養液の調製 滅菌３００ml三角フラスコ中の１００mlの栄養溶液（４
ｇ／リットル 酵母エキス、１５ｇ／リットル可溶性デ
ンプン、１ｇ／リットル Ｋ2ＨＰＯ4、０.５ｇ／リット
ル ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏを水で１０００mlにしたもの、
滅菌前pHは７.０）にアクチノプラネスsp. ＤＳＭ７３
５８株を接種しそして回転シェーカー上、３０℃および
１５０rpmで７日間インキュベートする。１.５mlのこの
培養液を次いで２.５mlの８０％強度グリセロールで希
釈しそして−２０℃で貯蔵する。
【００７３】１ｂ） 三角フラスコにおけるアクチノプ
ラネスsp. ＤＳＭ７３５８の培養液または前培養液の調
製 １００mlの栄養溶液(３０ｇ／リットル スクロース、２
ｇ／リットル ＫＮＯ3、１ｇ／リットル Ｋ2ＨＰＯ4、
０.５ｇ／リットル ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０.５ｇ／リ
ットル ＫＣｌ、０.０１ｇ／リットル ＦｅＳＯ4×７Ｈ
2Ｏ、２ｇ／リットル 酵母エキス、５ｇ／リットル ペ
プトン）を含む滅菌３００ml三角フラスコに斜面培養管
（同じ栄養溶液であるが２％寒天を含む）で増殖させた
培養物を、あるいは１mlのグリセロール培養液（実施例
１ａ参照）を接種しそしてシェーカーを用い１８０rpm
および３０℃でインキュベートする。約１２０時間後
に、本発明によるリポペプチドの一種またはそれ以上の
化合物の生産は最大となる。同じ栄養溶液からの４８〜
９６時間令液内培養液（接種物約１０％）は１０〜２０
０リットル発酵槽の接種に十分である。
ラネスsp. ＤＳＭ７３５８の培養液または前培養液の調
製 １００mlの栄養溶液(３０ｇ／リットル スクロース、２
ｇ／リットル ＫＮＯ3、１ｇ／リットル Ｋ2ＨＰＯ4、
０.５ｇ／リットル ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ、０.５ｇ／リ
ットル ＫＣｌ、０.０１ｇ／リットル ＦｅＳＯ4×７Ｈ
2Ｏ、２ｇ／リットル 酵母エキス、５ｇ／リットル ペ
プトン）を含む滅菌３００ml三角フラスコに斜面培養管
（同じ栄養溶液であるが２％寒天を含む）で増殖させた
培養物を、あるいは１mlのグリセロール培養液（実施例
１ａ参照）を接種しそしてシェーカーを用い１８０rpm
および３０℃でインキュベートする。約１２０時間後
に、本発明によるリポペプチドの一種またはそれ以上の
化合物の生産は最大となる。同じ栄養溶液からの４８〜
９６時間令液内培養液（接種物約１０％）は１０〜２０
０リットル発酵槽の接種に十分である。
【００７４】２） アクチノプラネスsp. ＤＳＭ７３５
８の特性比較 アクチノプラネスsp. ＤＳＭ７３５８株をShirlingおよ
びGottlieb ISP法（Int. J. of Sys. Bacteriol. 16, 3
（1966）313-340）により密接関連株と比較することに
より特性評価する。結果（表１参照）はアクチノプラネ
スsp. ＤＳＭ７３５８株は他の株と形態学的に、またそ
の生理学的性質の点で異なっていることを示している。
８の特性比較 アクチノプラネスsp. ＤＳＭ７３５８株をShirlingおよ
びGottlieb ISP法（Int. J. of Sys. Bacteriol. 16, 3
（1966）313-340）により密接関連株と比較することに
より特性評価する。結果（表１参照）はアクチノプラネ
スsp. ＤＳＭ７３５８株は他の株と形態学的に、またそ
の生理学的性質の点で異なっていることを示している。
【００７５】
【表３】
【００７６】
【表４】
【００７７】３ａ） リポペプチドＡ１４３７Ｂおよび
Ｄの調製 ５００リットル発酵槽を次の条件下に稼働する： 栄養培地： １１ｇ／リットル スクロ
ース ６ｇ／リットル 肉エキス ０.３ｇ／リットル 酵母エキス ０.６ｇ／リットル ＭｇＳＯ4 ０.１ｇ／リットル ＫＨ2ＰＯ4 １０μＭ ＦｅＣｌ3×６Ｈ2Ｏ ０.６ｇ／リットル Ｌ−バリン pH ７.３（滅菌前） インキュベーション時間：１２０時間 インキュベーション 温度： ３０℃ スターラー速度： ５０rpm 通気： １５０ リットル min-1
Ｄの調製 ５００リットル発酵槽を次の条件下に稼働する： 栄養培地： １１ｇ／リットル スクロ
ース ６ｇ／リットル 肉エキス ０.３ｇ／リットル 酵母エキス ０.６ｇ／リットル ＭｇＳＯ4 ０.１ｇ／リットル ＫＨ2ＰＯ4 １０μＭ ＦｅＣｌ3×６Ｈ2Ｏ ０.６ｇ／リットル Ｌ−バリン pH ７.３（滅菌前） インキュベーション時間：１２０時間 インキュベーション 温度： ３０℃ スターラー速度： ５０rpm 通気： １５０ リットル min-1
【００７８】発泡はエタノール性ポリオール溶液を反復
添加することにより抑えることができる。約９６〜１２
０時間後に生産は最大となる。アクチノプラネスsp. Ｄ
ＳＭ７３５８の発酵完了後、培養液を約２％の濾過助剤
（例えばCeliteR）を用いて濾過し、そして培養濾液を
４℃に冷却しそして１.５のpHに調節する。４時間後、
その混合物を１０,０００ｇで遠心分離しそして沈殿を
蒸留水に再懸濁する。懸濁液を中和すると前記物質は溶
液化する。それを凍結しそして凍結乾燥する。収量は約
１.５ｇ／リットル粗製生成物（＝７５０ｇ）である。
添加することにより抑えることができる。約９６〜１２
０時間後に生産は最大となる。アクチノプラネスsp. Ｄ
ＳＭ７３５８の発酵完了後、培養液を約２％の濾過助剤
（例えばCeliteR）を用いて濾過し、そして培養濾液を
４℃に冷却しそして１.５のpHに調節する。４時間後、
その混合物を１０,０００ｇで遠心分離しそして沈殿を
蒸留水に再懸濁する。懸濁液を中和すると前記物質は溶
液化する。それを凍結しそして凍結乾燥する。収量は約
１.５ｇ／リットル粗製生成物（＝７５０ｇ）である。
【００７９】３ｂ） イオンクロマトグラフィーによる
粗製生成物(Ｂ＋Ｄを含有)の分画 ３.２リットルクロマトグラフィーカラム（１０cm（内
径）×４０cm（高さ））にＤＥＡＥ−RSepharose Fast
Flowを充填しそして４０％メタノール中１０mMリン酸カ
リウム緩衝液、pH７.０（緩衝液Ａ）で平衡させる。次
に３.５リットルの水に溶解した２５ｇの（実施例３ａ
と同様にして得られた）Ａ１４３７Ｂ粗製生成物をカラ
ムにかけ、そして１リットルの水で洗浄し、次に６リッ
トルの緩衝液Ａで洗浄した。粗製生成物中の不純物は素
通り分および水性洗浄液中に存在する。次に、４０％メ
タノール中１０乃至１００mMリン酸カリウム（pH７.
０）勾配を適用する。Ａ１４３７Ｄペプチドを２５〜３
５mMリン酸カリウムで溶出し、そして抗生物質Ａ１４３
７Ｂを４０〜５５mMリン酸カリウムで取得する。メタノ
ールを適切な画分から真空除去する。１リットルの容量
を有するRDianion HP-20カラム（Mitsubishi社（日
本））を脱塩に用いる。ここで９リットルの精製Ｂペプ
チド含有画分をカラムにかけ、次いで３リットルの脱イ
オン水で洗浄する。勾配法（０〜５０％アルコール分）
による溶出に水／イソプロパノールを用いる。精製Ａ１
４３７Ｂを１５〜２５％イソプロパノールで支持体から
洗浄除去する。このカラムからの溶出液を別々に集め、
真空濃縮しそして凍結乾燥する。その結果純度９７％の
Ａ１４３７Ｂが４.８ｇ得られる。Ａ１４３７Ｄ含有画
分を同様に脱塩して３.１ｇの抗生物質を得た。純度９
８％。
粗製生成物(Ｂ＋Ｄを含有)の分画 ３.２リットルクロマトグラフィーカラム（１０cm（内
径）×４０cm（高さ））にＤＥＡＥ−RSepharose Fast
Flowを充填しそして４０％メタノール中１０mMリン酸カ
リウム緩衝液、pH７.０（緩衝液Ａ）で平衡させる。次
に３.５リットルの水に溶解した２５ｇの（実施例３ａ
と同様にして得られた）Ａ１４３７Ｂ粗製生成物をカラ
ムにかけ、そして１リットルの水で洗浄し、次に６リッ
トルの緩衝液Ａで洗浄した。粗製生成物中の不純物は素
通り分および水性洗浄液中に存在する。次に、４０％メ
タノール中１０乃至１００mMリン酸カリウム（pH７.
０）勾配を適用する。Ａ１４３７Ｄペプチドを２５〜３
５mMリン酸カリウムで溶出し、そして抗生物質Ａ１４３
７Ｂを４０〜５５mMリン酸カリウムで取得する。メタノ
ールを適切な画分から真空除去する。１リットルの容量
を有するRDianion HP-20カラム（Mitsubishi社（日
本））を脱塩に用いる。ここで９リットルの精製Ｂペプ
チド含有画分をカラムにかけ、次いで３リットルの脱イ
オン水で洗浄する。勾配法（０〜５０％アルコール分）
による溶出に水／イソプロパノールを用いる。精製Ａ１
４３７Ｂを１５〜２５％イソプロパノールで支持体から
洗浄除去する。このカラムからの溶出液を別々に集め、
真空濃縮しそして凍結乾燥する。その結果純度９７％の
Ａ１４３７Ｂが４.８ｇ得られる。Ａ１４３７Ｄ含有画
分を同様に脱塩して３.１ｇの抗生物質を得た。純度９
８％。
【００８０】 ４ａ） リポペプチドＡ１４３７ＡおよびＣの調製 生産培地中のＬ−バリンを４ｇ／リットル Ｌ−ロイシ
ンで置換しそして発酵を５０リットルバイオリアクター
で行う点を除いて３ａ）の記載と同様にして調製を行
う。収量は１.３ｇ／リットル粗製ペプチド（＝６５
ｇ）である。
ンで置換しそして発酵を５０リットルバイオリアクター
で行う点を除いて３ａ）の記載と同様にして調製を行
う。収量は１.３ｇ／リットル粗製ペプチド（＝６５
ｇ）である。
【００８１】 ４ｂ） リポペプチドＡ１４３７ＡおよびＣの単離 １０ｇの粗製生成物を１００mlの蒸留水に溶解しそして
下記スキームに従って後処理した。
下記スキームに従って後処理した。
【００８２】 後処理スキーム： １００mlの蒸留水中に１０ｇの粗製ペプチド ↓ Ｑ−Sepharose ファストフロー(fast flow)(Pharmacia社供給)(５×20cmカラム) への吸着 ↓ 下記の勾配による溶出： 緩衝液Ａ：５０％メタノール中ＮａＨ2ＰＯ4 １mM、pH５.９ 緩衝液Ｂ：５０％メタノール中ＮａＨ2ＰＯ4 １００mM、pH５.３ ２０分間：緩衝液Ａ→60分後25％緩衝液Ｂに、更に30分間25％緩衝液Ｂ； ↓ Ａ１４３７ＡおよびＣ画分の凍結乾燥および移動相への溶解 ↓ Biorad社供給のBiogel P2(100〜200メッシュ)(７×２０cmカラム)での脱塩 ↓ 1.6ｇのリポペプチドA1437A(純度80％)、1.2gのリポペプチドA1437C(純度80％) ↓ NucleosilRC18(7μm)でのRPクロマトグラフィー(20×250mmカラム、200mg負荷) 下記の勾配による溶出 緩衝液Ａ：二回蒸留水、０.１％ＴＦＡ 緩衝液Ｂ：アセトニトリル １０分間：緩衝液Ｂ→１０ml／分の流速で６０分後に９０％緩衝液Ｂに ↓ Ａ１４３７ＡおよびＣ画分の凍結乾燥 ↓ 150mgのＡ１４３７Ａ（純度＞95％）、154mgのＡ１４３７Ｃ(純度＞95％)
【００８３】５ａ） リポペプチドＡ１４３７Ｅ、Ｆ、
ＧおよびＨの調製 生産培地中のＬ−バリンを１.５ｇ／リットル Ｌ−イソ
ロイシンで置換しそして発酵を５０リットルバイオリア
クターで行う点を除いては実施例３ａ記載と同様にして
調製を行う。収量は１.４ｇ／リットル粗製ペプチド(７
０ｇ)である。
ＧおよびＨの調製 生産培地中のＬ−バリンを１.５ｇ／リットル Ｌ−イソ
ロイシンで置換しそして発酵を５０リットルバイオリア
クターで行う点を除いては実施例３ａ記載と同様にして
調製を行う。収量は１.４ｇ／リットル粗製ペプチド(７
０ｇ)である。
【００８４】５ｂ） イオンクロマトグラフィーによる
粗製ペプチドの画分 実施例５ａと同様にして得られた２５ｇのリポペプチド
粗製生成物を実施例３ａ記載のカラムで実施例３ａと同
様にして分画する。リポペプチドＡ１４３７Ｆ（収量：
１.８ｇ）は、１４〜１９mM緩衝液で溶出され；Ａ１４
３７Ｅ（収量：１.３ｇ）は１８〜２５mM緩衝液で溶出
され；Ａ１４３７Ｈ（収量：２.７ｇ）は３５〜５０mM
緩衝液で溶出され；そして、Ａ１４３７Ｇ（収量：１.
９ｇ）は６４〜８２mM緩衝液で溶出される。相当する画
分を合一しそしてメタノールを真空除去する。
粗製ペプチドの画分 実施例５ａと同様にして得られた２５ｇのリポペプチド
粗製生成物を実施例３ａ記載のカラムで実施例３ａと同
様にして分画する。リポペプチドＡ１４３７Ｆ（収量：
１.８ｇ）は、１４〜１９mM緩衝液で溶出され；Ａ１４
３７Ｅ（収量：１.３ｇ）は１８〜２５mM緩衝液で溶出
され；Ａ１４３７Ｈ（収量：２.７ｇ）は３５〜５０mM
緩衝液で溶出され；そして、Ａ１４３７Ｇ（収量：１.
９ｇ）は６４〜８２mM緩衝液で溶出される。相当する画
分を合一しそしてメタノールを真空除去する。
【００８５】５ｃ） 実施例５ｂ）で得られた成分の逆
相ＲＰ−１８による精製 ５００mlの容量を有する分取ＨＰＬＣカラム（５.１cm
（内径）×２５cm（高さ））にRLiChrosorG RP-18（１
０μｍ）を充填し、そして１.９ｇの抗生物質Ａ１４３
７Ｇを含有する塩含有溶液をかける。１０mMリン酸カリ
ウム緩衝液中５％アセトニトリル（pH７.０）乃至１０m
Mリン酸カリウム緩衝液中３６％アセトニトリル（pH７.
０）を用いた勾配法により溶出する。リポペプチドＡ１
４３７Ｇは２４〜２６％アセトニトリルにより得られ
る。真空濃縮し、水／５０％イソプロパノール系中１０
０mlのRDianion HP-20吸着樹脂で脱塩しそして凍結乾燥
すると１.１ｇのリポペプチドＡ１４３７Ｇが純度９９
％で得られる。
相ＲＰ−１８による精製 ５００mlの容量を有する分取ＨＰＬＣカラム（５.１cm
（内径）×２５cm（高さ））にRLiChrosorG RP-18（１
０μｍ）を充填し、そして１.９ｇの抗生物質Ａ１４３
７Ｇを含有する塩含有溶液をかける。１０mMリン酸カリ
ウム緩衝液中５％アセトニトリル（pH７.０）乃至１０m
Mリン酸カリウム緩衝液中３６％アセトニトリル（pH７.
０）を用いた勾配法により溶出する。リポペプチドＡ１
４３７Ｇは２４〜２６％アセトニトリルにより得られ
る。真空濃縮し、水／５０％イソプロパノール系中１０
０mlのRDianion HP-20吸着樹脂で脱塩しそして凍結乾燥
すると１.１ｇのリポペプチドＡ１４３７Ｇが純度９９
％で得られる。
【００８６】次に、実施例５ｂと同様にして得られるＡ
１４３７Ｈ溶液を１０mMリン酸カリウム緩衝液（pH７.
０）中１０〜５０％アセトニトリルの溶媒勾配を用いて
同様に精製する。抗生物質は３７〜３９％の溶媒含量で
溶出される。適切な画分を濃縮し、RDianion HP-20で脱
塩しそして凍結乾燥すると、２.２ｇのリポペプチドＡ
１４３７Ｈが９８％を超える純度で得られる。
１４３７Ｈ溶液を１０mMリン酸カリウム緩衝液（pH７.
０）中１０〜５０％アセトニトリルの溶媒勾配を用いて
同様に精製する。抗生物質は３７〜３９％の溶媒含量で
溶出される。適切な画分を濃縮し、RDianion HP-20で脱
塩しそして凍結乾燥すると、２.２ｇのリポペプチドＡ
１４３７Ｈが９８％を超える純度で得られる。
【００８７】５ｄ） 実施例５ｂで得られたリポペプチ
ド抗生物質Ａ１４３７ＥおよびＦのＭＣＩゲルによる精
製 実施例５ｂと同様にして得られた抗生物質Ａ１４３７Ｆ
を１.８ｇ含有する塩含有溶液を１リットルのＭＣＩゲ
ルＣＨＰ ２０Ｐ（Mitsubishi Kasei Corp.）にかけ
る。カラム寸法は６cm（内径）×３５cm（高さ））であ
る。支持体に分離すべき材料をかけた後、それを緩衝液
Ａ（２０％アセトニトリルを含有する５mMリン酸カリウ
ム緩衝液（pH７.０））で洗浄しそして緩衝液Ｂ（７０
％アセトニトリルを含有する５mMリン酸カリウム緩衝液
（pH７.０））への勾配を用いた方法により溶出する。
３４〜３５％の溶媒含量により精製抗生物質が溶出され
る。真空濃縮しそしてRDianion HP-20で脱塩すると１.
４ｇのリポペプチドＡ１４３７Ｆが９８％を越える純度
で得られる。実施例５ａで得られたＡ１４３７Ｅ粗製生
成物に対し同様の手順を施すと１ｇのリポペプチドＡ１
４３７Ｅが９８％を超える純度で得られる。
ド抗生物質Ａ１４３７ＥおよびＦのＭＣＩゲルによる精
製 実施例５ｂと同様にして得られた抗生物質Ａ１４３７Ｆ
を１.８ｇ含有する塩含有溶液を１リットルのＭＣＩゲ
ルＣＨＰ ２０Ｐ（Mitsubishi Kasei Corp.）にかけ
る。カラム寸法は６cm（内径）×３５cm（高さ））であ
る。支持体に分離すべき材料をかけた後、それを緩衝液
Ａ（２０％アセトニトリルを含有する５mMリン酸カリウ
ム緩衝液（pH７.０））で洗浄しそして緩衝液Ｂ（７０
％アセトニトリルを含有する５mMリン酸カリウム緩衝液
（pH７.０））への勾配を用いた方法により溶出する。
３４〜３５％の溶媒含量により精製抗生物質が溶出され
る。真空濃縮しそしてRDianion HP-20で脱塩すると１.
４ｇのリポペプチドＡ１４３７Ｆが９８％を越える純度
で得られる。実施例５ａで得られたＡ１４３７Ｅ粗製生
成物に対し同様の手順を施すと１ｇのリポペプチドＡ１
４３７Ｅが９８％を超える純度で得られる。
【００８８】６ａ） リポペプチドＡ１４３７Ｋの調製 生産培地中のＬ−バリンを５００mg／リットル Ｌ−α
−アミノ酪酸（または１ｇ／リットルのラセミ体）で置
換しそして発酵を１０リットルバイオリアクターで行う
点以外は４ａの記載と同様にして調製を行う。収量は
１.１ｇ／リットル粗製ペプチド（＝１０ｇ）である。
−アミノ酪酸（または１ｇ／リットルのラセミ体）で置
換しそして発酵を１０リットルバイオリアクターで行う
点以外は４ａの記載と同様にして調製を行う。収量は
１.１ｇ／リットル粗製ペプチド（＝１０ｇ）である。
【００８９】６ｂ） リポペプチドＡ１４３７Ｋの単離 １０ｇの粗製生成物を１００mlの蒸留水に溶解しそして
下記スキームに従って後処理する。
下記スキームに従って後処理する。
【００９０】後処理スキーム（Ａ１４３７Ｋ） −１００mlの蒸留水中に１０ｇの粗製ペプチド −Ｑ−Sepharose ファストフロー（３.５×１７cmカラ
ム）への吸着 −下記の勾配による溶出 緩衝液Ａ：５０％メタノール中ＮａＨ2ＰＯ4 １mM、pH
５.９ 緩衝液Ｂ：５０％メタノール中ＮａＨ2ＰＯ4 １００m
M、pH５.３ ２０分間：緩衝液Ａ→45分後25％緩衝液Ｂに、更に45分
間25％緩衝液Ｂ −Ａ１４３７Ｋ画分の凍結乾燥 Biogel P2（１００〜２００メッシュ）（７×２０cmカ
ラム）による脱塩 ７００mgのＡ１４３７Ｋ（純度６０％） −Nucleosil C18 ７μｍ(２０×２５０mmカラム)でのＲ
Ｐクロマトグラフィー 負荷：５０mgの予備精製物 下記の勾配による溶出 緩衝液Ａ：二回蒸留水、０.１％ＴＦＡ 緩衝液Ｂ：アセトニトリル 10分間：緩衝液Ａ／５％緩衝液Ｂ→10ml／分の流速で60
分後に70％緩衝液Ｂ −Ａ１４３７Ｋ画分の凍結乾燥 ５.６mgのＡ１４３７Ｋ（＞９５％純度）
ム）への吸着 −下記の勾配による溶出 緩衝液Ａ：５０％メタノール中ＮａＨ2ＰＯ4 １mM、pH
５.９ 緩衝液Ｂ：５０％メタノール中ＮａＨ2ＰＯ4 １００m
M、pH５.３ ２０分間：緩衝液Ａ→45分後25％緩衝液Ｂに、更に45分
間25％緩衝液Ｂ −Ａ１４３７Ｋ画分の凍結乾燥 Biogel P2（１００〜２００メッシュ）（７×２０cmカ
ラム）による脱塩 ７００mgのＡ１４３７Ｋ（純度６０％） −Nucleosil C18 ７μｍ(２０×２５０mmカラム)でのＲ
Ｐクロマトグラフィー 負荷：５０mgの予備精製物 下記の勾配による溶出 緩衝液Ａ：二回蒸留水、０.１％ＴＦＡ 緩衝液Ｂ：アセトニトリル 10分間：緩衝液Ａ／５％緩衝液Ｂ→10ml／分の流速で60
分後に70％緩衝液Ｂ −Ａ１４３７Ｋ画分の凍結乾燥 ５.６mgのＡ１４３７Ｋ（＞９５％純度）
【００９１】 ７ａ） リポペプチドＡ１４３７ＬおよびＭの調製 生産混合物中のＬ−バリンを５００mg／リットル Ｌ−
ノルバリン（または１ｇ／リットルのラセミ体）で置換
しそして発酵を１０リットルバイオリアクターで行う以
外は４ａの記載と同様にして調製を行う。収量は１.２
ｇ／リットル粗製ペプチド（＝１２ｇ）である。
ノルバリン（または１ｇ／リットルのラセミ体）で置換
しそして発酵を１０リットルバイオリアクターで行う以
外は４ａの記載と同様にして調製を行う。収量は１.２
ｇ／リットル粗製ペプチド（＝１２ｇ）である。
【００９２】 ７ｂ） リポペプチドＡ１４３７ＬおよびＭの単離 １０ｇの粗製生成物を１００mlの蒸留水に溶解しそして
下記スキームに従って後処理する。
下記スキームに従って後処理する。
【００９３】後処理スキーム： −１００mlの蒸留水中に１０ｇの粗製ペプチド −Ｑ−Sepharose ファストフロー（３.５×１７cmカラ
ム）への吸着 −下記の勾配による溶出： 緩衝液Ａ：５０％メタノール中ＮａＨ2ＰＯ4 １mM、pH
５.９ 緩衝液Ｂ：５０％メタノール中ＮａＨ2ＰＯ4 １００m
M、pH５.３ ２０分間：緩衝液Ａ→45分後に25％緩衝液Ｂに、更に45
分間25％緩衝液Ｂ −Ａ１４３７ＬおよびＭ画分の凍結乾燥 −Biogel P2（１００〜２００メッシュ）（７×２０cm
カラム）での脱塩 ９００mgのＡ１４３７ＬおよびＭ（純度約６０％） −Nucleosil C18 ７μｍ(２０×２５０mmカラム)でのＲ
Ｐクロマトグラフィー 負荷：５０mgの予備精製物 下記の勾配による溶出 緩衝液Ａ：二回蒸留水、０.１％ＴＦＡ 緩衝液Ｂ：アセトニトリル 10分間：緩衝液Ａ/５％緩衝液Ｂ→10ml/分の流速で60分
後に70％緩衝液Ｂに −Ａ１４３７ＬおよびＭ画分の凍結乾燥 5.8mgのＡ１４３７Ｌ（＞95％純度）、6.7mgのＡ１４３
７Ｍ（＞95％純度）
ム）への吸着 −下記の勾配による溶出： 緩衝液Ａ：５０％メタノール中ＮａＨ2ＰＯ4 １mM、pH
５.９ 緩衝液Ｂ：５０％メタノール中ＮａＨ2ＰＯ4 １００m
M、pH５.３ ２０分間：緩衝液Ａ→45分後に25％緩衝液Ｂに、更に45
分間25％緩衝液Ｂ −Ａ１４３７ＬおよびＭ画分の凍結乾燥 −Biogel P2（１００〜２００メッシュ）（７×２０cm
カラム）での脱塩 ９００mgのＡ１４３７ＬおよびＭ（純度約６０％） −Nucleosil C18 ７μｍ(２０×２５０mmカラム)でのＲ
Ｐクロマトグラフィー 負荷：５０mgの予備精製物 下記の勾配による溶出 緩衝液Ａ：二回蒸留水、０.１％ＴＦＡ 緩衝液Ｂ：アセトニトリル 10分間：緩衝液Ａ/５％緩衝液Ｂ→10ml/分の流速で60分
後に70％緩衝液Ｂに −Ａ１４３７ＬおよびＭ画分の凍結乾燥 5.8mgのＡ１４３７Ｌ（＞95％純度）、6.7mgのＡ１４３
７Ｍ（＞95％純度）
【００９４】８） Ａ１４３７リポペプチド検出用ＨＰ
ＬＣシステム 下記のシステムにより、粗製混合物中および培養濾液中
のリポペプチドを分離しそして定量することができる；
保持時間は１１.５分（Ａ１４３７Ｅ）〜約１５.９分
（Ａ１４３７Ｈ）である。
ＬＣシステム 下記のシステムにより、粗製混合物中および培養濾液中
のリポペプチドを分離しそして定量することができる；
保持時間は１１.５分（Ａ１４３７Ｅ）〜約１５.９分
（Ａ１４３７Ｈ）である。
【００９５】
【表５】
【００９６】９） アクチノプラネス・ニッポンエンシ
スＡＴＣＣ ３１１４５とアクチノプラネススピーシズ
（spec.）ＤＳＭ７３５８の比較 それら二つの株の前培養を実施例１ｂの記載と同様にし
て増殖させ、そして下記の生産培地の接種に用いる。 培地１：実施例３ａの記載と同様 培地２：実施例１と同様であるがＬ−バリンを含有しな
い 培地３：グルコース ３０ｇ／リットル；大豆粉 ２０ｇ
／リットル；Ｆｅ2(ＳＯ4)3 ０.３ｇ／リットル；Ｍｎ
Ｃｌ2×４Ｈ2Ｏ ０.３ｇ／リットルおよびＣｏＣｌ2×
６Ｈ2Ｏ、pH７.３ 各々３００ml三角フラスコ中１００mlの培地とする。
スＡＴＣＣ ３１１４５とアクチノプラネススピーシズ
（spec.）ＤＳＭ７３５８の比較 それら二つの株の前培養を実施例１ｂの記載と同様にし
て増殖させ、そして下記の生産培地の接種に用いる。 培地１：実施例３ａの記載と同様 培地２：実施例１と同様であるがＬ−バリンを含有しな
い 培地３：グルコース ３０ｇ／リットル；大豆粉 ２０ｇ
／リットル；Ｆｅ2(ＳＯ4)3 ０.３ｇ／リットル；Ｍｎ
Ｃｌ2×４Ｈ2Ｏ ０.３ｇ／リットルおよびＣｏＣｌ2×
６Ｈ2Ｏ、pH７.３ 各々３００ml三角フラスコ中１００mlの培地とする。
【００９７】インキュベーションは回転シェーカーを用
い３０℃で行う。培養濾液中のＡ１４３７リポペプチド
濃度を４８、９６および１４４時間後にＨＰＬＣ（実施
例８参照）により測定する。アクチノプラネス・ニッポ
ンエンシスＡＴＣＣ３１１４５株を含む培地２および培
地３中にはいかなるリポペプチドも検出できない。培地
１では１４４時間後に数種のペプチドを極く少量検出す
ることができる。これら化合物の特異吸光度がＡ１４３
７ペプチドのそれに一致すると仮定すると、生産量は培
地１においてアクチノプラネススピーシズＤＳＭ７３５
８株により同時間後に合成されるＡ１４３７Ｂ濃度より
も少なくとも１００倍低い（＜１mg／リットル）。
い３０℃で行う。培養濾液中のＡ１４３７リポペプチド
濃度を４８、９６および１４４時間後にＨＰＬＣ（実施
例８参照）により測定する。アクチノプラネス・ニッポ
ンエンシスＡＴＣＣ３１１４５株を含む培地２および培
地３中にはいかなるリポペプチドも検出できない。培地
１では１４４時間後に数種のペプチドを極く少量検出す
ることができる。これら化合物の特異吸光度がＡ１４３
７ペプチドのそれに一致すると仮定すると、生産量は培
地１においてアクチノプラネススピーシズＤＳＭ７３５
８株により同時間後に合成されるＡ１４３７Ｂ濃度より
も少なくとも１００倍低い（＜１mg／リットル）。
【００９８】１０） Ａ１４３７リポペプチドの作用 関連生物のＡ１４３７リポペプチドに対する感受性を寒
天希釈試験により測定する。使用される寒天であるMuel
ler-Hinton寒天に対し化膿連鎖球菌（S. pyrogenes）お
よびエンテロコッカスの場合には１０％馬血を添加す
る。抗生物質含有プレートに多通路接種器を用いて接種
する（特定株静止培養物を５×１０4cfu／接種部位）。
ＭＩＣ（最小阻止濃度）を３７℃で読みとる。ＭＩＣと
は２４時間インキュベーションした後に視認し得る生物
増殖を検出できない抗生物質濃度として定義される。結
果は表２にまとめられている。コントロールとして用い
たアンホマイシンはBoehringer Mannheim（ドイツ）か
ら取得した。アンホマイシンは同社のファインケミカル
として得ることができる。
天希釈試験により測定する。使用される寒天であるMuel
ler-Hinton寒天に対し化膿連鎖球菌（S. pyrogenes）お
よびエンテロコッカスの場合には１０％馬血を添加す
る。抗生物質含有プレートに多通路接種器を用いて接種
する（特定株静止培養物を５×１０4cfu／接種部位）。
ＭＩＣ（最小阻止濃度）を３７℃で読みとる。ＭＩＣと
は２４時間インキュベーションした後に視認し得る生物
増殖を検出できない抗生物質濃度として定義される。結
果は表２にまとめられている。コントロールとして用い
たアンホマイシンはBoehringer Mannheim（ドイツ）か
ら取得した。アンホマイシンは同社のファインケミカル
として得ることができる。
【００９９】
【表６】
【０１００】
【表７】 化合物Ｋ、ＬおよびＭは化合物Ａ〜Ｈと同等の試験管内
活性を有している。
活性を有している。
【０１０１】実施例１１ａ：Ａ１４３７Ｄの特性評価 リポペプチドＡ１４３７Ｄは無定形固体として単離され
る。 旋光度：＋３５°（ｃ＝０.１；メタノール） ＨＰＬＣ：保持時間：１５.１分 アミノ酸：２ アスパラギン酸 １ アスパラギン １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｅ＝１３０３.６９５２〔（Ｍ＋Ｈ)
+〕 分子量：１３０２.６８８４（Ｃ59Ｈ94Ｎ14Ｏ19） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３５６、４９１、５１７、５２
０、７４１、７６１、９３８、９８２ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９３
０、１６６０、１５３０、１４５０、１４００。
る。 旋光度：＋３５°（ｃ＝０.１；メタノール） ＨＰＬＣ：保持時間：１５.１分 アミノ酸：２ アスパラギン酸 １ アスパラギン １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｅ＝１３０３.６９５２〔（Ｍ＋Ｈ)
+〕 分子量：１３０２.６８８４（Ｃ59Ｈ94Ｎ14Ｏ19） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３５６、４９１、５１７、５２
０、７４１、７６１、９３８、９８２ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９３
０、１６６０、１５３０、１４５０、１４００。
【０１０２】実施例１１ｂ：Ａ１４３７Ｂの特性評価 リポペプチドＡ１４３７Ｂは無定形固体として単離され
る。 旋光度：＋２７°（ｃ＝０.１；メタノール） ＨＰＬＣ：保持時間：１２.８分 アミノ酸：３ アスパラギン酸 １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｅ＝〔（Ｍ＋Ｈ)+〕 分子量：１３０３（Ｃ59Ｈ93Ｎ13Ｏ20） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３５６、４０７、５１８、５２
１、７４１、７６２、９３８、９８２ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９２
５、１６５０、１５３５、１４５０、１４００。
る。 旋光度：＋２７°（ｃ＝０.１；メタノール） ＨＰＬＣ：保持時間：１２.８分 アミノ酸：３ アスパラギン酸 １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｅ＝〔（Ｍ＋Ｈ)+〕 分子量：１３０３（Ｃ59Ｈ93Ｎ13Ｏ20） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３５６、４０７、５１８、５２
１、７４１、７６２、９３８、９８２ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９２
５、１６５０、１５３５、１４５０、１４００。
【０１０３】実施例１１ｃ：Ａ１４３７Ｃの特性評価 リポペプチドＡ１４３７Ｃは無定形固体として単離され
る。 旋光度：＋３０°（ｃ＝０.１；メタノール） ＨＰＬＣ：保持時間：１４.１分 アミノ酸：２ アスパラギン酸 １ アスパラギン １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン 分子量：１２８８（Ｃ58Ｈ92Ｎ14Ｏ19） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３５６、３９２、５０３、７４
１、７４７、９３８、９８１ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９３
０、１６６０、１５３０、１４５０、１４００。
る。 旋光度：＋３０°（ｃ＝０.１；メタノール） ＨＰＬＣ：保持時間：１４.１分 アミノ酸：２ アスパラギン酸 １ アスパラギン １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン 分子量：１２８８（Ｃ58Ｈ92Ｎ14Ｏ19） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３５６、３９２、５０３、７４
１、７４７、９３８、９８１ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９３
０、１６６０、１５３０、１４５０、１４００。
【０１０４】実施例１１ｄ：Ａ１４３７Ａの特性評価 リポペプチドＡ１４３７Ａは無定形固体として単離され
る。 旋光度：＋３０°（ｃ＝０.１；メタノール） ＨＰＬＣ：保持時間：１１.８分 アミノ酸：３ アスパラギン酸 １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン 分子量：１２８９（Ｃ58Ｈ91Ｎ13Ｏ20） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３５６、４７８、５０４、５０
７、７４１、７４８、９３８、９８１ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９２
５、１６５０、１５３５、１４００。
る。 旋光度：＋３０°（ｃ＝０.１；メタノール） ＨＰＬＣ：保持時間：１１.８分 アミノ酸：３ アスパラギン酸 １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン 分子量：１２８９（Ｃ58Ｈ91Ｎ13Ｏ20） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３５６、４７８、５０４、５０
７、７４１、７４８、９３８、９８１ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９２
５、１６５０、１５３５、１４００。
【０１０５】実施例１１ｅ：Ａ１４３７Ｆの特性評価 リポペプチドＡ１４３７Ｆは無定形固体として単離され
る。 旋光度：＋３１°（ｃ＝０.１；メタノール） ＨＰＬＣ：保持時間：１３.８分 アミノ酸：２ アスパラギン酸 １ アスパラギン １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン 分子量：１２８８（Ｃ58Ｈ92Ｎ14Ｏ19） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３５６、３９２、５０３、５０
６、７４１、７４７、９３８、９８１ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９３
０、１６６０、１５３０、１４５０、１４００。
る。 旋光度：＋３１°（ｃ＝０.１；メタノール） ＨＰＬＣ：保持時間：１３.８分 アミノ酸：２ アスパラギン酸 １ アスパラギン １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン 分子量：１２８８（Ｃ58Ｈ92Ｎ14Ｏ19） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３５６、３９２、５０３、５０
６、７４１、７４７、９３８、９８１ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９３
０、１６６０、１５３０、１４５０、１４００。
【０１０６】実施例１１ｆ：Ａ１４３７Ｅの特性評価 リポペプチドＡ１４３７Ｅは無定形固体として単離され
る。 ＨＰＬＣ：保持時間：１１.５分 アミノ酸：３ アスパラギン酸 １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン 分子量：１２８９（Ｃ58Ｈ91Ｎ13Ｏ20） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３５６、３９３、５０４、５０
７、７４１、７４８、９３８、９８１ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９２
５、１６５０、１５３５、１４５０、１４００。
る。 ＨＰＬＣ：保持時間：１１.５分 アミノ酸：３ アスパラギン酸 １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン 分子量：１２８９（Ｃ58Ｈ91Ｎ13Ｏ20） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３５６、３９３、５０４、５０
７、７４１、７４８、９３８、９８１ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９２
５、１６５０、１５３５、１４５０、１４００。
【０１０７】実施例１１ｇ：Ａ１４３７Ｈの特性評価 リポペプチドＡ１４３７Ｈは無定形固体として単離され
る。 旋光度：＋３２°（ｃ＝０.１；メタノール） ＨＰＬＣ：保持時間：１５.９分 アミノ酸：２ アスパラギン酸 １ アスパラギン １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン 分子量：１３１６（Ｃ60Ｈ96Ｎ14Ｏ19） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３５６、４２０、５３１、５３
４、７４１、７７５、９３８、９８１ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９３
０、１６６０、１５３０、１４５０、１４００。
る。 旋光度：＋３２°（ｃ＝０.１；メタノール） ＨＰＬＣ：保持時間：１５.９分 アミノ酸：２ アスパラギン酸 １ アスパラギン １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン 分子量：１３１６（Ｃ60Ｈ96Ｎ14Ｏ19） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３５６、４２０、５３１、５３
４、７４１、７７５、９３８、９８１ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９３
０、１６６０、１５３０、１４５０、１４００。
【０１０８】実施例１１ｈ：Ａ１４３７Ｇの特性評価 リポペプチドＡ１４３７Ｇは無定形固体として単離され
る。 旋光度：＋３４°（ｃ＝０.１；メタノール） ＨＰＬＣ：保持時間：１３.６分 アミノ酸：３ アスパラギン酸 １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン 分子量：１３１７（Ｃ60Ｈ95Ｎ13Ｏ20） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３５６、４２１、５３２、５３
５、７４１、７７６、９３８、９８１ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９２
５、１６５０、１５３５、１４５０、１４００。
る。 旋光度：＋３４°（ｃ＝０.１；メタノール） ＨＰＬＣ：保持時間：１３.６分 アミノ酸：３ アスパラギン酸 １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン 分子量：１３１７（Ｃ60Ｈ95Ｎ13Ｏ20） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３５６、４２１、５３２、５３
５、７４１、７７６、９３８、９８１ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９２
５、１６５０、１５３５、１４５０、１４００。
【０１０９】実施例１１ｉ：Ａ１４３７Ｋの特性評価 リポペプチドＡ１４３７Ｋは無定形固体として単離され
る。 ＨＰＬＣ：保持時間：１２.５分 アミノ酸：３ アスパラギン酸 １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｅ＝〔（Ｍ＋Ｈ)+〕 分子量：１２９９（Ｃ58Ｈ91Ｎ13Ｏ20） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３９３、５０４、５０７、７４
１、７４８、９３８、９８１ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９２
５、１６５０、１５３５、１４５０、１４００。
る。 ＨＰＬＣ：保持時間：１２.５分 アミノ酸：３ アスパラギン酸 １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｅ＝〔（Ｍ＋Ｈ)+〕 分子量：１２９９（Ｃ58Ｈ91Ｎ13Ｏ20） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３９３、５０４、５０７、７４
１、７４８、９３８、９８１ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９２
５、１６５０、１５３５、１４５０、１４００。
【０１１０】実施例１１ｊ：Ａ１４３７Ｌの特性評価 リポペプチドＡ１４３７Ｌは無定形固体として単離され
る。 ＨＰＬＣ：保持時間：１３.０分 アミノ酸：３ アスパラギン酸 １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｅ＝〔（Ｍ＋Ｈ)+〕 分子量：１２８９（Ｃ59Ｈ93Ｎ13Ｏ20） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝４０７、５１８、７４１、７６
１、９３８、９８１ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９２
５、１６５０、１５３５、１４５０、１４００。
る。 ＨＰＬＣ：保持時間：１３.０分 アミノ酸：３ アスパラギン酸 １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｅ＝〔（Ｍ＋Ｈ)+〕 分子量：１２８９（Ｃ59Ｈ93Ｎ13Ｏ20） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝４０７、５１８、７４１、７６
１、９３８、９８１ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９２
５、１６５０、１５３５、１４５０、１４００。
【０１１１】実施例１１ｋ：Ａ１４３７Ｍの特性評価 リポペプチドＡ１４３７Ｍは無定形固体として単離され
る。 ＨＰＬＣ：保持時間：９.８分 アミノ酸：３ アスパラギン酸 １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｅ＝〔（Ｍ＋Ｈ)+〕 分子量：１２７５（Ｃ57Ｈ89Ｎ13Ｏ20） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３７９、４９０、４９３、７２
４、７４１、９３８、９８１ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９２
５、１６５０、１５３５、１４５０、１４００。
る。 ＨＰＬＣ：保持時間：９.８分 アミノ酸：３ アスパラギン酸 １ β−メチルアスパルテート ２ グリシン ２ ２,３−ジアミノ酪酸 １ プロリン １ ピペコリン酸 １ バリン ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｅ＝〔（Ｍ＋Ｈ)+〕 分子量：１２７５（Ｃ57Ｈ89Ｎ13Ｏ20） ＣＩＤ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３７９、４９０、４９３、７２
４、７４１、９３８、９８１ ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝３４２０（ｂｒ）cm-1、２９２
５、１６５０、１５３５、１４５０、１４００。
【０１１２】実施例１２：Ｃ１３化学シフト 表はＡ１４３７ＢのＣＨシグナルのＣ１３化学シフトを
示す。
示す。
【表８】
【０１１３】1Ｈデータとの比較を可能にするために、
ＮＨシグナルのＮＨ化学シフト、またＰｉｐおよびＰｒ
ｏについては相当するスピンシステムのＣαＨシフトも
示してある。
ＮＨシグナルのＮＨ化学シフト、またＰｉｐおよびＰｒ
ｏについては相当するスピンシステムのＣαＨシフトも
示してある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:045） (72)発明者 ゲールハルト・ザイベルト ドイツ連邦共和国デー−64291ダルムシ ユタト−アルハイリゲン．グレーザーヴ エーク21 (72)発明者 ラースロウ・フエルテシ ドイツ連邦共和国デー−65817エプシユ タイン／タウヌス．エペンハイナーヴエ ーク６ (72)発明者 ヨーアヒム・ヴインク ドイツ連邦共和国デー−63322レーダー マルク．マグデブルガーシユトラーセ14 (72)発明者 アストリド・マルクス ドイツ連邦共和国デー−65835リーダー バハ．ズルツバハーシユトラーセ６
Claims (8)
- 【請求項１】 アクチノプラネスｓｐ．を倍地中で発酵
させて式Ｉ 【化１】 （式中、 Ｒ１は一重または多重不飽和の、飽和の、またはそれと
は無関係に分枝状のまたは非分枝状の、６〜２２個の炭
素原子の鎖長を有する脂肪酸またはヒドロキシ脂肪酸で
あり、そしてＲ２はＡｓｐまたはＡｓｎである）で示さ
れる一種またはそれ以上のリポペプチドを培地中に蓄積
させそして適切な場合には式Ｉで示される一種またはそ
れ以上のリポペプチドを培地から精製して得られるリポ
ペプチド（ただし式ＩにおいてＲ１が 【化２】 であり、そしてＲ２がＡｓｐであるリポペプチドを除
く）。 - 【請求項２】 アクチノプラネスｓｐ．を倍地中で発酵
させて ａ）ｉＣ１３−脂肪酸−Ａｓｐ−Ｄａｂ−Ｐｉｐ−Ｍｅ
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｄａｂ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏ、 ｂ）ｉＣ１４−脂肪酸−Ａｓｐ−Ｄａｂ−Ｐｉｐ−Ｍｅ
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｄａｂ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏ． ｃ）ｉＣ１３−脂肪酸−Ａｓｎ−Ｄａｂ−Ｐｉｐ−Ｍｅ
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｄａｂ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏ、 ｄ）ｉＣ１４−脂肪酸−Ａｓｎ−Ｄａｂ−Ｐｉｐ−Ｍｅ
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｄａｂ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏ、 ｅ）ａｉＣ１３−脂肪酸−Ａｓｎ−Ｄａｂ−Ｐｉｐ−Ｍ
ｅＡｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｄａｂ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ、 ｆ）ａｉＣ１５−脂肪酸−Ａｓｐ−Ｄａｂ−Ｐｉｐ−Ｍ
ｅＡｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｄａｂ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ、 ｇ）ａｉＣ１５−脂肪酸−Ａｓｎ−Ｄａｂ−Ｐｉｐ−Ｍ
ｅＡｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｄａｂ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ、 ｈ）ｎＣ１２−脂肪酸−Ａｓｐ−Ｄａｂ−Ｐｉｐ−Ｍｅ
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｄａｂ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏ、 ｉ）ｎＣ１３−脂肪酸−Ａｓｐ−Ｄａｂ−Ｐｉｐ−Ｍｅ
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｄａｂ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏ、 ｊ）ｎＣ１４−脂肪酸−Ａｓｐ−Ｄａｂ−Ｐｉｐ−Ｍｅ
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｄａｂ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏなる群の一種またはそれ以上のリポペプチ
ドを培地中に蓄積させ、そして適切な場合にはこれらリ
ポペプチドの一種またはそれ以上を培地から精製して得
られるリポペプチド。 - 【請求項３】 式ＩＩ Ｒ１−Ｒ２−Ｄａｂ−Ｐｉｐ−ＭｅＡｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌ ｙ−Ｄａｂ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ ＩＩ （式中、 【化３】 【化４】
- 【請求項４】 アクチノプラネスｓｐ．を培地中で発酵
させて一種またはそれ以上のリポペプチドを培地中に蓄
積させ、そして適切な場合には一種またはそれ以上のリ
ポペプチドを培地から精製することより成る、請求項１
に記載の式Ｉで示される一種またはそれ以上のリポペプ
チド、請求項２に記載の一種またはそれ以上のリポペプ
チドまたは請求項３記載の式ＩＩで示される一種または
それ以上のリポペプチドの製造方法。 - 【請求項５】 アクチノプラネスｓｐ．を培地中で発酵
させて式ＩＩＩ Ｒ１−Ｒ２−Ｄａｂ−Ｐｉｐ−ＭｅＡｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌ ｙ−Ｄａｂ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ ＩＩＩ （式中Ｒ１は 【化５】 であり、そしてＲ２はＡｓｐである）で示されるリポペ
プチドを培地中に蓄積させ、そして適切な場合には式Ｉ
ＩＩで示されるリポペプチドを培地から精製することよ
り成るリポペプチドの製造方法。 - 【請求項６】 請求項１記載の式Ｉで示される一種また
はそれ以上のリポペプチドおよび適切な場合には薬学的
ビヒクルを含有する医薬。 - 【請求項７】 請求項５記載の式ＩＩＩで示されるリポ
ペプチドおよび適切な場合には薬学的ビヒクルを含有す
る医薬。 - 【請求項８】 アクチノプラネスｓｐ．ＤＳＭ７３５
８。
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