CZ285322B6

CZ285322B6 - Lipopeptidy produkované bakteriemi druhu Actinoplanes s farmakologickým účinkem, způsoby jejich přípravy a jejich použití

Info

Publication number: CZ285322B6
Application number: CZ941381A
Authority: CZ
Inventors: Peter Dr. Hammann; Gerhard Prof. Dr. Seibert; László Dr. Vertesy; Joachim Dr. Wink; Astrid Dr. Markus; Johannes Dr. Meiwes
Original assignee: Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date: 1993-06-08
Filing date: 1994-06-06
Publication date: 1999-07-14
Also published as: DE59407475D1; JP2660161B2; KR950000890A; IL109917A0; PL303716A1; ATE174604T1; HU9401465D0; MA23216A1; SK281830B6; ZA943983B; KR100319563B1; CY2190B1; GR3029591T3; FI942660A; DK0864584T3; KR0174264B1; GR3035204T3; PT864584E; PL180230B1; DE59409616D1

Abstract

Lipopeptidy s velmi homologními sekvencemi aminokyselin, ale s rozdílnými zbytky mastných kyselin (lipidickou částí) jsou syntetizovány v průběhu fermentace bakteriemi druhu Actinoplanes a odevzdávány do kultivačního média, způsob izolace těchto lipopeptidů z kultivačního média a jejich čištění, použití těchto lipopeptidů jako farmakologicky účiných látek, zejména proti gram-pozitivním bakteriím, jakož i použití Actinoplanes sp. DSM 7358 k výrobě výše zmíněných lipopeptidů.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká lipopeptidů s homologními sekvencemi aminokyselin, ale s rozdílnými zbytky mastných kyselin (lipidickou částí), které jsou syntetizovány během fermentace bakteriemi Actinoplanes sp. a odevdávány do kultivačního média, způsobů přípravy těchto lipopeptidů, léčiv, které tyto lipopeptidy obsahují, a jejich použití k přípravě antibiotik proti gram-pozitivním bakteriím, jakož i bakterií Actinoplanes sp. DSM 7358, které tyto lipopeptidy produkují.

Dosavadní stav techniky

Sekundární metabolity různých mikroorganismů jsou s úspěchem používány k léčbě infekčních nemocí. Sekundárními metabolity jsou míněny nízkomolekulámí sloučeniny, které jsou produkovány biosyntetickými pochody, které odbočují od primárního metabolismu, a jejichž okamžitý význam pro producenta je nejasný. Dodnes je známo cca 8000 sekundárních metabolitů izolovaných z kultur různých mikroorganismů (především hub a bakterií rodu Streptomyces).

Hlavní oblast použití těchto sekundárních metabolitů je v terapii infekčních nemocí. Avšak díky rozšířenému používání dochází často ke vzniku rezistence proti těmto látkám, takže existuje stálá potřeba nových antibiotik a účinných látek s novým mechanismem účinku (viz Neu H.C., Science 257, 1992, str. 1064 až 1073).

Vedle toho se rozšířila oblast indikace mikrobiálních látek také na nemoci, které nepatří mezi infekční choroby (například terapie tumorů, imunodulační nemoci nebo regulace výměny tuků) a také na ochranu rostlin (jako herbicity a insekticidy). Používané účinné látky jsou však často ještě zatíženy nedostatky, které spočívají v nedostatečné výši účinku, v příliš vysoké toxicitě a/nebo v nežádoucích vedlejších účincích.

V literatuře jsou popsány lipopeptidy, jejichž aminokyselinová část je vzhledem na sekvenci identická, a nebo vzhledem ke skladbě aminokyselin stejná, a nebo velmi podobná s lipopeptidy podle vynálezu. Avšak tyto lipopeptidy se od lipopeptidů podle vynálezu zásadně liší v lipidické části.

Příklady výše zmíněných lipopeptidů jsou:

Amphomycin antibiot. (J. Antibiotics, 38, str. 517 (1965));

Glumamycin (J. Antibiotics, 38, str. 517 (1965));

Zaomycin (J. Antibiot. Ann., str. 194 (1960));

Aspartocin (Antibiotics. Ann., 194 (1960));

Tsushimycin (J. Antibiotics, 21 str. 439 (1968));

Laspartomycin (J. Antibiotics, 21, str. 55 (1968)).

Tyto lipopeptidy, které jsou označovány jako lipopeptidy amphomycinového typu jsou syntetizovány mikroorganismy rodu Straptomyces. Jejich antibiotická účinnost se uplatňuje proti grampozitivním bakteriím, jako například proti streptokokům, staphylokokům a enterokokům.

V poslední době se rostoucí měrou ukázaly jako problémové choroboplodné zárodky zejména kmeny rodů staphylococcus a Enterococcus. Pod pojmem problémové choroboplodné zárodky rozumí odborník takové mikroorganismy, jejichž efektivní eliminace není možné vzhledem

- 1 CZ 285322 B6 k vzrůstající rezistenci na stávající antibiotika (například β-laktamová antibiotika nebo glykopeptidová antibiotika, jako jsou například Valcomycin nebo Teikoplanin).

Jednu skupinu kmenů mikroorganismů, u nichž se vytvořila rezistence, tvoří např. kmeny druhu staphylococcus aureus rezistentní vůči Methicillinu, zkráceně nazývané „MRSA-kmeny“ (Methicillin-resistent Staphylococcus aureus). Mezitím se zjistilo, že tyto MRSA-kmeny si vytvořily rezistenci nejenom proti Methicillinu, ale kromě toho i proti dalším antibiotikům (například Vancomycinu).

Nehledě na již popsané sloučeniny produkované straptomycety, je známa jedna sloučenina produkovaná bakteriemi Actinoplanes nipponensis ATCC 31145, která vykazuje na základě svého účinnostního spektra a popsaných fyzikálně-chemických vlastností strukturní podobnosti s lipopeptidy podle vynálezu, a která je označena jako sloučenina 41.012 (americký patent 4,001,397). Fermentace bakterií Actinoplanes nipponensis ATCC 31145 za různých kultivačních podmínek vede vždy k relativně nízkým výtěžkům sloučeniny 41.012.

Podstata vynálezu

Úkolem vynálezu je hledat mikrobiální přírodní látky se zlepšenými vlastnostmi.

Tento úkol je podle vynálezu řešen fermentaci bakterií druhu Actinoplanes v živném roztoku ze zdrojem uhlíku a dusíku, jakož i s obvyklými anorganickými solemi, až do nahromadění lipopeptidů v kultivačním médiu, především nahromadění lipopeptidů A 1437, následnou izolací lipopeptidů z kultivačního média a popřípadě rozdělení této směsi na její jednotlivé složky. Tyto lipopeptidy mají farmakologickou účinnost a s tím spojený terapeutický účinek a mohou být použity jako antibiotika s účinkem proti gram-pozitivním bakteriím, s výhodou proti kmenům, které jsou rezistentní proti glykopeptidům.

Předmětem vynálezu jsou tedy lipopeptidy obecného vzorce I

R¹-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro (I) ve kterém

R¹ představuje zbytek jednou nebo vícenásobně nenasycené, nasycené nebo, nezávisle na tom, rozvětvené nebo nerozvětvené mastné kyseliny nebo hydroxy-mastné kyseliny s délkou řetězce od 6 do 22 atomů uhlíku včetně.

Zbytek kyseliny ve významu symbolu R¹ má výhodně délku řetězce od 10 do 20 atomů uhlíku včetně, ještě výhodněji 12, 13,14 nebo 15 atomů uhlíku.

R¹ výhodně představuje

a) zbytek iCn-mastné kyseliny,

b) zbytek iC^-mastné kyseliny,

c) zbytek aiCu-mastné kyseliny, nebo

d) zbytek aiCu-mastné kyseliny.

-2CZ 285322 B6

Ještě výhodněji R¹ představuje skupinu

O

Předmětem vynálezu je dále způsob přípravy lipopeptidů výše uvedeného obecného vzorce I, při kterém se fermentují bakterie Actinoplanes sp. v kultivačním médiu až se v tomto kultivačním médiu nahromadí alespoň jeden tento lipopeptid, a tento lipopeptid, nebo tyto lipopeptidy, obecného vzorce I, se purifikují z kultivačního média. Purifikace se výhodně provádí tak, že se lipopeptidy vysráží z kultivačního média za použití kyselin při pH 0,5 až pH 4 včetně, načež se popřípadě lipopeptidy získané vysrážením přečistí chromatografii na iontoměničích nebo chromatografii na hydrofóbní matrici, přičemž se obě chromatografie mohou provádět alternativně nebo následně v libovolném pořadí. Pro fermentaci se výhodně použijí bakterie Actinoplanes sp. DSM 7358.

Předmětem vynálezu je dále léčivo, které obsahuje alespoň jeden lipopeptid obecného vzorce I a popřípadě farmaceutické nosiče a rovněž použití lipopeptidů obecného vzorce I k přípravě antibiotika proti gram-pozitivním bakteriím, zejména vůči bakteriím rezistantním vůči glykopeptidům.

Předmětem vynálezu je dále Actinoplanes sp. DSM 7358.

V následujícím textu bude vynález blíže popsán, zvláště pak jeho výhodné formy provedení.

Definice zkratek:

- Dab znamená kyselinu 2,3-diaminomáselnou.

- Pip znamená kyselinu pipekolinovou (synonymum: homoprolin)

- MeAsp znamená β-methylaspartát,

- Gly znamená glycin,

- Asp znamená asparagin,

- Asp znamená kyselinu asparagovou,

-Val znamená valin,

- Pro znamená prolin,

-3CZ 285322 B6

- n znamená normální/nerozvětvený (řetězec),

- CID znamená „collisional induced decay“ (srážkou způsobený rozpad).

Zkratka „i“ znamená „iso“, zatímco „ai“ má význam „ante-iso“. Tato označení jsou odborníku v oboru mastných kyselin známá (Biochemistry, Zubay, nakl. Addison Wesley v Londýně, Amsterdam, 1983).

Všechny údaje v procentech se vztahují k hmotnosti, pokud není uvedeno jinak. Směsné poměry u kapalin se vztahují k objemu, pokud nejsou uvedeny jiné údaje.

Způsob podle vynálezu může být použit pro fermentaci v laboratorním měřítku (mililitrové až litrové objemy) a pro fermentaci v průmyslovém měřítku (kubické metry).

Bakterie druhu Actinoplanes byly izolovány ze vzorku země. Za účelem vyčištění se vzorek země rozplaví fyziologickým roztokem (0,9% NaCl) za vytvoření řady klesajících koncentrací (10° až 10⁶). Jednotlivými zředěními se pak naočkují plotny se živnou půdou vhodnou pro actinomycety. Po kultivaci kultur při 30 °C po dobu od 2 do 14 dní vzniknou kolonie actinomycet, které lze izolovat odděleně v několika po sobě následujících přečišťovacích stupních. Určení rodu se provádí na základě morfologických a taxonomických kritérií podle odborníkovi známých metod. Pro rod Actinoplanes jsou charakteristické především pohyblivé spory.

Pomocí po sobě následujících izolačních a přečišťovacích stupňů, je možné z bakterií druhu Actinoplanes izolovat kolonii, která do kultivačního média vylučuje velmi účinně jednu nebo více sloučenin lipopeptidů podle vynálezu, s výhodou lipopeptidy A 1437 A, B, C, D, E, F, G, H, K, L, a/nebo M a označují se jako hlavní producent.

Jako hlavní producent se označuje takový izolát, který produkuje, respektive odevzdává do kultivačního média jednu nebo více sloučenin lipopeptidů podle vynálezu v desetinásobném až stonásobném množství ve srovnání s izoláty stejného druhu bakterií Actinoplanes.

Silně produkující kolonie bakterií Actinoplanes se množí. Izolát byl uložen podle pravidel Budapešťské smlouvy z 18. června 1990 v německé sbírce mikroorganismů a buněčných kultur (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, 3300 Brauschweig) pod následujícím číslem: Actinoplanes sp. DSM 7358

Actinoplanes sp. DSM 7358 má oranžově zbarvená mycelia a je charakterizována kulovitými sporangii.

Bakterie druhu Actinoplanes, především DSM 7358 produkují jednu nebo více sloučenin lipopeptidů podle vynálezu v živném roztoku (označován též jako kultivační médium), který obsahuje zdroj uhlíku a dusíku, jakož i obvyklé anorganické soli.

Místo kmene DSM 7358 mohou být také použity jeho mutanti nebo varianty, kteří syntetizují jednu nebo více sloučenin lipopeptidů podle vynálezu. Takovíto mutanti mohou být vytvořeni známými způsoby působením fyzikálních prostředků, například ozařováním ultrafialovými nebo rentgenovými paprsky, nebo působením chemických mutagenů, jako jsou například ethylmethansulfonát (EMS), 2-hydroxy-4-methoxy-benzofenon (MOB) nebo N-methyl-N'-nitroN-nitrosoguanidin (MNNG).

Vyhledávání mutantů a variant, které syntetizují jednu nebo více sloučenin lipopeptidů podle vynálezu, je prováděno podle následujícího schématu:

-4CZ 285322 B6

- Oddělení mycelií po fermentací

- Vysrážení lipopeptidů při pH 1-2 (4 °C)

- Rozpuštění sraženiny ve směsi methanol voda (1:1)

- Analytika pomocí HPLC, DC nebo inhibičního testu aktivity antibiotik.

Dále popsané fermentační podmínky platí pro bakterie druhu Actinoplanes, uložený izolát DSM 7358, jakož i pro jejich mutanty a varianty.

V živném roztoku, který obsahuje zdroje uhlíku a dusíku, jakož i anorganické soli, produkují bakterie druhu Actinoplanes, především pak DSm 7358, jednu nebo více sloučenin lipopeptidů podle vynálezu, především lipopeptidy A 1437 A-H jakož i K, L, M.

Jako výhodné zdroje uhlíku pro aerobní fermentací se hodí asimilovatelné uhlohydráty a cukerné alkoholy, jako je například glukóza, laktóza nebo D-mannitol, jakož i produkty obsahující uhlohydráty, jako například extrakt ze sladu. Jako živiny obsahující dusík přicházejí v úvahu: aminokyseliny, peptidy a proteiny, jakož i produkty vznikající jejich rozkladem, jako jsou pepton nebo trypton, dále masové extrakty, rozemletá semena například kukuřice, pšenice, fazolí, sóji nebo bavlníku, destilační zbytky výroby alkoholu, masové moučky nebo kvasnicové extrakty, ale také amonné soli a dusičnany. Z anorganických solí může živný roztok obsahovat například chloridy, uhličitany, sírany nebo fosforečnany alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, železo, zinek, kobalt a mangan.

Tvorba lipopeptidů podle vynálezu probíhá obzvláště dobře v živném roztoku, který obsahuje přibližně 0,1 až 5 % (s výhodou 0,3 až 2 %) masového extraktu a 0,2 až 5 % (s výhodou 0,3 až 2 %) masového extraktu a 0,2 až 5 % (s výhodou 0,5 až 2 %) sacharózy, 0,05 až 5 g/1 (s výhodou 0,1 až 0,5 g/1) kvasničného extraktu a 0,05 až 2 g/1 (s výhodou 0,1 až 1 g/1) síranu hořečnatého a 0,05 až 10 g/1, výhodně 0,1 až 1 g/1 hydrogenfosforečnanu draselného nebo sodného a 0 až 100 μΜ (5 až 20 μΜ chloridu železitého). Údaje v procentech jsou vždy vztaženy na hmotnost celkového živného roztoku.

Při kultivaci v živném roztoku vytvářejí bakterie Actinoplanes sp., s výhodu Actinoplanes sp., s výhodou Actinoplanes sp. DSM 7358, směs lipopeptidů obecného vzorce Π

R^!-R²-Dab-Pip-Me Asp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-V al-Pro (II)

Tato směs se s výhodou skládá z 11 odlišných a prokazatelných lipopeptidů, označených A 1437 A, B, C, D, E, F, G, Η, K, L a M, které jsou charakterizovány níže. Ty z těchto lipopeptidů, ve kterých R² znamená Asn, jsou nové.

-5CZ 285322 B6

Jméno

A 1437 A

R1/R2

Molekulová hmotnost ^R1

COOH

1290

A 1437 B

A 1437 C

A 1437 D

A 1437 E

A 1437 F

«1

COOH

R₂ = Asn

\₂ - Asn

- Asp

1304

1289

1303

COOH

1290

1289

-6CZ 285322 B6

Jméno	R]/R₂		Molekulová hmotnost
A 1437 G	^{Rl =} χΑ/Χ		1318
		'Χ/Χ/Χ/	COOH
	r₂ = Asp

A 1437 H

1317

R₂ = Asn

1318

A 1437 M R₁ =

1318

R₂ = Asp

Lipopeptid A 1437 A obsahuje stejně jako A 1437 C jednu iso-Cu-mastnou kyselinu, která dosud nebyla známa v lipopeptidech amphomycinového typu. Aminokyselinová sekvence lipopeptidu A 1437 A odpovídá sekvenci Amphomycinu, který však obsahuje ante-isomer-Cumastné kyseliny. Skladba aminokyselin a sekvence lipopeptidu A 1437 C není známa zjiných lipopeptidů.

A 1437 B má, stejně jako A 1437 D, mastnou kyselinu typu iso-C₁₄ a tudíž mastnou kyselinu známou z Tsushimycinu A 1437 D se však skladbou svých aminokyselin a jejich sekvencí liší od lipopeptidů známých z dosavadního stavu techniky, zatímco A 1437 B má sekvenci aminokyselin stejnou jako Amphomycin. Aminokyselinové složení Amphomycinu, Zaomycinu a Tsushimycinu je podle literatury identické.

Lipopeptid A 1437 E z bakterií druhu Actinoplanes, zvláště z Actinoplanes DSM 7358, je identický s Amphomycinem, známým ze Streptomycet.

A 1437 F sestává z ante-iso Cn-mastné kyseliny, má tudíž stejný typ mastné kyseliny jako je znám z Amphomycinu. Jeho aminokyselinové složení a sekvence není z dosavadního stavu techniky známa.

-7CZ 285322 B6

Lipopeptidy A 1437 G a A 1437 H mají stejně jako Aspartocin, jednu ante-iso-Cis-mastnou kyselinu. Sekvence aminokyselin lipopeptidu A 1437 G odpovídá sekvenci Amphomycinu, zatímco sekvence a složení lipopeptidu A 1437 H není z dosavadního stavu techniky známa.

Lipopeptidy A 1437 K, L a M mají nerozvětvené mastné kyseliny s řetězcem o délce 12 až 14 uhlíkových atomů. Sekvence aminokyselin tří jmenovaných lipopeptidů odpovídá sekvenci Amphomycinu.

Lipopeptidy A 1437 A až H mají všechny spojenu karboxylovou skupinu prolinu na C-konci s β-aminoskupinou 2,3-diaminomáselné kyseliny na N-konci. Tato vazba je vyznačena symbolem „|___|“ .

V závislosti na složení živného roztoku může kolísat množství podílu jednoho nebo několika lipopeptidů podle vynálezu. Mimo to lze složením živného média regulovat syntézu jednotlivých lipopeptidů tak, že není produkován mikroorganismem vůbec, popřípadě jenom v množství pod hranici detekovatelnosti.

Kultivační médium bakterií druhu Actinoplanes, výhodně Actinoplanes DSM 7358, obsahuje lipopeptidy s jednonásobně nebo vícenásobně nenasycenou, nasycenou nebo nezávisle na tom rozvětvenou nebo nerozvětvenou mastnou kyselinou nebo hydroxy-mastnou-kyselinou s řetězcem o délce 6 až 22 (včetně) uhlíkových atomů, výhodně pak od 10 do 20 (včetně) uhlíkových atomů, a zvláště výhodně o 13, 14 nebo 15 uhlíkových atomech. Takovéto mastné kyseliny jsou odborníkovi známy například zRompp Chemie Lexikon, prof. Falbe a prof. Regitz, 9. vyd. nakladatelství Georg Thieme, Stuttgert, New York nebo z The Encyclopedia of Chemistry C.A. Hampel a G.G.Hawley, 3. vyd., Van Nostrand Company, New York.

Následující výčet mastných kyselin je pouze příkladem, nečiní si žádné nároky na úplnost a není nijak omezující.

Nasycené, nerozvětvené mastné kyseliny v lipopeptidech podle vynálezu jsou například: kyselina kapronová, heptanová, kapiylová, pelargonová, kaprinová, undekanová, laurová, tridekanová, myristová, peptadekanová, palmitová, margarínová, stearová, nonadekanová, arachová, behenová.

Nasycené, rozvětvené mastné kyseliny lipopeptidů podle vynálezu jsou například: isomáselná nebo isovalerová kyselina nebo odpovídající kyselina v konfiguraci „ante-iso“.

Jednonásobně nenasycené, nerozvětvené mastné kyseliny lipopeptidů podle vynálezu jsou například: kyselina akrylová nebo krotonová.

Dvojnásobně nenasycená, nerozvětvená mastná kyselina lipopeptidů podle vynálezu je například kyselina sorbová.

Trojnásobně nenasycené, nerozvětvené mastné kyseliny lipopeptidů podle vynálezu jsou například: kyselina linolenová nebo eikosatrienová.

Čtyřnásobně nenasycenou, nerozvětvenou mastnou kyselinou v lipopeptidech podle vynálezu je například: kyselina arachidonová.

Pětinásobně nenasycenou, nerozvětvenou mastnou kyselinou v lipopeptidech podle vynálezu je například: kyselina klupanodenová.

-8CZ 285322 B6

Šestinásobně nenasycenou, nerozvětvenou mastnou kyselinou v lipopeptidech podle vynálezu je například: kyselina dokosahexaenová.

Dále se mohou v kultivačním médiu nacházet lipopeptidy s vícenásobně rozvětvenými mastnými kyselinami jako například s 2', 4', 6', 8'-tetramethyl-<iekanovou kyselinou.

Hydroxy-mastné-kyseliny v lipopeptidech podle vynálezu jsou například mastné kyseliny hydroxylové v poloze 2' a 3' a/nebo na konci uhlíkové řetězce v konfiguraci „iso“ nebo ante-iso.

Přidáním 0,01 až 5 %, výhodně 0,02 až 0,1 % L-valinu kvýše popsanému živnému roztoku, tvoří kmen bakterií druhu Actinoplanes především lipopeptidu A 1437 B a D. Po přidání 0,01 až 5 %, výhodně 0,01 až 0,5 % L-leucinu kvýše popsanému živnému roztoku tvoří kmen bakterií druhu Actinoplanes přednostně lipopeptidy A 1437 A a C.

Přidáním 0,01 až 5 %, výhodně 0,05 až 0,5 % L-isoleucinu k výše popsanému živnému roztoku tvoří kmen bakterií druhu Actinoplanes především lipopeptidy A 1437 E, F, G a H. Přidáním 0,01 až 5 %, výhodně 0,05 až 0,5 % L-a-aminomáselné kyseliny kvýše popsanému živnému roztoku tvoří kmen bakterií Actinoplanes především lipopeptid K. Při přídavku 0,01 až 5 %, výhodně 0,05 až 0,5 % L-norvalinu k výše popsanému živnému roztoku tvoří kmen bakterií druhu Actinoplanes především lipopeptidy L a/nebo M. Totéž platí pro výhodný kmen DSM 7358.

Vedle těchto aminokyselin mohou být také použity jim odpovídající α-ketokyseliny (a-ketoisovalerát, α-ketoisokaproát, a-keto-p-methylvalerát, α-ketovalerát), nebo jim odpovídající karboxylové kyseliny (isobutyrát, isovalerát, α-methylbutyrát, n-butyrát, propionát a valerát) v odpovídajících koncentracích nebo další substance, které mohou zasahovat do biosyntézy mastných kyselin.

Kultivace mikroorganismů probíhá v aerobních podmínkách, tedy například submersně za stálého protřepávání nebo míchání v třepačkách nebo fermentorech, popřípadě je směs probublávána vzduchem nebo kyslíkem. Kultivace může probíhat v teplotním rozmezí od asi 18 do 35 °C, výhodně při teplotě asi 25 až 35 °C, zejména však při 28 až 32 °C. Kultivační pH by se mělo pohybovat mezi 6 a 8, výhodně mezi 6,5 a 7,5. Mikroorganismus se za těchto podmínek kultivuje obecně po dobu od 24 do 300 hodin, výhodně od 36 do 140 hodin.

Výhodně se kultivace provádí v několika stupních, tj. nejprve se připraví jedna nebo několik předběžných kultur (inokulum) v tekutém živném médiu, které se poté přeočkují do vlastního produkčního média, tj. do hlavní kultury, například v objemovém poměru 1:10. Inokulum lze připravit tak, že například přesadíme jednu kolonii do živného roztoku a necháme ji růst okolo 36 až 120 hodin, výhodně 48 až 72 hodin. Takovouto kolonii lze získat například tak, že necháme určitý kmen bakterií růst po přibližně 3 až 40 dnů, výhodně 4 až 10 dnů, na pevné nebo tekuté živné půdě, například na směsi agaru, sladu a kvasnic, nebo na agaru s bujónem (standardní médium pro mikroorganismy, ve kterém jsou hlavními složkami pepton, kuchyňská sůl a agar, například od firmy Difco).

Průběh fermentace lze sledovat na základě hodnoty pH kultivačního média nebo objemu kolonií, jakož i chromatografíckými metodami, jako je např. chromatografíe na tenké vrstvě (Dunnschichtchromatographi, DC), nebo vysokotlakou kapalinovou chromatografií (High pressure liquid chormatography, HPLC) nebo zkouškami biologické aktivity. Sloučenina podle vynálezu je obsažena jak v koloniích tak i ve filtrátu kultury, největší díl se však nachází ve filtrátu kultivačního média kultivačním médiu (>90 %).

-9CZ 285322 B6

V následujícím textu popsaný způsob izolace slouží pro přečišťování lipopeptidů, zejména lipopeptidů A 1437 A-H, jakož i K, L, M.

Izolace, popřípadě přečištění některého z lipopeptidů z kultivačního média se provádí pomocí známých metod s ohledem na chemické, fyzikální a biologické vlastnosti přírodních látek. Ke zjištění koncentrace antibiotika v kultivačním médiu nebo v jednotlivých izolačních stupních může být použito chromatografie na tenké vrstvě, například na silikagelu a s použitím 25% roztoku amoniaku v isopropanolu jako rozpouštědla, nebo HPLC. K detekci při rozdělování chromatografií na tenké vrstvě lze použít barevné reagencie jako například anisaldehyd, přičemž množství vytvořené látky se účelně srovná s někteiým standardním roztokem.

Při izolaci lipopeptidů se nejdříve oddělí z kultivačního roztoku kolonie bakterií (mycelium) pomocí běžných postupů a poté se filtrát kultivačního média okyselí, výhodně při 4 °C, na hodnotu pH 0,5 až 4 (včetně), výhodně na pH 1,5 až 2,5 (včetně). Úprava hodnoty pH a sní spojené vysrážení lipopeptidů A 1437 se může provádět za použití všech na trhu běžných kyselin. Roztok se inkubuje až po dobu 16 hodin, výhodně až 4 hodiny, a poté se vzniklá sraženina oddělí odstřeďováním.

Sraženina, která obsahuje veškerý lipopeptid se resuspenduje s l/20tině původního objemu redestilovanou vodou a pomocí NaOH se hodnota pH suspenze upraví na pH 6 až 7. Veškerá sraženina přejde přitom do roztoku; roztok se ochladí na -20 °C a lyofilizuje. Lyofilizát, označený v následujícím textu jako surový produkt (nebo také surový peptid) obsahuje 5 až 30 % lipopeptidů a používá se pro další izolaci.

Další přečištění jednoho nebo více lipopeptidů podle vynálezu se provádí chromatografií na vhodných materiálech, výhodně na silikatelu, oxidu hlinitém, iontoměničích nebo na adsorbčních pryskyřicích a zcela zvlášť výhodně na silně nebo slabě bazických anexech. Pomocí těchto chromatografíckých metod se tyto lipopeptidy rozdělí, podle toho, zda obsahuje na N-konci aminokyselinu Asp nebo Asn. Chromatografie těchto lipopeptidů se provádí pufrovanými vodnými roztoky, nebo směsí vodných a alkoholických roztoků.

Pod pojmem pufrované vodné roztoky se rozumí například voda, fosforečnanový pufr, pufr s octanem amonným, citrátový pufr, borátový pufr o koncentracích 0 až 1 M, výhodně 1 až 100 mM, obzvláště výhodně se používají roztoky s fosforečnanovým pufrem o koncentraci 1 až 100 mM.

Pod pojmem směsi vodných nebo alkoholických roztoků se rozumí všechna organická rozpouštědla mísitelná s vodou, výhodně methanol, acetonitril, v koncentraci 10 až 80% organického rozpouštědla, výhodně 40 až 60 % rozpouštědla nebo také všechny pufrované vodné roztoky, které jsou mísitelné s organickým rozpouštědlem. Zde použité pufry jsou stejné jako výše popsané.

Rozdělování lipopeptidů podle jejich různých mastných kyselin se provádí pomocí chromatografie s reverzní fází, například na MCI^R (adsorpční pryskyřice od firmy Mitsubishi, Japonsko). Zvláště výhodná je chromatografie s reverzní fází na hydrofóbních materiálech, výhodné na fázích RP-8 nebo RP-18. Kromě toho se může provádět dělení pomocí chromatografie na silikagelu.

Chromatografie lipopeptidů se provádí pufrovanými nebo okyselenými vodnými roztoky nebo směsi vodných roztoků s alkoholy nebo jinými, s vodou mísitelnými organickými rozpouštědly. Jako organické rozpouštědlo se používá výhodně acetonitril.

Pod pojmem pufrované nebo okyselené vodné roztoky se rozumí například voda, fosforečnanový pufr, pufr s octanem amonným, citrátový pufr, borátový pufr o koncentraci 0 až 0,5 M, jakož

-10CZ 285322 B6 i kyselina mravenčí, kyselina octová, kyselina trifluorooctová nebo všechny běžné, odborníku známé kyseliny výhodně o koncentraci 0 až 1 %. Obzvláště výhodná je koncentrace 0,1 %.

Chromatografíe se provádí v gradientu, který začíná 100 % vody a končí 100 % rozpouštědla, výhodně se pracuje v lineárním gradientu od 40 do 60 % acetonitrilu.

Pořadí obou shora jmenovaných chromatografií (chromatografíe rozdělující lipopeptidy podle typu koncové aminokyseliny Asp nebo Asn, nebo podle typu mastné kyseliny) je zaměnitelné. Výhodné je rozdělovat lipopeptidy podle rozdílných aminokyselin v prvním stupni a teprve poté podle typu mastné kyseliny.

Obsahuje-li shora zmíněný surový produkt lipopeptidy s jednotnou mastnou kyselinou, používá se shora popsané chromatografíe (dělení lipopeptidů na základě rozdílných mastných kyselin) pro odsolení a k dalšímu přečištění těchto lipopeptidů.

Alternativně může být také použito gelové chromatografíe nebo chromatografíe na hydrofóbních fázích.

Gelová chromatografíe se provádí na polyakrylamidovém gelu nebo na gelu tvořeném směsí polymerů, jako jsou například Biogel-P 2^R (firma Biorad) nebo Fractogel TSK HW 40^R (firma Měrek, SRn nebo Toso Haas, USA).

Lipopeptidy podle vynálezu jsou stálé v pevném stavu a v roztocích v oblasti pH mezi 4 a 8, zejména mezi pH 5 a 7, a dají se tudíž zapracovávat do běžných galenických přípravků.

Jedna nebo více sloučenin lipopeptidů podle vynálezu se hodí, na základě svých cenných farmakologických vlastností, pro použití jako léčiva.

Substance podle vynálezu mají farmakologickou účinnost, zvláště jako antibiotika proti grampozitivním bakteriím a jsou zvláště výhodné proti kmenům rezistentním ke glykopeptidům.

U kmenů rezistentních vůči penicilinu, popřípadě methicilinu (kmenů MRSA), které si vytvořily další rezistence proti antibiotikům mají často postačující terapeutické účinky pouze glykopeptidy jako Vancomycin nebo Teicoplanin. V rostoucí míře se však vyskytují kmeny, které jsou rezistentní také proti těmto antibiotikům (FEMS Microbiol. Lett. 98 (1992), str. 109 až 116). Jedna nebo více sloučenin lipopeptidů podle vynálezu má vynikající účinek také proti těmto problémovým choroboplodným zárodkům.

Vynález se také týká léčiv (farmaceutických přípravků), obsahujících jeden nebo více lipopeptidů (v tomto textu často označovaných jako „sloučenin lipopeptidů“) podle vynálezu.

Lipopeptidy podle vynálezu se mohou v zásadě aplikovat jako takové. Výhodné je však použití ve směsi s vhodnými pomocnými látkami nebo nosným materiálem. Jako nosný materiál pro veterinární léčiva lze použít běžných krmných směsí, u humánních léčiv všechny farmakologicky přijatelné nosné materiály a/nebo pomocné látky.

Léčiva podle vynálezu se obecně podávají orálně nebo parenterálně, ale principiálně je možné také jejich rektální podávání. Vhodnými pevnými nebo tekutými formami galenických přípravků jsou například granuláty, prášky, tablety, dražé, (mikro-)kapsle, čípky, sirupy, emulze, suspenze, aerosoly, kapky nebo roztoky pro injekční podávání ve formě ampulí, jakož i preparáty s protrahovaným (zpomaleným) uvolňováním účinné látky, při jejichž se používají běžné nosiče a přísady a/nebo pomocné látky jako látky umožňující rozpad, pojidla, potahovadla, bobtnadla, lubrikátory nebo mazadla, dochucovadla, sladidla nebo látky usnadňující rozpouštění. Jako často používané nosiče nebo pomocné látky lze jmenovat například uhličitan hořečnatý, oxid titaničitý, laktózu, mannitol a další cukry, mastek, mléčnou bílkovinu, želatinu, škrob, vitaminy, celulózu a její deriváty, živočišné nebo rostlinné oleje, polyethylenglykoly a rozpouštědla jako například sterilní vodu, alkoholy, glycerin a vícemocné alkoholy.

Popřípadě se mohou dávkovači jednotky určené pro orální podání zapracovávat do mikrokapslí, tak aby se zpomalilo vstřebávání léku, nebo aby se prodloužilo na delší časové období, jako například potažením nebo zapouzdřením účinné látky ve formě jemných částic do vhodných polymerů, vosků a podobně a následné použití ve formě čípku.

Farmaceutické přípravky se připravují a aplikují výhodně ve formě dávkovačích jednotek, přičemž každá dávkovači jednotka obsahuje jako účinnou složku určitou dávku jedné nebo několika sloučenin lipopeptidů podle vynálezu. U pevných dávkovačích jednotek jako například tablet, kapslí a čípků může dávka účinné látky činit až přibližně 200 mg, výhodně však přibližně 0,1 až 100 mg, a u roztoku pro injekční podávání v ampulích až asi 200 mg, výhodně však asi 0,5 až 100 mg na den.

Podávaná denní dávka je závislá na tělesné hmotnosti, stáří, pohlaví a stavu savce. Podle okolností je však možno aplikovat vyšší nebo nižší denní dávky. Aplikace denní dávky může být jednorázová ve formě jediné dávkovači jednotky nebo také v několika menších dávkovačích jednotkách, nebo také několikanásobná, tj. rozdělením dávek v určitých časových intervalech.

Léčiva podle vynálezu se připravují tak, že se jedna nebo více sloučenin lipopeptidů podle vynálezu smísí spolu s běžnými nosiči popřípadě přísadami a/nebo pomocnými látkami a směs se popřípadě přivede na vhodnou aplikační formu.

Vynález je dále blíže objasněn v následujících příkladech. Údaje v procentech se vztahují na hmotnost. Směsné poměry u kapalin se vztahují k objemu, pokud nejsou udány žádné jiné údaje.

Příklady provedení vynálezu

Příklad la

Příprava glycerinové kultury bakterií druhu Actinoplanes DSM 7358

100 ml živného roztoku (4 g/1 kvasničného extraktu, 15 g/1 rozpustného škrobu, 1 g/1 K₂HPO₄, 0,5 g/1 MgSO₄.7H₂O doplněno vodou na 1000 ml, upraveno před sterilizací na pH = 7,0) se převede do sterilní Erlenmayerovy baňky o objemu 300 ml a naočkuje bakteriemi kmene Actinoplanes sp. DSM 7358 a inkubuje se 7 dní při 30 °C při 150 otáčkách za minutu na rotační třepačce. 1,5 ml této kultury se poté naředí 2,5 ml 80% glycerinu a uskladní se při -20 °C.

Příklad lb

Příprava kultury, respektive inokula bakterií Actinoplanes sp. DSM 7358 v Erlenmayerově baňce

Sterilní Erlenmayerova baňka o objemu 300 ml se naplní 100 ml následujícího živného roztoku: 30 g/1 sacharózy, 2 g/1 KNO₃, 1 g/1 K₂HPO₄, 0,5 g/1 MgSO₄.H₂O, 0,5 g/1 KC1, 0,01 g/1 FeSO₄.7H₂O, 2 g/1 kvasničného extraktu, 5 g/1 peptonu. Tento živný roztok se naočkuje buď kulturou narostou v šikmých zkumavkách s agarem (stejný živný roztok, ale s 2 % agaru), nebo 1 ml glycerinové kultuiy (viz příklad la). Po inokulaci se baňka inkubuje na třepačce při 180 otáčkách za minutu a teplotě 30 °C. Maximální produkce jedné nebo více sloučenin lipopeptidů podle vynálezu je dosaženo po cca 120 hodinách. K naočkování 10 a 2001

-12CZ 285322 B6 fermentorů postačuje 48 až 96 hodin stará kultura (množství inokula cca 10 %) ze stejného živného roztoku.

Příklad 2

Srovnávací charakterizace bakterií Actinoplanes sp. DSM 7358

Pro charakterizaci bakterií kmene Actinoplanes sp. DSM 7358 bylo provedeno srovnání s blízce příbuznými kmeny pomocí ISP-metody podle Shirlinga a Gottlieba (Int. J. of Sys. Bacteriol.

16,3 (1966) str. 313 až 340). Výsledky (viz tab. 1) ukazují, že kmen Actinoplanes sp. DSM 7358 se od ostatních kmenů odlišuje morfologicky i fyziologicky.

Tabulka 1

	Actinoplanes sp. DSM 7358	A. utahensis NRRL 12052	A. brasiliensis ATCC 25844	A. nipponensi ATCC 311455
Vzdušná mycelia	-	-	+ (ISP 3)	-
Sporangia Médium	+	+	+	+
ISP 2	oranžový	oranžový	žlutooranžový	oranžový
ISP 3	oranžový	oranžový	žlutooranžový	oranžový
ISP 4	oranžový	oranžový	žlutooranžový	oranžový
ISP 5	oranžový	oranžový	žlutooranžový	oranžový
ISP 6	oranžový červený Exopigment	oranžový hnědočervený Exopigment	žlutooranžový červený Exopigment	oranžový červený Exopigment
Melanin	-	-	(+)	(+)
Glukóza	+	+	+	+
Arabinóza	+	+	+	+
Sacharóza	+	+	+	+
Xylóza	+	+	(+)	-
Inositol	+	+	(+)	(+)
Manitol	+	+	+	-
Fruktóza	+	+	+	-
Ramnóza	+	+	+	+
Rafmóza	+	+	(+)	-
Celulóza	+	+	(+)	-
Melibióza	-	-	-	-
Amygdalin	-	+	+	+
Želatina (hydrolýza)	+	+	+	+
Citrát (hydrolýza)	-		+	-
Močovina (hydrolýza)	+		-	-
Arginin-hydroláza	+		-	-
β-galaktosidasa	-		-	-
Tryptofanasa	-		-	-
Lysin-dekarboxyláza	+		-	-
Acetoin(tvorba)	+	+	+	+
Indol (tvorba)	-		-	-
H₂S (tvorba)	-		-	-
NaCl tolerance	0-2,5 %	0-2,5 %	0-2,5 %	0-2,5 %

-13CZ 285322 B6

Příklad 3a

Výroba lipopeptidu A 1437 B a D

Fermentace probíhá ve fermentoru o objemu 500 1 za následujících podmínek:

Živné médium:	11 g/1 sacharózy, 6 g/1 mastného extraktu, 0,3 g/1 kvasničního extraktu, 0,6 g/lMgSO₄, 0,1 g/lKH₂PO₄, 0,6 g/1 L-valinu, 10 μΜ FeCl₃.6H₂O, pH = 7,3 (před sterilizací)
Inkubační doba:	120 hodin
Inkubační teplota:	30 °C
Rychlost míchání:	50 otáček za minutu
Provzdušňování:	150 l.min'¹

Tvorba pěny může být potlačena opakovaným přidáváním ethanolického roztoku polyolů. Produkčního maxima je dosaženo po cca 96 až 120 hodinách.

Po skončení fermentace bakterií kmene Actinoplanes sp. DSM 7358 se suspenze kultury filtruje za přidání cca 2 % pomocného filtračního prostředku (např. Celite^R). Pak se filtrát ochladí na 4 °C a hodnota pH se upraví na 1,5. Po 4 hodinách se provede odstředění při 10 000 g a sraženina se resuspenduje v destilované vodě. Neutralizací suspenze přejde jmenovaná látka do roztoku. Roztok se vymrazí a lyofilizuje.Výtěžek surového produktu činí cca 1,5 g/1 (tzn. 750 g).

Příklad 3b

Rozdělení surového produktu (obsahujícího B+D) pomocí inotové chromatografie

Chromatografická kolona o obsahu 3,2 1 (10 cm vnitřní průměr x 40 cm výška) se naplní DEAESepharosou pro rychlý průtok (Fast Flow) a zarovná 10 mM draselno-fosforečnanovým pufrem, pH 7,0 ve 40% methanolu (pufr A). Pak se 25 g surového produktu A 1437 B (získáno podle příkladu 3a) rozpustí v 3,5 1 vody, přenese se na kolonu a nechá se promývat nejprve 1 1 vody a pak 6 1 pufru A. Znečištění surového produktu se nachází v protékající vodě. Následně aplikujeme gradient draselno-fosforečnanového pufru o koncentraci od 10 do 100 mM (pH 7,0 v 40% methanolu). 25 až 35 mM draselno-fosforečnanovým pufrem se eluuje peptid A 1437 D a 40 a 55 mM draselno-fosforečnanovým pufrem se získá antibiotikum A 1437 B. Odpovídající frakce se ve vakuu zbaví methanolu. K odsolení se použije kolony ^RDianion HP-20 (Mitsubishi, Japonsko) o obsahu 1 1. Nyní se 9 1 frakcí obsahujících čistý B-peptid nanese na kolonu a poté se promyje 3 1 odsolené vody. K eluci se používá gradient voda-isopropanol (0 až 50 % alkoholového podílu). 15 až 25% isopropanolem se z nosiče vymývá čistý peptid A 1437 B. Tyto frakce se sbírají odděleně, ve vakuu zbaví alkoholu a poté vymražují. Výtěžek činí 4,8 g peptidů A 1437 B o 97% čistotě. Odpovídající odsolení frakcí obsahujících A 1437 D dává 3,1 g antibiotika. Čistota 98 %.

-14CZ 285322 B6

Příklad 4a

Výroba lipopeptidů A 1437 A a C

Výroba probíhala tak jak bylo popsáno v příkladu 3a, pouze L-valin byl v produkčním médiu nahrazen 4 g/1 L-leucinu a fermentace probíhala v bioreaktoru o obsahu 501. Výtěžek činil

1,3 g/1 (tzn. 65 g).

Příklad 4b

Izolace lipepeptidu A 1437 A a C g surového produktu se rozpustí ve 100 ml destilované vody a zpracuje podle níže uvedeného schématu.

Schéma zpracování:

g surového peptidu ve 100 ml destilované vody.

Φ

Absorbce na Q-Sepharose pro rychlý průtok (výrobek firmy Pharmacia, kolona 5 x 20 cm)

I

Eluce následujícím gradientem: pufr A: NaH₂PO₄ 1 mM v 50% methanolu, pH 5,9 pufr B: NaH₂PO₄100 mM v 50% methanolu, pH 5,3 min.: pufr A: -> po dobu 60 min na 25 % pufru B, dalších 30 minut při 25 % při 25 % pufru B

Φ

Lyofilizace frakcí obsahujících A 1437 A respektive C a jejich rozpouštění v elučním činidle

Φ

Odsolení na Biogelu P2 (mesh 100-200, firma Biorad) (kolona 7 x 20 cm) i ;

1,6 g lipopeptidů A 1437A (80%) 1,2 g lipopeptidů A 1437C (80%) i I

RP-chromatografie na Nucleosilu^R Cu (7 gm) (kolona 20 x 250 mm, dávka 200 mg)

Eluce následujícím gradientem pufr A: redestilovaná voda, 0,1 % TFA pufr B: acetonitril min.: pufr B ->po dobu 60 minut na 90 % pufru B při průtoku 10 ml/min

Φ Φ

Lyofilizace frakcí obsahujících A 1437 A respektive C

Φ ;

150 mg A 1437A (čistota>95 %) 154 mg A1437C (čistota>95 %)

-15CZ 285322 B6

Příklad 5a

Výroba lipopeptídů A 1437 E, F, G, a H

Výroba probíhala tak jak bylo popsáno v příkladu 3a pouze L-valin je v produkčním médiu nahrazen 1,5 g/1 L-isoleucinu a fermentace probíhá vbioreaktoru o obsahu 50 1. Výtěžek činí

1,4 g/1 surového peptidů (70 g).

Příklad 5 b

Rozdělení surového peptidů pomocí iontové chromatografíe

Na chromatografícké koloně (popsána v příkladu 3a) se rozdělí 25 g surového lipopeptídů, získaného podle příkladu 5a (přiměřeně příkladu 3a).

až 19 mM pufrem se eluuje peptid A 1437 F (výtěžek 1,8 g) až 25 mM pufrem se eluuje peptid A 1437 E (výtěžek 1,3 g) až 50 mM pufrem se eluuje peptid A 1437 H (výtěžek 2,7 g) až 82 mM pufrem se eluuje peptid A 1437 G (výtěžek 1,9 g)

Odpovídající frakce byly shromážděny a ve vakuu zbaveny methanolu.

Příklad 5 c

Přečištění složek z příkladu 5b chromatografií na reverzní fázi RP-18

Preparativní HPLC kolona o obsahu 500 ml (5,1 cm vnitřní průměr x 25 cm výška) se naplní materiálem ^RLiChrosorbG RP-18, 10 pm a pak se na ní nanese roztok, znečištěný doprovodnými solemi a obsahující 1,9 g antibiotika A 1437 G. Eluuje se gradientem, který začíná 5% acetonitrilem v 10 mM draselnofosforečnanovém pufru, pH 7,0 a končí 36% acetonitrilem v 10 mM draselno-fosforečnanovém pufru, pH 7,0. Ve frakci s 24 až 26 % acetonitrilu se nachází lipopeptid A 1437 G. Frakce se poté koncentruje ve vakuu, odsoluje na 100 ml absorpční pryskyřice ^Rdionion HP-20 ve směsi voda/50 % izopropanolu a po vymražení se získá 1,1 g lipopeptídů A 1437 o čistotě 99 %.

Pro odpovídající přečištění roztoku obsahujícího A 1437 H získaného podle příkladu 5b se používá gradientu rozpouštědla s 10 až 50 % acetonitrilu v 10 mM draselnofosforečnanovém pufru, pH 7,0. Eluce antibiotika probíhá ve frakci obsahující 37 až 39 % acetonitrilu. Zakoncentrování odpovídajících frakcí a odsolení na ^Rdianionu HP-20 a následné vymražení dají výtěžek 2,2 g lipopeptídů A 1437 H o čistotě více než 98 %.

Příklad 5d

Přečištění lipopeptidových antibiotik A 1437 E a F z příkladu 5b na gelu MCI^R

Roztok lipopeptídů A 1437 F, který se získá podle příkladu 5b obsahující soli a 1,8 g antibiotika se nanese na 11 MCI^R-gelu CHP 20P (Mitsubishi Kasei Corp.). Objem kolony je 6x35 cm. Poté se na nosič nanese materiál, který chceme rozdělit. Tento se pak nejdříve propláchne pufrem A (5mM draselno-fosforečnanovým pufrem, pH 7,0 s 20% acetonitrilem), a poté se eluuje vzrůstajícím gradientem pufru B (5 mM draselno-fosforečnanový pufr, pH 7,0, se 70 %

-16CZ 285322 B6 acetonitrilu). Ve frakci se 34 až 35 % acetonitrilu dochází k eluci čistého antibiotika. Zkoncentrování ve vakuu a odsolení na dianionu HP-20 poskytuje výtěžek 1,4 g lipopeptidů A 1437 F o čistotě vyšší než 98 %. Analogický postup se surovým lipopeptidem A 1437 E podle příkladu 5a poskytuje výtěžek 1 g peptidu A 1437 E o čistotě vyšší než 98 %.

Příklad 6a

Výroba lipopeptidů A 1437 K

Výroba probíhala tak jak je popsáno v příkladu 4a, pouze L-valin v produkčním médiu byl nahrazen 500 mg/1 kyseliny L-a-aminomáselné (nebo 1 g/1 racemátu) a fermentace probíhala v bioreaktoru o obsahu 101. Výtěžek činil 1,1 g/1 surového peptidu (cca 10 g).

Příklad 6b

Izolace lipopeptidů A 1437 K g surového produktu se rozpustí ve 100 ml destilované vody a dále zpracuje podle níže uvedeného schématu.

Schéma zpracování (A 1437 K) g surového peptidu ve 100 ml destilované vody

Adsorbce na Q-Sepharose s rychlým průtokem (rozměry kolony 3,5 x 17 cm) i

Eluce následujícím gradientem

Pufr A: NaH₂PO₄ 1 mM v 50% methanolu, pH 5,9

Pufr B: NaH₂PO₄ 100 mM v 50% methanolu, pH 5,3 minut: Pufr A -> po dobu 45 minut na 25 % pufru B, dalších 45 minut při 25 % pufru B Φ

Lyofilizace frakcí obsahujících A 1437 K

Odsolení na Biogelu-P2 (mesh 100-200) (rozměry kolony 7 x 20 cm)

700 mg A 1437 K (60% čistota) i

RP-chromatografie na materiálu Nucleosil Ci₈ 7 pm (rozměry kolony 20 x 250 mm) Naneseme 50 mg předčištěného produktu

Eluce následujícím gradientem

Pufr A: redestilovaná voda, 0,1 % TFA

Pufr B: acetonitril min.: pufr A/5 % pufru B -> v 60 minutách na 70 % pufru B při průtoku 10 ml/min

Φ

Lyofilizace frakcí, které obsahují A 1437 K

5,6 mg A 1437 K (> 95%)

-17CZ 285322 B6

Příklad 7a

Výroba lipopeptidu A 1437 L a M

Výroba probíhala tak, jak je popsáno v příkladu 4a pouze L-valin byl v produkčním médiu nahrazen 500 mg/1 L-norvalinu (nebo 1 g/1 racemátu) a fermentace probíhala v bioreaktoru o obsahu 10 1. Výtěžek surového peptidů činil 1,2 g/1 (tzn. cca 12 g).

Příklad 7b

Izolace lipopeptidů A 1437 L a M g surového produktu se rozpustí ve 100 ml destilované vody a dále zpracuje podle níže uvedeného schématu.

Schéma zpracování (A 1437 L a M) g surového peptidů ve 100 ml destilované vody

Φ

Adsorbce na Q-Sepharose s rychlým průtokem (rozměry kolony 3,5 x 17 cm)

Eluce následujícím gradientem

Pufr A: NaH₂PO₄ 1 mM v 50% methanolu, pH 5,9

Pufr B: NaH₂PO₄ 100 mM v 50% methanolu, pH 5,3 minut: Pufr A -> po dobu 45 minut na 25 % pufru B, dalších 45 minut při 25 % pufru B i

Lyofílizace frakcí obsahujících A 1437 L a M

Odsolení na Biogelu-P2 (mesh 100-200) (rozměry kolony 7 x 20 cm)

900 mg lipopeptidů A 1437 L a M (60% čistota)

I

RP-chromatografie na materiálu Nucleosil Cis 7 pm (rozměry kolony 20 x 250 mm)

Naneseme 50 mg předčištěného produktu

Eluce následujícím gradientem

Pufr A: redestilovaná voda, 0,1 % TFA

Pufr B: acetonitril min.: pufr A/5 % pufru B -> po dobu 60 minut na 70 % pufru B při průtoku 10 ml/min i

Lyofílizace frakcí, které obsahují lipopeptidy A 1437 L a M 5,8 mg A 1437 L (> 95%) 6,7 mg A 1437 M (> 95%)

Příklad 8

HPLC systém sloužící k důkazu lipopeptidů A 1437

Níže popsaný systém umožňuje rozdělení a kvantifikaci lipopeptidů, které se nacházejí v surové směsi, respektive ve filtrátu kultivačního média. Retenční časy leží mezi 11,5 minutami (A 1437 E) a cca 15,9 minutami (A 1437 H).

-18CZ 285322 B6

Rozpouštědlo: A: draselno-fosforečnanový pufr pH 7,0,10 mM B: acetonitril

gradient.: t [min]	průtok [ml/min]	A [%]	B [%]
0	1,5	80	20
15	1,5	50	50
15,5	2	00	100
16,5	2	00	100
17	1,5	80	20
22	1,5	80	20

Kolona: Shandon ODS Hypersil RP - 18 (120 x 4,6 mm s předkolonou 20 x 4,6 mm) nebo Nucleosil 120 RP 18 (120 x 4,6 mm s předkolonou 20 x 4,6 mm)

Průtok: 1,5 ml/min

Detekce: 210 nm

Injekce: 10 μΐ

Příklad 7'

Srovnání mezi bakteriemi Actinoplanes nipponensis ATCC 31145 a Actinoplanes sp. DSM 7358

Od obou kmenů se nejdříve připraví inokulum tak, jak je to popsáno v příkladu lb a toto se potom použije k naočkování následujících produkčních médií.

Médium 1: stejné jako bylo popsáno v příkladu 3a

Médium 2: stej né j ako médium 1, ale bez L-valinu

Médium 3: glukóza 30 g/1; sojová moučka 20 g/1; Fe₂(SO₄)₃ 0,3 g/1; MnCl₂.4H₂O 0,3 g/1 a CoCl₂.6H₂O; pH 7,3

Vždy 100 ml média se umístí do jedné Erlenmeyerovy baňky o obsahu 300 ml.

Inkubace probíhá při 30 °C na třepačce. Po 48, 96 a 144 hodinách se určí koncentrace lipopeptidů A 1437 ve filtrátu kultivačního média pomocí HPLC (viz příklad 6). V médiu 2 a 3 nebyl u kmene Actinoplanes nipponensis ATCC 31145 zjištěn žádný lipopeptid. V médiu 1 se podařilo nalézt malé množství nějakých peptidů až po 144 hodinách. Kdybychom pokládali specifickou extinkci těchto sloučenin ve srovnání s peptidy A 1437 za stejnou, pak by bylo vyprodukované množství peptidů nejméně stokrát menší (< 1 mg/1), než koncentrace peptidu A 1437 B, který byl vyprodukován kmenem Actinoplanes sp. DSM 7358 v médiu 1 v témže časovém úseku.

Příklad 8'

Účinky lipopeptidů A 1437

Citlivost určitého kmene proti lipopeptidům A 1437 byla zjišťována pomocí zřeďovacích testů na agaru. Byl použit Muller-Hintonův agar, který byl v příkladě S. pyogenes obohacen 10% koňské krve. Plotny obsahující antibiotikum byly naočkovány za pomoci multikanálového očkovacího přístroje (5 x 10⁴ CFU/očkovací dávka stacionární kultury určeného kmene). Hodnoty MHK-(Minimale hemmkonzentration - minimální inhibiční koncentrace) byla odečteny při 37 °C. Jako hodnota MHK je definována koncentrace antibiotika, při které nelze po 24 hodinové inkubaci detekovat žádný viditelný růst choroboplodných zárodků.

-19CZ 285322 B6

Výsledky jsou uspořádány v tabulce 2. Amphomycin, který byl použit jako kontrola byl získán od firmy Boehringe Mannheim (SRN). Tato firma nabízí Amphomycin ve velmi čistém stavu (Feinchemikalie).

Tabulka 2

Látky A 1437: aktivita in vitro (AB-spektrum); koncentrace jsou udány v pg/ml

A 1437 A A 1437 B A 1437 C A 1437 D A 1437 E A 1437 F A 1437G A 1437 H	0,391 0,098 0,195 0,049 0,098 0,098 0,098 0,049	0,781 0,195 0,781 0,195 0,195 0,391 0,195 0,098	0,391 0,098 0,391 0,049 0,094 0,195 0,049 0,049	1,56 0,195 3,13 0,781 0,098 1,56 0,088 0,195	0.391 0,049 0,781 0,391 0,025 0,781 0,025 0,049	3,13 0,391 3,13 0,781 0,195 1,56 0,195 0,195
Amphomycin	0,195	0,781	0,391	1,56	0,391	1,56

Látky A 1437: aktivita in vitro (Vancomycin-rezistenní kmeny); koncentrace udány v pg/ml

	Enterococcus faecium VR1	Enterococcus faecium VR2	Streptococcus pyogenes
A 1437 A		neurčeno
A 1437B	1	1	0,5
A 1437C	4	4	4
A 1437 D	2	2	1
A 1437 E	4	4	1
A 1437F	4	4	1
A 1437G	0,25	0,25	0,125
A 1437H	1	1	0,5
Amphomycin	4	4	2

Sloučeniny K, L, M mají aktivitu in vitro srovnatelnou se sloučeninami A až H

Příklad 9a

Charakterizace lipopeptidů A 1437 D

Lipoeptid A 1437 D je izolován jako amorfní tuhá látka.

Optická otáčivost: +35° (c = 0,1; methanol) HPLC: retenční čas 15,1 minut

Aminokyseliny: 2 x kyselina asparagová x asparagin x β-methylaspartát x glycin

2x2, 3-diaminomáselná kyselina

1 x prolin x kyselina pipekolinová x valin

-20CZ 285322 B6

FAB-MS: m/e = 1303, 6952 [(M+H)⁺]

Molámí hmotnost: 1302, 6884 (C^F^NhO^)

CID-MS: m/z = 356, 491, 517, 520, 741, 761, 938, 982

IR(KBr):v= 3420 (š) cm’¹, 2930, 1660,1530, 1450,1400.

Příklad 9b

Charakterizace lipopeptidů A 1437 B

Lipopeptid A 1437 B je izolován jako amorfní tuhá látka. Optická otáčivost: +27° (c = 0,1; methanol)

HPLC: retenční čas 12,8 minut

Aminokyseliny:

3 x kyselina asparagová 1 x β-methylaspartát 2 x glycin 2x2, 3-diaminomáselná kyselina 1 x prolin 1 x kyselina pipekolinová 1 x valin

FAB-MS: m/e = [(M+H)⁺J

Molámí hmotnost: 1303 (C59H93N13O20)

CID-MS: m/z = 356, 407, 518, 741, 762, 938, 982 IR(KBr): δ = 3420 (š) cm'¹ 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

Příklad 9c

Charakterizace lipopeptidů A 1437 C

Lipopeptid A 1437 C je izolován jako amorfní tuhá látka.

Optická otáčivost: +30° (c= 0,1; methanol)

HPLC: retenční čas 14,1 minut

Aminokyseliny:

2 x kyselina arparagová 1 x asparagin 1 x β-methylaspartát 2 x glycin 2x2, 3-diaminomáselná kyselina 1 x prolin 1 x kyselina pipekolinová 1 x valin

Molámí hmotnost: 1288 (C58H92N14O19)

CID-MS: m/z 356, 392, 503, 503, 741, 747, 938, 981

IR(KBr): v = 3420 (š) cm’¹, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400.

-21CZ 285322 B6

Příklad 9d

Charakterizace lipopeptidů A 1437 A

Lipopeptid A 1437 A je izolován jako amorfní tuhá látka. Optická otáčivost: +30° (c = 0,1; methanol)

HPLC: retenční čas, 11,8 minut

Aminokyseliny: 3 x kyselina asparagová x β-methylaspartát x glycin

2x2, 3-diaminomáselná kyselina x prolin x kyselina pipekolinová x valin

Molámí hmotnost: 1289 (C58H91N13O20

CID- MS: m/z = 356, 478, 504, 507, 741, 748, 938, 981 IR(KBr): v = 3420 (š) cm’¹, 2925, 1650, 1535,1450,1400.

Příklad 9e

Charakterizace lipopeptidů A 1437 F

Lipopeptid A 1437 F je izolován jako amorfní tuhá látka. Optická otáčivost: +31° (c = 0,1; methanol)

HPLC: retenční čas, 13,8 minut

2x2, 3-diaminomáselná kyselina x prolin x kyselina pipekolinová x valin

Molámí hmotnost: 1288 (C58H92N14O19)

CID-MS: m/z = 356, 392, 503, 506, 741, 747, 938, 981 IR(KBr): v = 3420 (š) cm¹, 2930, 1660, 153é, 1450, 1400.

Příklad 9f

Charakterizace lipopeptidů A 1437 E

Lipopeptid A 1437 E je izolován jako amorfní tuhá látka. HPLC: retenční čas 11,5 minut

Aminokyseliny: 3 x kyselina asparagová x β-methylaspartát x glycin

-22CZ 285322 B6

2x2, 3-diaminomáselná kyselina x prolin x kyselina pipekolinová x valin

Molámí hmotnost: 1289 (CseH^NnCbo)

CID-MS: m/z= 356, 393, 504, 507, 741, 748, 938, 981 IR(KBr): v = 3420 (š) cm’¹, 2925. 1650,1535, 1450, 1400.

Příklad 9g

Charakterizace lipopeptidu A 1437 H

Lipopeptid A 1437 H je izolován jako amorfní tuhá látka.

Optická otáčivost: +32° (c = 0,1; methanol)

HPLC: retenční čas 15,9 minut

2x2, 3-diaminomáselná kyselina x prolin x kyselina pipekolinová x valin

Molámí hmotnost: 1316 (CóoH^NuOig)

CID-MS: m/z = 356, 420, 531, 534, 741, 775, 938, 981 IR(KBr): v= 3420 (š) cm’¹, 2930,1660, 1530, 1450, 1400.

Příklad 9h

Charakterizace lipopeptidu A 1437 G

Lipopeptid A 1437 G je izolován jako amorfní tuhá látka.

Optická otáčivost: +34° (c= 0,1; methanol)

HPLC: retenční čas 13,6 minut

Aminokyseliny: 3 x kyselina asparagová x β-methylaspartát x glycin

2x2, 3-diaminomáselná kyselina x prolin x kyselina pipekolinová x valin

Molámí hmotnost: 1317 (C60H95N13O20)

CID-MS: m/z = 356, 421, 532, 535, 741, 776, 938, 981 IR(KBr): v= 3420 (š) cm'¹, 2925, 1650, 1535,1450, 1400.

-23CZ 285322 B6

Příklad 9i

Charakterizace lipopeptidu A 1437 K

Lipopeptid A 1437 K je izolován jako amorfní tuhá látka. HPLC: retenční čas 12,5 minut

Aminokyseliny: 3 x kyselina asparagová x β-methylaspartát x glycin

2x2, 3-diaminomáselná kyselina x prolin x kyselina pipekolinová x valin

FAB-MS: m/e = [(M+H)⁺J

Molámí hmotnost: 1299 (C58H91N13O20)

CID-MS: m/z = 393, 504, 507, 741, 748, 938, 981

IR(KBr): v = 3420 (š) cm¹, 2925,165é, 1535,1450, 1400.

Příklad 9j

Charakterizace lipopeptidu A 1437 L

Lipopeptid A 1437 L je izolován jako amorfní tuhá látka. HPLC: retenční čas 13,0 minut

Aminokyseliny: 3 x kyselina asparagová x β-methylaspartát x glycin

2x2, 3-diaminomáselná kyselina x prolin x kyselina pipekolinová x valin

FAB - MS: m/e = [(M+H)⁺]

Molámí hmotnost: 1289 (C59H93NHO20)

CID-MS: m/z = 407, 518, 741, 761, 938, 981

IR(KBr): v = 3420 (š) cm'¹, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

Příklad 9k

Charakterizace lipopeptidu A 1437 M

Lipopeptid A 1437 M je izolován jako amorfní tuhá látka. HPLC: retenční čas 9,8 minut

Aminokyseliny: 3 x kyselina asparagová x β-methylaspartát x glycin

2x2, 3-diaminomáselná kyselina

-24CZ 285322 B6 x prolin x kyselina pipekolinová x valin

FAB-MS: m/e = [(M+H)⁺J

Molámí hmotnost: 1275 (C57H89N13O20)

CID-MS: m/z = 379, 490, 724, 741, 938, 981

IR(KBr): v = 3420 (š) cm’¹,2925, 1650,1535, 1450, 1400.

Příklad 10

Chemický posun C₁₃

Tabulka ukazuje chemický posun signálu CH sloučeniny A 1437 B způsobený uhlíkem C13

	Dab	Gly	MeAsp	Gly	Asp	Asp	Asp	Dab	Val	Pro	Pip
NH/Ca	8,30	8,43	8,19	8,12	8,09	7,96	8,15	7,87	7,30	4,13	4,62
a	56,00	44,60	41,20	44,70	52,00	53,10	53,00	55,60	59,20	62,40	56,80
β	50,10		14,40		36,10	35,60	36,30	47,80	31,30	30,80	27,20
Z	16,00							20,10	18,9	26,00	20,60
									19,7
δ										49,40	24,90
ε											45,00

Aby bylo umožněno srovnání s daty signálu *H jsou v tabulce uvedeny také hodnoty chemického posunu signálu NH, respektive pro Pip a pro Pro posuvu CaH odpovídajícího spinsystému.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Lipopeptidy obecného vzorce I

E^-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro (I) ve kterém

R* představuje zbytek jednou nebo vícenásobně nenasycené, nasycené nebo, nezávisle na tom, rozvětvené nebo nerozvětvené mastné kyseliny nebo hydroxy-mastné kyseliny s délkou řetězce od 6 do 22 atomů uhlíku včetně.
2. Lipopeptid obecného vzorce I podle nároku 1, ve kterém R¹ znamená zbytek kyseliny definovaný v nároku 1 s délkou řetězce od 10 do 20 atomů uhlíku včetně.
3. Lipopeptid obecného vzorce I podle nároku 1, ve kterém R¹ znamená zbytek kyseliny definovaný v nároku 1 s délkou řetězce 12, 13, 14 nebo 15 atomů uhlíku.

-25CZ 285322 B6
4. Lipopeptid obecného vzorce I podle nároku 1, ve kterém R¹ představuje

a) zbytek iC]₃-mastné kyseliny,

b) zbytek iC₍₄-mastné kyseliny,

c) zbytek aiC₁₃-mastné kyseliny, nebo

d) zbytek aiCis-mastné kyseliny.
5. Lipopeptid obecného vzorce I podle nároku 4, ve kterém R¹ představuje skupinu
6. Lipopeptid obecného vzorce I podle nároku 4, ve kterém R¹ představuje skupinu
7. Lipopeptid obecného vzorce I podle nároku 4, ve kterém R¹ představuje skupinu

II O
8. Lipopeptid obecného vzorce I podle nároku 4, ve kterém R¹ představuje skupinu
9. Způsob přípravy lipopeptidů obecného vzorce I podle jednoho nebo více z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že se fermentují bakterie Actinoplanes sp. v kultivačním médiu až se v tomto kultivačním médiu nahromadí alespoň jeden tento lipopeptid, a tento lipopeptid, nebo tyto lipopeptidy, obecného vzorce I, se purifikují z kultivačního média.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že se purifikace provádí tak, že se lipopeptidy vysráží z kultivačního média za použití kyselin při pH 0,5 až pH 4 včetně, načež se popřípadě lipopeptidy získané vysrážením přečistí chromatografii na iontoměničích nebo chromatografií na hydrofobní matrici, přičemž se obě chromatografíe mohou provádět alternativně nebo následně v libovolném pořadí.
11. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že se fermentují bakterie Actinoplanes sp. DSM 7358.
12. Léčivo, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden lipopeptid obecného vzorce I podle jednoho nebo více z nároků 1 až 8 a popřípadě farmaceutické nosiče.

-26CZ 285322 B6
13. Použití lipopeptidů obecného vzorce I podle libovolného z nároků 1 až 8 k přípravě antibiotika pro gram-pozitivním bakteriím.
14. Použití podle nároku 13, kde bakteriemi jsou bakterie rezistentní vůči glykopeptidům.
15. Actinoplanes sp. DSM 7358.