SK281830B6

SK281830B6 - Lipopeptidy, spôsob ich prípravy, liečivo s ich obsahom, ich použitie a kmeň actinoplanes, ktorý ich produkuje

Info

Publication number: SK281830B6
Application number: SK685-94A
Authority: SK
Inventors: Peter Hammann; Johannes Meiwes; Gerhard Seibert; L�Szl� Vertesy; Joachim Wink; Astrid Markus
Original assignee: Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date: 1993-06-08
Filing date: 1994-06-06
Publication date: 2001-08-06
Also published as: EP0864584A1; AU6462094A; UY23762A1; FI942660A; DE59407475D1; JP2660161B2; IL109917A; EP0629636A1; ES2127312T3; DK0864584T3; EP0629636B1; JPH0797394A; DE59409616D1; RU2117672C1; CZ138194A3; EP0864584B1; CZ285322B6; PL180230B1; GR3029591T3; HU217177B

Abstract

Opisujú sa lipopeptidy s homológnymi sekvenciami aminokyselín, ale s rozdielnymi zvyškami mastných kyselín (lipidickou časťou) všeobecného vzorca (I), v ktorom R1 znamená zvyšok jeden alebo viacnásobne nenasýtenej, nasýtenej alebo nezávisle od toho rozvetvenej alebo lineárnej mastnej kyseliny, alebo hydroxy-mastnej kyseliny s dĺžkou reťazca od 6 do 22 atómov uhlíka vrátane, ktoré sú syntetizované v priebehu fermentácie baktériami druhu Actinoplanes sp. a vylučované do kultivačného média, spôsoby prípravy týchto lipopeptidov, liečivá s ich obsahom a použitie týchto lipopeptidov na prípravu antibiotík proti gram-pozitívnym baktériám. Ďalej sú opísané baktérie Actinoplanes sp. DSM 7358, ktoré uvedené lipopeptidy produkujú.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka lipopeptidov s homológnymi sekvenciami aminokyselín, ale s rozdielnymi zvyškami mastných kyselín (lipidickou časťou), ktoré sú syntetizované počas fermentácie baktériami druhu Actinoplanes sp. a vylučované do kultivačného média, spôsobu prípravy týchto lipopeptidov, liečiv obsahujúcich tieto lipopeptidy, ich použitia na prípravu antibiotík proti gram-pozitívnym baktériám, ako aj baktérií Actinoplanes sp. DMS 7358, ktoré tieto lipopeptidy produkujú.

Doterajší stav techniky

Sekundárne metabolity rôznych mikroorganizmov sa úspešne používajú na liečenie infekčných chorôb. Sekundárnymi metabolitmi sa rozumejú nízkomolekuláme zlúčeniny, ktoré sú produktmi biosyntetických pochodov, ktoré odbočujú od primárneho metabolizmu, a ktorých okamžitý význam pre producenta je nejasný. Dodnes je známych asi 8000 sekundárnych metabolitov izolovaných z kultúr rôznych mikroorganizmov (predovšetkým húb a baktérií rodu Streptomyces).

Hlavná oblasť použitia týchto sekundárnych metabolitov je v terapii infekčných chorôb. Ale vďaka rozšírenému používaniu dochádza často k vzniku rezistencie proti týmto látkam, takže existuje stála potreba nových antibiotík a účinných látok s novým mechanizmom účinku (pozri Neu H. C. Science 257,1992, str. 1064 až 1073).

Popritom sa rozšírila oblasť indikácie mikrobiálnych látok tiež na choroby, ktoré nepatria medzi infekčné choroby (napríklad terapia tumorov, imunomodulačné choroby alebo regulácia výmeny tukov) a tiež na ochranu rastlín (ako herbicídy a insekticídy). Používané účinné látky sú však často zaťažené nedostatkami, ktoré spočívajú v nedostatočnej výške účinku, v príliš vysokej toxicite a/alebo v nežiaducich vedľajších účinkoch.

V literatúre sú opísané lipopeptidy, ktorých aminokyselinová časť je vzhľadom na sekvenciu identická, alebo vzhľadom na skladbu aminokyselín rovnaká alebo veľmi podobná s lipopeptidmi podľa vynálezu. Ale tieto lipopeptidy sa od lipopeptidov podľa vynálezu zásadne líšia v lipidickej časti.

Príklady uvedených lipopeptidov sú: Amphomycin antibiot. (J. Antibiotics, 38, str. 517 (1965)); Glumamycin (J. Antibiotics, 38, str. 517 (1965)); Zaomycin (J. Antibiot. Ann., str. 194 (1960)); Aspartocin (Antibiotics. Ann., 194 (1960));

Tsushimycin (J. Antibiotics, 21 str. 439 (1968)); Laspartomycin (J. Antibiotics, 21, str. 55 (1968)).

Tieto lipopeptidy, ktoré sa označujú ako lipopeptidy amphomycinového typu, sú syntetizované mikroorganizmami rodu Streptomyces. Ich antibiotická účinnosť sa uplatňuje proti gram-pozitívnym baktériám, ako napríklad proti streptokokom, stafylokokom a enterokokom. V poslednom čase sa v zvýšenej miere ukázali ako problémové choroboplodné zárodky najmä kmeňa rodu Staphylococcus a Enterococcus. Pod pojmom problémové choroboplodné zárodky rozumie odborník také mikroorganizmy, ktorých efektívna eliminácia nie je možná vzhľadom na vzrastajúcu rezistenciu na súčasné antibiotiká (napríklad β-laktámové antibiotiká alebo glykopeptidové antibiotiká, ako sú napríklad Vancomycin alebo Teikoplanin).

Jednu skupinu kmeňov mikroorganizmov, pri ktorých sa vytvorila rezistencia, tvoria napr. kmene druhu Staphylococcus aureus rezistentné proti Methicillinu, skrátene na zývané „MRSA-kmene“ (Methicillin-resistent Staphylococcus aureus). Medzitým sa zistilo, že tieto MRSA-kmene si vytvorili rezistenciu nielen proti Methicillinu, ale aj proti ďalším antibiotikám (napríklad Vancomycinu).

Odhliadnuc od už opísaných zlúčenín produkovaných streptomycétami, je známa jedna zlúčenina produkovaná baktériami Actinoplanes nipponensis ATTCC 31145, ktorá má na základe svojho účinnostného spektra a opísaných fyzikálno-chemických vlastností štruktúrne podobnosti s lipopeptidmi podľa vynálezu, a ktorá je označená ako zlúčenina 41.012 (americký patent 4,000,397). Fermentácia baktériou Actinoplanes nipponensis ATCC 31145 pri rôznych kultivačných podmienkach vedie vždy k relatívne nízkym výťažkom zlúčeniny 41.012.

Podstata vynálezu

Úlohou vynálezu je hľadať prírodné mikrobiálne látky so zlepšenými vlastnosťami.

Táto úloha je podľa vynálezu riešená fermentáciou baktérií druhu Actinoplanes v živom roztoku so zdrojom uhlíka a dusíka, ako aj s obvyklými anorganickými soľami, až do nahromadenia lipopeptidov v kultivačnom médiu, predovšetkým nahromadenia lipopeptidov A 1437, následnou izoláciou lipopeptidov z kultivačného média a prípadne rozdelením tejto zmesi na jej jednotlivé zložky. Tieto lipopeptidy majú farmakologickú účinnosť a s tým spojený terapeutický účinok a môžu sa použiť ako antibiotiká s účinkom proti gram-pozitívnym baktériám, výhodne proti kmeňom, ktoré sú rezistentné na glykopeptidy.

Predmetom vynálezu sú teda lipopeptidy všeobecného vzorca (I)

R'-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Dab-Val-Pro (I) v ktorom

R¹ predstavuje zvyšok jeden alebo viacnásobne nenasýtenej, nasýtenej alebo, nezávisle od toho, rozvetvenej alebo nerozvetvenej mastnej kyseliny alebo hydroxy-mastnej kyseliny s dĺžkou reťazca od 6 do 22 atómov uhlíka vrátane.

Zvyšok kyseliny vo význame symbolu R¹ má výhodne dĺžku reťazca od 10 do 20 atómov uhlíka vrátane, ešte výhodnejšie 12,13,14 alebo 15 atómov uhlíka.

R¹ výhodne predstavuje

a) zvyšok iC_l3-mastnej kyseliny,

b) zvyšok iC]4-mastnej kyseliny,

c) zvyšok aiC₁₃-mastnej kyseliny alebo

d) zvyšok aiCis-mastnej kyseliny.

Ešte výhodnejšie R¹ predstavuje skupinu

alebo

Predmetom vynálezu je ďalej spôsob prípravy lipopeptidov všeobecného vzorca (I), pri ktorom sa fermentujú baktérie Actinoplanes sp. v kultivačnom médiu až sa v tomto kultivačnom médiu nahromadí aspoň jeden tento lipopeptid, a tento lipopeptid alebo tieto lipopeptidy vše

SK 281830 Β6 obecného vzorca (I) sa purifikujú z kultivačného média. Purifikácia sa výhodne uskutočňuje tak, že sa lipopeptidy vyzrážajú z kultivačného média použitím kyselín pri pH 0,5 až 4 vrátane, a potom sa prípadne lipopeptidy získané vyzrážaním prečistia chromatografiou na ionomeničoch alebo chromatografiou na hydrofóbnej matrici, pričom sa obe chromatografie môžu uskutočňovať alternatívne alebo následne v ľubovoľnom poradí. Na fermentáciu sa výhodne použijú baktérie Actinoplanes sp. DSM 7358.

Predmetom vynálezu je aj liečivo, ktoré obsahuje aspoň jeden lipopeptid všeobecného vzorca (I) a prípadne farmaceutické nosiče, a rovnako aj použitie lipopeptidov všeobecného vzorca (I) na prípravu antibiotika proti gram-pozitívnym baktériám, najmä proti baktériám rezistentných na glykopeptidy.

Predmetom vynálezu je aj Actinoplanes sp. DMS 7358.

V nasledujúcom texte bude vynález bližšie opísaný, hlavne jeho výhodné formy uskutočnenia.

Definícia skratiek:

Dab	znamená kyselinu 2,3-diaminomaslovú
Pip	znamená kyselinu pipekolinovú (synonymum = homoprolín)
MeAsp	znamená β-metylaspartát
Gly	znamená glycín
Asn	znamená asparagin
Asp	znamená kyselinu asparagovú
Val	znamená valin
Pro	znamená prolín
n	znamená normálny/nerozvetvený (reťazec)
CID	znamená „collisional induced decay“ (zrážkou spôsobený rozpad).

Skratka „i“ znamená „izo“, kým „ai“ má význam „anteTieto označenia sú pre odborníka v odbore mastných kyselín známe (Biochemistry, Zubay, nakl. Addison Wesley v Londýne, Amsterdam, 1983).

Všetky údaje v percentách sa vzťahujú na hmotnosť, pokiaľ nie je uvedené inak. Zmesové pomery kvapalín sa vzťahujú na objem, pokiaľ nie sú uvedené iné údaje.

Spôsob podľa vynálezu sa môže použiť na fermentáciu v laboratórnom rozsahu (mililitrové až litrové objemy) a na fermentáciu v priemyslovom rozsahu (kubické metre).

Baktérie druhu Actinoplanes boli izolované zo vzorky zeme. Na vyčistenie sa vzorky zeme rozplavia fyziologickým roztokom (0,9 % NaCl) pri vytvorení radu klesajúcich koncentrácií (10° až 10⁶). Jednotlivými zriedeniami sa potom naočkujú platne so živnou pôdou vhodnou pre aktinomycéty. Po 2-14-dňovej kultivácii kultúr pri 30 °C vzniknú kolónie aktinomycét, ktoré možno izolovať oddelene v niekoľkých za sebou nasledujúcich prečisťovacích stupňoch. Určenie rodu sa uskutočňuje na základe morfologických a taxonomických kritérií, pre odborníka známymi metódami. Pre rod Actinoplanes sú charakteristické predovšetkým pohyblivé spóry.

Pomocou za sebou nasledujúcich izolačných a prečisťovacích stupňov možno z baktérií druhu Actinoplanes izolovať kolóniu, ktorá do kultivačného média vylučuje veľmi účinne jednu alebo viac zlúčenín lipopeptidov podľa vynálezu, výhodne lipopeptidy A 1437 A, B, C, D, E, F, G, H, K, L a/alebo M a označujú sa ako hlavný producent.

Ako hlavný producent sa označuje taký izolát, ktorý produkuje, respektíve odovzdáva do kultivačného média jednu alebo viac zlúčenín lipopeptidu podľa vynálezu v desaťnásobnom až stonásobnom množstve v porovnaní s izolátmi rovnakého druhu baktérií Actinoplanes.

Silne produkujúce kolónie baktérií Actinoplanes sa množia. Izolát bol uložený podľa pravidiel Budapeštianskej zmluvy z 18. júna 1990 v nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg IB, 3300 Braunschweig) pod nasledujúcim číslom:

Actinoplanes sp. DSM 7358

Actinoplanes sp. DMS 73 58 má oranžovo sfarbené mycéliá a je charakterizovaná guľovitými sporangiami.

Baktérie druhu Actinoplanes, predovšetkým DSM 7358 produkujú jednu alebo viac zlúčenín lipopeptidov podľa vynálezu v živnom roztoku (označovaný tiež ako kultivačné médium), ktorý obsahuje zdroj uhlíka a dusíka, ako aj obvyklé anorganické soli.

Namiesto kmeňa DSM 7358 sa môžu použiť tiež jeho mutanty alebo varianty, ktoré syntetizujú jednu alebo viac zlúčenín lipopeptidov podľa vynálezu. Takéto mutanty môžu byť vytvorené známymi spôsobmi pôsobením fyzikálnych prostriedkov, napríklad ožarovaním ultrafialovými alebo rôntgenovými lúčmi, alebo pôsobením chemických mutagénov, ako sú napríklad etylmetánsulfonát (EMS), 2-hydroxy-4-metoxy-benzofenón (MOB) alebo N-metyl-N‘-nitro-N-nitrozoguanidín (MNNG).

Vyhľadávanie mutantov a variantov, ktoré syntetizujú jednu alebo viac zlúčenín lipopeptidov podľa vynálezu, sa uskutočňuje podľa nasledujúcej schémy:

Oddelenie mycélií po fermentácii.

Vyzrážanie lipopeptidov pri pH 1-2 (4 °C). Rozpustenie zrazeniny v zmesi metanol voda (1 :1).

Analýza pomocou HPLC, TLC alebo inhibičného testu aktivity antibiotík.

Ďalej opísané fermentačné podmienky platia pre baktérie druhu Actinoplanes, uložený izolát DSM 7358, ako aj pre ich mutanty a varianty.

V živnom roztoku, ktorý obsahuje zdroje uhlíka a dusíka, ako aj anorganické soli, produkujú baktérie druhu Actinoplanes, predovšetkým DSM 7358, jednu alebo viac zlúčenín lipopeptidov podľa vynálezu, predovšetkým lipopeptidy A 1437 A-H, ako aj K, L, M.

Ako výhodné zdroje uhlíka na aeróbnu fermentáciu sú vhodné asimilovateľné uhľohydráty a cukomé alkoholy, ako je napríklad glukóza, laktóza alebo D-manitol, ako aj produkty obsahujúce uhľohydráty, ako napríklad extrakt zo sladu. Ako živiny obsahujúce dusík prichádzajú do úvahy: aminokyseliny, peptidy a proteíny, ako aj produkty vznikajúce ich rozkladom, ako sú peptón alebo tryptón, ďalej mäsové extrakty, rozomleté semená napríklad kukurice, pšenice, fazule, sóje alebo bavlníka, destilačné zvyšky z výroby alkoholu, mäsové múčky alebo kvasnicové extrakty, ale tiež amónne soli a dusičnany. Z anorganických solí môže živný roztok obsahovať napríklad chloridy, uhličitany, sírany alebo fosforečnany alkalických kovov alebo kovov alkalických zemín, železo, zinok, kobalt a mangán.

Tvorba lipopeptidov podľa vynálezu prebieha mimoriadne dobre v živnom roztoku, ktorý obsahuje približne 0,1 až 5 % (výhodne 0,3 až 2 %) mäsového extraktu a 0,2 až 5 % (výhodne 0,5 až 2 %) sacharózy, 0,05 až 5 g/1 (výhodne 0,1 až 0,5 g/1) kvasničného extraktu a 0,05 až 2 g/1 (výhodne 0,1 až 1 g/1 síranu horečnatého a 0,05 až 10 g/1, výhodne 0,1 až 1 g/1 hydrogenfosforečnanu draselného alebo sodného a 0 až 100 μΜ (5 až 20 μΜ chloridu železitého). Údaje o percentách sa vždy vzťahujú na hmotnosť celkového živného roztoku.

Pri kultivácii v živnom roztoku vytvárajú baktérie Actinoplanes sp., výhodne Actinoplanes DSM 7358, aj zmes lipopeptidov všeobecného vzorca (II) R’-R²-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro (II).

SK 281830 Β6

Výhodne sa táto zmes skladá z 11 odlišných a preukázateľných lipopeptidov. Tieto lipopeptidy boli pomenované A, B, C, D, E, F, G, H, K, L, M. Sú charakterizované takto:

A 1437 H

1317

R² = Asn

A 1437 K R¹ - ZX/V	N/ ν'*	COOH	1318
R² - Aep

A 1437 L R¹ - X/XZX/		CQOH	1318
R² = Asp

Lipopeptid A 1437 A obsahuje rovnako ako A 1437C jednu izo-C₁₃-mastnú kyselinu, ktorá doposiaľ nebola známa v lipopeptidoch amphomycinového typu. Aminokyselinová sekvencia lipopeptidu A 1437 A zodpovedá sekvencii Amphomycinu, ktorý však obsahuje ante-izomér-Ci₃-mastnej kyseliny. Skladba aminokyselín a sekvencia lipopeptidu A 1437 C nie je známa z iných lipopeptidov.

A 1437 B má, rovnako ako A 1437 D, mastnú kyselinu typu izo-C₁₄ a teda mastnú kyselinu známu z Tsushimycinu. A 1437 D sa však skladbou svojich aminokyselín a ich sekvencii líši od lipopeptidov známych z doterajšieho stavu techniky, zatiaľ čo A 1437 B má sekvenciu aminokyselín rovnakú ako Amphomycin. Aminokyselinové zloženie Amphomycinu, Zaomycinu a Tsushimycinu je podľa literatúry identické.

Lipopeptid A 1437 E z baktérií druhu Actinoplanes, zvlášť z Actinoplanes DSM 7358, je identický s Amphomycinom, známym zo streptomycét.

A 1437 F pozostáva z ante-izo-Ci₃-mastnej kyseliny, má teda rovnaký typ mastnej kyseliny, ako je známy z Amphomycinu. Jeho aminokyselinové zloženie a sekvencia nie je z doterajšieho stavu techniky známa.

Lipopeptidy A 1437 G a A 1437 H majú rovnako ako Aspartocin jednu ante-izo-Ci₅-mastnú kyselinu. Sekvencie aminokyselín lipopeptidu A 1437 G zodpovedá sekvencii Amphomycinu, zatiaľ čo sekvencia a zloženie lipopeptidu A 1437 H nie je z doterajšieho stavu techniky známa.

Lipopeptidy A 1437 K, L a M majú nerozvetvené mastné kyseliny s reťazcom, ktorého dĺžka je 12 až 14 atómov uhlíka. Sekvencia aminokyselín troch uvedených lipopeptidov zodpovedá sekvencii Amphomycinu.

Lipopeptidy A 1437 A až H majú všetky spojenú karboxylovú skupinu prolinu na C-konci s β-aminokyselinou 2,3-diaminomaslovej kyseliny na N-konci. Táto väzba je vyznačená symbolom „ I____I “.

V závislosti od zloženia živného roztoku môže kolísať množstvo podielu jedného alebo niekoľkých lipopeptidov podľa vynálezu. Okrem toho možno zložením živného média regulovať syntézu jednotlivých lipopeptidov tak, že ho mikroorganizmus neprodukuje vôbec, prípadne iba v množstve pod hranicou detegovateľnosti.

Kultivačné médium baktérií druhu Actinoplanes, výhodne Actinoplanes DSM 7358, obsahuje lipopeptidy s jednonásobne alebo viacnásobne nenasýtenou, nasýtenou alebo nezávisle od toho rozvetvenou alebo nerozvetvenou mastnou kyselinou alebo hydroxy-mastnou-kyselinou s reťazcom s dĺžkou 6 až 22 (vrátane) atómov uhlíka, výhodne však od 10 do 20 (vrátane) atómov uhlíka, a zvlášť výhodne s 13, 14 alebo 15 atómami uhlíka. Takéto mastné kyseliny sú pre odborníka známe napríklad z „Rômpp Chemie Lexikón“, prof. Falbe a prof. Regitz, 9. vyd. nakladateľstva Georg Thieme, Stuttgart, New York alebo z „The Encyklopédia of Chemistry“, C. A. Hampel a G. G. Hawley, 3. vyd., Van Nostrand Company, New York.

Nasledujúci rad mastných kyselín jc iba príkladom, nenárokuje si na úplnosť a nie je nijako obmedzujúci.

Nenasýtené, nerozvetvené mastné kyseliny v lipopeptidoch podľa vynálezu sú napríklad: kyselina kaprónová, heptánová, kaprylová, pelargónová, kaprínová, undekánová, laurová, tridekánová, myristová, pentadekánová, palmitová, margarínová, stearová, arachová, behenová.

Nasýtené, rozvetvené mastné kyseliny lipopeptidov podľa vynálezu sú napríklad: kyselina izomaslová alebo izovalérová, alebo zodpovedajúce kyseliny v konfigurácii „ante-izo“.

Jednonásobne nenasýtené, nerozvetvené mastné kyseliny lipopeptidov podľa vynálezu sú napríklad: kyselina akrylová alebo krotónová.

Dvojnásobne nenasýtená, nerozvetvená mastná kyselina lipopeptidov podľa vynálezu je napríklad kyselina sorbová.

Trojnásobne nenasýtené, nerozvetvené mastné kyseliny lipopeptidov podľa vynálezu sú napríklad: kyselina linolenová alebo eikosatrienová.

Štvornásobne nenasýtenou, nerozvetvenou mastnou kyselinou v lipopeptidoch podľa vynálezu je napríklad: kyselina arachidonová.

Päťnásobne nenasýtenou, nerozvetvenou mastnou kyselinou v lipopeptidoch podľa vynálezu je napríklad: kyselina klupanodenová.

Šesťnásobne nenasýtenou, nerozvetvenou mastnou kyselinou v lipopeptidoch podľa vynálezu je napríklad: kyselina dokosahexaenová.

SK 281830 Β6

Ďalej sa môžu v kultivačnom médiu nachádzať lipopeptidy s viacnásobne rozvetvenými mastnými kyselinami ako napríklad s kyselinou 2‘,4‘,6‘,8‘-tetrametyldekánovou.

Hydroxy-mastné kyseliny v lipopeptidoch podľa vynálezu sú napríklad mastné kyseliny hydroxylované v polohe 2‘ a 3‘ a/alebo na konci uhlíkového reťazca v konfigurácii „izo“ ante-izo.

Pridaním 0,01 až 5 %, výhodne 0,02 až 0,1 % L-valínu k opísanému živnému roztoku, tvorí kmeň baktérií druhu Actinoplanes predovšetkým lipopeptidy A 1437 B a D. Po pridaní 0,01 až 5 %, výhodne 0,01 až 0,5 % L-leucínu k opisanému živnému roztoku tvorí kmeň baktérií druhu Actinoplanes prednostne lipopeptidy A 1437 A a C.

Pridaním 0,01 až 5 %, výhodne 0,05 až 0,5 % L-izoleucínu k opísanému živnému roztoku tvorí kmeň baktérií druhu Actinoplanes predovšetkým lipopeptidy A 1437 E, F, G a H. Pridaním 0,01 až 5 %, výhodne 0,05 až 0,5 % kyseliny L-a-aminomaslovej k opísanému živnému roztoku tvorí kmeň baktérií Actinoplanes predovšetkým lipopeptid K. Po prídavku 0,01 až 5 %, výhodne 0,05 až 0,5 % L-norvalínu k opísanému živnému roztoku tvorí kmeň baktérií druhu Actinoplanes predovšetkým lipopeptidy L a/alebo M. To isté platí pre výhodný kmeň DSM 7358.

Popri týchto aminokyselinách sa môžu tiež použiť im zodpovedajúce α-ketokyselíny (a-ketoizovalerát, a-ketoizokaproát, a-keto-P-metylvalerát, α-ketovalerát), alebo im zodpovedajúce karboxylové kyseliny (izobutyrát, izovalerát, α-metylbutyrát, n-butyrát, propionát a valerát) v zodpovedajúcich koncentráciách alebo ďalšie substancie, ktoré môžu zasahovať do biosyntézy mastných kyselín.

Kultivácia mikroorganizmov prebieha v aeróbnych podmienkach, teda napríklad submerzne pri stálom pretrepávaní alebo miešaní v trepačkách alebo fermentoroch, prípadne sa zmes prebubláva vzduchom alebo kyslíkom. Kultivácia môže prebiehať v teplotnom rozmedzí od asi 18 do °C, výhodne pri teplote asi 25 až 35 °C, najmä však pri 28 až 32 °C. Kultivačné pH by sa malo pohybovať medzi 6 a 8, výhodne medzi 6,5 a 7,5. Mikroorganizmus sa pri týchto podmienkach kultivuje všeobecne od 24 do 300 hodín, výhodne od 36 do 140 hodín.

Kultivácia sa výhodne uskutočňuje v niekoľkých stupňoch, t. j. najprv sa pripraví jedna alebo niekoľko predbežných kultúr (inokulum) v tekutom živnom médiu, ktoré sa potom preočkuje do vlastného produkčného média, t. j. do hlavnej kultúry, napríklad v objemovom pomere 1 : 10. Inokulum možno pripraviť tak, že napríklad presadíme jednu kolóniu do živného roztoku a necháme ju rásť približne až 120 hodín, výhodne 48 až 72 hodín. Takúto kolóniu možno získať napríklad tak, že necháme určitý kmeň baktérií rásť približne 3 až 40 dní, výhodne 4 až 10 dní, na pevnej alebo tekutej živnej pôde, napríklad na zmesi agaru, sladu a kvasníc, alebo na agare s bujónom (štandardné médium pre mikroorganizmy, v ktorom sú hlavnými zložkami peptón, kuchynská soľ a agar, napríklad od firmy Difco).

Priebeh fermentácie možno sledovať na základe hodnoty pH kultivačného média alebo objemu kolónií, ako aj chromatografickými metódami, ako je napr. chromatografia na tenkej vrstve (Thin layer chromatography, TLC) alebo vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou (High pressure liquid chromatography, HPLC), alebo skúškami biologickej aktivity. Zlúčenina podľa vynálezu sa nachádza v kolóniách aj vo filtráte kultúry, najväčší diel sa však nachádza vo filtráte kultivačného média (> 90 %).

V nasledujúcom texte slúži opísaný spôsob izolácie na prečisťovanie lipopeptidov podľa vynálezu, výhodne však pre lipopeptidy A 1437 A-H, ako aj K, L, M.

Izolácia, prípadne prečistenie niektorého z lipopeptidov podľa vynálezu z kultivačného média sa uskutočňuje pomocou známych metód vzhľadom na chemické, fyzikálne a biologické vlastnosti prírodných látok. Na zistenie koncentrácie antibiotika v kultivačnom médiu alebo v jednotlivých izolačných stupňoch sa môže použiť chromatografia na tenkej vrstve, na silikagéli a s použitím 25 % roztoku amoniaku v izopropanole ako rozpúšťadla alebo HPLC. Na detekciu pri rozdeľovaní chromatografiou na tenkej vrstve možno použiť farebné reagencie ako napríklad anizaldehyd, pričom množstvo vytvorenej látky sa účelne porovná s niektorým štandardným roztokom.

Pri izolácii lipopeptidu podľa vynálezu sa najprv oddelia z kultivačného roztoku kolónie baktérií (mycélium) pomocou bežných postupov a potom sa filtrát kultivačného média okyslí, výhodne pri 4 °C, na hodnotu pH 0,5 až 4 (vrátane), výhodne na pH 1,5 až 2,5 (vrátane). Úprava hodnoty pH a s ňou spojené vyzrážanie lipopeptidov A 1437 sa môže uskutočňovať použitím všetkých kyselín bežných na trhu. Roztok sa inkubuje až 16 hodín, výhodne až 4 hodiny, potom sa vzniknutá zrazenina oddelí odstreďovaním.

Zrazenina, ktorá obsahuje akýkoľvek lipopeptid sa resuspenduje v 1/20 pôvodného objemu redestilovanou vodou a pomocou NaOH sa hodnota pH suspenzie upraví na pH 6 až 7. Každá zrazenina prejde pritom do roztoku; roztok sa ochladí na -20 °C a lyofilizuje. Lyofilizát, označovaný v nasledujúcom texte ako surový produkt (alebo tiež surový peptid) obsahuje 5 až 30 % lipopeptidu a používa sa na ďalšiu izoláciu.

Ďalšie prečistenie jedného alebo viacerých lipopeptidov podľa vynálezu sa uskutočňuje chromatografiou na vhodných materiáloch, výhodne na silikagéli, oxide hlinitom, ionomeničoch lebo na adsorpčných živiciach a najvýhodnejšie na silne alebo slabo zásaditých anexoch. Pomocou týchto chromatografických metód sa tieto lipopeptidy rozdelia podľa toho, či obsahujú na N-konci aminokyselinu Asp alebo Asn. Chromatografia týchto lipopeptidov sa uskutočňuje pufrovanými vodnými roztokmi alebo zmesou vodných a alkoholických roztokov.

Pod pojmom pufrované vodné roztoky sa rozumie napr. voda, fosforečnanový pufer, pufer s octanom amónnym, citrátový pufer, borátový pufer s koncentráciou 0 až 1 M, výhodne 1 až 100 mM, zvlášť výhodne sa používajú roztoky s fosforečnanovým pufrom s koncentráciou 1 až 100 mM.

Pod pojmom zmesi vodných alebo alkoholických roztokov sa rozumejú všetky organické rozpúšťadlá zmiešateľné s vodou, výhodne metanol, acetonitril, v koncentrácii 10 až 80 % organického rozpúšťadla alebo tiež všetky pufrované vodné roztoky, ktoré sú zmiešateľné s organickými rozpúšťadlami. Pufre, ktoré sa tu použili, sú rovnaké ako už opísané.

Rozdeľovanie lipopeptidov podľa ich rôznych mastných kyselín sa uskutočňuje pomocou chromatografie s reverznou fázou, napríklad na MCI^R (adsorpčné živice z firmy Mitsubishi, Japonsko). Zvlášť výhodná je chromatografia s reverznou fázou na hydrofóbnych materiáloch, výhodne na fázach RP-8 alebo RP-18. Okrem toho sa môže uskutočňovať delenie pomocou chromatografie na silikagéli.

Chromatografia lipopeptidov sa uskutočňuje pufrovanými alebo okyslenými vodnými roztokmi, alebo zmesami vodných roztokov s alkoholmi alebo inými, s vodou zmiešateľnými organickými rozpúšťadlami. Ako organické rozpúšťadlo sa používa výhodne acetonitril.

Pod pojmom pufrované alebo okyslené vodné roztoky sa rozumie napríklad voda, fosforečnanový pufer, pufer s octanom amónnym, citrátový pufer, borátový pufer s koncentráciou 0 až 0,5 M, ako aj kyselina mravčia, kyselina octová, kyselina trifluóroctová alebo všetky bežné, pre od bomíka známe kyseliny, výhodne s koncentráciou 0 až 1 %. Zvlášť výhodná je koncentrácia 0,1 %.

Chromatografía sa uskutočňuje v gradiente, ktorý začína 100 % vody a končí 100 % rozpúšťadla, výhodne sa pracuje v lineárnom gradiente od 40 do 60 % acetonitrilu.

Poradie oboch uvedených chromatografii (chromatografie rozdeľujúce lipopeptidy podľa typu koncovej aminokyseliny Asp alebo Asn, alebo podľa typu mastnej kyseliny) je zameniteľné. Výhodné je rozdeľovať lipopeptidy podľa rozdielnych aminokyselín v prvom stupni a až potom podľa typu mastnej kyseliny.

Ak uvedený surový produkt obsahuje lipopeptidy s jednotnou mastnou kyselinou, používa sa opísaná chromatografia (delenie lipopeptidov na základe rozdielnych mastných kyselín) na odsolenie a ďalšie prečistenie týchto lipopeptidov.

Alternatívne sa môže tiež použiť gélová chromatografía alebo chromatografía na hydrofóbnych fázach.

Gélová chromatografía sa uskutočňuje na polyakrylamidovom géli alebo na géli tvorenom zmesou polymérov, ako sú napríklad Biogel-P 2^R (firma Biorad) alebo Fractogel TSK HW 40^R (firma Merck, SRN alebo Toso Haas, USA).

Lipopeptidy podľa vynálezu sú stále, v pevnom stave a v roztokoch v oblasti pH medzi 4 a 8, najmä medzi pH 5 a 7, a teda sa dajú zapracovať do bežných galenických prípravkov.

Jedna alebo viac zlúčenín lipopeptidov podľa vynálezu sú na základe svojich cenných farmakologických vlastností vhodné na použitie ako liečivá.

Substancie podľa vynálezu majú farmakologickú účinnosť, zvlášť ako antibiotiká proti gram-pozitívnym baktériám a sú zvlášť výhodné proti kmeňom rezistentným na glykopeptidy.

Kmene rezistentné na penicilín, prípadne methicillin (kmene MRSA), ktoré si vytvorili ďalšiu rezistenciu na antibiotikám, majú často postačujúce terapeutické účinky iba glykopeptidy, ako je Vancomycín alebo Teicoplanín. V rastúcej miere sa však vyskytujú kmene, ktoré sú rezistentné tiež na tieto antibiotiká (FEMS Microbiol. Lett. 98 (1992), str. 109 až 116). Jedna alebo viac zlúčenín lipopeptidov podľa vynálezu má vynikajúci účinok tiež proti týmto problémovým choroboplodným zárodkom.

Vynález sa týka tiež liečiv (farmaceutických prípravkov) obsahujúcich jednu alebo viac zlúčenín lipopeptidov podľa vynálezu.

Jedna alebo viac zlúčenín lipopeptidov podľa vynálezu, jedna alebo viac zlúčenín lipopeptidov A 1437 A až H, sa môžu zásadne aplikovať samotné. Výhodné je však použitie v zmesi s vhodnými pomocnými látkami alebo nosným materiálom. Ako nosný materiál pre veterinárne liečivá možno použiť bežné kŕmne zmesi, pre humánne liečivá všetky farmakologicky prijateľné nosné materiály a/alebo pomocné látky.

Liečivá podľa vynálezu sa všeobecne podávajú orálne alebo parenterálne, ale principiálne je možné tiež rektálne podávanie. Vhodnými pevnými alebo tekutými formami galenických prípravkov sú napríklad granuláty, prášky, tablety, dražé, (mikro-)kapsuly, čapíky, sirupy, emulzie, suspenzie, aerosóly, kvapky alebo roztoky na injekčné podávanie vo forme ampúl, ako aj preparáty s protrahovaným (spomaleným) uvoľňovaním účinnej látky, pri ktorej sa používajú bežné nosiče a prísady a/alebo pomocné látky ako látky umožňujúce rozpad, spájadlá, poťahovadlá, napučiavadlá, lubrikanty alebo mazadlá, dochucovadlá, sladidlá alebo látky uľahčujúce rozpúšťanie. Ako často používané nosiče alebo pomocné látky možno uviesť napríklad uhličitan horečnatý, oxid titaničitý, laktózu, manitol a ďalšie cukry, mastenec, mliečnu bielkovinu, želatínu, škrob, vita míny, celulózu a jej deriváty, živočíšne alebo rastlinné oleje, polyetylénglykoly a rozpúšťadlá ako napríklad sterilná voda, alkoholy, glycerín a viacmocné alkoholy.

Prípadne sa môžu dávkovacie jednotky určené na orálne podanie zapracovať do mikrokapsúl tak, aby sa spomalilo vstrebávanie lieku, alebo predĺžilo na dlhšie časové obdobie, ako napríklad potiahnutím alebo zapuzdrením účinnej látky vo forme jemných častíc do vhodných polymérov, voskov a podobne a následné použitie vo forme čapíku.

Farmaceutické prípravky sa pripravujú a aplikujú výhodne vo forme dávkovacích jednotiek, pričom každá dávkovacia jednotka obsahuje ako účinnú zložku určitú dávku jednej alebo niekoľkých zlúčenín lipopeptidov podľa vynálezu. V pevných dávkovacích jednotkách ako napríklad tabletách, kapsulách a čapíkoch môže byť dávka účinnej látky až približne 200 mg, výhodne však približne 0,1 až 100 mg, a v roztokoch na injekčné podávanie v ampulách až asi 200 mg, výhodne však asi 0,5 až 100 mg na deň.

Podávaná denná dávka závisí od telesnej hmotnosti, veku, pohlavia a stavu cicavca. Podľa okolnosti však možno aplikovať vyššie alebo nižšie denné dávky. Aplikácia dennej dávky môže byť jednorazová vo forme jednej dávkovacej jednotky alebo tiež v niekoľkých menších dávkovacích jednotkách, alebo tiež niekoľkonásobná, t. j. rozdelením dávok v určitých časových intervaloch.

Liečivá podľa vynálezu sa pripravujú tak, že sa jedna alebo viac zlúčenín lipopeptidov podľa vynálezu zmieša spolu s bežnými nosičmi, prípadne prísadami a/alebo pomocnými látkami a zmes sa prípadne prevedie na vhodnú aplikačnú formu.

Vynález je ďalej bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch. Údaje v percentách sa vzťahujú na hmotnosť. Zmesové pomery sa pri kvapalinách vzťahujú na objem, pokiaľ nie sú udané žiadne iné údaje.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad la

Príprava glycerínovej kultúiy baktérií druhu Actinoplanes DSM 7358

100 ml živného roztoku (4 g/1 kvasničného extraktu, 15 g/1 rozpusteného škrobu, 1 g/1 K₂HPO₄, 0,5 g/1 MgSO₄.7H₂O doplnené vodou na 1000 ml, upravené pred sterilizáciou na pH = 7,0) sa prevedie do sterilnej Erlenmayerovej banky s objemom 300 ml a naočkuje baktériami kmeňa Actinoplanes sp. DSM 7358 a inkubuje sa 7 dní pri 30 °C a 150 otáčkach za minútu na rotačnej trepačke. 1,5 ml tejto kultúry sa potom nariedi 2,5 ml 80 % glycerínu a uskladní sa pri -20 °C.

Príklad lb

Príprava kultúry, respektíve inokula baktérií Actinoplanes sp. DSM 7358 v Erlenmayerovej banke

Sterilná Erlenmayerova banka s objemom 300 ml sa naplní 100 ml nasledujúceho živného roztoku: 30 g/1 sacharózy, 2 g/1 KNOj, 1 g/1 K₂HPO₄, 0,5 g/1 MgSO₄.H₂O, 0,5 g/1 KC1,0,01 g/1 FeSO₄.7H₂0,2 g/1 kvasničného extraktu, 5 g/1 peptónu. Tento živný roztok sa naočkuje buď kultúrou narastenou v šikmých skúmavkách s agarom (rovnaký živný roztok, ale s 2 % agaru), alebo 1 ml glycerínovej kultúry (pozri príklad la). Po inokulácii sa banka inkubuje na trepačke pri 180 otáčkach za minútu a teplote 30 °C. Maximálna produkcia jednej alebo viacerých zlúčenín lipopeptidov podľa vynálezu sa dosiahne po 120 hodinách. Na naočkovanie 10 a 2001 fermentora stačí 48 až 96 hodín stará kultúra (množstvo inokula cca 10 %) z rovnakého živného roztoku.

Príklad 2

Porovnávacia charakterizácia baktérii Actinoplanes sp. DSM 7358

Na charakterizáciu baktérii kmeňa Actinoplanes sp. DSM 7358 sa uskutočnilo porovnanie s blízko príbuznými kmeňmi pomocou ISP-metódy podľa Shirlinga a Gottlieba (Int. J. of Sys. Bacteriol. 16,3 (1966) str. 313 až 340). Výsledky (pozri tab. 1) ukazujú, že kmeň Actinoplanes sp. DSM 7358 sa od ostatných kmeňov odlišuje morfologicky i fyziologicky.

Tabuľka 1

	Actinoplanes sp.DSM7358	A. utahensis NRRL12052	A. brasäiensis ÁTCC25844	A. nipponensis ATCC311455
Vzdušné mycélium	-	-	+ (ISP3)	-
Sporangia	+	+	+	+
Médium ISP2	oranžový	oranžový	žltooranž.	oranžový
ISP3	oranžový	oranžový	žltooranž.	oranžový
ISP4	oranžový	oranžový	žltooranž.	oranžový
ISP5	oranžový	oranžový	žltooranž.	oranžový
ISP6	oranžový	oranžový	žltooranž.	oranžový
	červený	hnedočervený	červený	červený
	Exopigment	Exopigment	Exopigment	Exopigment
Melániu	-	-	(+)	(+)
Glukóza	+	+	+	+
Arabinóza	+	+	+	+
Sacharóza	+	4-	+
Xylóza	+	+	(+)
Inozitol	+		(+)	(+)
Manitol	+	+
Fruktóza	+	+
Ramnóza	+	+	+	+
Rafmóza	+	+	(+)
Celulóza	+	+	(+)
Melibióza	-	-		-
Amygdalín	+	+	+
Želatína (hydrolýza)	+	+	+	+
Citrát (hydrolýza)	-		+
Močovina (hydrolýza)	+		-
Arginín-hydroláza β-galaktozidáza Tryptofanáza	+		-
Lyzin-dekarboxyláza Acetoín	+ +	+	+	+
(tvorba) Indol (tvorba)
H2S (tvorba)	-	-	-	-
NaCl tolerancia	0 - 2,5 %	0 - 2,5 %	0-2,5%	0-2,5%

Príklad 3 a

Výroba lipopeptidu A 1437 B a D

Fermentácia prebieha vo fermentore s objemom 500 1 v nasledujúcich podmienkach:

Živné médium: 11 g/1 sacharózy, g/1 mäsového extraktu,

0,3 g/1 kvasničného extraktu,

0,6 g/1 MgSO₄,

0,1 g/lKH₂PO₄,

0,6 g/1 L-valínu, μΜ FeCl₃.6H₂O, pH = 7,3 (pred sterilizáciou) Inkubačný čas: 120 hodín

Inkubačná teplota: 30 °C

Rýchlosť miešania: 50 otáčok za minútu

Prevzdušňovanie: 150 Emin¹

Tvorba peny sa môže potlačiť opakovaným pridávaním etanolického roztoku polyolov. Produkčné maximum sa dosiahne po cca 96 až 120 hodinách.

Po skončení fermentácie baktérií kmeňa Actinoplanes sp. DSM 7358 sa suspenzia kultúry filtruje pri pridávaní cca 2 % pomocného filtračného prostriedku (napr. Celite^R). Potom sa filtrát ochladí na 4 °C a hodnota pH sa upraví na 1,5. Po 4 hodinách sa uskutoční odstredenie pri 10 000 g a zrazenina sa resuspenduje v destilovanej vode. Neutralizáciou suspenzie prejde táto látka do roztoku. Roztok sa vymrazí a lyofilizuje. Výťažok surového produktu je cca

1,5 g/1 (t. j. 750 g).

Príklad 3b

Rozdelenie surového produktu (obsahujúceho B + D) pomocou iónovej chromatografie

Chromatograflcká kolóna s obsahom 3,2 1 (10 cm vnútorný priemer x 40 cm výška) sa naplní DEAE-Sepharosou pre rýchly prietok (Fast Flow) a zarovná 10 mM draselnofosforečnanovým pufrom, pH 7,0 v 40 % metanolu (pufer A). Potom sa 25 g surového produktu A 1437 B (získané podľa príkladu 3a) rozpustí v 3,5 1 vody, prenesie sa na kolónu a nechá sa premývať najprv 1 1 vody a potom 6 1 pufra A. Znečistenie surového produktu sa nachádza v pretekajúcej vode. Následne aplikujeme gradient draselnofosforečnanového pufra s koncentráciou od 10 do 100 mM (pH 7,0 v 40 % metanolu), 25 až 35 mM draselno-fosforečnanovým pufrom sa eluuje peptid A 1437 D a 40 až 55 mM draselno-fosforečnanovým pufrom sa získava antibiotikum A 1437 B. Zodpovedajúca frakcia sa vo vákuu zbaví metanolu. Na odsolenie sa použije kolóna ^RDianion HP-20 (Mitsubishi, Japonsko) s obsahom 11. Teraz sa 91 frakcií obsahujúcich čistý B-peptid nanesie na kolónu a potom sa premyje 3 1 odsotenej vody. Na elúciu sa používa gradient voda-izopropanol (0 až 50 % alkoholového podielu). 15 až 25 % izopropanolom sa z nosiča vymýva čistý peptid A 1437 B. Tieto frakcie sa zbierajú oddelene, vo vákuu sa zbavia alkoholu a potom vymrazujú. Výťažok je 4,8 g peptidu A 1437 B s 97 % čistotou. Zodpovedajúce odsolenie frakcií obsahujúcich A 1437 D dáva 3,1 g antibiotika. Čistota 98 %.

Príklad 4a Výroba lipopeptidov A 1437 A a C

Výroba prebiehala tak, ako bolo opísané v príklade 3a, ale L-valín bol v produkčnom médiu nahradený 4 g/1 L-leucinu a fermentácia prebiehala v bioreaktore s obsahom 501. Výťažok bol 1,3 g/1 (t. j. 65 g).

Príklad 4b

Izolácia lipopeptidu A 1437 A a C g surového produktu sa rozpustí v 100 ml destilovanej vody a spracuje podľa uvedenej schémy:

Schéma spracovania:

g surového peptidu v 100 ml destilovanej vody.

I Adsorpcia na Q-Sepharose pre rýchly prietok (výrobok firmy Pharmacia, kolóna 5 x 20 cm) l Elúcia nasledujúcim gradientom: pufer A: NaH₂PO₄1 mM v 50 % metanole, pH 5,9 pufer B: NaH₂PO₄100 mM v 50 % metanole, pH 5,3 20 min.: pufer A: -»počas 60 min. na 25 % pufre B, ďalších 30 minút pri 25 % pufre B, l

SK 281830 Β6

Lyofilizácia frakcií obsahujúcich A 1437 A, respektíve C a ich rozpustenie v elučnom činidle l Odsolenie na Biogele P2 (mesh 100-200, firma Biorad) (kolóna 7 x 20 cm)

1

1,6 g lipopeptidu A 1437A(80%) 1,2 g lipopeptidu A 1437C (80%) i I

RP-chromatografia na Nucleosile^R C₁₈ (7 pm) (kolóna 20 x 250 mm, dávka 200 mg) Elúcia nasledujúcim gradientom pufer A: redestilovaná voda, 0,1 % TFA pufer B: acetonitril min.: pufer B —> počas 60 minút na 90 % pufre B pri prietoku 10 ml/min.

I l

Lyofilizácia frakcii obsahujúcich A 1437 A, respektíve C l 4

150 mg A1437A (čistota >95 %) 154 mg A1437C (čistota>95 %)

Príklad 5a

Výroba lipopeptidov A 1437 E, F, G a H

Výroba prebieha tak, ako bolo opísané v príklade 3a, ale L-valín je v produkčnom médiu nahradený 1,5 g/1 L-izoleucinu a fermentácia prebieha v bioreaktore s obsahom 50 1. Výťažok je 1,4 g/1 surového peptidu (70 g).

Príklad 5b

Rozdelenie surového peptidu pomocou iónovej chromatografie

Na chromatografickej kolóne (opísaná v príklade 3a) sa rozdelí 25 g surového lipopeptidu, získaného podľa príkladu 5a (primerane k príkladu 3a).

až 19 mM pufrom sa eluuje peptid A1437 F (výťažok 1,8 g) 18 až 25 mM pufrom sa eluuje peptid A1437 E (výťažok 1,3 g) 35 až 50 mM pufrom sa eluuje peptid A 1437 H (výťažok 2,7 g) 64 až 82 mM pufrom sa eluuje peptid A1437 G (výťažok 1,9 g)

Príslušné frakcie sa zhromaždili a vo vákuu sa zbavili metanolu.

Príklad 5c

Prečistenie zložiek z príkladu 5b chromatografiou na reverznej fáze RP-18

Preparatívna HPLC kolóna s obsahom 500 ml (5,1 cm vnútorný priemer x 25 cm výška) sa naplní materiálom ^RLiChrosorbG RP-18, 10 pm a potom sa na ňu nanesie roztok, znečistený sprievodnými soľami a obsahujúci 1,9 g antibiotika A 1437 G. Eluuje sa gradientom, ktorý začína 5 % acetonitrilom v 10 mM draselno-fosforečnanovom pufre, pH 7,0 a končí 36 % acetonitrilom v 10 mM draselno-fosforečnanovom pufre, pH 7,0. Vo frakcii s 24 až 26 % acetonitrilu sa nachádza lipopeptid A 1437 G. Frakcia sa potom koncentruje vo vákuu, odsoľuje na 100 ml absorpčnej živici ^RDianion HP-20 v zmesi voda/50 % izopropanolu a po vymrazení sa získa 1,1 g lipopeptidu A 1437 G s čistotou 99 %.

Na zodpovedajúce prečistenie roztoku obsahujúceho A 1437 H, získaného podľa príkladu 5b sa používa gradient rozpúšťadla s 10 až 50 % acetonitrilu v 10 mM draselno-fosforečnanovom pufre, pH 7,0. Elúcia antibiotika prebieha vo frakcii obsahujúcej 37 až 39 % acetonitrilu. Zakoncentrovanie zodpovedajúcich frakcií a odsolenie na ^RDianione HP-20 a následné vymrazenie dajú výťažok 2,2 g lipopeptidu A 1437 H s čistotou viac ako 98 %.

Príklad 5d

Prečistenie lipopeptidových antibiotík A 1437 E a F z príkladu 5b na géli MCI^R

Roztok lipopeptidu A 1437 F, ktorý sa získa podľa príkladu 5b, obsahujúci soli a 1,8 g antibiotika sa nanesie na 1 1 MCI^R-gélu CHP 20P (Mitsubishi Kasei Corp.). Objem kolóny je 6 x 35 cm. Potom sa na nosič nanesie materiál, ktorý chceme rozdeliť. Tento sa najprv prepláchne pufrom A (5 nM draselno-fosforečnanovým pufrom, pH 7,0 s 20 % acetonitrilom), a potom sa eluuje vzrastajúcim gradientom pufra B (5 mM draselno-fosforečnanový pufer, pH 7,0, so 70 % acetonitrilu). Vo frakcii s 34 až 35 % acetonitrilu dochádza k elúcii čistého antibiotika. Skoncentrovanie vo vákuu a odsolenie na dianione HP-20 poskytuje výťažok 1,4 g lipopeptidu A 1437 F s čistotou vyššou ako 98 %. Analogický postup so surovým lipopeptidom A 1437 E podľa príkladu 5a poskytuje výťažok 1 g peptidu A 1437 E s čistotou vyššou ako 98 %.

Príklad 6a

Výroba lipopeptidu A 1437 K

Výroba prebiehala tak, ako je opísané v príklade 4a, ale L-valín v produkčnom médiu bol nahradený 500 mg/1 kyseliny L-a-aminomaslovej (alebo 1 g/1 racemátu) a fermentácia prebiehala v bioreaktore s obsahom 10 1. Výťažok bol 1,1 g/1 surového peptidu (cca 10 g).

Príklad 6b

Izolácia lipopeptidu A 1437 K g surového produktu sa rozpustí v 100 ml destilovanej vody a ďalej spracuje podľa uvedenej schémy.

Schéma spracovania (A 1437 K) g surového peptidu v 100 ml destilovanej vody.

I

Adsorpcia na Q-Sepharose s rýchlym prietokom (rozmery kolóny 3,5 x 17 cm) i

Elúcia nasledujúcim gradientom: pufer A: NaH₂PO₄1 mM v 50 % metanole, pH 5,9 pufer B: NaH₂PO₄100 mM v 50 % metanole, pH 5,3 20 min.: pufer A: —> počas 45 min. na 25 % pufre B, ďalších 45 minút pri 25 % pufre B, l

Lyofilizácia frakcii obsahujúcich A 1437 K Odsolenie na Biogele P2 (mesh 100-200) (rozmery kolóny 7 x 20 cm) 700 mg A 1437 K (60 % čistota) l 1

RP-chromatografia na materiáli Nucleosil^R C|₈ (7 pm) (rozmery kolóny 20 x 250 mm) Nanesieme 50 mg predčisteného produktu

I

Elúcia nasledujúcim gradientom pufer A: redestilovaná voda, 0,1 % TFA pufer B: acetonitril min.: pufer A/5 % pufra B —> za 60 minút na 70 % pufre B pri prietoku 10 ml/min.

I

Lyofilizácia frakcií, ktoré obsahujú A 1437 K

5,6 mg A 1437 K (>95%)

SK 281830 Β6

Príklad 7a

Výroba lipopeptidu A1437 L a M

Výroba prebiehala tak, ako je opísané v príklade 4a, ale L-valín bol v produkčnom médiu nahradený 500 mg/1 L-norvalínu (alebo 1 g/1 racemátu) a fermentácia prebiehala v bioreaktore s obsahom 10 1. Výťažok surového peptidu bol 1,2 g/1 (t. j. cca 12 g).

Príklad 7b

Izolácia lipopeptidov A 1437 L a M g surového produktu sa rozpustí v 100 ml destilovanej vody a ďalej spracuje podľa uvedenej schémy.

Schéma spracovania (A 1437 L a M) 10 g surového peptidu v 100 ml destilovanej vody.

I

Adsorpcia na Q-Sepharose s rýchlym prietokom (rozmery kolóny 3,5 x 17 cm)

I

Elúcia nasledujúcim gradientom: pufer A: NaH₂PO₄ 1 mM v 50 % metanole, pH 5,9 pufer B: NaH₂PO₄100 mM v 50 % metanole, pH 5,3 20 min.: pufer A: -> počas 45 min. na 25 % pufre B, ďalších 45 minút pri 25 % pufre B, l

Lyofilizácia frakcií obsahujúcich A 1437 L a M

I

Odsolenie na Biogele P2 (mesh 100-200) (rozmery kolóny 7 x 20 cm)

900 mg lipopeptidov A 1437 L a M (60 % čistota)

RP-chromatografia na materiáli Nucleosil C_]8 (7 pm) (rozmery kolóny 20 x 250 mm)

Nanesieme 50 mg predčisteného produktu Elúcia nasledujúcim gradientom Pufer A: redestilovaná voda, 0,1 % TFA Pufer B: acetonitril min.: pufer A/5 % pufra B —► za 60 minút na 70 % pufre B pri prietoku 10 ml/min.

i Lyofilizácia frakcií, ktoré obsahujú lipopeptidy A 1437 L a M 5,8 mg A 1437 L (> 95 %) 6,7 mg A 1437 M (> 95 %)

Príklad 8

HPLC systém na dôkaz lipopetidov A 1437

Ďalej opísaný systém umožňuje rozdelenie a kvantifikáciu lipopeptidov, ktoré sa nachádzajú v surovej zmesi, respektíve vo filtráte kultivačného média. Retenčné časy ležia medzi 11,5 minútami (A 1437 E) a cca 15,9 minútami (A 1437 H).

Rozpúšťadlo:

A: draselno-fosforečnanový pufer pH 7,0, 10 mM

B: acetonitril
gradient.: t [min.]	prietok [ml/min.]	A[%]	B[%]
0	1,5	80	20
15	1,5	50	50
15,5	2	00	100
16,5	2	00	100
17	1,5	80	20
22	1,5	80	20

Kolóna: Shandon ODS HYpersil RP-18 (120 x 4,6 mm s predkolónou 20 x 4,6 mm) alebo

Nucleosil 120 RP 18 (120 x 4,6 mm s predkolónou 20 x 4,6 mm)

Prietok: 1,5 ml/min.

Detekcia: 210 nm

Injekcia: 10 pl

Príklad 7'

Porovnanie medzi baktériami Actinoplanes nipponensis ATCC 31145 a Actinoplanes sp. 7358

Z obidvoch kmeňov sa najprv pripraví inokulum tak, ako je to opísané v príklade lb a toto sa potom použije na naočkovanie nasledujúcich produkčných médií.

Médium 1: rovnako, ako bolo opísané v príklade 3 a

Médium 2: rovnako ako médium 1, ale bez L-valínu

Médium 3: glukóza 30 g/1; sójová múčka 20 g/1; Fe₂(SO₄)₃

0,3 g/1; MnCl₂.4H₂O 0,3 g/1 a CoCl₂.6H₂O; pH 7,3

Vždy 100 ml média sa umiestni do jednej Erlenmayerovej banky s obsahom 300 ml.

Inkubácia prebieha pri 30 °C na trepačke. Po 48, 96 a 144 hodinách sa určí koncentrácia lipopeptidov A 1437 vo filtráte kultivačného média pomocou HPLC (pozri príklad 6). V médiu 2 a 3 nebol v kmeni Actinoplanes nipponensis ATCC 31145 zistený žiadny lipopeptid. V médiu 1 sa podarilo nájsť malé množstvo peptidov až po 144 hodinách. Ak by sme pokladali špecifickú extinkciu týchto zlúčenín v porovnaní s peptidmi A 1437 rovnakú, potom by bolo vyprodukované množstvo peptidov najmenej stokrát menšie (< 1 mg/1) ako koncentrácia peptidu A 1437 B, ktorý bol vyprodukovaný kmeňom Actinoplanes sp. DSM 7358 v médiu 1 v tom istom časovom úseku.

Príklad 8'

Účinky lipopeptidov A 1437

Citlivosť určitého kmeňa proti lipopeptidom A 1437 sa zisťovala pomocou zrieďovacích testov na agare. Použil sa Miiller-Hintonov agar, ktorý bol v prípade S. pyogenes obohatený 10 % konskej krvi. Plame obsahujúce antibiotikum boli naočkované pomocou multikanálového očkovacieho prístroja (5 x 10⁴ CFU/očkovacia dávka stacionárnej kultúry určeného kmeňa). Hodnoty MHK-(Minimale Hemmkonzentration minimálna inhibičná koncentrácia) sa odčítali pri 37 °C. Ako hodnota MHK je definovaná koncentrácia antibiotika, pri ktorej sa nedá po 24 hodinovej inkubácii detegovať žiadny viditeľný rast choroboplodných zárodkov.

Výsledky sú usporiadané v tabuľke 2. Amphomycin, ktorý sa použil ako kontrola, sa získal od firmy Boehringer Mannhcim (SRN). Táto firma ponúka Amphomycin vo veľmi čistom stave (Feinchemikalie).

Tabuľka 2

Látky A 1437 : aktivita in vitro (AB-spektrum); koncentrácie sú udané v pg/ml

1437 A	0,391	0,781	0,391	1,56	0,391	3,13
1437 B	0,098	0,195	0,098	0,195	0,049	0,391
1437 C	0,195	0,781	0,391	3,13	0,781	3,13
1437 D	0,049	0,195	0,049	0,781	0,391	0,781
1437 E	0,098	0,195	0,094	0,098	0,025	0,195
1437 F	0,098	0,391	0,195	1,56	0,781	1,56
1437 G	0,098	0,195	0,049	0,088	0,025	0,195
1437 H	0,049	0,098	0,049	0,195	0,049	0,195
Amphomycin	0,195	0,781	0,391	1,56	0,391	1,56

Látky A 1437 : aktivita in vitro (Vancomycin-rezistentné kmene); koncentrácie udané v pg/ml

	Enterococcus faecium VRI	Enterococcus faecium VR2	Slreptococcus pyogenes
A 1436 A	neurčené
A 1437 B	1	1	0,5
A 1437 C	4	4	4
A 1437 D	2	2	1
A 1437 E	4	4	1
A 1437 F	4	4	1
A 1437 G	0,25	0,25	0,125
A 1437 H	1	1	0,5
Amphomycin	4	4	2

Zlúčeniny K, L, M majú aktivitu in vitro porovnateľnú so zlúčeninami A až H

Príklad 9a

Charakterizácia lipopeptidu A 1437 D

Lipopeptid A 1437 D je izolovaný ako tuhá amorfná látka.

Optická otáčavosť: +35° (c = 0,1; metanol)

HPLC: retenčný čas 15,1 minút

Aminokyseliny: 2 x kyselina asparágová x asparagín x β-metylaspartát x glycín x kyselina 2,3-diaminomaslová x prolín x kyselina pipekolinová x valín

FAB-MS: m/e = 1303,6952 p[(M+H)⁺]

Moláma hmotnosť: 1302, 6884 (C₃₉H₉4Ni4Oi₉)

CID-MS: m/z = 356,491,517, 520,741, 761,938, 982

IR(KBr): v = 3420 (š) cm'¹,2930, 1660, 1530, 1450,1400.

Príklad 9b

Charakterizácia lipopeptidu A 1437 B

Lipopeptid A1437 je izolovaný ako tuhá amorfná látka.

Optická otáčavosť: +27° (c = 0,1; metanol)

HPLC: retenčný čas 12,8 minút

Aminokyseliny: 3 x kyselina asparágová x β-metylaspartát x glycín x kyselina 2,3-diaminomaslová x prolín x kyselina pipekolinová x valín

FAB-MS: m/e = [(M+H)'j

Moláma hmotnosť: 1303 (C₃₉H_wNi3O₂₀)

CID-MS: m/z = 356,407, 518, 521, 741, 762, 938, 982

IR(KBr): δ = 3420 (ä)cm’¹ 2925, 1650, 1535,1450, 1400.

Príklad 9c

Charakterizácia lipopeptidu A 1437 C

Lipopeptid A 1437 C je izolovaný ako tuhá amorfná látka.

Optická otáčavosť: +30° (c = 0,1; metanol)

HPLC: retenčný čas 14,1 minút

Aminokyseliny: 2 x kyselina asparágová x asparagín x β-metylaspartát x glycín x kyselina 2,3-diaminomaslová x prolín x kyselina pipekolinová

I x valín

Moláma hmotnosť: 1288 (CsgH^NuO^)

CID-MS: m/z= 356,392,503,503,741,747, 938,981

IR(KBr): v = 3420 (š)cm¹ 2930,1660,1530,1450,1400.

Príklad 9d

Charakterizácia lipopeptidu A 1437 A

Lipopeptid A 1437 A je izolovaný ako tuhá amorfná látka. Optická otáčavosť: +30° (c = 0,1; metanol)

HPLC: retenčný čas 11,8 minút

Moláma hmotnosť: 1289 (C₃₈H₉₁N₁₃0₂o)

CID-MS: m/z = 356,478,504,507,741,748,938,981 IR(KBr): v = 3420 (š)cin¹ 2925,1650,1535,1450, 1400.

Príklad 9e

Charakterizácia lipopeptidu A 1437 F

Lipopeptid A 1437 F je izolovaný ako tuhá amorfná látka.

Optická otáčavosť: +31° (c = 0,1; metanol)

HPLC: retenčný čas 13,8 minút

Aminokyseliny: 3 x kyselina asparágová x asparagín x β-metylaspartát x glycín x kyselina 2,3-diaminomaslová x prolín x kyselina pipekolinová x valín

Moláma hmotnosť: 1288 (C^H^N^O^)

CID-MS: m/z = 356, 392, 503,506,741, 747,938,981 IR(KBr): v = 3420 (íjcm'¹ 2930,1660,1530,1450,1400.

Príklad 9f

Charakterizácia lipopeptidu A 1437 E

Lipopeptid A 1437 E je izolovaný ako tuhá amorfná látka.

HPLC: retenčný čas 11,5 minút

Moláma hmotnosť: 1289 (C₃₈H₉|N_I30₂o)

CID-MS: m/z = 356, 393,504, 507, 741,748,938,981

IR(KBr): v = 3420 (š)cm'¹ 2925,1650, 1535, 1450, 1400.

Príklad 9g

Charakterizácia lipopeptidu A 1437 H

Lipopeptid A 1437 H je izolovaný ako tuhá amorfná látka.

Optická otáčavosť: +32° (c = 0,1; metanol)

HPLC: retenčný čas 15,9 minút

Moláma hmotnosť: 1316 (C₆oH₅₆N_]40₁₉)

CID-MS: m/z = 356,420,531,534,741,775,938,981 IR(KBr): v = 3420 (š)cm'¹ 2930,1660,1530,1450,1400.

Príklad 9h

Charakterizácia lipopeptidu A 1437 G

Lipopeptid A 1437 G je izolovaný ako tuhá amorfná látka. Optická otáčavosť: +34° (c = 0,1; metanol)

HPLC: retenčný čas 13,6 minút

Moláma hmotnosť: 1317 ((/^Η^Ν^Ο^)

CID-MS: m/z = 356,421,532,535, 741,776,938,981 IR(KBr): v = 3420 (šjcm¹ 2925,1650,1535,1450,1400.

Príklad 9i

Charakterizácia lipopeptidu A 1437 K

Lipopeptid A 1437 K je izolovaný ako tuhá amorfná látka. HPLC: retenčný čas 12,5 minút

FAB-MS: m/e = [(M+H)⁺J

Moláma hmotnosť: 1299 (C5₈H_9IN|₃0₂o)

CID-MS: m/z = 393,504, 507,741,748,938,981 IR(KBr): v = 3420 (š)crrí¹ 2925,1650,1535,1450,1400.

Príklad 9j

Charakterizácia lipopeptidu A 1437 L

Lipopeptid A 1437 L je izolovaný ako tuhá amorfná látka. HPLC: retenčný čas 13,0 minút

FAB-MS: m/e = [(M+H)⁺]

Moláma hmotnosť: 1289 (C₅9H₉₃N₁₃02o)

CID-MS: m/z = 407,518,741,761,938,981

IR(KBr): v = 3420 (šjem’¹ 2925,1650, 1535, 1450, 1400.

Príklad 9k

Charakterizácia lipopeptidu A 1437 M

Lipopeptid A 1437 M je izolovaný ako tuhá amorfná látka. HPLC: retenčný čas 9,8 minút

FAB-MS: m/e = [(M+H)⁺]

Moláma hmotnosť: 1275 (ϋ5₇Η₈₉Νι₃Ο₂₀)

CID-MS: m/z = 379, 490, 724, 741, 938, 981 lR(KBr): v = 3420 (š)crn ¹ 2925, 1650,1535,1450,1400.

Príklad 10

Chemický posun C₁₃

Tabuľka ukazuje chemický posun signálu CH zlúčeniny A 1437 B spôsobený uhlíkom C,₃

	Dab	Gly	Nfcňfip	Gly	Asp	Asp	Αφ	Dab	Val	Pro
NHCa	830	8,43	8,19	8,12	8.09	796	8,15	7_r87	730	4,13	4,62
a	56,00	44,60	41#	44,70	52,00	53,10	53,00	55j60	39#	62,40	56#
β	50,10		14,40		36,10	35,60	3630	47,80	31#	30,80	27#
z	16,00							20,10	18£ 19,7	26,00	20,60
5										49,40	24,90
β											45,00

Aby bolo možné porovnanie s údajmi signálu 'H, sú v tabuľke uvedené tiež hodnoty chemického posunu signálu NH, respektíve pre Pip a pre Pro posunu CaH zodpovedajúceho spinsystému.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Lipopeptidy všeobecného vzorca (I)

R'-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-GIy-Dab-Val-Pro (I), I_________________________________________________________________________________________________________________I v ktorom

R¹ znamená zvyšok jeden- alebo viacnásobne nenasýtenej, nasýtenej, alebo nezávisle od toho, rozvetvenej alebo nerozvetvenej mastnej kyseliny alebo hydroxy-mastnej kyseliny s dĺžkou reťazca od 6 do 22 atómov uhlíka vrátane.
2. Lipopeptidy všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1, v ktorom R¹ znamená zvyšok kyseliny definovaný v nároku 1 s dĺžkou reťazca 10 až 20 atómov uhlíka vrátane.
3. Lipopeptidy všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1, v ktorom R¹ znamená zvyšok kyseliny definovaný v nároku 1 s dĺžkou reťazca 12,13,14 alebo 15 atómov uhlíka.
4. Lipopeptidy všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1, v ktorom R¹ znamená

a) zvyšok ÍC₁₃ mastnej kyseliny,

b) zvyšok iC|₄ mastnej kyseliny,

c) zvyšok aiC,₃ mastnej kyseliny alebo

d) zvyšok aiC₁₅ mastnej kyseliny.
5. Lipopeptidy všeobecného vzorca (I) podľa nároku

4, v ktorom R¹ znamená skupinu
6. Lipopeptidy všeobecného vzorca (1) podľa nároku

4, v ktorom R¹ znamená skupinu
7. Lipopeptidy všeobecného vzorca (I) podľa nároku

4, v ktorom R¹ znamená skupinu o
8. Lipopeptidy všeobecného vzorca (I) podľa nároku

4, v ktorom R¹ znamená skupinu o
9. Spôsob prípravy lipopeptidov všeobecného vzorca (I) podľa jedného alebo viacerých z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že sa baktérie druhu Actinoplanes fermentujú v kultivačnom médiu dovtedy, kým sa v tomto kultivačnom médiu nahromadí aspoň jeden tento lipopeptid, a tento lipopeptid alebo tieto lipopeptidy všeobecného vzorca (I) sa purifikujú z kultivačného média.
10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sa purifikácia uskutočňuje tak, že sa lipo11

SK 281830 Β6 peptidy vyzrážajú z kultivačného média použitím kyselín pri pH 0,5 až pH 4 vrátane, potom sa prípadne lipopeptidy získané zo zrazeniny prečistia chromatografiou na ionomeničoch alebo chromatografiou na hydrofóbnej matrici, pričom sa obe chromatografie môžu uskutočňovať alternatívne alebo následne v ľubovoľnom poradí.
11. Spôsob podľa nároku 9 alebo 10, vyznačujúci sa tým, že sa fermentujú baktérie Actinoplanes sp. DSM 7538.
12. Liečivo, vyznačujúce sa tým, že obsahuje aspoň jeden lipopeptid vzorca (I) podľa jedného alebo viacerých z nárokov 1 až 8 a prípadne farmaceutické nosiče.
13. Použitie lipopeptidu všeobecného vzorca (I) podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 8 na prípravu antibiotika proti gram-pozitívnym baktériám.
14. Použitie podľa nároku 13, kde baktériami sú baktérie rezistentné na glykopeptidy.
15. Actinoplanes sp. DSM 7358.