TW455591B - Lipopeptides from actinoplanes sp. with pharmacological action, process for their production and the use thereof - Google Patents

Description

455591 A6 B6 經濟部中夬標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（1 ) 本發明係關祕有細質祕基咖序但不顏肪酸 殘基（脂質部份）之脂壯類，其係於發酵期間，藉游動放 線菌種合成，並釋於培養基中；並關於自此培養基單離此 脂月太類及將其純化之方法；及關於此脂彳太類作爲藥理活性 物質之用途，特别是用以抵抗革蘭陽性細菌；以及關於產 生上述脂狀類之游動放線菌種DSM 7358。 得自微生物之次級代謝物，係成功地用於感染疾病之 治療上。次級代謝物爲低分子量化合物，其製造係發生於 與初級代謝作用分歧之、、生物合成單行道"上，且其對特 定製造者之功能爲未知。迄今，已知約8〇〇〇種次級代謝物 單離自不同微生物（尤其是鏈黴菌種之眞菌與細菌）之培 養物。 此等次級代謝物用途之主要範圍，係爲感杂疾病之治 療。但是，由於其廣泛使用，故不斷發展出抗藥性，以致 仍持績需要具有新穎作用機轉之新穎抗生素與活性物質 (Neu H.C” Science 257，1992,第 1064-1073 頁） 此外，關於微生物活性物質適應徵之範園，亦已擴大 至未包含在感染疾病中之疾病（例如，腫瘤治療，免疫調 節或關於脂質代謝作用之調節）及作物保護（除草劑與殺 蟲劑〉。但是，所採用之活性物質，仍經常伴隨著缺點， 其特徵是未令人滿意之作用程度、過量毒性及/或不期望 之副作用。 於文獻中描述之脂U類，其胺基酸内容物’在順序方 面係與根據本發明之脂舦類相同，或在胺基酸組成方面係 一請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210X297公逄1 455591 A6 B6

五、發明説明（2 } 經濟部中央標毕局爵工消"合作社印製 相同於或類似於根據本發明之脂狀類。但是，此等脂爿太類 基本上與根據本發明之脂Η類之不同點，係在其脂質部份 上。 如上述之脂Π類，其實例爲： -安弗黴素（Amphoxnycin)抗生素[J· Antibiotics,拙，第 517 頁（1965)}; -谷路馬徽素（Glumamycin〉iJ. Antibiotics，38，第 517 頁（1965)]; -沙歐黴素（Zaomycin〉iJ. Antibiot· Ann·，第 194 頁 (I960)); -阿斯巴多黴素（Aspartocin) (Antibiot. Ann·，第 I94 頁 (I960))； -拉斯巴多黴素（Laspartomycin) U· Antibiotics 21，第 55 頁（1968)J 。 此等脂狀類（稱爲安弗黴素型之脂狀類），係由鏈徵 菌種之微生物合成。其顯示抵抗革蘭陽性細菌（例如，麵 球菌、葡萄球菌及腸球菌）之抗菌活性。於最近，已註實 特别是葡萄球菌及腸球菌種之品系，係爲漸增問題之有機 體。熟練之研究者明瞭有問題之有機體，係爲目前爲不可 能有效控制之微生物，因其對習用抗生素（例如内醯 胺抗生素或糖U抗生素，譬如凡可黴素（Vancomycin )或 達可普蘭徽素（teikoplanin ))之抗藥性所致。 己發展抗藥性之一群微生物菌株，其實例包括對二甲 氧基苯青黴素具抗藥性之金黄色葡萄球菌菌株，簡寫爲

{請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁J .裝 .訂‘ 0 :線 本紙張尺度適用中國@家標準（CNS)<p4規格（210父297公发）

455591 A7 B7 五、發明説明（3 專利申請案第82110700號 ROC Patent Λρρίη. No.82110700 „ 中文説明書修正頁-附件(三） Amended Pages of the Chinese Specification ~Encl.(lD) 7" ' e(民因0年12只I，曰送呈) (Amended & Submitted on December , 1995) 經濟部中央橾準局負工消費合作社印製 MRSA菌株。目前已發現此等MRSA菌株，經常已發展出 不僅是對二甲氧基苯青黴素而且對其他抗生素（例如凡可 黴素）之抗藥性。 除了上述得自鏈微菌之化合物以外，亦已知一種得自 曰本游動放線菌ATTCC 3114S之化合物，由於其作用圖譜 及所述之物化性質，故其與根據本發明之脂轴類具有結構 類似性，並稱爲化合物41.〇12 (美國專利4,001，397 )。日 本游動放線菌ATCC 31145於各種培養條件下之發酵，總 是導致相對較低產率之化合物41.012。 本發明之目的’係爲尋找具有改良性質之微生物天然 物質。 此目的係推據本發明而達成，其方式是將游動放線菌 種，在具有碳來源與氮來源以及習用有機鹽類之營養溶液 中發酵’直到脂Μ類（較佳爲脂壯類Α Η37 )蓄積於培養_ 基中爲止’接著自培養基中單離出此脂駄類，及於適當情 況下，將此混合物分離成其個别成份。此脂壯類具有藥理 活性，及因而具有療效，並可作爲抵抗革蘭陽性細菌之抗 生素使用，較佳爲抵抗對糖壯具抗藥性之菌株。 因此，本發明係關於： Ob纟太類’其中係將游動放線菌種在培養基中發酵，直到 —或多種下式I脂壯類蓄積於該培養基中爲止，該式工 爲： -5 - 本紙張尺度適用中國闺家標準（CNS)A4il格（2丨0X297公漦} (請先閲讀背面之注意事項再填寫本莨) 訂 — - · a修正 455591 A7 3補充 B7 P^R2-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro 其中 R1爲一種具有6至22 (内含）個碳原子鏈長之單或多 未飽和，飽和或其獨立情況之分枝或未分枝脂肪酸或 m基脂肪酸， 及 R2 爲 Asp 或 Asn， 於適當情況下，自培養基中純化一或多種式I脂奴類， 但下式I脂U則除外，其中 (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) ^ 訂 R1爲 經濟部中央標準局員工消費合作社印装

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II 〇 及 R2 爲 Asp。 么脂U類，其中係將游動放線菌種在培養基中發酵，直到 得自下列族群之一或多種脂壯類蓄積於該培養基中爲止， 該族群爲： a) iC 丨 3-脂防酸-^ρ-Ε^ΙτΡΐρ-ΜοΑΒρ-Αερ-Μγ-Αερ-ΟΙγ-Ι^Ιί-νβ^ΡΓο L-------~~.___ b) iC】4-脂肪酸-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Va 卜 Pro 1-------1 c) iCi3-腊肪酸-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Va 卜 Pro *----*--—~~-4 d) iCi4-脂肪酸-Asn-Dab-P ί P-Me Asp-Asp-G 1 y-Asp-G 1 y-Dab-Va 1 - Pro ------1 e) aiCi3-脂肪酸-Asi^Pab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro -6 本紙張尺度適用中國圉家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4 5 5 5 9 1, A7 B7 五、發明説明（ 專利申請索第82110700 ROC Patent Αρρίη. No. 82110700 中文説明書修正頁-附件(_

Amended Pages of the Chinese Specification-Encl. (HI) (民国86年8月18日修正並送呈） (Amended & Submitted on August 18 ,1997) f) aiCi5_ 脂肪酸-Asp-Dgib-P〖p.-McAsp~Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-VahPi|〇 g) aiCi5~脂胺酸-Asn-DalrPip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab~Val-Pro於適當情況下，自培養基中純化一或多種此等脂壯類。 &式ϋ脂a類， R^-^-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro It其中 R-

Asp C' IIο —l·-------4丨 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 或

Ri Cπo R2 = Asp或 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Π3 fl ^ ~~~ Asn或 R2 = Asn C IIo

cu0 本紙張尺度適用中國國家襟準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐） 455691 五、發明说明（ 或 A7 B7 P-j ^ R2 = Asn 或 = R2 = Asp 或 f^2 = Asn

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c IIο c SIο (請先閲讀背西之注意事項戽填寫本X) -νβ 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 4, 或多種如1中定義之式Ϊ脂力太類，一或多種如2中定 義之脂臟’或-或多種如3中定義之式们旨賴之製 法，其包括將游動放線_種在培養基中發酵，直到一或 多種脂Π類蓄積於培養基中爲止，於適當情況下，自培 養基中純化一或多種脂駄類。 5. 式I脂u類作爲禁理活性物質之一項用途，特别是作爲 抵抗革蘭陽性細菌之抗生素，特佳爲抵抗對糖U具抗藥 性之細菌。 上式ΠΙ脂狀 Rl~R2-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-val-Pr〇 冚 其中 ^ R1 爲 II 0 本紙張 A4规格（210X297公釐） 4555 9 A7 B7 修if 牛月 日彳夕'u·、 84.12. 1 3^J Κχ 五、發明説明（7 及 R 爲 Asp 作爲藥理活性物質之用途，特别是作爲抵抗革蘭陽性細 菌之抗生素，特佳爲抵抗對糖壯具抗藥性之細菌。 7.游動放射菌種DSM 7358。- 本發明係詳述於後文，尤其是詳述於其較佳具體實施 例中。本發明係藉申請專利範園之内容進一步界定。 術語之定義： 、 _ Dab意謂2,3-二胺基丁酸； "Ηρ意謂六氫卟啶羧酸（同意字==高脯胺酸）； - MeAsp意謂乃_甲基天門冬胺酸酯； 'G1y意謂甘胺酸； -Asn 意謂天門冬醢胺； —Asp 意謂天門冬胺酸； -Val意謂胺基異戊酸及 Pro 意謂鋪胺酸。 縮寫1代表”異夕，然而，/ ai /，則意謂夕前異,，。 此等定義係爲熟練研究人員，在脂肪酸類之文脈中所習知 者（生物化學’ Zubay，魏敦，阿姆斯特丹，由Addis〇n Wesley 發行，1983 )。 . 除非另有指明，否则所有百分比數據，均與重量有關。 除非另有述及’否則液體之混合比，均與體積有關。 .. 根據本發明之方法，可祕實驗室規模（毫升至升範 _ 園）及用於工業規模（立方朱規模）之發酵。 '本紙張尺度適用 ---：____ y _ 455591 A6 B6 經濟部中央標準局W工消贽合作社印11 五、發明説明（8 ) 游動放線菌種係單離自一種土壤試樣。關於得自此土 壤之純化，係使用一種生理NaCl溶液（〇.9% )，將此土 壤懸浮，其中係製備一系列稀釋液。隨後，將各種稀釋液 (10G-106 )覆蓋在放線菌營養基上。將此培養物於30 eC 下培養2至14天，造成放線菌菌落，可將其覆蓋在平板上， 並藉多項連續純化步驟進行單離。 菌種測定，係以形態學及分類學準則爲基礎，使用熟 諳此藝者已知之方法進行，此游動放線菌種之獨特特徵爲 可游動孢子。 在以連績單離及純化步驟爲基礎下，可自游動放線菌 種中單離出一種菌落，此菌落係極有效地释出一或多種根 據本發之脂壯類化合物，較佳爲脂肽類A 1437 A，B,C，D,E， F，G及/或Η，進入培養基中，並稱之爲主要製造者。 此主要製造者係爲對一種單離物所賦予之名稱，該單 離物會產生或釋出一或多種根據本發之脂壯化合物，進入 培養基中，其產生量爲該相同游動放線菌種單離物之10至 100 倍。 將一種強烈產生之游動放線菌種菌落，加以繁殖。一 種單離物係放置在 Deutsche Sammking von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg IB, 3300 Braun-schweig，Germany，根據1990年6月18日布達佩斯條约之 規則，將其安排在下列編號下： 游動放線菌種DSM 7358。 游動放線菌種DSM 7358具有一種橘色菌絲體，且其 本紙張尺度適用中H凼家標毕（CNS)甲4規格[210x297公釐) 1 ° " ......................................................................... 裝......................訂............................線 <請先閲讀背面之注意事项再填寫本頁1

455591 經濟部中央標準局員工消t合作社印製 A6 ' _________B6______ 五、發明説明（9 ) 特徵爲球形抱子囊。 於一種含有碳來源與氮來源以及習用無機鹽類之營養 溶液（亦稱爲培養基）中，游動放線菌種（較佳爲DSM 7358 )會產生一或多種根據本發明之脂戕類化合物。 亦可替代DSM 7358菌株，採用其突變種及變種，其 可合成一或多種根據本發明之脂釉類化合物。此類型之突 變種’可以本身已知之方式，藉物理方式產生，例如照射， 譬如使用紫外線或X-射線’或化學突變劑，例如，甲垸磺 酸乙酯（EMS )，2_羥基_4_甲氧基二苯甲酮（M〇B ) 或N-曱基f -硝基_N_亞硝基胍（丽NG )。 關於合成一或多種根據本發明脂戕類化合物之突變種 與變種之篩選，係根據下列綱要進行： -於發酵後，移除菌絲體； -此脂狀類於pH 1至2 ( 4)下之沉殿； -此沉澱物之溶SH20/Me0H ( 1:1 )中； -藉HPLC，TLC或抑制區域試驗之分析。 後文所述之發酵條件，係應用於游動放線菌種，存放 之單離物DSM 7358，及其突變種及變種。 於一種含有碳來源與氮來源以及習用無機鹽類之營養 溶液中’游動放線菌種（較佳爲DSM 7358 )會產生一或 多種根據本發明之脂壯化合物，但較佳爲脂壯類A 1437 A_ Η ° 供需氧性發酵用之適當與較佳碳來源，係爲可同化碳 水化合物，及糖醇類，例如葡萄糖，乳糖或甘露醇，以 本紙張尺度適用中國國家標觇格（210X 297公釐)"""汁1 " —--- t請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) .裝 訂. '線. 經濟部中央標準局員工消伢合作社印製 ^55591 Α6 ___ Β6 五、發明説明（10 ) 及含碳水化合物之天然產物，例如，麥芽萃取物。適當含 氮營養物爲：胺基酸類，U類及蛋白質類，以及其分解產 物，例如蛋白料或胰蛋白酹水解棘，另外爲肉萃取物，種 子粉，例如玉米、小麥、豆類、大豆或棉花植物，得自醇 製造上之蒸餾殘留物，肉粉或酵母萃取物，或者銨鹽及硝 酸鹽。此營養溶液中可含有之無機鹽類爲例如鹼金屬或鹼 土金屬、鐵、鋅、鈷及短之氣化物、碳酸鹽、硫酸鹽或碑 酸鹽β 根據本發明之脂壯類，其製造係特别良好地發生在一 種營養溶液中，其中含有約0a至5%，較佳爲〇 3至2% 肉萃取物’ 〇.2至將，較佳爲Ο』至狹蔗糖，〇 〇5至5 克/升，較佳爲G.1至Q·5克/升酵母萃取物，0.05至2 克/升，較佳爲0.1至1克/升硫酸鐵，〇 〇5至1〇克/ 升，較佳爲0.1至1克/升二氫磷酸鉀或鈉，及q至1〇〇 /Z Μ ’較佳爲5至2〇μΜ氣化鐵（)。百分比數據，於 各情況中均以全部營養溶液之重量爲基準。 於此營養溶液中，游動放線菌種，較佳爲游動放線菌 種DSM 7358，會產生根據本發明之脂戕類混合物。此混 合物較佳係由8種不同的可測得之脂肽類所組成。此等脂 月太類已％爲A,B，C，D,E，F，G及Η。其具有下列特性： {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝‘ 訂 本紙張尺度通用中國國家標準丨CNS)〒4规格（210x 297公楚）

分子量 1290 1304 1289 1303 1290 1289 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ο 84· !2. i 3補充 45 55 9 1 α7 Β7

五、發明説明（W 名 稱 R!/R2 分子量 A 1437 G R1 1318 = Asp CII 0 A 1437 H R. 1317 ~ Asn CII 0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -0 經濟郎中丸fpt -14 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消"合作社印级 4 5 5 5 9 1 A6 __B6_ 五、發明説明（13 ) 月g月太A 1437 A ( A 1437 C亦然〉係含有一種異-脂肪酸，迄今仍未知其係在安弗黴素型之脂彳太類中β A I437 A之胺基酸順序，係相應於安弗黴素之胺基酸順序， 但是其含有一種前-異-C13-脂肪酸。a 1437 C之胺基酸組 成與順序，並未得知自其他脂壯類。 A 1437 B ( A 1437 D亦然）係含有一種異-Cl4型脂 防酸’且因而是得知自津枝黴素（tsushimycin )之脂脉酸。 但是，A 1437 D與迄今已知自先前技藝之脂壯類，其不 同點在於其胺基酸组成與順序，而Α μ37 b則含有安弗 黴素之胺素及津枝黴素，於胺基酸組成中均相同。

得自游動放線菌種（特别是得自游動放線菌DSM 7358 )之A I437 E，係與已知得自鏈黴菌之安弗黴素相 同。 A I437 F包含一種前-異_Cl3_脂肪酸，因此含有與已 知得自安弗黴素相同之脂肪酸型式。其胺基酸順序與組成 並未得知自先前技藝。 脂壯類A I437 G與Α Η37 Η各具有（阿斯巴多黴素 亦然〉一種前-異-C1S-脂肪酸。a Μ” 〇之胺基酸順序， 係相應於安弗黴素之胺基酸順序，而A乜37 η之順序與 組成’未得知自先前技藝。 脂肽類A 1437 Α至Η，均具有一種鏈結，由〇未端 脯胺酸之羧基官能基，至位於胺基酸末端之Dab之乃—胺 基官能基。此鍵結係以L--1 #表示。 自一或多種根據本發明脂壯類之量之觀點見之，其内 '氏張A度-適用节固國家反和哪…規格（2冗^7公變）_15一 ------ ί請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝 訂 455591 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A6 B6__. 五、發明説明（I4 ) 容物可依營養溶液之組成而定》此外，可藉培養基之組成， 控制個别脂狀類之合成，以致此微生物不會只產生一種脂 月太，或以低於债測範園之量產生。 得自游動放線菌種（較佳爲DSM 7358 )之培養基， 含有脂壯類，其具有單或多未飽和，飽和，或其獨立情況， 分枝或未分枝脂肪酸或羥基脂肪酸，其具有之鏈長爲6至 找（内含）個碳原子，較佳爲1〇至2〇 (内含）個竣原子， 特佳爲I3，Η或1S (内舍）個碳原子。 此等型式之脂肪酸爲熟諳此藝者所已知，例如得知自 R0mpp Chemie Lexikon，Falbe 敎授與 Regitz 敎授，第 9 版， Georg Thieme Verlag Stuttgart，紐約，或得知自化學百科 全書 ’ C_A. Hempel 與 G.G. Hawley，第 3 版，Van Nostrand ReinhoId 公司，紐約。 下列脂肪酸清單，僅爲舉例，並非聲稱係爲其完全描 述，且並非表示其限制。 於根據本發明脂u類上之飽和未分枝脂肪酸，其實例 爲己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、 —酸、月桂酸、十 三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕搁酸、十七酸、硬脂酸、十 九酸、花生酸及二十二酸。 於才艮據本發明脂U類上之飽和分枝脂肪酸，其實例爲 異丁酸或異戊酸，或呈"前-異，/構型之相應酸類。 於根據本發明脂壯類上之單未飽和未分枝脂肪酸，其 實例爲丙烯酸或巴豆酸。 於根據本發明脂肽類上之雙未飽和未分枝脂肪酸，其 :. '丨.η ......................-..................................Κ-----------------------------------------裝.....................訂........................：¾ (諳先閱讀背面之注意事項再填寫本頁一 455591

五、發明說明（ls ) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 實例爲花楸酸》 於根據本發明脂U類上之參未飽和未分枝脂肪酸，其 實例爲亞麻脂酸或油硬脂酸。 於根據本發明脂肽類上之四重未飽和未分枝脂肪酸， 其實例爲花生四歸酸。 於根據本發明脂牡類上之五重未飽和未分枝脂肪酸， 其實例爲鯡油酸。 於根據本發明脂壯類上之六重未飽和未分枝脂肪酸* 其實例爲廿二碳六婦酸。 對此脂狀類而言，更可能是具有多重分枝之脂肪酸， 例如2,4,6，s-四甲基癸酸，發生在此培養基中。 於根據本發明脂粘類上之羥基脂肪酸，其實例爲在位 置2與3及/或在碳鏈末端被麟基化且具有"異或"前-異’構型之脂肪'酸。 在將0.01至S%，較佳爲0.〇2至0.1% L-胺基異戊酸， 加入上述營養溶液中時，游動放線菌種係優先產生脂/}太類 A 1437 Β與D。在將〇·〇1至5%，較佳爲0.1至0,5%L-白胺酸，加入上述營養溶液中時，游動放線菌種係優先產 生脂U類A 1437 A與C。在將0_〇1至跡，較佳爲〇.〇5 至0.5%L-異白胺酸，加入上述營養溶液中時，游動放線菌 種係產生特别是脂U類Α Η37 E，F，G及Η。以相同方式 應用至較佳菌株DSM 7358。 除了此等胺基酸外，亦可採用適當濃度之L-正胺基異 戊酸與L-α-胺基丁酸，以及相應於該胺基酸之oc-酮基酸 ---------- 本纸張尺度適用中國S家標準丨CNS)甲4規格1210x297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝 .訂. ο 線… 455591 A6 B6 經濟部中夬標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（16 ) (〇ί-酮基異戊酸酯，α_酮基異己酸酯，α_酮基_乃_甲 基-戊酸酯’ α-酮基戊酸酯>，或其相應酸類（異丁酸酯， 異戊酸酷，α —甲基丁酸酯，正-丁酸酷，丙酸酯，戊酸酯） ，或其他可介入脂肪酸生物合物合成之物質。 此微生物培養作業係以需氧方式進行，意即例如，浸 沒在振盪燒瓶或發酵器中，並振爱或檀拌，於適當情況下， 並引進空氣或氧氣。其可在約ls至35亡溫度範園中進行， 較佳是在約25至35亡下，特别是在28至32亡下進行。 其PH範園應在e與s之間，較佳是在6 5與a之間。此 微生物一般係在此等條件下，培養24至3〇Q小時，較佳爲 36至140小時。 此培養作業可有利地以數個階段進行，意即首先在液 體營養培養基中製備一或多個預培養物，然後以例如1:1〇 之體積比，將其轉移至實際製造之培養基中，以獲得主要 培養物。獲得此預培養物之方式，例如，將一種菌絲體轉 移至營養溶液中，並使其生長约36至小時，較佳爲妨 至72小時。此菌絲體可以下述方式獲得，例如，在一種固 體或液體營養培養基上，例如酵母-麥芽瓊脂或營養肉湯 瓊脂（供微生物用之標準培養基，其主要成份爲蛋白n， 氣化鈉及瓊脂，例如由Difco供應）。 其發酵程序可以此培養物之pH値或菌絲體之體積爲 基礎，進行監測’以及藉層析方法監測，例如，薄層層析 或高壓液相層析或測試其生物活性。此菌絲體與体養物過 濾物，均含有根據本發明之化合物，但大部份（> 卯％ ) I紙孟_尺度適用中國g家標準（CNS) ΐ4规格（210X 297公没)~ 1C '~~~~- {諳先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 裝 訂 4555 9 1 A6 B6 經濟部中央標準局g工消许合作社印鼓 五、發明説明（l7 ) 係位在培養物過遽物中。 後文所述之單離程序，係用以純化根據本發明之脂月太 類’但較佳係對脂狀類Α Η37 a-H而言。 得自培養基之根據本發明脂壯，其單離或純化，係考 慮天然物質之化學、物理及生物性質，藉已知方法進行。 於培養基中或於個别單離階段中，抗生素濃度可藉薄層層 析測試，例如於石夕膠上使用異丙醇us%濃度Nh3作爲移 動相，或藉HPLC測試。在藉薄層層析進行分餾時，其偵 測可藉例如顏色試劑（例如對-甲氧基苯甲醛）進行，於 此情況中，最好將所產生的物質之量，與校準溶液作比較。 爲單離根據本發明之脂耿，係首先藉習用方法，將菌 絲體與培養肉湯分離，接著調整（較佳是在4。〇下）此培 養物遽液之pH値’從pH 0·5至pH 4 (内舍），較佳係 從pH 1.5至pH 2.5 (内含）。此pH値之調整，且因而 是脂月燦Λ 1437之沉澱，可使用所有市購可得之酸類進行。 將此溶液培養至高I6小時，較佳爲至高4小時，接著藉離 心移除所形成之沉殿物。 將含有所有脂狀類之沉澱物，再懸浮於最初體積1/20 之二次蒸餾水，並使用NaOH調整至ρΗ 6至7。這會造 成殿物完全溶解；將此溶液冷卻至_2〇。(0並;東乾。此康 乾物，後文稱爲粗產物，係舍有5至3〇%脂胲類，並用於 隨後之單離中。 、 一或多種根據本發明之脂狀類，其進一步純化係於適 當物質上藉層析進行，較佳係在例如發膠、氧化紹、離子 ------ 本紙張尺度通用中國國家標準…邶）甲4規格 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 訂. 丨線. 4555 9 A6 B6 經濟部中夹檩芈局員工消赀合作社印製 五、發明説明（18 ) 交換劑或吸附劑樹脂上，及極特佳係在強或弱鹼性陰離子 交換劑上進行°含有Asp或Asn作爲位在其胺基末端之胺 基酸之脂壯類，係藉此層析分離。此脂壯類之層析，係使 用緩衝水溶液或含水與含醇溶液之混合物進行。 緩衝水溶液係意謂水’鱗酸鹽緩衝液，醋酸銨，檸樣 酸盤缓衝液’棚酸鹽缓衝液，其濃度爲〇至1M ’較佳爲1 至lOOmM，且特佳係採用具有濃度爲1至1〇〇mM之磷酸 鹽缓衝溶液。 含水或含醇溶液之混合物，係意謂所有可與水互混之 有機溶劑’較佳爲甲醇、乙胩，其濃度爲1〇至祕溶劑， 較佳爲4〇至6〇%溶劑，或者爲可與有機溶劑互混之所有 緩衝水溶液。欲使用之缓衝劑，均與上述相同。 此脂Π類在以其不同脂肪酸爲基礎下之分離，係藉助 於逆相層析進行，例如在MCI ® (得自曰本三菱公司之吸 收劑樹脂）上進行。於疏水性材料上之逆相層析，較佳爲 即_8或RP-1S相層析，係爲特佳者。此外，此分離作業可 藉助於矽膠層析進行。 此脂壯類之層析，係使用經緩衝或經酸化水溶液，或 水溶液與醇類或其他可與水互混之有機溶劑所形成之混合 物進行。較佳係使用乙料作爲有機溶劑。 經緩衝或經酸化水溶液，係意謂例如水，磷酸鹽緩衝 劑’醋酸銨，檸檬酸鹽緩衝劑，硼酸鹽緩衝劍，其濃度爲 0至〇·5Μ，以及甲酸、醋酸、三氟醋酸或熟諳此藝者已知 _ 之所有市購可得之酸類，其濃度較佳爲0至1%，特隹爲〇. ^^^®^S?TC^4^(210X297^^I—糾- (諳先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -裝 .訂· 〕線 455591 A6

i^發明說明（19 ) 經濟部中央桴爭功員工消"合作社印奴 n 層析係以梯度進行，以100%水開始，並以1〇〇%溶劑 結束，且較佳係採用4〇至6〇%乙/}音之線性梯度。 此兩種上述層析之順序（層析以分離根據胺基酸Asp 或Asn及根據脂肪酸型式之脂壯類），可對調。較佳係在 第一個步驟中分離根據不同胺基酸之脂駄類，且隨後僅根 據脂肪酸型式分離之。 若上述粗製產物含有具有均句脂肪酸之脂狀類，則前 述層析（以不同脂肪酸爲基礎，分離腊壯類）係用於該脂 月太類之脱鹽作用及進一步純化。 另一種可行式爲凝膠層析或於疏水相上之層析。 凝膠層析係於聚丙烯醯胺或混合聚合體凝膠上進行， 例如，Bioge卜P2 ⑰（由 Biorad 供應）或 Fractogel TSK HW 4〇® (由德國Merck或美國Toso Haas供應）〇 根據本發明之脂壯類’於固態中及於pH範園在4與8 之間（特别是5與7之間）之溶液中很安定，因此，可摻 入習用醫藥配方中。 根據本發明之一或多種脂収類化合物，由於其有價値 之藥理性質，故適合作爲醫禁使用β 根據本發明之物質’具有藥理活性，特别是作爲抵抗 革蘭陽性細菌之抗生素，特佳爲抵抗對糖狀具有抗藥性之 菌株。 對於具青黴素-或二甲氡基笨青黴素_抗藥性之菌株 (MRSA菌株）（其已發展出對抗生素之進一步抗藥性） {請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁} -裝 訂 *線- 家標準（CNS丨甲4规格（210 X29 7公釐） 45 5 5 9 經濟部中央標毕局員工消t合作社印製 Α6 Β6 五、發明説明（2〇 ) 一種治療上適當作用，經常僅藉糖壯進行’例如凡可黴素 或達可普蘭黴素。但是，甚至對此等抗生素具有抗藥性之 菌株’顯示正逐漸增加（FEMS Microbiol. Lett 109至 11〇。根據本發明之一或多種脂壯類化合物，亦具有抵 抗此等成問題的有機體之優越作用。 本發明亦關於根據本發明一或多種脂壯類化合物之醫 藥配方。 原則上可將根據本發明之一或多種脂壯類化合物進行 投禁，較佳爲以本身未經稀釋之一或多種脂壯類厶1437 A_ Η化合物進行投藥。與適當輔助物質或載體物質，呈混合 物形式使用係爲較佳者。可於獸醫藥物之情沉中使用之载 體物質，係包括習用飼料混合物，而於人類情況中，係包 括所有藥理上可相容之載體物質及/或輔助物質。 根據本發明之醫藥，通常係以口服或非經腸方式進行 投禁，但直腸用途原則上亦是可能的。適當固態或液態醫 藥形式之實例，係爲顆粒、粉末、片劑、塗層片劑、（微） 膠囊、栓劑、糖漿、乳液、懸浮液、氣溶膠，呈安瓶形式 之滴劑或可注射溶液，以及具有延期釋放活性物質之產物， 於其製造上，一般係使用媒質與添加劑及/或輔助劑，例 如崩解劑、黏結劑、塗制、膨麵、滑賊潤滑劑、墙 味劑、增甜劑或助溶劑。常被使用且可提及之媒質或輔助 物質’其實例爲竣酸鎂、二氧化鈥、乳糖、甘露醇及其他 糖類、滑石、乳清蛋白、白明膠、澱粉、維生素、纖維素 及其衍生物，動物或植物油，聚乙二醇類及溶劑，例如鼻 <請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 ..一叮. 本紙張尺度適/fl中目目家標準丨咖丨格丨^ 455591 A6 B6 經濟部中央樣準局Μ工消费合作社印製 五、發明説明（21 ) 菌水、醇類、甘油及多鲽醇。 在對劑量單位適當之情況下，可經微包膠以供口服投 蔡用，以延遲釋放或使其延長較長時間，例如，將呈微粒 子形式之活性物質，以適當聚合體、碟類等塗佈之，或埋 藏於其中β 此醫藥產物較佳係以劑量單位製造與投葯，其中各單 位係含有特定劑量之根據本發明之一或多種脂壯類化合物， 作爲活性成份》於固態劑量單位（例如片劑、膠囊及栓劑） 之情況中，此劑量可至高爲每天約2〇〇毫克，但較佳爲約 〇·1至100毫克，而在呈安瓶形式之注射溶液之情況中，係 每天可至高爲2〇〇毫克，但較佳爲約0 5至100毫克。 欲投予之曰服劑量，係依哺乳動物之體重、年齡、性 别及症狀而定。但是’在一些情況中，較高或較低日服劑 量，亦可能是適當的。日服劑量之投葯，可以下述任一種 方式進行，以單一劑量單位或者多個較小劑量單位之形式 進行一次投葯，以及在特定時間間隔下，以分割劑量進行 多次投葯。 根據本發明之醫葯係以下述方式製成，使用習用媒質， 以及於適當情況下使用添加劑及/或辅助物質，將根據本 發明之一或多種脂U類化合物，轉化成適當劑量形式。 本發明係於下述實例中進一步解釋。百分比數據係與 重量有關。除非另有述及’否則液體之混合比，係與體積 有關。 實例 <請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁> .裝 ..訂. --線- 本紙張尺度適用中园國家檑準規格(7^^297公釐）-23^ 455591 A6 B6 經濟部中央標毕局員工消赀合作社印製 五、發明説明（22 ) la) 游動放線菌種DSM 73邱之甘油培養物之製備： 於一個無菌3〇〇毫升錐形瓶中，將100毫升營養溶液 (4克/升酵母萃取物，15克/升可溶性澱粉，1克/ 升 K2HP〇4,〇.5 克 / 升 MgS〇4 X 7H20，以水補充至 1000 毫升，於殺菌之前pH値爲7.0 )，以游動放線菌種 DSM 7358接種，並於30。〇及150rPm下，在旋轉振盪器 上培養7天。接著將I.5毫升此培養物，以2.5毫升80% 濃度甘油稀釋，並儲存於-20 1Q下。 lb) 游動放線菌種DSM 7358在錐形瓶中之培養物或預培 養物之製備： 一個無菌3〇〇毫升錐形瓶，其中含有1〇〇毫升下列營 養溶液：30克/升蔗糖，2克/升KNOs，1克/升 K2HP〇4，0.5 克 / 升 MgS04 X 7Η2〇，0.5 克 / 升 KC1， 〇.〇1克/升FeS〇4 X 7H20，2克/升酵母萃取物，5 克/升蛋白0，將其以一種在斜管中成長之培養物（相 同營養溶液，但使用2%瓊脂）接種，或以1毫甘油培 養物（見實例la )接種，並於l8〇mp與3〇 °C下，在振 盪器中培養。根據本發明之一或多種脂U類化合物，其 最大產量係於約12〇小時後達成。一種得自此相同營養 溶液之48至96小時大之浸沒培養物（接種體約10% )， 係足以接種10與200升發酵器。 2)游動放線菌DSM 7358之比較特性： 籍 Shilling 與 Gottlieb ISP 方法（1)!1:.1.。{375· Bacteriol. lj，3(1966) 313 至 34〇 )，經由與密切相關之 {請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝_ -訂 :¾ 各紙張尺度適用中® ®家標準丨CNS)甲4规格〔210乂 297公釐1 A6 B6 Λ砂9' 五、發明説明（23 ) 菌株作比較，以顯示游動放線菌種DSM 7358之特性。其 結果（見表1 )顯示游動放線菌種DSM 7358，於形態學 上及其生理學上，與其他菌株不同。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消贽合作社印製 本紙張尺度適用中國凼家標準（CNS;甲4规格（210x297公釐） 4555 9 1 A6 B6 五、發明説明（24 ) 表1 : 經濟郏中央標準局員工消t合作社印製 游動放線菌種 游動放線菌種 游動放線菌種 游動放線菌種 DSM 7358 NRRL 12052 ATCC 25844 ATCC 311455 氣生菌絲體 - - + (ISP 3) - 孢子嚢 + + + + 培養基 ISP 2 橘紅 橘紅 橘黄 橘紅 ISP 3 橘紅 橘紅 橘黄 橘紅 ISP 4 橘紅 橘紅 橘黄 橘紅 ISP 5 橘紅 橘紅 橘黄 橘紅 ISP 6 橘紅 橘紅 橘黄 橘紅 紅 紅 紅 紅 外表色素 外表色素 外表色素 外表色素 黑色素 — 一 (+ ) (+) 葡軔糖 + + + + 阿拉伯糖 + + + + 蔗糖 + 十 + + 木糖 + + (+ ) 肌醇 + 十 (+ ) (+) 甘露醇 + 十 + 果糖 + + + - 鼠李糖 + + + 十 植物蜜糖 + 十 (+ ) - 纖維素 + + (+ ) - 蜜二糖 - - 苦杏仁苷 - + + + 白明膠 (水解） + + + + 檸檬酸鹽 (水解） 十 屎素 (水解） 十 精胺酸 水解直每 + 偏 - - /?-半乳糖苷1每 - - - - 色胺酸西每 - - - - 離胺酸 脱羧百每 + - - - 3-羥丁酮 (形成） + + + + 口引口朵 (形成） - - - - H2S(形成） - - - - NaCl容許性 0-2.5% 0-2.5% 0-2.5% 0-2,5% (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 訂. 本纸張尺度適用中Β固家標準（CNS)甲4规格（210X297公釐） 455591 經濟部中央標準局員工消伢合作社印製 A6 B6_ 五、發明説明（25 ) 3a)脂U類A I437 B與D之製備： 將一個500升發酵器下列條件下操作： 營養培養基·· 11克/升蔗糖 6克/升肉萃耳又物 0.3克/升酵母萃取物 0.6 克/升 MgS04 0.1 克/升 ΚΗ2Ρ04 10 α μ FeCl3 X 6H20 0.6克/升L-胺基異戊酸 pH 7·3 (於殺菌之前） 培養時間：120小時 培養 溫度： 30 擾掉速度：50rpm 充氣： 150升/分鐘 可藉不斷添加舍乙醇多元醇溶液，以抑制起泡作用。 於約％至120小時後，達最大產量。 於完成游動放線菌種DSM 7358之發酵後，藉添加約2 %過濾助劑（例如Celite ® )，過濾此培養基，並將此培 養濾液冷卻至4 °C，及調整至pH 1.5。於4小時後，將混 合物於10,0G0克重力下離心，再將沉澱物再懸浮於蒸餾水 中。此懸浮液之中和作用，造成該物質形成溶液。將後者 冷漆並漆乾。其產量爲約I·5克/升粗產物（=75〇克）。 3b)粗產物（含有B + D )藉離子層析之分級分離： (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝 線. 本紙張尺度適用中國®家標芈（CNS)甲4規格（210x297公釐） 4 5 5 5 9 1 A6 B6 經濟部中夬標準局員工消"合作杜印製 五、發明説明（26 ) 於3·2升層析管柱（10公分内徑X 4〇公分高度）中， 充填 DEAE-® Sepharose Fast Flow，並以 10mM 鱗酸卸缓 衝劑（pH 7.0,於40%甲醇中）（缓_ A)達成平衡。 然後將已溶於3.5升水中之25克A 1437 B粗產物（如在 實例3a中所得者），裝塡在此管柱上，並以1升水，及接 著以6升緩衝劑A洗滕。於此粗產物中之雜質，係存在於 流動通道中及於含水洗液中。接著，採用從1〇至lOOmM 磷酸鉀（pH 7.0，於40%甲醇中）之梯度。a 1437 d月太 係使用25至35mM磷酸鉀溶離，而抗生素A 1437 B係使 用4〇至SSmM磷酸鉀而得。將甲醇於眞空中自適當溶離份 中移除。使用具有1升容積之® Dianion HP_2〇管柱（日 本三菱），以進行脱鹽作用。現在，將含有純B狀之9升 溶離份，裝填在此管柱上，接著以3升去離子水洗滌。藉 梯度方法使用水/異丙醇（0至50%醇含量），進行溶離。 使用I5至25%異丙醇，將純A I437 B洗離擔體。個别收 集得自管拄之此種溶離物，於眞空中濃縮並凍乾。其結果 爲具有97%純度之4.8克A 1437 B。含有A 1437 D之溶 離份，其相應之脱鹽作用，係產生3.1克此抗生素。純度 98% 〇 如）脂壯類A I437 A與C之製備： 按3a所述進行製備，惟以4克/升L-白胺酸替代製 造媒質中之L-胺基異戊酸，並在5〇升生物反應器中進行 發酵。產量爲1_3克/升粗狀（==65克）。 4b)脂壯類A I437 A與C之單離： 本紙张尺度通用中围標準（c邶）甲4规格（21〇 X 公釐)~~-·2ΰ^ —---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝 .訂 ^ 455591 A6 B6 ®濟部中央標準局'*工消#合作社印製 五、發明説明（27 ) 將10克粗產物溶於100毫升蒸餾水中，並根據下文所 示綱要進行處理。 處理綱要： 10克粗壯，於100毫升蒸餾水中 Φ 吸附在快速流動Q-遭脂糖上（由Pharmacia供應）（5 X 2〇公分管柱）小 使用下列梯度液溶離： 緩衝劑 A : NaH2P04 ImM，於 50% 甲醇中，PH5.9 缓衝劍 B : NaH2P04 100mM，於 50% 甲醇中，PH5.3 2〇分鐘：缓衝劑A ;於60分鐘内至25%緩衝劑B，進一 步在25%緩衝劑B下30分鐘；小 A 1437 A與C溶離份之凍乾，並溶解於移動相中 在由Biorad供應之Biogel P2 ( 100-200網目）上進行脱鹽 (7 X 2〇公分管拄） 1.6克脂壯A 1437 A ( 80%純度） 1.2 克脂U A 1437 C ( 80% 純度） 於Nucle。sil⑬C18 ( 7微米）上之JRP層析 (2〇 X 25〇毫米管柱，裝塡2〇0毫克） _^_ 本紙張尺度適用中囤國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐） 一請先閱讀背面之注意事項再填窝本頁) .裝 .訂. 一線 455591 A6 B6 五、發明説明（28 經濟部中央標準局員工消赀合作社印^ 使用下列梯度液進行溶離 缓衝劑：二次蒸餾水， 0.1%TFA 缓衝劑：乙月青 10分鐘：緩衝劑B ~>於60分鐘内至90%缓衝劑B，流速 爲1〇毫升/分鐘小 小 A I437 A與C溶離份之凍乾 150 毫克 A 1437 A (純度>95% ) 154 毫克 a 1437 c (純度>95% ) 如）脂戕類a 1437 E，F，G及Η之製備： 按實例3a中所述進行製備，惟藉i·5克/升L-異白 胺酸，替代製造培養基中之L-胺基異戊酸，並於5〇升生 物反應器中發酵。其產量爲I.4克/升粗壯（7〇克）。 Sb)粗壯藉離子層析之分級分離： 將25克按實例如中所得之脂社粗產物，於實例3a中 所述之管柱上，相_據實例Sa進行分級分離。 將脂U A 1437 F (產量：1>8克），以14至i9mM緩衝 劑進行溶離， 將A I437 E (產量：玉3克），以ig至缓衝劑溶離， 將A Μ37 η (產量：2 7克），以邡至即以％緩衝劑溶雜， 將A 1437 G (產量：I·9克），以Q至82mM缓衝劑溶 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) -裝 '訂 " A6 B6 455591 五、發明説明（29 ) <請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 離。 合併相應之溶離份，並於眞空中移除甲醇。 5c)將得自實例Sb之成份，於逆相rp-18上純化： .裝 於具有5〇0毫升容積之預備HPLC管柱（5.1公分（ID) X 25 公分 Η )中，充填® LichrosorbG RP-18 ( 10 微米）， 並將含有I.9克抗生素A I437 G之舍鹽溶液裝填於其上。 溶離係藉梯度方法進行，使用5%乙踐（在10mM麟酸鉀 缓衝劑中，pH 7.0 )，至沘％乙月音（在lOmM磷酸鉀緩衝 劑中，pH 7.0 )。脂狀A 1437 G係使用24至26%乙月音 獲得。於眞空中濃縮，於100毫升® Dianion HP-20吸附樹 脂上，在水/50%異丙醇系統中脱鹽，並凍乾造成1.1克 脂壯A 1437 G，純度99%。 按實例5b中所得之Α Η37 Η溶液，其相應之隨後純 化作業，係使用10至5〇%乙肢（在l〇mM磷酸鉀緩衝劑中， pH 7.0 )之溶劑梯度進行〇此抗生素係使用從37至39% 之溶劑含量進行溶離。 經濟部中央標準局員工消1Ϊ-合作社印製 適當溶離分之濃縮，及在® Dianion HP-2◦上之脱鹽， 以及凍乾，產生2.2克脂狀A I437 Η，純度係高於98%。 5d)將得自實例5b之脂壯抗生素A I437 Ε與F，於MCI 凝膠上純化： 將含有1.8克實例5b中所得之抗生素A 1437 F之舍 鹽溶液，裝填在1升MCI凝膠CHP 20P (三菱Kasei公司） 上。管柱尺寸爲6公分内徑X 35公分高。於欲被分離之物 質已装塡在擔體上之後，以缓衝劑A (具有20%乙|音之

本紙狀度適财_家棵旧哪丨f 4规格（2lQX 297公FT 455591 A6 B6 五、發明説明（30 ) 5raM磷酸鉀緩衝劑pH 7.0 )洗滌之，並藉梯度方法漸增 至缓衝劑B (具有7〇%乙Η之5mM磷酸鉀缓衝劑， pH 7.0 )。34至邪％溶劑含量，導致純抗生素之溶離。 於眞空中濃縮及在® Dianion HP_2〇上脱鹽，產生1.4克脂 月太Α Η37 E，純度高於98%。對於得自實例5a之A 1437 E粗產物，進行類似程序，產生1克脂狀A 1437 E，純度 高於98%。 6)偵測Α Η37脂U類之HPLC系統： 下述系統允許粗混合物中及培養物遽液中之脂壯類， 被分離及定量；其滯留時間係在II.5分鐘（A Η37 E ) 與約15.9分鐘（A 1437 Η )之間。 移動相：Α 磷酸鉀緩衝劑，pH 7.0，10mM B 乙月音 {請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) .裝 .訂. 經濟部肀央標準局员工消"合作社印製

梯度液：t[分鐘] 流速[毫升/分鐘] A(%] Bt%] 0 1.5 80 20 15 1.5 50 50 15.5 2 00 100 16.5 2 00 100 17 1.5 80 20 22 1.5 80 20 管柱：Shandon ODS Hypersil RP 18 ( 120 X 4.6 毫米， 具有2〇 X 4·6毫米前管柱）或 Nucleosil 120 RP 18 ( 120 X 4.6 毫米，具有 20 X 本紙張尺度適用中國圍家標準（CNS)甲4規格！ 210X297公釐）

經濟部中夹樣準局员工消Φ合作杜印製 A6 B6 4.6毫米前管柱）。 流速：I.5毫升/分鐘 俄測：210毫微米 注射：10微升 7) 曰本游動放線菌atcc m45與游動放線菌種dsm 7358間之比較。 首先將此兩種菌株，按實例lb中所述，產生預培養物， 並用以接種下列製造培養基。 培養基1 :如實例扣中所述 培養基2 :如培養基1，但未使用1_胺基異戊酸 培養基3 :葡萄糖3〇克/升；大豆粉2〇克/升； Fe2(S04)3 0.3 克 / 升；MnCl2 X 扭2〇 〇‘3 克 / 升及 C〇Cl2 X 6h2〇，pH 7.3。 於各情況中’均爲100毫升培養基在3〇〇毫升錐形瓶中。 於3〇 °C下，在旋轉振盪器中進行培養。a 1437脂月太 類於培養物ϊ慮液中之濃度，係於48、％及U4小時後， 藉HPLC (見實例6 )測定。無論如何，在使用日本游動 放線菌種ATCC 31145時，在培養基2與培養基3中均未 測得脂Η。於培養基1中，可於I44小時後，測出極少量 之少數壯類。假設此等化合物之比消光係數係與A U37月太 相同，則所產生之量，係爲至少100之因素（< i毫克/ 升）低於藉游動放線菌種DSM 7358在培養基1中，於相 同時間後合成而得之A 1437 B濃度。 8) A 1437脂U類之作用： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中固闼家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐） 455591 A6 B6 五、發明説明（32 ) 相關有機體對A I437脂壯類之敏感性，係藉瓊脂稀釋 試驗測定。所用之瓊脂爲MiiUer-Hinton瓊脂，於釀腺鍵球 菌與腸球菌之情況下，在其中添加10%馬血。將含有抗生 素之板接種，利用一種多通道接種器（5 χ 1〇4cfu/特定 菌株之固定培養物之接錄⑸。於37trFft|MIe値 (最低抑織度）。此職係定義爲抗生素之濃度，於此 濃度下，於培養24小時後，未測得有機體之可見成長。其 結果係轉於表2中。作爲對照物使用之安綠素，係得 自 Boehringer Mannheim (待固、 . 、仏國）。安弗黴素可自其中，以 精製化學品獲得。 表2 : A順物質：於活體外活性（AB圖譜）；濃度以微克/ 毫升表示

0.195 0.049 ).391 3.13 0.781 0.781 0.391 3.13 —- 0.781 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .装. —订 經濟部中夬悖準局SE工消伢合作社印製 A 1437 A ---- 0.391 0.781 A 1437 B ---—_ 0-098 0.195 A 1437 C 0.195 0*781 A 1437 D 0.049 0.195 A 1437 E —---- 0.098 0.195 A 1437 F ---- 0.098 0.391 A 1437 G — 0*098 0.195 A 1437 H 0.049 0.098 安弗黴素 0.195 0.781

1.56 0.088 0.195 0.098 0.025 0.781 0.025 0.049 0.391 線· 0.195 1.56 -----— 0.195 0,195 L56 4555 9 1 A6 B6 五、發明説明（33 ) A I437物質：於活體外活性（對凡可黴素具抗性之菌株）； 濃度以微克/毫升表示 faecium VR1 腸球菌 faecium VR2 腸球菌 釀膿鏈球菌 A 1437 A 未測定 A 1437 B 1 1 0.5 A 1437 C 4 4 4 A 1437 D 2 2 1 A 1437 E 4 4 1 A 1437 F 4 4 A 1437 G 0.25 0.25 0.125 A 1437 H 1 1 0.5 安弗黴素 4 4 2 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝 .訂 經濟部肀央標準局員工消货合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐） 84. 12. 1 3 年月曰 修正 A7 B7 經濟部中央榇準局員工消費合作社印製 HP万説明（34) 實例9a : A 1437 D之特徵 脂U A I437 D係以非晶質固體單離而得。 旋光度：+35 ° ( C=0_1 ;甲醇） HPLC :滯留時間：15.1分鐘 胺基酸：2個天門冬胺酸 - 1個天門冬醯胺 1個/δ-甲基天門冬胺酸酯 ν 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 1個六氫毗啶羧酸 1個胺基異戊酸 FAB-MS:m/e= 1303.6952((Μ + Η) + ] 分子量：1302.6S84(C59H94N14019) IR(KBr)： y =3420 (br) cm'1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400. 實例9b : A 1437 B之特徵 此脂Πα Η37 b係以非晶質固體單離而得 旋光度：+27 ° ( C=0.1 ;甲醇） HPLC :滯留時間：12.8分鐘 胺基酸：3個天門冬胺酸 1個/5-曱基夭門冬胺酸酯 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 本紙張尺度適用中國國家標举—（CNS ) A4規格（210X297公釐） 36 ----------^表 訂 線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 84位3條if一 補尤； 4 5 5 5 9 1 A7 B7 ' 五、發明説明（ 3 5) 1個六氫此交談酸 1個胺基異戊酸 FAB-MS：m/e=((M + H) + ) 分子量：13Q3(C59H93N13O20) IR(KBr)： y =3420 (br) cm'1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400. 實例9c : A 1437 C之特徵 此脂U A l437 C係以非晶質固體單離而得。 -旋光度：+30。（ C=0.1 ;甲醇） HPLC :滯留時間：14.1分鐘 胺基酸：2個天門冬胺酸 1個天門冬醢胺 1個/3-甲基天門冬胺酸酯 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 _ 1個六氫吨啶羧綾 1個胺基異戊酸 分子量：1288(C5sH92M14019) IR(KBr)： v =3420 (br) cm"1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400. 實例9d : A I437 A之特徵 此脂U A l437 A係以非晶質固體單離而得。 旋光度：+30 ° ( C=0.1 ;甲醇） HPLC :滯留時間：11.8分鐘 ' 胺基酸：3個天門冬胺酸 本紙張尺度適用中lii冢羅萃(CNS )Α4ΐ〇|Γ(——5ΐ 0X297公釐） _ 37 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝-

-tT 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 年 β 日 4 § 5 5 9 1 A7 84 J3補无丨_B7_-__ 五、發明説明（36) 1個曱基天門冬胺酸酉旨 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 1個六氫吡啶羧酸 1 1個胺基異戊酸 分子量：1289 (C58H91N13O20) IR(KBr)： y =3420 (br) cm'1, 2925, 1650, 1535, 1400. 實例9e : A 1437 F之特徵 此脂肽A l437 F係以非晶質固體單離而得。 旋光度：十31 ° ( C=0.1 ;甲醇） HPLC :滯留時間：13.8分鐘 胺基酸：2個天門冬胺酸 1個夭門冬醯胺 1個ζδ-甲基天門冬胺酸酯 _ 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 1個六氫α Α啶羧酸 1個胺基異戊酸 ‘ 分子量 U288(C58H92N14019) m(KBr): v =3420 (br) cm-1, 2930, 1660, 1530, 1450，1400. 實例Μ : A 1437 E之特徵 此脂U A l437 E係以非晶質固體單離而得。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2! Ο X 297公釐） -3 8 - 裝 訂 絲 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 ^ .f-jj 46 55 9 1 A7 84. 12. I 3 Β7 ——U ------ ΐ__ 五、發明説明（3?) 旋光度： HPLC :滯留時間：11.5分鐘 胺基酸：3個天門冬胺酸 1個召-甲基天門冬胺酸酯 2個甘胺酸 ， 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 1個六氫ΠΑ啶羧酸 1 1個胺基異戊酸 分子量：l289(C58H91N13O20) IR(KBr): v =3420 (br) cm-1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400. 實例9g : A I437 H之特徵 此脂壯A 1437 H係以非晶質固體單離而得。 旋光度：+32° ( C=0.1 ;甲醇） HPLC :滯留時間：15.9分鐘 胺基酸：2個天門冬胺酸 1個天門冬醢胺 1個乃-甲基天門冬胺酸酯 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 - 1個脯胺酸 1個六氫盹啶羧酸 1個胺基異戌酸 分子量 -----------批衣------ΐτ-------# (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!〇X29_7公釐） -39 - A6 B6 4 5 5 591 五、發明説明（38 ) IR(KBr): V =3420 (br) cm"1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400. 實例9h : A 1437 G之特徵 此脂U A 1437 G係以非晶質固體單離而得。 旋光度：+34° ( C = 0.1 ;甲醇） HPLC :滯留時間：13.6分鐘 胺基酸：3個天門冬胺酸 1個>5-曱基天門冬胺酸酯 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 1個六氫盹。定羧酸 1個胺基異戊酸 分子量：1317(C6QH95N13O20) IR(KBr): V =3420 (br) cm"1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400. 一請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 袭 -線. 經濟部t央標準局員工消t合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS}甲4規格丨210x297公釐）

Claims (1)

1. 年月日雙正 88. 12.3 充_ 六、申請專利範圍455591 、A8 -]-B8 口' 專利申請案第82110700號 ROC Patent Appln. No. 82110700 中文說明書修正頁-附件（一） Amended Pages of the Chinese Specificatim- Hhcl. (I CX國肋年月31日修正並送Μ ) (Amended & Submitted on December. 31, 1999) h—種式I之脂肽： R^-R^-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro 其中 R〗爲一具有10至20(含上下限）個碳原子鏈長之不飽和分 枝脂肪酸， R2 爲 Asp 或 Asn， Dab為2,3-二胺基丁酸，以及 Pip為六氫吼咬觀酸， 但其中 R1爲‘

   Π 0 ---------袭.— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 且 R2 爲 Asp 之式I脂肽除外。 2.根據申請專利範圍第1項之脂鈥，其中代表13、14 或15個碳原子之鏈長。 本紙乐尺度適用中國國家操準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4¾ 4¾ R ~R -Dab_Pip*-MeAsp''Asp~GIy-Asp_GlyDab~Val-Pro *-------------------------------- -j

   Α8 Be- CS D8 申請專利範圍 3.拫據申請專利範園第1項之脂肽「其係選自於以下者 a) iCi3-脂防酸，Asp-Dp b-P i p-MeAsp-Asp-G 1 y-Asp-G 1 y-Dab-Va 卜 Pro b) iC!4-脂肪酸-Asp-Dab-Pi p-MeAsp-Asp-Gly-Asp，Gly-Dab-Va 卜 Pro 1---—_-j c) 〖C13-脂防殖-AsivDab-iHp-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Glr'Dab-Val-Pro <-；—_____ ___I d) iCir 脂肪酸-Asn-Dab-P i p-MeAsp-Asp-G 丨 y ~Asp-G 1 y-Dab-Va 卜 Pro '------4 e) a i Ci3-脂标较-Asn-Dab-P i p-MeAsp-Asp-G 1 y-Asp-G 1 y-Dab-Va 卜 Pro '___________I f) a iCis** 脂膀酸-Asp-Dab-Pi p-MeAsp-Asp-Gl y-Asp-G 1 y-Dab，Va 卜 Pro i------------- I g) aiCis-脂防狡-Asti-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Va 卜 Pro 4，. 一種式ϋ之脂肽， π 其中 Rt = R2 = Asp 或 _-------、：装------訂.------0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁).; . __ Βι 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 R7 = Asp 或 R1 R2 = Asn

   C U 0

   C il 0 本紙張尺度通用令國國家標準（CMS ) A4規格（21〇Χ297公瘦） 45 55 9 A8 B8 C8 D8 申請專利範園 或 Ri

   C IIο 或 R, = Asn

   或 Ri = 闩2 = Asp 或 R1 =

   C II 0

   l·---------、.裝--.----訂------ί (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) _ R- Asn c II 0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5·種製備根據申請專利範圍第i戒2項之一或多 種式I脂狀。或根據申請專利範面第3項之一或 多種如狀或拫據申請專利範圍第4項之一或多種式j 脂肽之方法’其包括將游動放線菌種!)別7358在培養 基令發酵’直到—或多種脂肽類’蓄積於該培養基中 -43 - 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（2】似297公* ) 555591^、申請專利範圍 A8 B8 C8 DS 爲止，並於適當情況下，使用ρΗ0·5至pH4(含上下限） 下之-酸類，使脂肽類自培養基中沉澱，然後於適當情 況下’將得自此沉掇之脂肽純化，其方式是在陰離子 交換劑上層析或在—種疏水性基質上層析，此兩種層 折可佐選其一或以任柯期望順序連續進行，以自培養 基中純化一或多種脂肽。 & 一種製備脂肽之方法’其包括將游動放線菌種咖 7358在培養基中發酵，直到下式DI脂肽蓄積於該培養 基中爲止’該式Η爲 R、R2-Cj3b.Pip-MeAsp-Asp-(3ly-Asp-Gly-Dab-Val-P|〇 丨" 其中 .

   I - 1^— •丨 ^^1 -11 I I I—f -II I f锖先聞讀背面之注項再填寫本耳} 經濟部智慧財產局—工消費合作社印製 Π 0 及R2 爲 Asp， 且於適當情況下’使用pHO.5至pH4(含上下限）下之酸 類，使脂肽類自培養基中沉澱，然後於適當情況下， 將仔自此沉殿之脂狀純化，其方式是在陰離子交換劑 -44 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4既格（210 X 297公釐） 線. 六、申請專利範圍 偷 Βδβ C8 D8 上層析或在一種疏水性基質上層析，此兩種層析可)任 選其一或以任何期望順序連續進行，以自培養基中純 化式ΙΠ脂肽〇 7.-種用於抗革蘭陽性細菌之醬镔纽成物.，其中含有根 據申請專利範圍第1項之一或多種式I脂肽，並於適 當情况下，含有醫镔用載體β —種用於抗革蘭陽性細菌之醫镔組成物，其中含根據 申請專利範圍第6項之方法所製得之式)π脂肽，並於 適當情泥下，含有醫镔用載體。 认根據申請專利範圍第1項之式I脂肽，其係做爲抵抗 针糖肽具技性之細菌的抗生素使用。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) i —裝. "' •丨-4 _ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 45 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X：297公釐）

   455591 A7 B7 五、發明説明（3 專利申請案第82110700號 ROC Patent Λρρίη. No.82110700 „ 中文説明書修正頁-附件(三） Amended Pages of the Chinese Specification ~Encl.(lD) 7" ' e(民因0年12只I，曰送呈) (Amended & Submitted on December , 1995) 經濟部中央橾準局負工消費合作社印製 MRSA菌株。目前已發現此等MRSA菌株，經常已發展出 不僅是對二甲氧基苯青黴素而且對其他抗生素（例如凡可 黴素）之抗藥性。 除了上述得自鏈微菌之化合物以外，亦已知一種得自 曰本游動放線菌ATTCC 3114S之化合物，由於其作用圖譜 及所述之物化性質，故其與根據本發明之脂轴類具有結構 類似性，並稱爲化合物41.〇12 (美國專利4,001，397 )。日 本游動放線菌ATCC 31145於各種培養條件下之發酵，總 是導致相對較低產率之化合物41.012。 本發明之目的’係爲尋找具有改良性質之微生物天然 物質。 此目的係推據本發明而達成，其方式是將游動放線菌 種，在具有碳來源與氮來源以及習用有機鹽類之營養溶液 中發酵’直到脂Μ類（較佳爲脂壯類Α Η37 )蓄積於培養_ 基中爲止’接著自培養基中單離出此脂駄類，及於適當情 況下，將此混合物分離成其個别成份。此脂壯類具有藥理 活性，及因而具有療效，並可作爲抵抗革蘭陽性細菌之抗 生素使用，較佳爲抵抗對糖壯具抗藥性之菌株。 因此，本發明係關於： Ob纟太類’其中係將游動放線菌種在培養基中發酵，直到 —或多種下式I脂壯類蓄積於該培養基中爲止，該式工 爲： -5 - 本紙張尺度適用中國闺家標準（CNS)A4il格（2丨0X297公漦} (請先閲讀背面之注意事項再填寫本莨) 訂 — - · a修正 455591 A7 3補充 B7 P^R2-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro 其中 R1爲一種具有6至22 (内含）個碳原子鏈長之單或多 未飽和，飽和或其獨立情況之分枝或未分枝脂肪酸或 m基脂肪酸， 及 R2 爲 Asp 或 Asn， 於適當情況下，自培養基中純化一或多種式I脂奴類， 但下式I脂U則除外，其中 (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) ^ 訂 R1爲 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 C II 〇 及 R2 爲 Asp。 么脂U類，其中係將游動放線菌種在培養基中發酵，直到 得自下列族群之一或多種脂壯類蓄積於該培養基中爲止， 該族群爲： a) iC 丨 3-脂防酸-^ρ-Ε^ΙτΡΐρ-ΜοΑΒρ-Αερ-Μγ-Αερ-ΟΙγ-Ι^Ιί-νβ^ΡΓο L-------~~.___ b) iC】4-脂肪酸-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Va 卜 Pro 1-------1 c) iCi3-腊肪酸-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Va 卜 Pro *----*--—~~-4 d) iCi4-脂肪酸-Asn-Dab-P ί P-Me Asp-Asp-G 1 y-Asp-G 1 y-Dab-Va 1 - Pro ------1 e) aiCi3-脂肪酸-Asi^Pab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro -6 本紙張尺度適用中國圉家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4 5 5 5 9 1, A7 B7 五、發明説明（ 專利申請索第82110700 ROC Patent Αρρίη. No. 82110700 中文説明書修正頁-附件(_ Amended Pages of the Chinese Specification-Encl. (HI) (民国86年8月18日修正並送呈） (Amended & Submitted on August 18 ,1997) f) aiCi5_ 脂肪酸-Asp-Dgib-P〖p.-McAsp~Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-VahPi|〇 g) aiCi5~脂胺酸-Asn-DalrPip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab~Val-Pro於適當情況下，自培養基中純化一或多種此等脂壯類。 &式ϋ脂a類， R^-^-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro It其中 R- Asp C' IIο —l·-------4丨 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 或 Ri Cπo R2 = Asp或 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Π3 fl ^ ~~~ Asn或 R2 = Asn C IIo

   cu0 本紙張尺度適用中國國家襟準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐） 4555 9 A7 B7 修if 牛月 日彳夕'u·、 84.12. 1 3^J Κχ 五、發明説明（7 及 R 爲 Asp 作爲藥理活性物質之用途，特别是作爲抵抗革蘭陽性細 菌之抗生素，特佳爲抵抗對糖壯具抗藥性之細菌。 7.游動放射菌種DSM 7358。- 本發明係詳述於後文，尤其是詳述於其較佳具體實施 例中。本發明係藉申請專利範園之内容進一步界定。 術語之定義： 、 _ Dab意謂2,3-二胺基丁酸； "Ηρ意謂六氫卟啶羧酸（同意字==高脯胺酸）； - MeAsp意謂乃_甲基天門冬胺酸酯； 'G1y意謂甘胺酸； -Asn 意謂天門冬醢胺； —Asp 意謂天門冬胺酸； -Val意謂胺基異戊酸及 Pro 意謂鋪胺酸。 縮寫1代表”異夕，然而，/ ai /，則意謂夕前異,，。 此等定義係爲熟練研究人員，在脂肪酸類之文脈中所習知 者（生物化學’ Zubay，魏敦，阿姆斯特丹，由Addis〇n Wesley 發行，1983 )。 . 除非另有指明，否则所有百分比數據，均與重量有關。 除非另有述及’否則液體之混合比，均與體積有關。 .. 根據本發明之方法，可祕實驗室規模（毫升至升範 _ 園）及用於工業規模（立方朱規模）之發酵。 '本紙張尺度適用 ---：____ y _

   分子量 1290 1304 1289 1303 1290 1289 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ο 84· !2. i 3補充 45 55 9 1 α7 Β7 五、發明説明（W 名 稱 R!/R2 分子量 A 1437 G R1 1318 = Asp CII 0 A 1437 H R. 1317 ~ Asn CII 0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -0 經濟郎中丸fpt -14 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 84. 12. 1 3 年月曰 修正 A7 B7 經濟部中央榇準局員工消費合作社印製 HP万説明（34) 實例9a : A 1437 D之特徵 脂U A I437 D係以非晶質固體單離而得。 旋光度：+35 ° ( C=0_1 ;甲醇） HPLC :滯留時間：15.1分鐘 胺基酸：2個天門冬胺酸 - 1個天門冬醯胺 1個/δ-甲基天門冬胺酸酯 ν 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 1個六氫毗啶羧酸 1個胺基異戊酸 FAB-MS:m/e= 1303.6952((Μ + Η) + ] 分子量：1302.6S84(C59H94N14019) IR(KBr)： y =3420 (br) cm'1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400. 實例9b : A 1437 B之特徵 此脂Πα Η37 b係以非晶質固體單離而得 旋光度：+27 ° ( C=0.1 ;甲醇） HPLC :滯留時間：12.8分鐘 胺基酸：3個天門冬胺酸 1個/5-曱基夭門冬胺酸酯 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 本紙張尺度適用中國國家標举—（CNS ) A4規格（210X297公釐） 36 ----------^表 訂 線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 84位3條if一 補尤； 4 5 5 5 9 1 A7 B7 ' 五、發明説明（ 3 5) 1個六氫此交談酸 1個胺基異戊酸 FAB-MS：m/e=((M + H) + ) 分子量：13Q3(C59H93N13O20) IR(KBr)： y =3420 (br) cm'1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400. 實例9c : A 1437 C之特徵 此脂U A l437 C係以非晶質固體單離而得。 -旋光度：+30。（ C=0.1 ;甲醇） HPLC :滯留時間：14.1分鐘 胺基酸：2個天門冬胺酸 1個天門冬醢胺 1個/3-甲基天門冬胺酸酯 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 _ 1個六氫吨啶羧綾 1個胺基異戊酸 分子量：1288(C5sH92M14019) IR(KBr)： v =3420 (br) cm"1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400. 實例9d : A I437 A之特徵 此脂U A l437 A係以非晶質固體單離而得。 旋光度：+30 ° ( C=0.1 ;甲醇） HPLC :滯留時間：11.8分鐘 ' 胺基酸：3個天門冬胺酸 本紙張尺度適用中lii冢羅萃(CNS )Α4ΐ〇|Γ(——5ΐ 0X297公釐） _ 37 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- -tT 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 年 β 日 4 § 5 5 9 1 A7 84 J3補无丨_B7_-__ 五、發明説明（36) 1個曱基天門冬胺酸酉旨 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 1個六氫吡啶羧酸 1 1個胺基異戊酸 分子量：1289 (C58H91N13O20) IR(KBr)： y =3420 (br) cm'1, 2925, 1650, 1535, 1400. 實例9e : A 1437 F之特徵 此脂肽A l437 F係以非晶質固體單離而得。 旋光度：十31 ° ( C=0.1 ;甲醇） HPLC :滯留時間：13.8分鐘 胺基酸：2個天門冬胺酸 1個夭門冬醯胺 1個ζδ-甲基天門冬胺酸酯 _ 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 1個六氫α Α啶羧酸 1個胺基異戊酸 ‘ 分子量 U288(C58H92N14019) m(KBr): v =3420 (br) cm-1, 2930, 1660, 1530, 1450，1400. 實例Μ : A 1437 E之特徵 此脂U A l437 E係以非晶質固體單離而得。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2! Ο X 297公釐） -3 8 - 裝 訂 絲 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 ^ .f-jj 46 55 9 1 A7 84. 12. I 3 Β7 ——U ------ ΐ__ 五、發明説明（3?) 旋光度： HPLC :滯留時間：11.5分鐘 胺基酸：3個天門冬胺酸 1個召-甲基天門冬胺酸酯 2個甘胺酸 ， 2個2,3-二胺基丁酸 1個脯胺酸 1個六氫ΠΑ啶羧酸 1 1個胺基異戊酸 分子量：l289(C58H91N13O20) IR(KBr): v =3420 (br) cm-1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400. 實例9g : A I437 H之特徵 此脂壯A 1437 H係以非晶質固體單離而得。 旋光度：+32° ( C=0.1 ;甲醇） HPLC :滯留時間：15.9分鐘 胺基酸：2個天門冬胺酸 1個天門冬醢胺 1個乃-甲基天門冬胺酸酯 2個甘胺酸 2個2,3-二胺基丁酸 - 1個脯胺酸 1個六氫盹啶羧酸 1個胺基異戌酸 分子量 -----------批衣------ΐτ-------# (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!〇X29_7公釐） -39 - 年月日雙正 88. 12.3 充_ 六、申請專利範圍455591 、A8 -]-B8 口' 專利申請案第82110700號 ROC Patent Appln. No. 82110700 中文說明書修正頁-附件（一） Amended Pages of the Chinese Specificatim- Hhcl. (I CX國肋年月31日修正並送Μ ) (Amended & Submitted on December. 31, 1999) h—種式I之脂肽： R^-R^-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro 其中 R〗爲一具有10至20(含上下限）個碳原子鏈長之不飽和分 枝脂肪酸， R2 爲 Asp 或 Asn， Dab為2,3-二胺基丁酸，以及 Pip為六氫吼咬觀酸， 但其中 R1爲‘

   Π 0 ---------袭.— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 且 R2 爲 Asp 之式I脂肽除外。 2.根據申請專利範圍第1項之脂鈥，其中代表13、14 或15個碳原子之鏈長。 本紙乐尺度適用中國國家操準（CNS ) A4規格（210X297公釐）