KR860001048B1 - A41030 항생물질의 제조방법 - Google Patents

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A41030 항생물질의 제조방법

제 1 도는 A41030 인자 A의 적외선 흡수 스펙트럼(KBr 펠렛법)을 나타내는 도.

제 2 도는 A41030 인자 B의 적외선 흡수 스펙트럼(KBr 펠렛법)을 나타내는 도.

제 3 도는 A41030 인자 C의 적외선 흡수 스펙트럼(KBr 펠렛법)을 나타내는 도.

제 4 도는 A41030 인자 D의 적외선 흡수 스펙트럼(KBr 펠렛법)을 나타내는 도.

제 5 도는 A41030 인자 E의 적외선 흡수 스펙트럼(KBr 펠렛법)을 나타내는 도.

제 6 도는 A41030 인자 F의 적외선 흡수 스펙트럼(KBr 펠렛법)을 나타내는 도.

제 7 도는 A41030 인자 G의 적외선 흡수 스펙트럼(KBr 펠렛법)을 나타내는 도.

본 발명은 선행 기술된 바 없는 미지의 스트렙토마이세스 속 미생물의 배양에 의한, 항미생물 작용을 갖는 항생물질인 신규 발효 생성물의 제조방법에 관한 것이다.

이들 신규 화합물은 미합중국 특허 제4,322,343호 및 4,322,406호에 기술된 항생제와 유사하다.

병원성 미생물의 항생물질-특이 저항성 균주가 나타날 가능성이 크고, 그러한 위험이 항상 존재하기 때문에, 새로운 항생제의 개발은 커다란 필요성을 가지고 있다. 특히 그람 양성균인 스타필로코커스 및 스트렙토마이세스 속 중의 병원균은 때때로 페니실린 및 에리스로마이신과 같이 통상 사용되는 항생제에 대하여 저항성이 있다[참조 예 : W.O. Foye, Principles of Medicinal Chemistry, pp.684-686(1974)].

본 발명에 따라, A41030 복합체 및 그의 인자(factor) A, B, C, D, E, F 및 G 또는 이들의 약제학적으로 무독한 염은 유효한 항미생물제임이 밝혀졌다.

이들 신규 항생물질은 선행 기술되지 않은 미지의 미생물인 스트렙토마이세스 버지니아에(Streptomyces virginiae) NRRL 12525 또는 그의 모체인 스트렙토마이세스 버지니아에 NRRL 15156을 탄소, 질소 및 무기염류의 동화원(assimilable sources)을 함유하는 배지내에서 호기성 발효시킴으로써 제조할 수 있다. 이들 미생물 및 다른 미생물은 인자 A, B, C, D, E, F 및 G로 표시되는 인자를 포함한, 여러 항생물질 인자로 이루어지는 항생물질 복합체를 생산한다. 편의상 배양된 미생물인 스트렙토마이세스 버지니아에 NRRL 12525는 우리의 실험실에서 배양물 A41030.4라 칭한다. 스트렙토마이세스 버지니아에 NRRL 15156은 실험실에서 A41030으로 칭한다.

개개 인자의 적외선 흡수 스펙트럼은 첨부된 도면 제 1 도 내지 제 7 도에 나타나 있다.

발효 분야 및 본 명세서에서 사용된 "복합체(complex)"라는 용어는 공생성된(coproduced) 개개 항생물질 인자의 혼합물을 의미하는 것이다. 발효에 의한 항생물질 생산분야에서 잘 알려진 바와 같이 항생물질 복합체 내에 생성된 개개 인자의 수 및 비율은 발효 조건 및 사용된 균주에 따라 다양하게 변화된다.

인디애나주 인디애나폴리스에서 체취된 토양 샘플로부터 최초의 분리된 스트렙토마이세스 버지니아에(A41030) 균주의 화학적으로 유도된 돌연변이체의 배양물인 배양물 A41030.4는 Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604에 기탁되어 저장 배양물을 구성하였으며, 이것으로부터 기탁번호 NRRL 12525(기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1983년 1월 25일, 기탁번호 : KAIST 830125-07111)로 사용할 수 있다. 복합체-생성 모 배양물인 스트렙토마이세스 버지니아에(A41030)도 또한 Northern Regional Research Center에 기탁되었으며 기탁번호 NRRL 15156(기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1983년 1월 25일, 기탁번호 : KAIST 830125-07211)으로 사용할 수 있다.

배양물 A41030.4는 배양물 A41030을 계속해서 마이토마이신 C로 처리한 다음 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘으로 처리하여 얻는다.

배양물 A41030을 다른 변이유발소(mutagenic)로 처리하면 필수적으로 스트렙토마이세스 버지니아에 NRRL 12525와 동일한 생합성능을 갖는 추가의 균주를 생성할 수 있다는 것은 본 분야에 숙련된 사람에게는 잘 이해되는 것이다. 마이토마이신 C 이외에, 다른 적합한 약품으로는 아크리플라빈, 아크리딘 오렌지, 에티디움 브로마이드 및 유사한 화학약품이 포함된다. 마이토마이신 C에 이어서 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘이 사용되어 NRRL 12525가 얻어지지만 자외선, 고주파 및 방사능 조사, X-선 및 다른 화학약품과 같은 다른 공지의 변이유발소를 사용하여서도 유사한 돌연변이를 유도할 수 있다.

A41030은 스트렙토마이세스 버지니아에의 균주로 분류되며, 배양물 A41030.4는 스트렙토마이세스 버지니아에 균주의 화학적으로 유도된 돌연변이체로 분류되고, 이것은 스트렙토마이세스 아비디니(Sterptomyces avidinii) ATCC 27419, 스트렙토마이세스 콜룸비엔시스(Streptomyces columbiensis) ATCC 27425, 스트렙토마이세스 고시키엔시스(Streptomyces goshikiensis) ATCC 23914, 스트렙토마이세스 그리세오라벤두스(Streptomyces griseolavendus) ATCC 25457, 스트렙토마이세스 라벤둘라에 (Streptomyces lavendulae) ATCC 8664, 스트렙토마이세스 톡시트리시니(Streptomyces toxytricini) ATCC 19813 및 스트렙토마이세스 버지니아에(Grundy, Whitman, Rdzok, Hanes and Sylvester 1952) ATCC 19817의 동시 배양을 기초로 한 것이다. 보충시험과 함께 셔링과 고트리브에 의해 추천된 방법 및 배지[Shirling and Gottlieb, " Methods of Characterization of Streptomyces Species, " Int. J.Syst.Bacteriol. 16(3), 313-340(1966)]를 사용한다. 배양물 A41030.4는 또한 " Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" (8th edition,edited by R.E. Buchanan and N.E. Gibbons, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Maryland) 및 셔링과 고트리브의 " Cooperative Description of type strains of Streptomyces", Int. J.Syst. Bacteriol. 18(2), 178(1968)에 나타나 있는 상기 명칭의 균주의 공지된 사항과 동등하다.

배양물 A41030.4가 기중 균사체(aerial mycelia) 및 배지상에 포자를 생성하지 않기 때문에, 상술한 모든 종의 미생물과는 다르다.

THE A41030 및 A41030.4 배양물의 특성 지적

형태학

A41030은 잘 발달된 기중 균사체 및 포자체를 생성하며, 이들은 모두 코일상이고, 후크(hooks)와 루프(loops)를 나타낸다. A41030은 1차 형태학적 형태로는 푸담 등의 분류[Pudham et al., " A Guide for the Classification of Streptomycetes According to Selected Groups," Appl.Microbiol.6, 52-79(1957)] 중 나선형 항에 위치하며, 2차 형태학적 형태는 프리담(Pridam) 등의 테티나쿨룸-아퍼툼(Tetinaculum Apertum)(RA)항에 위치한다. A41030.4는 기중 균사체와 포자를 생성하지 않는다.

배양특징

여러 배지상에서의 배양물 A41030, A41030.4 및 에스. 버지니아에 ATCC 19817의 배양 특징은 표 1과 같다.

색(color)의 명칭은 ISCC-NBS 센트로이드 색표 표준 샘플 번호 2106(National Bureau of Standards, U.S. Department of Commerce, 1958) 및 Color Harmony Manual 4판 (Color Standard Department, Container Corporation of America, Chicago, Illinois, 1958)에 따르는 것이다.

[표 1]

A41030, A41030.4 및 ATCC 19817의 배양특징

G=성장 R=역전 Am=기중 균사체 Sp=용성 색소

배양물 A41030.4는 선택된 생리적 성질에 대하여 표준 방법에 따라 시험하였다. 관찰된 성질 및 나타난 특징은 다음 표 2와 같다.

[표 2]

A41030.4의 생리적 성질

멜라노이드 양색소 생성 :

1. 트립톤 효모 추출 육즙 (ISP #1) 멜라노이드 양 색소

2. 펩톤 효모 추출 철 한천 사면 (ISP #6) 멜라노이드 양 색소

3. 타이로신 한천 사면 (ISP #7) 멜라노이드 양 색소 생성이 없음

니트레이트 환원 음성 반응 전분 가수분해 음성반응

젤라틴 액화 음성 반응 탈지유 부분 가수분해

NaCl 내성 3% 온도 요구 10 내지 34℃

배양물 A41030, 배양물 A41030.4 및 스트렙토마이세스 버지니아에 ATCC 19817의 탄소 이용방식의 비교는 최종농도가 1.0%로 되도록 여과-멸균된 탄소 공급원을 가한 ISP No.9 기본배지를 사용하여 수행한다. 판은 30℃에서 14일 동안 배양한 후에 읽는다. 결과는 표 3에 기술되어 있다.

[표 3]

A41030, A41030.4 및 스트렙토마이세스 버지니아에 ATCC 19817의 탄소 이용 방식

주 : -=이용 안됨 +=이용 ±=부분적 이용

가수분해된 미생물의 전세포를 사용하여, 베커(Becker)등의 방법[Appl. Microbiol. 11, 421-423(1964)]에 따라 디아미노피멜산의 이성체를 측정한다. 이 시험의 결과는 다음과 같다.

시 험 관찰된 결과

2,6-디아미노피멜산의 이성체 LL-이성체

배양물 A41030, 배양물 A41030.4 및 스트렙토마이세스 버지니아에 ATCC 19817 사이의 유사성 및 차이점의 비교는 표 4에 기술되어 있다.

색의 명칭은 상술한 바와 같이 지정되며, 형태학은 푸담 등(상기 참조)이 기술한 바와 같다.

[표 4]

A41030, A41030.4 및 에스. 버지니아에 ATCC 19817의 유사성 및 차이점

A41030 복합체는 선행 기술된 바가 없는 미생물인 스트렙토마이세스 버지니아에 NRRL 15156, 스트렙토마이세스 버지니아에 NRRL 12525 또는 A41030-생성 돌연변이체 또는 이들의 변종을, 액침 호기성 발효조건하에서 충분한 정도의 항생물질 활성이 생성될 때까지 탄소, 질소 및 무기염류의 동화원을 함유하는 배지내에서 배양하여 생산할 수 있다. 항생물질 활성의 대부분은 육즙내에서 발견되는 반면에, 미량의 항생물질 활성은 균사체와 관련하여 나타날 수 있다. A41030 복합체는 균사체 즉, 생물량(biomass)을 여과 제거하여 발효 혼합물로부터 가장 쉽게 분리된다. 일반적으로 균사체는 버린다. 다음에 항생물질 복합체는 여과된 발효 육즙으로부터 분리되는데 바람직하게는 메탄올 : 물(1 : 1)과 같은 용출제를 사용하여 적합한 흡착제 상에서 칼럼크로마토그라피하여 분리한다.

적합한 흡착제에는 탄소, 알루미나, 음이온 및 양이온 교환수지, 실리카겔, 폴리아미드, 카복시메틸셀룰로오즈, 다이아이온(Diaion) HP-20과 같은 스티렌과 디비닐벤젠의 고다공성 공중합체, 앰버라이트(Amberlite)XAD 수지, 및 ES-865와 같은 듀오라이트(Duolite) 수지 등이 포함되며, 뿐만 아니라 세파덱스(Sephadex) 수지(교차 결합된 덱스트란으로 만들어진 친수성 불용성 분자체 크로마토그라피 매질) 및 TSK겔도 포함된다. 다이아이온 수지는 미쯔비시 케미칼 인더스트리즈 리미티드(Mitsubishi Chemical Industries, Limited, Tokyo, Japan)의 제품이다. 앰버라이트 XAD 수지는 롬 앤드 하스(Rohm and Haas, Philadeplhia, Pennsylvania)의 제품이다. 듀오라이트 수지는 다이아몬드 샴로크(Diamond Shamrack,Redwood City, California)의 제품이며, 세파덱스 수지는 파마시아 화인 케미칼스 에이비(Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden)사에서 제조되었고, TSK 겔은 이. 머크(E. Merck. Darmstadt)사 및 바이오-래드(Bio-Rad, 2200 Wright Ave., Richmond, California, 94804)사의 제품을 사용할 수 있다.

A41030 항생물질 복합체는 항생물질 복합체는 크로마토그라피방법에 의해 더 정제할 수 있으며 개개 인자로 분리될 수 있다.

여러가지 다른 배지를 사용하여 스트렙토마이세스 버지니아에 NRRL 12525 또는 에스. 버지니아에 NRRL 15156으로부터 A41030 복합체를 생성시킬 수 있다. 그러나 생산의 경제성, 최적 수율 및 생성물 분리의 용이성을 이유로 특정한 배지가 바람직하다. 이들 배지는 탄소, 질소 및 무기염류의 동화원을 함유한다. 적합한 탄소원은 덱스트린, 전분, 만노즈, 글리세롤 및 면실유를 포함한다. 탄소원의 최적 농도는 약 2 내지 약 3중량 퍼센트이다.

바람직한 질소원으로는 대두립, 대두말, 땅콩가루, 어분, 육류 펩톤 및 포크 혈액가루가 포함된다.

미생물의 성장 및 발육에 필요한 팔수 미량원소는 매생물의 성장 및 생합성의 필요성을 충족시키기에 충분한 양으로 배지중의 다른 성분중에 불순물로 존재할 수 있다. 그러나 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 클로라이드, 카보네이트, 포스페이트, 설페이트, 니트레이트 등의 이온을 생설할 수 있는 추가의 가용성 영양물질 무기염류를 배지내에 혼입시키는 것이 바람직할 수 있다.

발효 배지에 2 내지 4%의 농도로 트윈 80(오일성 액체 폴리옥시 에틸렌 소르비탄 모노올리에이트, ICI Americas Inc., Wilmington, Del.의 제품)을 첨가하면 약 300%까지 수율을 증가시킨다. 그러나 실제로 이러한 조건하에서는 A41030 항생제를 분리하기 어렵다.

진탕-플라스크 배양법으로 소량의 A41030 항생물질을 수득할 수 있지만, A41030 항생물질을 충분한 양으로 수득하기 위해서는 탱크중에서의 액침 호기성 발효법이 바람직하다. 탱크 발효를 위해서는 증식용 접종물을 사용하는 것이 바람직하다. 증식용 접종물은 소량의 배지를 포자형, 또는 균사체에 단편과 함께 접종하여 미생물의 새롭고 활동적으로 성장하는 배양물을 얻어 제조한다. 다음에 증식용 접종물을 대규모의 탱크에 옮겨 여기에서 적절한 배양 기간이 경과한 후에 A41030 항생물질이 최적 수율로 생성된다.

증식용 배지에 사용하는 접종물을 제공하는 다른 방법은 수성 포자 현탁액 대신에 동결건조된 펠렛으로 구성된다. 동결건조된 펠렛은 본 분야에서 공지된 방법으로 제조된다. 동결건조용 포자 현탁액의 제조는 수성 포자 현탁액의 제조방법과 유사하나, 단 멸균 증류수 대신에 멸균 송아지 혈청을 사용한다.

A41030-생성 미생물은 약 10 내지 약 34℃의 넓은 범위외 온도에 걸쳐 성장할 수 있다. A41030 항생물질 복합체의 최적 생산은 약 30℃의 온도에서 일어난다.

통상적인 호기성 액침 배양법에서와 같이 멸균공기를 배지중에 분산시킨다. 미생물의 효율적인 성장을 위해서 탱크법에서 사용되는 공기의 용량은 약 100 내지 약 300RPM으로 교반하면서 1분에 배지 용량당 공기 약 0.1 내지 약 0.5 용량(v/v/m)의 범위이다. 발효 배지 100리터를 함유하는 165리터 용기중에서의 최적 비율은 약 200RPM으로 임펠러(impeller) 회전시켜 교반하며서 약 0.25v/v/m이다.

일반적으로 항생물질 활성은 약 48시간 후에 나타나며, 발효 기간중 적어도 144시간동안 유지된다. 최고의 항생물질 생성은 약 96시간 내지 약 120시간의 발효 시간에 나타난다.

A41030 항생물질의 생성은 발효기간중에 비. 서브틸리스(B.subtilis)를 사용한 한천 확산법이나 스타필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 9114를 사용하는 비탁법으로 관찰한다.

본 발명에 의해 제공되는 항생물질 복합체 및 그의 개개 인자는 거의 동등한 온도, 기간 및 배지 성분의 발효 조건하에서 에스. 버지니아에 NRRL 15156 또는 에스. 버지니아에 NRRL 12525에 의해 생성된다. 그러나, 이러한 조건하에서, 에스. 버지니아에 NRRL 12525가 약간 더 많은 항생물질 복합체를 생성한다.

본 발명을 더욱 완전히 설명하기 위해 다음의 비제한적인 실시예가 제공된다.

[실시예 1]

제 1 단계 접종물의 제조

스트렙토마이세스 버지니아에 NRRL 12525 및 스트렙토마이세스 버지니아에 NRRL 15156의 한천 사면 배양에 사용하기 위해 다음 배지를 제조한다.

성 분 양(g/ℓ) 성 분 양(g/ℓ)

덱스트린¹⁾10.0 CoCl₂·6H₂O 0.01

효모 추출물 1.0 한 천 20.0

효소-가수분해된 카제인²⁾2.0 탈이온수 적량을 가해 1.0리터로 한다.

육 즙 1.0

주 1) Matheson Coleman & Bell, Norwood, Ohio 45212

2) N-Z-아민 A(Humko Sheffield Chemical Co., Memphis, Tenn.)

제조된 배지의 pH는 6.5이며, 고압 멸균하기 전에 5N 수성 수산화나트륨을 사용하여 pH 7.3으로 조정한다. 고압 멸균후에 배지의 pH는 6.9이다.

각 미생물의 포자는 상술한 성분으로 만들어진 한천 사면상에 접종하고, 이 사면을 약 30℃ 온도에서 약 6일동안 배양한다. 다음에 성숙한 사면 배양물을 멸균 증류수로 덮고 멸균 기구로 긁어서 포자와 균사체를 흩어놓는다. 생성된 포자 현탁액 1밀리리터를 사용하여 증식용 배지 50ml를 접종시킨다. 증식용 배지에 사용하기 위한 접종물을 제공하는 다른 방법은 수성 포자 현탁액 대신에 동결건조된 펠렛으로 구성되어 있다.

NRRL 12525의 증식용 배지의 조성은 다음과 같다.

성 분 양(g/ℓ) 성 분 양(g/ℓ)

글루코즈 20.0 옥수수 침지액 10.0

대두 조립(또는 대두말) 15.0 CaCO₃2.0

수도물 적량을 가해 1리터로 한다.

NRRL 15156의 증식용 배지의 조성은 다음과 같다.

성 분 양(g/ℓ) 성 분 양(g/ℓ)

글루코즈 15.0 대두조립(또는 대두말) 15.0

덱스트린 20.0 옥수수 침지액 10.0

수도물 적량을 가해 1리터로 한다. CaCO₃2.0

배지의 조정하기 전 pH는 5.5이며, 이것은 고압 멸균하기 전에 5N 수성수산화나트륨을 사용하여 pH 6.5로 조정한다. 고압 멸균후에 배지의 pH는 7.0이다.

각 증식용 배지는 250RPM에서 2인치 직경의 호를 그리며 회전하는 진탕기상에서, 배지 50ml를 함유하는 250ml 광구 삼각 플라스크내에서 약 30℃로 약 48시간동안 배양한다. 이 배양 배지를 소량의 발효물을 접종하거나(발효 배지 용량당 약 1%의 배양물) 더 많은 용량의 배양물을 제조하기 위해 증식용 배지와 같은 동일 조성의 제 2단계 배지를 접종하는데 사용한다.

NRRL 15156의 발효

생상 배지 50밀리리터를 상기에서 얻은 배양된 증식용 배지 1%(0.5ml)로 접종한다. 생산 배지는 다음 조성을 갖는다.

성 분 양(g/ℓ) 성 분 양(g/ℓ)

덱스트린¹⁾30.0 MgSO₄·7H₂O 10

대두 조립 6.0 NaNO₃1.0

K₂HPO₄1.0 CaCO₃2.0²⁾

FeSO₄·7H₂O 0.005

탈이온수 적량을 가해 1리터로 한다.

주 1) 덱스트린은 타피오카나 감자 덱스트린일 수 있다.

2) NRRL 12525의 발효를 위해, CaCO₃농도는 4.0g/l이다.

K₂HPO₄는 물에 용해시키고, 용액을 따로 멸균하여 필요량의 용액을 고압 멸균된 배지의 각 성분에 가한다. 접종된 발효 배지 50ml를 250RPM에서 2인치 직경의 호를 그리며 회전하는 진탕기상의 250ml 삼각 플라스크내에서 약 30℃로 약 4 내지 5일 동안 배양한다.

스트렙토마이세스 버지니아에 NRRL 12525는 또한 상술한 생산 배지를 사용하여 165리터 및 1600갤론 탱크내에서 대규모로 수행하는 발효법으로 배양한다.

접종된 생산배지는 100리터의 배지를 함유하는 165리터 발효 탱크내에서 약 32℃온도로 약 210시간(8.75일)동안 발효시킨다. 발효 배지는 0.25v/v/m의 비율로 멸균공기를 사용하여 통기시키고 통상적인 교반기를 사용하여 약 200RPM의 속도로 교반한다.

NRRL 12525의 대규모 발효는, 다음에 기술하는 바와 같이 A41030 항생물질을 분리하는 공급원이다.

[실시예 2]

A41030 항생물질의 분리

실시예 1에 기술한 바와 같이 하여 수득한 전 발효육즙(4215리터)을 필터 프레스(filter press)하에서, 필터 에이드(filter aid : Hyflo supercel, 규조토, Johns-Manville Products Corporation)를 사용하여 여과한다. 여과된 육즙을 다이아이온 HP-20(비드(bead)형의 고다공성 스티렌-디비닐벤젠 공중합체, Mitsubishi Chemical Industries, Limited, Tokyo, Japan) 100ℓ를 함유하는 칼럼에 4ℓ/분의 유속으로 적용한다. 칼럼을 물 300ℓ 및 메탄올 : 물(1 : 3) 1000ℓ를 사용하여 4ℓ/분의 속도로 연속세척한다. 6ℓ/분의 속도로 메탄올 : 물(1 : 1)을 사용하여 용출시켜 100ℓ씩의 분획을 모은다. 각 분획의 생물학적 활성을 분석한다. 생물학적 시험은 바실루스 서브틸리스를 접종한 한천 평판상에서 페퍼 디스크(paper disc) 시험으로 수행한다. 분획 1은 버린다. 분획 2부터 15까지를 합하여 감압하에서 농축하고, 농축물은 동결건조하여 조항생물질 복합체 220g을 얻는다.

이 복합체의 일부 110g을 메탄올 : 물(1 : 1) 5ℓ내에 용해시키고 수성 수산화나트륨을 사용하여 pH 10으로 조정하고, 혼합물을 여과한다. 여액을 메탄올 : 물(1 : 1)로 미리 평형화시킨 거친 세파덱스 G-50(교차 결합된 덱스트란으로 만든 친수성, 불용성, 분자체 크로마토그라피 매질, Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ 08854에서 시판)의 30ℓ칼럼(0.2×1m)에 50ml/분의 속도로 적용한다. 칼럼을 메탄올 : 물(1 : 1)로 50ml/분의 속도로 용출시켜 3ℓ씩의 분획을 모은다. 분획 1부터 12까지는 버린다. 비. 서브틸리스에 대해 활성인 분획 13부터 24까지를 모아, 감압하에서 농축하고, 동결건조하여 A41030 항생물질 복합체 35.7g을 얻는다.

본 발명에 따라 제조된 항생물질은 본 명세서에서 임의로 A41030 항생제라 칭한다. A41030 복합체는 A41030 인자 A,B,C,D,E,F 및 G로 칭하는 여러개의 개개 인자를 함유한다. 유용성에 관한 검토에서, 간단하게 "A41030 항생물질"이라고 사용된 것은 A41030 복합체 및 A41030 인자 A,B,C,D,E,F 및 G로 이루어진 그룹으로부터 선택된 요소를 칭하는 것이다.

7개의 항생물질 인자를 발효로부터 회수하고, 혼합물 A41030 복합체로 수득한다. A41030 복합체중의 각 인자의 비율은 사용된 발효 조건에 따라 변화한다. 개개 인자 A,B,C,D,E,F 및 G를 분리하여 후술하는 바와 같이 개개 화합물로 분리시킨다. A41030 복합체는 물, 묽은 수성산, 묽은 수성 염기, 메탄올-물 혼합물, 에탄올-물 혼합물, 디메틸포름아미드 및 디메틸포름아미드-물 혼합물, 디메틸설폭사이드, 디메틸설폭사이드-물 혼합물, 아세토니트릴, 아세톤, 에틸아세테이트, 테트라하이드로푸란 또는 메틸렌클로라이드와 같은 용매에 가용성이다.

다음 항목은 분리 방법을 기술한 것이며, 또한 이렇게 하여 특징화된 A41030 인자의 물리적 성질 및 스펙트럼을 기술한 것이다.

[실시예 3]

A41030 인자 A의 분리

실시예 2로부터 수득한 A41030 복합체중의 8g을 물 : 아세토니트릴 : 염화나트륨(84 : 16 : 2g/ℓ)으로 이루어진 용매 200ml에 용해시키고 여과한다. 여액을 미합중국 특허 제4,229,763호에 기술된 특별한 방법으로 우리의 실험실에서 제조한 10 내지 20마이크론 LP-1/C₁₈역전상 실리카겔 4ℓ로 충진된 스테인레스 강철 칼럼(8×100cm)에 적용시킨다. 칼럼은 크로마토스팩 프레프-100단위(Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal 91160 Longjumeau,France)의 일부이다. 칼럼을 물 : 아세토니트릴 : 염화나트륨(84 : 16 : 2g/ ℓ)을 사용하여 분당 60ml의 속도로 용출시켜 480ml씩의 분획을 모은다. 용출액을 6형 광학단위를 갖는 ISCO 모델 UA-5-UV 모니터(Instrumentation Specialities Co., Lincoln, NF 68505)를 사용하여 254nm에서 측정한다. 선택된 분획에 대하여 상술한 특별 방법으로 실험실에서 제조한 10마이크론 LP-1/C₁₈로 충진된 4.6×250mm 스테인레스 강철 칼럼상에서 분석용 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC)로 인자 A의 존재를 분석한다. 샘플을 Rheodyne 모델 7120 주입밸브(Rheodyne Inc., Berkeley, CA 94710)를 사용하여 적용한다. 빙초산을 사용하여 pH 6으로 조정한 물 : 아세토니트릴 : 나트륨 아세테이트(81 : 19 : 0.03몰)로 구성된 용매를 밀톤로이 듀플렉스 미니펌프(Milton Roy Duplex Minipump, Laboratory Data Control, Division of Milton Roy Co., Rivera Beach, FL 33404)를 사용하여 분당 1ml의 속도(1,200psi)로 공급한다. 인자 A를 ISCO 모델 UA-5UV 검출계를 사용하여 254nm에서 검출한다. 분획 1부터 51까지를 버린다. 인자 A가 풍부한 분획 52부터 79까지를 합하여 감압하에서 용량이 50ml로 되도록 농축한다. 농축물을 수성 수산화나트륨을 사용하여 pH 8.2로 조정하고 여과한다. 여액을 물로 미리 평형화시킨 칼럼(2.8×22cm)중의 다이아이온 HP-20 수지 100ml에 분당 15ml의 속도로 적용한다. 칼럼을 염화물이 세액에서 염화은 침전으로 검출되지 않을 때까지 물(400ml, 포름산을 사용하여 pH 2.5로 조정)로 세척한다. 분당 15ml의 속도로 물 : 아세토니트릴(8 : 2)을 사용하여 용출을 수행하여 1ℓ씩의 분획을 모은다. 분획의 비. 서브틸리스에 대한 활성을 측정한다. 냉동시킴에 의해 분획 2에서 형성된 결정성 인자 A를 여과하여 회수한다.(389.6mg). 분획 1 및 분획 2로부터의 여액을 각각 감압하에서 농축시키고 동결 건조하여 각각 인자 A 731.18mg 및 514mg을 수득한다.

항생물질 A41030 인자 A는 백색 결정성 고체이다. A41030 인자 A의 원소분석은 다음과 같은 대략의 퍼센트로 이루어진 조성물임을 나타낸다 : 탄소 56.44%, 수소 3.58%, 질소 8.11%, 산소 23.20%, 및 염소 8.29% 장탈착 및 혈장탈착 질량 분광 분석에 의해 측정된 바와 같이, A41030 인자 A는 1231의 분자량을 가지고 있다. 원소 분석과 분자량을 기초로 하여 인자 A는 C₅₈H₄₄Cl₃N₇O₁₈의 실험식으로 확인된다. 물 중에서 66% 디메틸포름아미드내의 인자 A의 전기적 적정은 추가로 > 10.5의 pKa값(초기 pH 7.83)과 함께 약 5.53, 7.60 및 10.37의 pKa값을 갖는 3개의 적정 가능한 그룹의 존재를 지시한다. 항생물질 A41030 인자 A는 다음과 같은 비선광도를 갖는다 : [α]²⁵ _D-19.6° (C, 디메틸설폭사이드중에서 9.0).

KBr 펠렛법에 의한 A41030 인자 A의 적외선 스펙트럼은 첨부된 제 1 도에서 보는 바와 같다. 다음과 같이 식별 가능한 최대 흡수가 관찰된다 : 3448-3226(강, 브로드), 1653(강), 1610(약), 1587(중), 1515(강), 1488(약), 1429(중), 1227(강), 1139(중), 1064(강) 및 1010(강)cm^-1.

산성, 중성 및 염기성 조건하에서 메탄올 : 물(1 : 1)내의 A41030 인자 A 내지 G의 자외선 최대 흡수는 표 5에 기록되어 있다.

[표 5]

A41030 인자들의 UV 분광분석

항생물질 A41030 인자 A는 알콜-물 혼합물, 디메틸설폭사이드, 디메틸설폭사이드-물 혼합물, 디메틸포름아미드-물 혼합물, 묽은 수성산 및 묽은 수성 염기내에 용해한다.

관찰된 물리화학적 데이타를 기초로 하여, A41030 인자 A는 다음과 같은 구조를 갖는 것으로 확인되었다.

생물학적 시험 및 고성능 액체 크로마토그라피를 사용하여, 인자 A는 배양물 A41030.4에 의해 생성된 항생물질 인자들의 약 94 내지 약 96중량%로 계산되며, 인자 B,C,D,E,F 및 G는 생성된 인자들의 나머지 약 4 내지 약 6중량%로 계산된다.

[실시예 4]

A41030 인자 B의 분리

A41030 복합체중 1.0g을 물 : 아세토니트릴 : 염화나트륨(85 : 15 : 2g/ℓ)으로 구성된 용매 35ml 내에 용해시키고, 용액을 실험실에서 25 내지 40마이크론 리크로프레프(Lichroprep) RP-18 [실리카겔에 화학적으로 결합된 탄화수소상(C₁₈), MC/B Manufacturing Chemists, Inc., Cincinnati, OH]로 충진된 4.7×45cm 미셀-밀러 고성능 저압액체 크로마토그라피(HPLPLC) 가스칼럼(Ace Glass, Inc., Vineland, NJ 08360)에 가한다. FMI 밸브가 없는 피스톤 펌프(Fluid Matering Inc., Oyster Bay, NY 11771)를 사용하여 샘플을 용해시키는데 사용된 동일 용매조합으로 칼럼을 21ml/분(100psi)의 속도로 용출시켜 21ml씩으로 분획을 모은다. 용출액은 ISCO 모델 UA-5UV 검출계를 사용하여 280nm에서 검사한다. 분획 1부터 183까지는 버린다. 인자 B가 풍부한 분획 184부터 245까지를 합하여 감압하에서 25ml가 되도록 농축시킨다. 7회의 유사한 정제로부터 얻은 농축물을 합하고, 물을 가하여 1.4ℓ가 되도록 희석하고, 물로 미리 평형화시킨 칼럼내의 다이아이온 HP-20 수지 100ml에 8 내지 10ml/분의 속도로 가한다. 염화물이 세척액에서 염화은 침전으로 검출되지 않을 때까지 칼럼을 물(600ml)로 세척한다. 물 : 메탄올(1 : 1)을 사용하여 8 내지 10ml/분의 속도로 용출을 수행해서 300ml씩의 분획을 모은다. 분획에 대하여 비. 서브틸리스에 대한 활성을 측정한다. 분획 1 내지 5를 합쳐서 감압하에서 농축시키고 동결건조하여 조인자 B 523mg을 얻는다.

2개의 인자 B의 조제제를 합친 중의 550㎎을 용액에 형성될 때까지 테트라부틸암모늄 하이드록사이드를 가하여 물 : 아세토니트릴 : 디부틸아민으로 이루어진 용매(75 : 25 : 0.03몰, 용매는 인산을 가하여 pH 7.8로 조정한다) 10㎖에 용해시킨다. 용액을 25 내지 40마이크론 리크로프레프 RP-8[실리카겔에 화학적으로 결합된 탄화수소상 (C₈), MC/B Manufacturing Chemists, Inc., Cincinnati, OH]로 충진된 2.8×59㎝ 미셀-밀러 HPLPLC 유리 칼럼에 가한다. FMI 펌프를 사용하여 샘플을 용해시키는데 사용된 것과 동일한 조합의 용매를 사용하여 5㎖/분(35psi)의 속도로 칼럼을 용출시킨다. 용출액을 ISCO 모델 UA-5UV 검출기를 사용하여 254nm에서 검사한다. 선택된 27㎖씩의 분획들을 10마이크론 리크로소르브 RP-18(시판품, 역전상 실리카겔, E. Merck, Darmstadt, Germany의 제품)로 충진된 4.6×250㎜ 스테인레스 강철 칼럼상에서 분석용 HPLC로 인자 B의 존재에 대하여 검사한다. 샘플을 레오다인(Rheodyne) 모델 7120 주입 밸브를 사용하여 가한다. 인산으로 pH 2.5가 되게 조정한 물 : 아세토니트릴 : 디부틸아민(82 : 18 : 0.03몰)으로 이루어진 용매를 콘스타메트릭(Constametric) Ⅲ 펌프(LDC-Laboratory Data Control, Division of Milton Roy Co., Riviera Beach FL 33404)로 1㎖/분의 속도로 공급한다. 인자 B는 LDC스펙트로 모니터 Ⅲ 가변성 파장 UV 검출계를 사용하여 225nm에서 검출한다. 인자 B가 풍부한 RP-8 칼럼 용출액 999 내지 1,296㎖를 농축하여 용량이 200㎖가 되게 한다. 농축물을 희석하여 용량이 500㎖가 되게 하고 인산을 가하여 pH 2.0으로 조정하고 이온표지물로 염화나트륨(1㎎/㎖)을 가한다. 이 용액을 물로 미리 평형화시킨 칼럼(2.8×22㎝)중의 다이아이온 HP-20 수지 100㎖에 20㎖/분의 속도로 가한다. 세액에서 염화물이 염화은 침전으로 검출되지 않을 때까지 수성 포름산을 가하여 pH 2.5로 조정된 물(500㎖)로 칼럼을 세척한다. 다음에 칼럼을 물 : 아세토니트릴 1ℓ로 분당 30㎖의 속도로 용출시킨다. 용출액을 감압하에서 농축하고 동결건조하여 조인자 B 295.6㎎을 수득한다.

이 제제중 285㎎을 가열하여 디메틸포름아미드 : 물(4 : 6) 30㎖에 용해시키고, 실온으로 냉각하여 냉동시켜 인자 B의 침전을 얻는다. 침전을 여과해서 회수하여 아세톤으로 세척하고 진공중에서 건조시켜 인자 B 84㎎을 수득한다.

항생물질 A41030 인자 B는 다음과 같은 대략의 원소 분석을 갖는 백색 고체이다 : 탄소 58.54%, 수소 4.21%, 질소 8.63%, 염소 5.96% 및 나머지는 산소 22.66%. 물 중에서 66% 디메틸포름아미드 중의 인자 B를 전기적 적정하면 가능한 추가의 pKa값>10(초기 pH 6.22)과 함꼐 각각 pKa값 약 5.6 및 7.5에서 2개의 적정 가능한 그룹의 존재를 나타낸다. 고속 원자 포격 질량 분광분석(fast atom bombardment mass spectrometry)을 사용하여 약 1197의 실측 분자량을 얻는다. 원소 분석 및 실측 분자량을 기초로 하여 인자 B의 실험식은 C₅₈H₄₅Cl₂N₇O₁₈로 확인된다.

KBr 펠렛법에 의한 항생물질 A41030 인자 B의 적외선 흡수 스펙트럼은 첨부된 도면 제2도와 같다. 다음과 같이 식별 가능한 최대 흡수가 관찰된다 : 3448-3226(강, 브로드), 1653(강), 1610(중), 1587(약), 1515(강), 1488(약), 1429(중), 1290(약), 1227(강), 1139(중), 1064(강) 및 1010(강)㎝^-1.

중성, 산성 및 염기성 메탄올 : 물(1 : 1) 중에서 A41030 인자 B의 자외선 최대 흡수는 전술한 표 5에 기록되어 있다.

항생물질 A41030 인자 B는 인자A와 같은 동일 용매 중에 용해한다.

측정된 물리화학적 데이타를 기초로 하여 A41030 인자 B는 다음과 같은 구조로 확인된다.

[실시예 5]

A41030 인자 C의 분리

A41030 복합체중 9.0g을 물 : 아세토니트릴 : 염화나트륨(83 : 17 : 2g/ℓ)으로 구성된 용매 200㎖에 용해시키고 용액을 여과한다. 여액을, 실시예 3에 기술된 특별한 공정으로 실험실에서 제조된 10 내지 20마이크론 LP-1/C₁₈역전상 실리카겔 4ℓ로 충진된 8×100㎝ 스테인레스 강철 칼럼에 가한다. 크로마토스펙 프레프-100 단위중의 부분인 칼럼을 샘플을 용해시킨데 사용한 것과 동일한 조성의 용매로 분당 60㎖의 속도로 용출시켜 480㎖씩의 분획을 모은다. 용출액을 ISCO 모델 UA-5UV 검출계를 사용하여 254nm에서 검사한다. 선별된 분획은 실험실에서 25 내지 40마이크론 리크로프레프 RP-8로 충진한 0.8×30㎝ 미셀-밀러 유리 칼럼상에서 분석용 HPLPLC로 인자 C의 존재에 대해 시험한다. 물 : 아세토니트릴 : 염화나트륨(84 : 16 : 2g/ℓ) 용매를 FMI 펌프를 사용하여 분당 4㎖로 공급한다. 인자 C는 ISCO 모델 UA-5UV 검출계를 사용하여 254nm에서 검출된다. 분획 1부터 27까지는 버린다. 인자 C가 풍부한 분획 28부터 52까지를 합하고 감압하에서 용량이 500㎖가 되도록 농축한다.

2번의 유사한 정제로부터 얻은 농축물을 합하여, 여과하고 물로 미리 평형화시킨 칼럼(2.8×22㎝) 중의 다이아이온 HP-20 수지 100㎖에 분당 10㎖로 가한다. 칼럼을 염화물이 세액에서 염화은 침전으로 검출되지 않을 때까지 물(2ℓ)로 세척한다. 물 : 아세토니트릴(6 : 4) 1ℓ로 분당 15㎖의 속도로 용출시킨다. 용출액을 감압하에서 농축하고 동결건조시켜 인자 C가 풍부한 인자들의 혼합물 2.75g을 얻는다. 이 혼합물 중 1.25g을 용액에 형성될 때까지 테트라부틸암모늄 하이드록사이드를 첨가하여 물 : 아세토니트릴 : 디부틸아민으로 이루어진 용매(80 : 20 : 0.03몰, 용매는 인산을 가하여 pH 7.8로 조정한다) 25㎖에 용해시킨다. 샘플을 25 내지 40마이크론 리크로프레프 RP-8로 충진된 2.8×59㎝ 미셀-밀러 유리 칼럼에 가하고 칼럼을 FMI 펌프를 사용하여, 샘플을 용해시키는데 사용한 것과 동일한 조성의 용매로 분당 4㎖로 용출시킨다. 용출액은 ISCO 모델 UA-5UV 검출계를 사용하여 254nm에서 검사한다. 선별된 28㎖씩의 분획을 실험실에서 10마이크론 뉴클레오실(Nucleosil) C₁₈(시판품, 역전상 실리카겔, Rainin Instrument Co., Inc., Woborn, MA01801의 제품)로 충진한 4.6×150㎜ 스테인레스 강철 칼럼상에서 분석용 HPLC에 의해 인자 C의 존재에 대해 시험한다. 샘플을 레오다인 모델 7120 주입 밸브를 사용하여 가한다. 빙초산을 가하여 pH 6으로 조정한 물 : 아세토니트릴 : 나트륨아세테이트(81 : 19 : 2g/ℓ)로 이루어진 용매를 밀톤 로이 듀플렉스 미니펌프를 사용하여 분당 1㎖로 공급한다. 인자 C는 ISCO 모델 1800 가변성 파장 UV 검출계를 사용하여 225nm에서 검출된다. 인자 C가 풍부한 4.2 내지 5.1ℓ로부터의 용출액 부분을 감압하에서 500㎖ 용량이 되도록 농축시킨다.

3회의 유사한 정제로부터 얻은 농축물을 합하여 인산을 가하여 용해시키고 pH 1.7로 한다. 이온 표지물로 염화나트륨(1㎎/㎖)을 가한다. 샘플을, 물로 미리 평형화시킨 칼럼(2.8×22㎝) 중의 다이아이온 HP-20 수지 100㎖에 분당 20㎖로 가한다. 칼럼을 염화물이 세액에서 염화은 침전으로 검출되지 않을 때까지 pH 2.5의 수성 포름산(300㎖)으로 세척한다. 칼럼을 물 : 아세토니트릴(6 : 4) 1ℓ로 분당 30㎖의 속도로 용출시킨다. 용출액을 모아서, 감압하에서 농축하고, 동결건조시켜 부분적으로 정제된 인자 C 0.87g을 수득한다. 이 제제를 용액이 형성될 때까지 테트라부틸암모늄 하이드록사이드를 가하여 물 : 아세토니트릴 : 디부틸아민으로 이루어진 용매(80 : 20 : 0.03몰, 용매는 인산을 가하여 pH 7.8로 조정한다) 20㎖에 용해시킨다. 샘플을 전술한 바와 같은 2.8×59㎝ 미셀-밀러 유리 칼럼중의 25 내지 40마이크론 리크로프레프 RP-8상에 크로마토그라피한다. 2.45 내지 3.20ℓ로부터 얻은 용출액 부분을 감압하에서 500㎖ 용량이 되도록 농축한다.

2회의 유사한 정제로부터 얻은 농축물을 합하여 전술한 양식으로 다이아이온 HP-20 수지를 함유하는 칼럼상에서 탈염시킨다. 용출액을 감압하에서 농축하고 동결건조시켜 인자 C 688㎎을 수득한다. 이 제제중 678㎎을 가열하여 물 : 아세토니트릴 (6 : 4) 60㎖ 중에 용해시킨다. 용액을 냉각하고 냉동시키면 인자 C가 침전된다. 침전을 여과 회수하여 아세톤으로 세척하고 진공하에서 건조시켜 인자 C 428㎎을 수득한다.

항생물질 A41030 인자 C는 다음과 같은 대략의 원소 분석치를 갖는 백색 고체이다 : 탄소 48.87%, 수소 4.39%, 질소 6.16%, 염소 6.96%, 및 산소 33.81%. 물 중의 66% 디메틸포름아미드 내에서 인자 C를 전기적 적정하면 가능한 추가의 pKa값>10(초기 pH 6.6)와 함께 각각 pKa값이 약 5.5 및 7.1인 2개의 적정 가능한 그룹의 존재가 확인된다. 고속 원자 포격 질량 분광분석을 사용하여 약 1393의 실측 분자량을 얻는다. 원소 분석치 및 실측 분자량을 기초로 하여 인자 C는 실험식 C₆₄H₅₄Cl₃N₇O₂₃으로 확인된다.

KBr 펠렛법에 의한 항생물질 A41030 인자 C의 적외선 흡수 스펙트럼은 첨부된 도면 제3도와 같다. 다음과 같은 식별 가능한 최대 흡수가 관찰된다 :

3448-3226(강, 브로드), 1653(강), 1610(중), 1587(약), 1504(강), 1481(약), 1429(중), 1220(강), 1136(강), 1064(약), 1053(중) 및 1005(강)㎝^-1.

중성, 산성 및 염기성 메탄올 : 물(1 : 1) 중에서 A41030 인자 C의 자외선 최대 흡수는 상기 표 5에 기술되어 있다.

항생물질 A41030 인자 C는 A와 같이 동일 용매로 용해한다.

측정된 물리화학적 데이타를 기초로 하여, A41030 인자 C의 구조는 다음과 같다 :

[실시예 6]

A410303 인자 D의 분리

A41030 복합체 중 6.0g을 물 : 아세토니트릴 : 염화나트륨(83 : 17 : 2g/ℓ)으로 구성된 용매 200㎖에 용해시키고 용액을 여과한다. 여액을 실시예 3에 기술된 특별한 공정으로 실험실에서 제조된 10 내지 20마이크론 LP-1/C₁₈역전상 실리카겔 4ℓ로 충진된 8×100㎝ 스테인레스 강철 칼럼에 가한다. 크로마토스펙프레프-100 단위중의 부분인 칼럼을 샘플을 용해시킨데 사용한 것과 동일한 조성의 용매로 분당 60㎖의 속도로 용출시켜 480㎖씩의 분획을 모은다. 용출액을 ISCO 모델 UA-5UV 검출계를 사용하여 254nm에서 검사한다. 선별된 분획은 실험실에서 25 내지 40마이크론 리크로프레프 RP-8로 충진한 0.8×30㎝ 미셀-밀러 유리 칼럼상에서 분석용 HPLPLC로 인자 D의 존재에 대해 시험한다. 물 : 아세토니트릴 : 염화나트륨(84 : 16 : 2g/ℓ) 용매를 FMI 펌프를 사용하여 분당 4㎖로 공급한다. 인자 D는 ISCO 모델 UA-5UV 검출계를 사용하여 254nm에서 검출한다. 분획 1부터 34까지는 버린다. 인자 D가 풍부한 분획 35부터 53까지를 합하고 감압하에서 용량이 500㎖가 되도록 농축한다.

2번의 유사한 정제로부터 얻은 농축물을 합하여 물로 3ℓ가 되도록 희석하고, 물로 미리 평형화시킨 칼럼(2.8×22㎝) 중의 다이아이온 HP-20 수지 100㎖에 분당 8 내지 10㎖로 가한다. 세액에서 염화물이 염화은 침전으로 검출되지 않을 때까지 칼럼을 물(300㎖)로 세척한다. 물 : 아세토니트릴(6 : 4)로 이루어진 용매 1ℓ로 분당 8 내지 10㎖의 속도로 용출시킨다. 용출액을 감압하에서 농축하고 동결건조시켜 인자 D가 풍부한 인자들의 혼합물 2.33g을 수득한다.

이 혼합물중 1.15g을 용액에 형성될 때까지 테트라부틸암모늄 하이드록사이드를 첨가하여 물 : 아세토니트릴 : 디부틸아민으로 이루어진 용매(80 : 20 : 0.03몰, 용매는 인산을 가하여 pH 7.8로 조정한다) 25㎖에 용해시킨다. 샘플을 25 내지 40마이크론 리크로프레프 RP-8로 충진된 2.8×59㎝ 미셀-밀러 유리 칼럼에 가하고 칼럼을 FMI 펌프를 사용하여, 샘플을 용해시키는데 사용한 것과 동일한 조성의 용매로 분당 5㎖로 용출시킨다. 용출액은 ISCO 모델 UA-5UV 검출계를 사용하여 254nm에서 검사한다. 선별된 25㎖씩의 분획을 10마이크론 리크로소르브 RP-18(시판품, 역전상 실리카겔, E. Merck, Darmstadt, Germany의 제품)로 충진된 4.6×25㎜ 스테인레스 강철 칼럼상에서 분석용 HPLC에 의해 인자 D의 존재에 대해 시험한다. 샘플을 레오다인 모델 7120 주입밸브를 사용하여 가한다. 인산을 가하여 pH 2.5로 조정한 물 : 아세토니트릴 : 디부틸아민(80 : 20 : 0.03몰)으로 이루어진 용매를 밀톤 로이 듀플렉스 미니펌프를 사용하여 분당 0.75㎖로 공급한다. 인자 D는 ISCO 모델 1800 가변성파장 UV 검출계를 사용하여 225nm에서 검출된다. 인자 D가 풍부한 2.6 내지 3.4ℓ로부터의 용출액 부분을 감압하에서 300㎖ 용량이 되도록 농축한다.

3회의 유사한 정제로부터 얻은 농축물을 합하여 인산을 가하여 용해시키고 pH 7.7로 한다. 이온 표지물로 염화나트륨(1㎎/㎖)을 가한다. 샘플을 물로 미리 평형화시킨 칼럼(2.8×22㎝) 중의 다이아이온 HP-20 수지 100㎖에 분당 20㎖로 가한다. 칼럼을 염화물이 세액에서 염화은 침전으로 검출되지 않을 때까지 pH 2.5의 수성 포름산(300㎖)으로 세척한다. 칼럼을 물 : 아세토니트릴(6 : 4) 1ℓ로 분당 30㎖의 속도로 용출시킨다. 용출액을 감압하에서 농축하고, 동결건조시켜 부분적으로 정제된 인자 D 0.63g을 수득한다. 이 제제를 용액이 형성될 때까지 테트라부틸암모늄 하이드록사이드를 가하여 물 : 아세토니트릴 : 디부틸아민으로 이루어진 용매(80 : 20 : 0.03몰, 용매는 인산을 가하여 pH 7.8로 조정한다) 15㎖에 용해시킨다. 용액을 전술한 바와 같은 방법으로 2.8×59㎝ 미셀-밀러 유리 칼럼중의 25 내지 40마이크론 리크로프레프 RP-8상에 크로마토그라피한다. 2.5 내지 3.0ℓ로부터 얻은 용출액 부분을 감압하에서 200㎖ 용량으로 농축시킨다. 이 농축물을 전술한 바와 같은 양식으로 다이아이온 HP-20 수지를 함유하는 칼럼상에서 탈염시킨다. 용출액을 감압하에서 농축하고 동결건조시켜 부분적으로 정제된 인자 D 193㎎을 수득한다.

2개의 부분적으로 정제된 인자 D제제를 합친 것 중의 259㎎을 물 : 아세토니트릴 : 제2인산나트륨으로 이루어진 용매(82 : 18 : 0.03몰, 용매는 인산을 가하여 pH 7.8로 조정한다) 6㎖에 용해시키고 수성 5N NaOH를 가하여 pH 10이 되도록 조정한다. 용액을 25 내지 40마이크론 리크로프레프 RP-8로 충진된 2.8×59㎝ 미셀-밀러 유리 칼럼에 가하고, 칼럼을 FMI 펌프를 사용하여 샘플을 용해시키는데 사용한 것과 동일한 조성의 용매로 분당 4㎖로 용출시킨다. 용출액은 ISCO 모델 UA-5UV 검출계를 사용하여 254nm에서 검사한다. 선별된 27㎖씩의 분획을, 실험실에서 10마이크론 뉴클레오실 C₁₈로 충진된 4.6×150㎜ 스테인레스 강철 칼럼상에서 분석용 HPLC에 의해 인자 D의 존재에 대하여 시험한다. 샘플을 레오다인 모델 7120 주입 밸브를 사용하여 가한다. 제제 용출에 사용한 것과 동일한 조성의 용매를 밀톤 로이 듀플렉스 미니펌프로 분당 0.6㎖로 공급한다. 인자 D는 ISCO 모델 1800 가변성파장 UV 검출계를 사용하여 225nm에서 검출된다. 405 내지 1134㎖로부터 얻은 용출액 부분을 감압하에서 500㎖의 용량이 되도록 농축하고, 전술한 바와같은 양식으로 다이아이온 HP-2- 수지를 함유하는 칼럼상에서 탈염시킨다. 용출액을 감압하에서 농축하고 동결건조시켜 인자 D120㎎을 수득한다.

항생물질 A41030 인자 D는 다음과 같은 대략의 원소 분석치를 갖는 백색 무정형 고체이다 : 탄소 54.46%, 수소 4.35%, 질소 7.58%, 염소 4.27%, 및 나머지는 산소 29.34%. 물 중의 66% 디메틸포름아미드내에서 인자 D를 전기적 적정하면 가능한 추가의 pKa값>10(초기 pH 6.6)와 함께 각각 pKa값이 약 5.5 및 7.6인 2개의 적정 가능한 그룹의 존재가 확인된다. 고속 원자 포격 질량 분광분석을 사용하여 약 1326의 실측 분자량을 얻는다.

KBr 펠렛법에 의한 항생물질 A41030 인자 D의 적외선 흡수 스펙트럼은 첨부된 도면인 제4도와 같다. 다음과 같은 식별 가능한 최대 흡수가 관찰된다 : 3448-3226(강, 브로드), 2959(약), 1661(강), 1592(강), 1511(강), 1429(약), 1290(약), 1227(약), 1212(중), 1163(약), 1143(약), 1053(중) 및 1010c(강)㎝^-1.

중성, 산성 및 염기성 메탄올 : 물(1 : 1) 중에서 A41030 인자 D의 자외선 최대 흡수는 상기 표 5에 기술되어 있다.

항생물질 A41030 인자 D는 A와 같이 동일 용매로 용해한다.

측정된 물리화학적 데이타를 기초로 하여, A41030 일자 D의 구조는 다음과 같은 것으로 믿어진다.

(추가로 하나 또는 그 이상의 n-부틸그룹)

[실시예 7]

A41030 인자 E의 분리

A41030 복합체 3.0g을 물 : 아세토니트릴 : 염화나트륨(85 : 15 : 2g/ℓ)으로 이루어진 용매 30㎖에 용해시키고, 실험실에서 25 내지 40마이크론 리크로프레프 RP-8로 충진된 2.8×59㎝ 미셀-밀러 유리 칼럼에 가한다. FMI 펌프를 사용하여 샘플을 용해시키는데 사용한 것과 동일한 조성의 용매로 칼럼을 분당12㎖(85psi)로 용출시키고, 24㎖씩의 분획을 모은다. 용출액을 ISCO 모델 UA-5UV 검출계를 사용하여 254nm에서 검사한다. 분획 1부터 54까지는 버린다. 인자 E가 풍부한 분획 55부터 122까지를 합하고 감압하에서 용량이 50㎖가 되도록 농축한다.

13회의 유사한 정제로부터 얻은 농축물을 합하여 물을 가하여 1.5ℓ로 희석하고, 물로 미리 평형화시킨 칼럼(2.8×22㎝)중의 다이아이온 HP-20 수지 100㎖에 분당 5㎖로 가한다. 세액에서 염화물이 염화은 침전으로 검출되지 않을 때까지 칼럼을 물(900㎖)로 세척한다. 다음에 물 : 에탄올(1 : 1)을 사용하여 분당 10㎖로 용출시켜 300㎖씩으로 분획을 모은다. 분획들은 비. 서브틸리스에 대한 활성에 관하여 시험한다. 분획 1부터 8까지를 합하여 감압하에서 농축하고 동결건조시켜 일자 E가 풍부한 인자들의 혼합물 1.04g을 수득한다. 이 혼합물중 0.5g을 물 : 아세토니트릴 : 염화나트륨(84 : 14 : 2g/ℓ)으로 이루어진 용매 10㎖에 용해시키고, 25 내지 40마이크론 리크로프레프 RP-8로 충진된 2.8×59㎝ 미셀-밀러 유리 칼럼에 가한다. FMI 펌프를 사용하여 샘플을 용해시키는데 사용한 것과 동일한 조성의 용매로 분당 5㎖로 칼럼을 용출시키고, 25㎖씩의 분획을 모은다. 용출액을 ISCO 모델 UA-5UV 검출계를 사용하여 254nm에서 검사한다. 선별된 분획을 실험실에서 5마이크론 ODS-하이퍼슈피어즈(Hyperspheres) (Shandon Southern Products, Ltd., Cheshire, England)로 충진된 4.6×150㎜ 스테일레스 강철 칼럼상에서 분석용 HPLC에 의해 인자 E의 존재에 대해 시험한다. 샘플은 레오다인 모델 7120 주입밸브를 사용하여 가한다. 빙초산을 가하여 pH 6으로 조정된 물 : 아세토니트릴 : 나트륨아세테이트(81 : 19 : 2g/ℓ)로 이루어진 용매를 밀톤 로이 듀플렉스 미니 펌프로 분당 0.65㎖로 공급한다. 인자 E는 ISCO 모델 1800 가변성파장 UV 검출계를 사용하여 225nm에서 검출한다. 1,520 내지 1,780㎖로부터 얻은 용출액 부분을 감압하에서 50㎖ 용량이 되도록 농축시킨다.

3회의 유사한 정제로부터 얻은 농축물을 합쳐서, 물 1ℓ로 희석하고 물로 미리 평형화시킨 칼럼(2.8×22㎝) 중의 다이아이온 HP-20 수지 100㎖에 분당 10㎖로 가한다. 칼럼을 세액에서 염화물이 염화은 침전으로 검출되지 않을 때까지 수성 포름산을 가하여 pH 2.5로 조정된 물(200㎖)로 세척한다. 물 : 아세토니트릴(6 : 4) 0.5ℓ를 사용하여 분당 15㎖로 용출시킨다. 용출액을 감압하에서 농축하고, 동결건조시켜 부분적으로 정제된 인자 E 202.2㎎을 수득한다. 이 제제를 물 : 아세토니트릴 : 염화나트륜(86 : 14 : 2g/ℓ)으로 이루어진 용매 4㎖에 용해시키고, 전술한 바와 같이 25 내지 40마이크론 리크로프레프 RP-8로 충진된 2.8×59㎝ 미셀-밀러 유리 칼럼상에서 분당 4㎖로 크로마토그라피한다. 인자 E가 풍부한 2,060 내지 2,480㎖로부터 얻은 용출액 부분을 감압하에서 50㎖ 용량이 되도록 농축한다. 3회의 유사한 정제로부터 얻은 농축물을 합하여 전술한 바와 같이 칼럼내의 다이아이온 HP-20 수지 100㎖상에서 탈염시킨다. 용출액을 감압하에서 농축하고 동결건조시켜 인자 E 242㎎을 수득한다.

항생물질 A41030 인자 E는 다음과 같은 대략의 원소 분석치를 값는 백색 고체이다 : 탄소 56.06%, 수소 4.06%, 질소 8.53%, 염소 3.50%, 및 나머지는 산소 27.8%. 물중의 66% 디메틸포름아미드내에서 인자 E를 전기적 적정하면 가능한 추가의 pKa값>10(초기 pH 6.57)와 함께 각각 pKa값이 약 5.8 및 7.7일 2개의 적정 가능한 그룹의 존재가 확인된다. 고속 원자 포격 질량 분광분석을 사용하여 약 1163의 실측 분자량을 얻는다. 인자 E의 잠정 실험식은 C₅₈H₄₆ClN₇O₁₈로 인정된다.

KBr 펠렛법에 의한 항생물질 A41030 인자 E의 적외선 흡수 스펙트럼은 첨부된 도면인 제5도에서 보는 바와 같다. 다음과 같은 식별 가능한 최대 흡수가 관찰된다 : 3448-3226(강, 브로드), 1653(강), 1600(중), 1504(강), 1429(약), 1290(약), 1198(중), 1136(약), 1064(약) 및 1010(강)㎝^-1.

중성, 산성 및 염기성 메탄올 : 물(1 : 1) 중에서 A41030 인자 E의 자외선 최대 흡수는 상기 표 5에 기술하였다.

항생물질 A41030 인자 E는 A와 같이 동일 용매로 용해한다.

측정된 물리화학적 데이타를 기초로 하여, A41030 일자 E는 다음과 같은 구조로 확인된다.

[실시예 8]

A41030 인자 F의 분리

A41030 복합체중 9.0g을 물 : 아세토니트릴 : 염화나트륨(83 : 17 : 2g/ℓ)으로 이루어진 용매 200㎖에 용해시키고 용액을 여과한다. 여액을 실시예 3에 기술된 특정 공정에 이해 실험실에서 제조한 10 내지 20마이크론 LP-1/C₁₈역전상 실리카겔 4ℓ로 충진된 8×100㎝ 스테인레스 강철 칼럼에 가한다. 크로마토스펙프레프-100 단위중의 부분인 칼럼을, 샘플을 용해시키는데 사용한 것과 동일한 조성의 용매로 분당 60㎖로 용출시켜 480㎖씩의 분획을 모은다. 용출액은 ISCO 모델 UA-5UV 검출계를 사용하여 254nm에서 검사한다. 선별된 분획을 실험실에서 25 내지 40마이크론 리크로프레프 RP-8로 충진된 0.8×30㎝ 미셀-밀러 유리 칼럼상에서 분석용 HPLPLC함에 의해 인자 F의 존재에 대해 시험한다. 물 : 아세토니트릴 : 염화나트륨(84 : 16 : 2g/ℓ) 용매를 FMI 펌프를 사용하여 분당 4㎖로 공급한다. 인자 F는 ISCO 모델 UA-5UV검출계를 사용하여 254nm에서 검출된다. 분획 1부터 25까지는 버린다. 인자 F가 풍부한 분획 26부터 36까지를 합하고 감압하에서 약 500㎖ 용량이 되도록 농축한다.

3회의 유사한 정제로부터 얻은 농축물을 합하여 여과하고 여액을 물로 미리 평형화시킨 칼럼(2.8×22㎝) 중의 다이아이온 HP-20 수지 100㎖에 분당 10㎖로 가한다. 칼럼을 세액에서 염화물이 염화은 침전으로 검출되지 않을 때까지 물(900㎖)로 세척한다. 물 : 아세토니트릴(6 : 4) 1ℓ를 사용하여 분당 15㎖로 용출시킨다. 용출액을 감압하에서 농축하고 동결건조시켜 부분적으로 정제된 인자 F 2.6g을 수득한다. 이 제제중 500㎎을 수성 수산화나트륨을 가해 pH 7.0으로 조정하여 물 : 아세토니트릴 : 염화나트륜(84 : 16 : 2g/ℓ)으로 이루어진 용매 10㎖에 용해시킨다. 용액을 실험실에서 25 내지 40마이크론 리크로프레프 RP-18로 충진된 4.7×45㎝ 미셀-밀러 유리 칼럼에 가한다. FMI 펌프를 사용하여 샘플을 용해시키는데 사용한 것과 동일한 조성의 용매로 분당 6㎖로 칼럼을 용출시킨다. 용출액은 ISCO 모델 UA-5UV 검출계를 사용하여 254nm에서 검사한다. 선별된 분획을 전술한 바와 같은 분석용 HPLPLC계를 사용하여 인자 F의 존재에 대하여 시험한다. 인자 F가 풍부한 1,940 내지 2,520㎖로부터 얻은 용출액 부분을 감압하에서 약 300㎖ 용량이 되도록 농축시킨다.

2회의 유사한 정제로부터 얻은 농축물을 합하여, 물로 미리 평형화시킨 칼럼(2.8×22㎝) 중의 다이아이온 HP-20 수지 100㎖에 분당 10㎖로 가한다. 칼럼은, 세액중에서 염화물이 염화은 침전으로 검출되지 않을때까지 포름산을 가하여 pH 2.5로 조정함 물(300㎖)로 세척한다. 물 : 아세토니트릴(6 : 4) 0.75ℓ를 사용하여 용출시킨다. 용출액은 감압하에서 농축하고 동결건조시켜 인자 F 299㎎을 수득한다.

항생물질 A41030 인자 F는 다음과 같은 대략의 원소 분석치를 갖는 백색 고체이다 : 탄소 51.39%, 수소 3.96%, 염소 6.45%, 질소 6.45% 및 산소 28.65%. 물중의 66% 디메틸포름아미드 내에서 인자 F를 전기적 적정하면 추가로 가능한 pKa값>10(초기 pH 5.93)과 함께 각각 pKa값이 약 5.4 및 7.1인 2개의 적정 가능한 그룹의 존재가 확인된다. 고속 원자 포격 질량 분광분석을 사용하여 약 1555의 실측 분자량을 얻는다. 인자 F의 잠정 실험식은 C₇₀H₆₄Cl₃N₇O₂₈로 인정된다.

분자량 데이타는 인자 F가 2개의 당 부분을 더 가지고 있기 때문에 인자 A와 다르다는 것을 시사하며, 일정하지 않은 분자량은 아미노당이 존재하지 않음을 나타내는 것이다.

KBr 펠렛법에 의한 항생물질 A41030 인자 F의 적외선 흡수 스펙트럼은 첨부된 도면중 제6도와 같다. 다음과 같은 식별 가능한 최대 흡수가 관찰된다 : 3448-3226(강, 브로드), 1653(강), 1600(중), 1504(강), 1429(약), 1258(약), 1227(강), 1136(강), 1075(강), 1053(강) 및 1010(강)㎝^-1.

중성, 산성 및 염기성 메탄올 : 물(1 : 1) 중에서 A41030 인자 F의 자외선 최대 흡수는 상기 표 5에 기술되어 있다.

항생물질 A41030 인자 F는 인자 A와 같이 동일 용매에 용해한다.

측정된 물리화학적 데이타를 기초로 하여, A41030 일자 F는 다음과 같은 구조로 확인된다 :

[실시예 9]

A41030 인자 G의 분리

실시예 2에서 얻은 A41030 복합체중 8g을 물 : 아세토니트릴 : 염화나트륨(84 : 16 : 2g/ℓ)으로 이루어진 용매 200㎖에 용해시키고 여과한다. 여액을 실시예 3에 기술된 특별한 공정으로 제조된 10 내지 20마이크론 LP-1/C₁₈역전상 실리카겔 4ℓ로 충진된 스테인레스 강철 칼럼(8×100㎝)에 가한다. 칼럼은 크로마토스펙프레프-100 단위(참조 실시예 3)의 일부이다. 칼럼을 물 : 아세토니트릴 : 염화나트륨(84 : 16 : 2g/ℓ)을 사용하여 분당 60㎖로 용출시키고, 480㎖씩의 분획을 모은다. 용출액은 실시예 3에 기술된 바와 같이 254nm에서 검사한다. 선별된 분획에 대하여 전술한 실시예에 기술된 분석용 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC) 공정으로 인자 G의 존재를 시험한다.

인자 G가 풍부한 분획 22부터 35까지를 합하여 감압하에서 500㎖의 용량이 되도록 농축한다. 3회의 유사한 정제로부터 얻은 농축물을 합하여 수성 수산화나트륨을 가해 pH 8.5로 조정하고 여과한다. 여액은 물로 미리 평형화시킨 칼럼(2.8×22㎝) 중의 다이아이온 HP-20 수지 100㎖에 분당 10㎖로 가한다. 칼럼은 세액에서 염화물이 염화은 침전으로 검출되지 않을 때까지 물(400㎖, 포름산을 가하여 pH 2.5로 조정된다)로 세척한다. 물 : 아세토니트릴(6 : 4)을 사용하여 분당 15㎖로 용출시켜 1ℓ씩의 분획을 모은다. 분획은 비. 서브틸리스에 대한 활성을 시험한다. 활성 분획을 모아 감압하에서 농축시키고, 동결건조하여 물질 2.85g을 얻는다.

이 물질중 0.5g을 용액이 형성될 때까지(최종 pH8.2) 디부틸아민을 가하여 물 : 아세토니트릴 : 디부틸아민으로 이루어진 용매(80 : 20 : 0.03몰, 용매는 인산을 가하여 pH 7.8으로 조정된다) 10㎖에 용해시킨다. 용액은 25 내지 40마이크론 리크로프레프 RP-8 (MC/B Manufacturing Chemist, Inc., Cincinnati, OH)로 충진된 2.8×59㎝ 미셀-밀러 HPLPLC 유리 칼럼에 가한다.

FMI 펌프를 사용하여 샘플을 용해시키는데 사용한 것과 동일한 조성의 용매로 칼럼을 분당 4㎖로 용출시킨다. 용출액은 ISCO 모델 UA-5UV 검출계를 사용하여 254nm에서 검사한다. 선별된 10㎖ 분획들은 전술한 실시예에 기술된 분석용 HPLC 공정에 의해 인자 G의 존재에 대하여 시험한다.

인자 G가 풍부한 분획 54부터 74까지를 2회의 유사한 정제로부터 얻은 분획과 합쳐서 물로 미리 평형화시킨 칼럼(2.8×22㎝) 내의 다이아이온 HP-20 수지 100㎖에 분당 10㎖ 로 가한다. 칼럼을 세액에서 염화물이 염화은 침전으로 검출되지 않을 때까지 포름산을 가하여 pH 2.5로 조정된 물(300㎖ )로 세척한다. 물 : 아세토니트릴(6 : 4) 0.75ℓ로 용출시킨다. 용출액을 감압하에서 농축하고 동결건조시켜 인자 G 960㎎을 수득한다.

항생물질 A41030 인자 G는 다음과 같은 대략의 원소 분석치를 갖는 백색 고체이다 : 탄소 50.02%, 수소 4.61%, 염소 4.74%, 질소 6.11%, 및 산소 30.70%. 물중의 66% 디메틸포름아미드내에서 인자 G를 전기적 적정하면 추가로 가능한 pKa값>10.5(초기 pH 6.32)과 함께 각각 pKa값이 약 5.4 및 7.0인 적정가능한 그룹의 존재가 인정된다. 고속 원자 포격 질량 분광분석을 사용하여 약 1684의 실측 분자량을 얻어진다.

KBr 펠렛법에 의한 항생물질 A41030 인자 G의 적외선 흡수 스펙트럼은 첨부된 도면 제7도와 같다. 다음과 같은 식별 가능한 최대 흡수가 관찰된다 : 3320(매우 브로드, 강), 2975(샤프, 약), 2920(샤프, 약), 1659(노말, 강), 1594(브로드, 강), 1512(샤프, 강), 1492(쇼울더), 1430(샤프, 약), 1386(브로드, 약), 1337(브로드, 약), 1308(샤프, 약), 1264(샤프, 약), 1230(브로드, 중)< 1145(브로드, 중), 1077(샤프, 중), 1062(샤프, 중), 1014(샤프, 중) 및 846(브로드, 중)㎝^-1.

중성, 산성 및 염기성 메탄올 : 물(1 : 1)내의 A41030 인자 G의 자외선 최대 흡수는 상기 표 5에 기술되어 있다.

항생물질 A41030 인자 G는 인자 A와 같이 동일 용매에 용해한다.

A41030 복합체의 인자 A, B, C, D, E, F 및 G는 실리카겔 박층 크로마토그라피(TLC) 및 여지크로마토그라피를 사용하여 분리할 수 있으며 서로서로 구별할 수 있다. 생물학적 자기 묘사법에 사용하는 미생물은 바실루스 서브틸리스이다. 이동율(Rx)은 1.00의 값으로 주어진 A41030 인자 A에 비례하여 표시된 것으로 표 6에 기술되어 있다.

[표 6]

계 A

여지 : 와트만 1호(비처리)

용매 ; 물 : 메탄올(1 : 1)로 포화된 n-부탄올

계 B

흡착제 ; 머크-다름스타트-실리카겔 60

용 매 ; 아세토니트릴 : 에탄올 : 물 (8 : 1 : 1.5)

A41030 인자 A부터 G까지의 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC)저류 시간은 인산을 가하여 pH 2.5로 조정된 물 : 아세토니트릴 : 디부틸아민(82 : 18 : 0.03몰)으로 이루어진 용매와, 충진제로 10마이크론 리크로소르브 RP-18을 함유하는 스테인레스 강철 칼럼을 사용하여 측정된다. 용매는 분당 0.75㎖의 유속으로 가한다. 용출액은 225nm에서의 UV 흡수로 검사한다. A41030 인자 A의 저류시간에 대한 각 인자의 저류 시간의 비인 상대저류값은 표 7에 기술되어 있다.

[표 7]

항생물질 A41030의 여러 인자들은 아미노그룹과 카복실산 기능을 모두 함유하는 양쪽성이기 때문에 적합한 산 및 염기와 염을 형성할 수 있다. 이렇게 하여 형성된 약제학적으로 무독한 염은 또한 본 발명에 포함된다. "약제학적으로 무독한"염은 온혈동물의 화학요법에 유용한 염이다. A41030 인자 A, B, C, D, E, F 및 G의 대표적이며 적합한 염은 유기 및 무기산, 예를 들어 황산, 인산, 염산, 아세트산, 석신산, 시트르산, 락트산, 말레산, 푸마르산, 팔미트산, 콜산, 파모산, 무스산, D-글루탐산, d-캄포산, 글루타르산, 글리콜산, 프탈산, 타타르산, 라우르산, 스테아르산, 살리실산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 소르브산, 피크르산, 벤조산, 신남산 등의 산과의 표준 반응으로 형성된 산부가염뿐 아니라 카복실산 기능과 염기, 예를 들어 수산화나트륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 수산화칼슘, 수산화칼륨, 트리메탈아민, 수산화암모늄, 디에탄올아민 등의 염기와의 반응으로 형성된 염도 포함한다.

항생물질 A41030 복합체 및 그의 인자들은 스타필로코커스 및 스트렙토코커스 종을 포함한 그람양성균에 대하여 활성이 있다. 이들 항생물질은 또한 가끔 돼지 및 소에서 성장을 촉진하여 사료 효율을 개선시키는 활성을 나타낸다.

A41030 복합체 및 개개 인자들의 활성은 다음에 기술하는 여러 종류의 시험에 의해 증명되었다.

[실시예 10]

생물학적 시험을 위한 샘플 제조 및 건조된 전육급내에서 A41030 인자 A의 정량분석

전육즙 1리터를 200㎖의 용량이 되도록 농축시키고, 동결건조하여 건조된 전육즙 31.5g을 수득한다. 건조된 전육즙 샘플 400㎎을 pH 8.5에서 물 10㎖씩으로 3회 추출한다. 추출물을 합하여 10㎖ 용량이 되도록 농축시키고, 이 농축물의 일부를 생물학적 시험에 사용한다. 혼탁도 측정 시험은 엔. 알. 쿠젤 및 에프. 더블유. 카바나우[N.R. Kuzel and F.W. Kavanaugh in J. Pharmaceut. Sci. 60(5), 764 and 767(1971)]가 기술한 반자동계(Autoturb

미생물 시험계, Elanco)상에서 수행한다. A41030복합체를 시험함에 있어서, 다음과 같은 시험 파라메터(parameter)가 사용된다 : 37℃에서 4시간 동안 배양한 영양육즙 배지(pH 7)내의 스타필로코커스 오레우스 ATCC 9144. 시험 샘플과 표준품은 메탄올 : 물(1 : 1)내에 용해시킨다. 표준품 A41030 인자 A는 0.4, 0.6, 0.9, 1.2 및 1.5mcg/㎖의 농도로 오토터브

캐로우셀(Autoturb

carousel)을 사용할 수 있다.

상기 농축물 1㎖를 HPLC에 의한 분석용으로 사용하기 위해 다음 공정에 따라 정제한다.

(a) 한개의 C-18 SEP-PAR

카트리지(실리카겔 카트리지, Waters Associates, Inc., Milford, Mass. )를 본 분야에서 공지된 루어 휘팅(Luer fitting)으로 10㎖ 시린지를 사용하여 메탄올 10㎖로 세척한다.

(b) 동일한 카트리지를 물 10㎖로 세척한다.

(c) 상기의 농축물 1㎖를 분당 약 1㎖의 속도로 카트리지에 가한다.

(d) 카트리지를 물 1㎖로 세척하고 카트리지를 송풍 건조시킨다.

(e) 카트리지를 테트라하이드로푸란 : 물(1 : 1)의 용액 1㎖로 분당 약 0.5㎖로 용출시킨다.

(f) 용출액으로부터 진공중에서 또는 질소류하에서 테트라하이드로푸란을 제거하고, 용출액은 물을 가하여 1㎖가 되도록 재조제한다.

(g) 전술한 바와 같은 HPLC 공정에 의해 용액을 시험한다.

전육즙의 생물학적 활성시험 및 HPLC 분석의 결과는 표 8에 기술되어 있다.

[표 8]

전육즙내에서 A41030A의 생물학적 활성 및 HPLC 분석

* A41030인자 A, B, C, D, E, F 및 G로 이루어진 총 생물학적 활성.

-HPLC로 측정한 A.

한천-희석 시험 방법

MIC값을 측정하기 위해 International Collaborative Study (ICS) 그룹에 의해 기술된 한천 희석법을 사용한다.

한천 희석 시험방법으로 항생물질 A41030 인자 A를 시험하여 얻은 결과는 다음 표 9에 기술되어 있다.

[표 9]

A41030 인자 A의 활성

시험미생물 (㎍/㎖)

스타필로코커스 오레우스 3055* <0.5

스타필로코커스 오레우스 3074** <0.5

스트렙토코커스 화에칼리스 X66 <0.5

*벤질페니실린-감수성

**벤질페니실린-저항성

디스크-플레이트 감수성 시험

시험 미생물로 접종한 한천 플레이트를 사용하며, 6㎜ 디스크(0.02㎖ 용액)를 항생물질 용액의 로그 2희석액으로 포화시킨다. 디스크 함량은 사용된 용액 농도의 1/5 또는 1/50인데, 즉, 100㎎ 또는 10㎎의 디스크 함량은 500㎎/㎖ 농도의 용액으로부터 얻는다. 각 디스크 함량에 대한 A41030 인자 A 항생물질에 의해 나타나는 억제대의 범위는 표 10에 기술되어 있다.

[표 10]

A41030 인자 A의 활성

*벤질페니실린-감수성

**벤질페니실린-저항성

***벤질페니실린-저항성, 메티실린-저항성

항상물질 A41030 인자 A는 한천 희석법에 따라 측정하면 헤모필루스 인플루엔자에(Hemophilus influenzae)의 여러 균주에 대하여 활성을 나타낸다. 시험의 결과는 표 11에 기술되어 있다.

[표 11]

헤모필루스 인플루엔자에 균주에 대한 A41030 인자 A의 활성

항생물질 A41030 인자 A는 한척 희석법에 따라 측정하면, 나이세리아 종(Neisseria sp.)에 대하여 활성을 나타낸다. 시험 결과는 표 12에 기술되어 있다.

[표 12]

나이세리아 종에 대한 A41030 인자 A의 활성

한천 희석법에 따라 측정한 항생물질 A41030 인자 A의 여러 종류 세균에 대한 활성은 표 13에 기술되어 있다.

[표 13]

여러 종류의 세균에 대한 A41030 인자 A의 활성

*페니실린-저항성

**페니실린, 메티실린 및 에리스로마이신-저항성

A41030 항생물질, 인자 A, B 및 C는 박테로이데스 종((Bacteroides sp.)과 같은 혐기성 세균속에 대하여 활성이 있으며, 24시간 MIC값은 한천 희석법으로 시험하여 표 14에 기술하였다.

[표 14]

항생물질 A41030 인자 A, B 및 C는 또한 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)와 같은 혐기성 세균속에 대한 시험으로 이들 세균속에 대하여 활성이 있음을 발견하였다.

MIC값은 24시간 한천 희석법으로 측정하여 표 15에 기술되었다.

[표 15]

항생물질 A41030인자 A, B, C, D, E, F 및 G는 표 16에 기술된 바와 같이 여러 종류의 혐기성 세균에 대하여 시험하여 활성이 있음을 발견하였으며, 그 MIC값은 한천 희석법으로 측정하였다.

[표 16]

항생물질 A41030 인자 A, B 및 C는 각각 펩토코커스(Peptococcus) 및 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus)와 같은 혐기성 구균의 2가지 속의 여러종에 대하여 활성을 나타낸다. MIC값은 한천 희석법으로 측정하였으며, 표 17에 기술하였다.

[표 17]

A41030 항생물질 인자 A, B, C, D, E, F 및 G는 또한 한천 희석법에 따라 측정된 바와 같이 클로스트리디움디휘실례(clostridium difficile)의 여러균주에 대하여 활성이 있다.

시험이 결과는 다음 표 18에 기술되어 있다.

[표 18]

여러 종류의 호기성 세균에 대한 항생물질 A41030 인자 A, B, C, D, E, F 및 G의 시험관내 활성은 표준한천 희석시험을 사용하여 측정한다. 24시간후에 종말점을 판독한 후의 결과는 표 19에 기술되었다.

[표 19]

-=시험하지 않음.

스트렙코커스 종, 그룹 D를 포함한 여러 종의 대표적인 호기성, 그람 양성균에 대한 항상물질 A41030인자 A 및 B의 시험관내 활성은 표준 한천 희석 시험을 사용하여 측정한다. 24시간 후의 종말점을 판독하여 측정한 결과는 표 20에 기술된 바와 같다.

[표 20]

호기성 세균에 대한 A41030 인자 A 및 B의 활성

여러종의 동물 병원체에 대한 항생물질 A41030 복합체의 활성은 표준 시험관내 항미생물 육즙 마이크로 타이터 시험으로 측정하며, 그 결과는 표 21에 기술되어 있다.

[표 21]

여러 동물 병원체에 대한 A41030 복합체의 활성

시험한 A41030 인자의 모두는 실험적 세균감염에 대하여 생체내에서 항 미생물 활성을 나타낸다. 시험 화합물의 2가지 용량을 예증적 감염이 있는 생쥐에게 피하 투여하면, 관찰된 활성을 ED₅₀값으로 측정된다[시험 동물의 50%를 보호하는 유효 용량 mg/kg : 참조 Warren Wick, et al., J. Bacteriol. 81, 233-235(1961)]. A41030 인자 A, B, C, D, E 및 F에 대하여 측정된 ED₅₀값은 다음 표 22에 주어졌다.

[표 22]

황생물질 A41030 인자 A, B 및 C 각각의 급성 독성은 생쥐에게 복강내 투여하였을 때 >300mg/kg으로 측정되었다.

항생물질 A41030 인자 A, B 및 C 각각의 LD₅₀은 생쥐에게 복강내 투여하였을때 >300mg/kg으로 측정되었다.

생쥐에게서 에스. 파이오제네스에 대하여 측정된 바와 같이 항생물질 A41030 인자 A, B 및 C 각각의 생체내 경구 활성은 >300mg/kg×2이다.

본 발명의 한 관점에서, 본 발명은 A41030 항생물질 복합체 또는 그의 인자 또는 이들의 약제학적으로 무독한 염의 화합요법적 유효량, 예를 들면 약 25mg 내지 약 2,000mg을 온혈 동물에게 투여함을 특징으로 하여 온혈 동물에서의 감염을 치료하는 방법을 제공한다.

인자 A 또는 그의 약제학적으로 무독한 염은 인간에게서의 감염을 치료하는데 사용할 수 있지만, 일반적으로 복합체 및 다른 인자들, 및 이들의 염이 다른 온혈동물의 감염을 치료하는데 가장 적합하다.

인간의 간염증을 치료함에 있어서, 항생물질 인자, 바람직하게는 인자 A는 근육 주사 또는 정맥내 주입과 같은 비경구식 투여 방법으로 투여할 수 있다. 주사용으로 항생물질 또는 그의 약제학적으로 무독한 염을 원하는 농도롤 생리적으로 무독한 희석제 에 용해시켜 투여한다. 적합한 희석제는 예를들어, 주사용 물, 0.9%식염, 5% 덱스트로즈, 링거 용액 또는 기타 통상적으로 사용되는 희석제를 포함한다. 정맥내 주입시켜 투여하기 위해서는 항생제 또는 그의 염을 적합한 농도로, 예를들어 약 5% 내지 약 10%의 농도로 생리적 액체 또는 묽은 영양액중에서 조합시킬 수 있으며 액체와 함께 서서히 주입한다. 또한 항생물질은 "피기-백(piggy-back)" 방법으로 투여할 수 있다.

개개 인자, 인자들의 조합 또는 인자들 전부의 복합체 및 이들의 약제학적으로 무독한 염은 밀봉적으로 밀폐된 바이알, 멸균 고무 마게된 바이알 또는 플라스틱 포우치(pouches)내에서 단위 용량제형으로 구성될 수 있다. 이러한 단위 용량제형으로 구성될 수 있다. 이러한 단위 용량제형은 산화방지제, 안정화제, 분산제, 완충제 등과 같은 부형제를 함유할 수 있다. 이러한 단위 용량제형 1개는 고무(부틸고무) 마개된 바이알중에 인자 A, 또는 그의 약제학적으로 무독한 염 100mg을 함유한다. 다른 단위 용량제형은 멸균 밀폐된 바이알내에 인자 A 또는 그의 염 250mg을 함유한다. 정맥내 주입용인 본 발명의 단위 용량제형은 플라스틱 포우치 중에 인자 A 또는 그의 약제학적으로 무독한 염 5g을 함유할 수 있다.

항균제로 사용하는 경우에, A41030 복합체 또는 A41030 인자는 경구로 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 본 분야에서 숙련된 사람에게서 기대되는 바와 같이 A41030 복합체 또는 인자는 일반적으로 약제학적으로 무독한 담체 또는 희석제와 함께 투여된다. A41030 복합체 또는 인자의 용량은 치료되어야 하는 특정 감염증의 성질 및 중증도와 같은 상황에 따라 좌우된다. 투여하기 위한 적절한 용량 범위 및/ 또는 용량 단위는 환자 또는 숙주 및 감염 미생물과 같은 요인들과 함께 본 명세서에 제공된 MIC 및 ED₅₀값과 독성 데이타를 고려하여 결정할 수 있다는 것은 본 분야에서 숙련된 사람에게는 잘 알려져 있다.

A41030 항생물질은 그중에서도 스타필로코커스, 스트렙토코커스 및 프로피오니박테리움 아크네스와 같은 미생물의 성장을 억제하는데 유용하며, 그러므로 항생물질은 예를들어 여드름의 치료에 사용될 수 있다. A41030 개개인자 또는 정제된 상태의 이소프로필 알콜과 같은 약제학적으로 무독한 희석제 내에서 제형화 할 수 있다. 이런한 용액은 용량당 약 1 내지 약 15중량%의 항생물질농도로 구성될 수 있다. 또한 항생물질은 피부에 적용하기 위한 크림제 또는 로숀제로 구성할 수 있다.

A41030 항생물질은 또한 장내에서 위장성 대장염(pseudomembranous colitis)을 일으키는 미생물인 클로스트리디움 디휘실레의 성장을 억제하는데 유용하다. A41030 개개 인자들이나 이들의 혼합물은 약제학적으로 무독한 용량형으로 제조된 이들 항생물질 도는 이들의 약제학적으로 무독한 염의 유효량을 경구투여하여 위장성 대장염을 치료하는데 사용할 수 있다. 이러한 용도로, 항생물질은 젤라틴 캅셀제 또는 액체 현탁제로 투여할 수 있다.

본 발명의 항생물질은 또한 가축 및 사육용 동물의 감염성 질병을 치료하는 수의과용 약제로도 사용할 수 있다. 이들은 또한 동물 사육, 즉 식용우 및 다른 반추동물의 성장을 증가시키는데 유용하다. 본 발명의 항생물질의 특별히 중요한 용도는 젖소의 우유 생산을 증가시키는데 있다. 이들 용도는 본 발명의 또다른 관점이며 이것은 다음 단락에 더 상세히 기술되어 있다.

A41030 복합체는 40mcg/ml의 농도로 시험관내에서 감염성 개 간염 바이러스에 대하여 활성을 나타낸다. A41030 복합체는 또한 20mcg/ml로 시험관내에서 위광견병(pseudorabies)에 대하여 활성을 나타내며, A41030 인자 A는 시험관내에서 20mcg/ml로 위광견병에 대해 활성을 나타낸다.

항생물질 A41030 복합체는 닭의 성장 촉진제로써 활성을 나타내며, 시험을 다음과 같이 수행한다.

[시험 1]

이 시험에서는 8일된 페노브스코트((Penobscot) 브로일러인 병아리를 사용한다. 총 560마리의 병아리를 사용하며, 이것을 각각 7마리씩 군으로 나눈다. 35군은 대조용으로 작용하며, 5군을 사료 톤당 항생물질 A41030 복합체 20g의 비율로 표준 병아리 사료에 가해진 항생물질로 처리한다. 사료 및 물은 21일동안 모든 군에 임의로 사용할 수 있다. 시험을 2회 반복하여 수행한다. 1회 또는 2회 반복하여 체중획득의 3% 증가 및/또는 사료 효율의 2% 개선을 활성에 대한 척도로 한다. 결과는 표 23에 기술되어 있다.

[표 23]

따라서 본 발명은 사료 톤당 A41030항생물질 인자 또는 A41030 항생물질 복합체 또는 이들의 약제학적으로 무독한 염 약 20g 내지 약 30g을 닭에게 투여함을 특징으로 하여 닭의 성장을 촉진시키는 방법을 제공한다. 또한 약제학적으로 허용되는 비독성 염의 형태로 항생물질 인자 또는 복합체를 닭의 음료수에 투여할 수 있다.

항생 물질 A41030은 또한 이유(weanling) 돼지에게 투여하였을 때 성장촉진제로 작용한다. 항생물질을 후술하는 바와같이 여러 용량 수준으로 어린돼지에게서 시험하였다.

[시험 2]

항생물질 A41030 복합체는 초기체중이 약 21파운드인 돼지(5내지 7주된 돼지)의 먹이중에 5, 20, 50 및 100ppm의 농도로 시험한다. 시험은 우리중에서 철망바닥을 갖는 환경적으로 억제된 사육시설내에서 수행한다. 27일의 시험기긴동안 각 처리를 5번 반복하며, 반복할 때마다 5마리의 돼지를 사용한다. 이 시험의 결과는 표 24에 기술된 바 있다.

[표 24]

ADG=평균 1일 체중증가

ADF=평균 1일 사료 소비

F/G=체중 증가에 대한 사료 소비의 비율

이 시험에서 항생물질은 5ppm 및 100ppm에서의 반응으로 확인된 바와 같이 이유 돼지의 성장 능력에 있어서 뚜렷한 용량 비례의 증가를 나타낸다.

[시험 3]

항생물질 A41030 복합체는 또한 35일 동안 사료 톤당 25, 50 및 100ppm의 농도로 이유 돼지(17파운드, 4 내지 6주된 돼지)에서 시험한다. 처리당 6마리의 돼지를 사용하여 4번 반복한다.

지정된 농도로 이유 돼지에게 항생물질 A41030 복합체를 투여하면 먹이에 톤당 25, 50 및 100mg을 가했을 때 각각 5.6%, 8.5% 및 7.0%의 체중 증가율과 6.6%, 9.2% 및 3.1%의 사료 전환 효율이 증가된다.

이들 결과는 표 25에 기술되어 있다.

[표 25]

이러한 또다른 관점에서, 본발명은 A41030 항생물질 복합체 또는 A41030 항생물질 인자 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 비독성염 약 5 내지 약 100ppm을 사료에 가하여 돼지에게 투여함을 특징으로 하는 이유 돼지의 성장을 촉진시키는 방법뿐 아니라 사료 톤당 A41030 항생물질 복합체 또는 그의 약제학적으로 허용되는 비독성염 약 25g 내지 약 100g으로 돼지에게 투여함을 특징으로 하는 이유 돼지의 성장을 촉진시키는 방법을 제공한다. 약제학적으로 허용되는 비독성염 형태의 항생물질 A41030 복합체는 음료수중에 가하여 돼지에게 투여할 수 있다.

A41030항생물질은 또한 반추동물의 사료 이용 효율을 증가시키는데 유효하다. 반추동물에서의 탄수화물이용 효율은 동물의 전위세균상(rumen flora)을 자극하여 아세테이트 또는 부티레이트 화합물보다는 프로피오네이트 화합물을 생성시키는 처리에 의해 증가된다(더욱 자세한 설명은 다음 문헌을 참고한다 : Church et al. in "Digestive Physioloogy and Nutrition of Ruminants, vol.2, 1971, pp.622 및 625).

전위내에서 생성되는 휘발성 지방산의 비율을 변화시키는 항생물질 A41030 복합체 및 A41030 인자 A의 효능은 후술하는 방법에 따라 시험관내 시험하여 관찰된다.

[시험 4]

전위액은, 전위내로 열린 외과적으로 장치된 누관(fistula)을 갖는 거세우(steer)로부터 얻는다. 거세우는 곡물립의 함량이 높은 사료를 투여하며 그 조성은 다음과 같다.

전위액의 샘플을 치이즈 클로오드(cheesecloth)의 4층을 통과시켜 거르고, 여액을 진공병중에 모은다. 치이즈 클로오드에 걸려진 미립자물은 충분한 생리적 액체에 재현탁시켜 원래의 전위액 용량으로 만들고, 현탁액은 치이즈클로오드를 통해 다시 거른다. 사용된 완충액은 쳉 등의 문헌[Cheng et al., J. Dairy Sci. 38, 1225 (1955)]에 다음과 같이 기술되었다.

2개의 여액을 분할 깔대기에 넣고 미립자물이 상부로 떠오를때 까지 방치한다. 다음에 등명한 층을 분리하여 동일한 완충액으로 1 : 1희석하고 pH 7.0으로 조정한다.

이렇게 하여 제조된 희석한 전위액 10ml를 상술한 바와같은 조성의, 세분된 곡물립의 함량이 높은 사료 90mg과 함께 25ml 플라스크에 넣는다. 시험화합물을 평량하여 상기한 적절한 용매에 용해시킨다. 용액을 각 시험 플라스크중의 세분된 사료상에 놓고 건조시킨다.

4개의 비처리 대조 플라스크의 셋트 2개 각각을 준비한다. 4개의 비처리 대조 플라스크 셋트 1개를 시험플라스크와 함께 38℃에서 16시간동안 배양한다. 다른 하나의 셋트인 4개의 비처리 대조 플라스크는 0-시(zero-time) 대조군이며, 발효가 중지되자마자 각 플라스크에 25% 메타인산 2ml를 가할 수 있도록 준비한다.

배양시험 및 대조 플라스크에서의 발효는 각 플라스크에 25% 메타인산 2ml르 가하여 16시간의 마지막에 중지된다.

모든 샘플을 정지시켜, 상등액은 가스 크로마토그라피방법에 의해 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트에 대하여 분석한다.

0-시 대조군에서 관찰되는 각 휘발성 지방산에 대한 분석은 비처리 대조군 및 시험 플라스크의 분석으로부터 추정한다. 얻어진 결과는 16시간의 발효 기간중 생성된 각 VFA의 양을 나타내는 것이다.

표 26의 데이타는 비처리 대조 플라스크에서 생성된 VFA의 양에 대한 처리된 플라스크에서 생성된 VFA양의 비로 표기된 것이다. 이러한 데이타의 기록 방법은 사료 이용을 개선하는 본 발명의 신규한 방법에 의한 전위내 화학 변화의 결과를 가장 명백하게 보여주는 것이다.

[표 26]

상기표에 기술된 데이타는 항생물질이 전위내에서 프로피오네이트 생성을 증가시키는데 유효하다는 것을 나타낸다.

본 방법에서 유용한 항생물질 화합물의 투여는 사료 이용을 개선시킬 뿐 아니라 케토시스(ketosis)를 방지하고 치료한다. 케토시스의 원인적 기전은 프로피오네이트 화합물의 생성이 부족한 것이다. 현재 추천되고 있는 치료법은 프로피온산 또는 선택적으로 프로피오네이트를 생성하는 사료를 투여하는 것이다. 명백하게, 본 출원에 기술된 방법은 통상적인 사료로부터의 프로피오네이트 생성을 촉진시키며, 케토시스의 발생을 감소시킨다.

본 명세서에 기술된 항생물질 화합물은 프로피오네이트 증가 용량으로 투여하였을 때 반추동물의 사료 이용 효율을 증가시키는 것을 알 수 있다. 항생물질, 즉 개개 또는 전복합체로써 또는 경제적이며 덜 정제된 전복합체로써의 항생물질은 동물 사료중에 혼입시켜 적합하게 투여한다. 그러나, 항생물질 화합물은 다른 방식으로 유효하게 투여할 수 있다. 예를들어, 이들은 정제, 침세제(drenches), 거환제 또는 캅셀제로 조합할 수 있으며 동물에게 투여된다. 이러한 용량형의 항생물질 화합물 제형은 수의약품 분야에서 잘 알려진 방법으로 제조할 수 있다. 각각의 개개 용량 단위는 처리되는 동물에게 적절한 1일 용량과 직접 관련되는 사료-효율-개선 화합물의 양을 함유한다.

캅셀제는 목적하는 항생물질의 원하는 형태를 젤라틴 캅셀에 충진시켜 쉽게 제조한다. 경우에 따라 항생물질은 캅셀을 충진시키기에 용이하도록 그의 용량을 증가시키기 위해 당, 전분 또는 정제된 결정성 셀룰로즈와 같은 불활성 분말 희석제로 희석할 수 있다.

항생물질의 정제는 통상적인 약제학적 공정에 의해 제조한다. 정제의 제조는 잘알려져 있으며 고도로 진보된 분야이다. 활성성분 이외에, 정제는 일반적으로 기제, 붕해제, 흡착제, 결합제 및 활탁제를 함유한다. 대표적인 기계에는 락토즈, 미세한 얼음설탕, 염화나트륨, 전분 및 만니톨이 포함된다. 전분은 또한 좋은 붕해제이며, 알긴산도 그렇다. 나트륨 라우릴설페이트 및 디옥틸나트륨 설포석시네이트와 같은 계면활성제가 사용될 수도 있다. 일반적으로 사용되는 흡착제는 또한 전분 및 락토즈를 포함하며, 반면에 탄산 마그네슘은 또한 오일성 물질로 유용하다. 빈번히 사용되는 결합제는 젤라틴, 고무, 전분, 덱스트린 및 여러가지 셀룰로즈 유도체이다. 통상적으로 사용되는 활탁제중에는 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 파라핀왁스, 여러가지 금속성 비누 및 폴리에틸렌글리콜이 있다.

항생물질 화합물은 서방출성 거환제(slow-payout bolus)로 또한 투여할 수도 있다. 이러한 거환제는 정제 제조와 같이 제조할 수 있으나, 단 항생물질 용해를 지연시키는 방법이 제공된다. 거환제는 장기간동안 항생물질이 방출되도록 제조한다. 이렇게 지연되는 용해는 고도로 수불용성인 형태의 항생물질을 선택함에 의해 도울 수 있다. 거환제의 밀도를 증가시키고 거환제가 전위의 하부에 정치되어 유지되도록 철분(iron filings)과 같은 물질을 가한다.

항생물질의 용해는 약물을 둘러싸고 있는 불용성 물질의 매트릭스에 의해 지연된다. 예를 들어 이러한 물질로는 식물성 왁스, 정제된 광물성 왁스 및 수불용성 중합체 물질이 유용하다.

항생물질의 침세제는 항생물질의 수용성 형태를 선택함에 의해 가장 용이하게 제조된다. 몇가지 이유로 불용성 형태가 바람직하다면, 현탁액이 제조될 수 있다. 또한, 침세제는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 생리적으로 무독한 용매내의 용액으로 제형화될 수 있다.

항생물질의 불용성 형태의 현탁제는 선택된 항생물질의 형태에 따라 땅콩, 옥수수 또는 호마유와 같은 식물성유 등의 비용매, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜과 같은 글리콜 또는 물 중에서 제조할 수 있다. 적합한 생리적으로 무독한 보조제는 현탁된 항생물질을 유지시키기 위해 필요하다. 보조제는 카복시메틸셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알리네이트와 같은 농조화제중에서 선택할 수 있다. 대부분의 계면활성제는 항생물질을 현탁시키기 위해 제공된다. 예를들어, 액체 비용매중에서 현탁제를 제조하기 위해서는 레시틴, 알킬페놀, 폴리에틸렌옥사이드 부가물, 나프틸렌설포네이트, 알킬벤젠설포네이트 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르가 유용하다.

추가로 액체의 친수성, 밀도 및 표면장력에 영향을 미치는 많은 물질이 각각의 경우에 현탁제 제조에 도움을 줄 수 있다. 예를들어, 실리콘 기포 방지제, 글리콜, 소르비톨 및 당이 유용한 현탁화제가 될 수 있다.

현탁시킬 수 있는 항생물질은 현탁제 또는 사용하기 전에 희석시키는 항생물질과 보조제의 건조혼합물로써 동물 성장제로 제공될 수 있다.

항생물질은 또한 반추동물의 음료수에 투여될 수 있다. 음료수내로 혼입시키는 것은 수용성 또는 수현탁성 형태의 항생물질을 적절한 양으로 물중에 가하여 수행한다. 음료수에 첨가하기 위한 항생물질 제형은 침세제 제형과 동일한 원리에 따른다.

이들 항생물질 화합물로 동물을 치료하는 가장 실용적인 방법은 화합물의 제형을 사료에 가하는 것이다. 통상적인 건조사료, 액체사료 및 펠렛화사료를 포함하여 어떤 형태의 사료도 항생물질 화합물과 혼합시킬수 있다.

동물 사료내에 약물을 혼입시키는 방법은 잘 알려져 있다. 혼합사료용의 원료물질로는 통상 농축된 약물 예비혼합물을 제조한다. 예를 들어, 대표적인 약물 예비혼합물은 예비혼합물 파운드당 약물 약 1 내지 약 400g을 함유할 수 있다. 이렇게 넓은 범위는 최종 사료내에서 원하는 약물 농도의 범위가 넓기 때문이다. 예비혼합물은 액체 이거나 고체일 수 있다.

치료에 유용한 항생물질 화합물의 적정량을 함유하는 동물 사료 조성물을 제조하는 것은 대개 산술적인 문제이다. 다만 하루에 동물이 먹는 사료량 및 사용되는 ㄹ에비혼합물중의 항생물질 화합물의 농도를 고려하여 각 동물에게 투여하기를 원하는 화합물의 양을 계산하고, 사료내의 항생물질 화합물의 적절한 농도를 계산하는 것은 필요하다.

반추동물 또는 비반추동물 사료 분야에서 일반적으로 사용되는 사료의 제형화, 혼합 및 펠렛화의 모든 방법은, 본 방법에서 사용할 수 있는 항생물질 화합물을 함유하는 사료를 제조하는데 모두 적합하다.

항생물질 A41030 복합체는 육류 생산용으로 유용한 반추동물에서 사료 이용의 효율을 증가시킬 뿐 아니라 개선된 전위과정을 갖는 포유동물에게 투여하였을때 우유 질에 대해 나쁜 영향을 주지 않고 우유생산을 놀라웁게 개선시킨다는 것이 발견되었다.

젖소와 같은 포유 반추동물의 사료 이용의 필요성 및 목적은 반추동물에서 육류 생성을 증가시키기 위한 것과는 다르다. 반추동물의 휘발성 지방산(VFA) 생성은 이것이 동물의 정상적인 유지뿐 아니라 동물이 생산하는 우유의 질과 양에도 직접적으로 관련되기 때문에 일차적인 중요성이 있다. 그러나 포유 반추동물에서, 수유를 위한 에너지는 우유 생성에 있어서 가장 제한적인 인자이다. 아세테이트는 유지 합성에 필요한 반면에 프로피오네이트는 클루코즈 생성에 이용되며, 이것은 차례로 락토즈 합성에 필요하고, 또한 유지 생성에도 약간의 영향을 갖는다. 부티레이트는 지질원이라기보다는 당원이며, 지질원으로의 관점은, 부티레이트가 장쇄 지방산 합성(즉, 유지)에 이용될 수 있으려면 그 전에 우선 아세테이트로 분해되어야 하기 때문에 간접적이다.

따라서 포유 반추동물에서 우유 생산을 증가시키기 위해서는 아세테이트 및 부티레이트 생성에 지나친 영향 없이 프로피오네이트 생성을 증가시키는 것이 필요하다. 매우 감소된 아세테이트 및 부티레이트 농도는 유지함량을 현저히 감소시키며, 이렇게 하여 질이나 경제성(벌크 우유의 가격은 유지함량에 의해 일부 결정된다)의 모든 면에서 효율성이 낮은 우유를 생산하게 된다.

본 발명의 개선된 우유 생성은 지질함량의 뚜렷한 변화없이 우유의 단백질의 함량을 증가시키는 것으로 표시된다. 개선시키는 방법은 포유 반추동물에게 항생물질 A41030 복합체의 프로피오네이트-증가량을 경구적으로 투여하는 것을 특징으로 한다.

항생물질 A41030 복합체는 사료 예비혼합물, 사료 첨가제, 릭크(lick), 수분 첨가제 등의 반추동물에게 경구투여하기 적합한 제형으로 제형화할 수 있으며, 또는 경우에 따라 항생물질 A41030 복합체는 1회 투여로 장기간에 걸쳐 서서히 방출되도록 제형화될 수 있다.

개선된 전위기능을 갖는 포유 반추동물에게 항생물질 A41030 복합체의 프로피오네이트-증가량을 투여하여 우유 조성에 나쁜 영향을 미치지 않고 우유 생성을 증가시키는 것은 생체내 시험에 의해 입증된다.

[시험 5]

갓 출산한 홀스타인(Holstein) 종 젖소를 사용하여 2회의 실험을 수행한다.

1차실험에서는 12마리의 소를 각각 6마리씩의 2군으로 나누어 사용한다.

출산한지 2주 후에, 시험동물은 1주동안의 예비기간을 시작하며, 이 동안에 모든 동물들은 항생물질은 투여하지 않고 사료와 물의 1일분 먹이를 투여한다. 모든 소는 저장 옥수수 50%, 알팔파 건초 20% 및 농축물 30%를 함유하는 표준 사료 조성물을 투여받으며, 농축물은 다음과 같은 조성을 갖는다.

주(1) 비타민 A 및 D₃예비혼합물은 1파운당 비타민 A 2,000,000usp 단위 및 비타민 D₃225,750usp 단위를 함유한다.

(2) 비타민 E 예비혼합물은 1파운드당 비타민 E 20,000IU를 함유한다.

(3) 셀레늄 예비혼합물은 1kg당 나트륨 셀레나이트로 셀레늄 200mg을 함유한다. 셀레늄에 대하여 계산된 분석은 단지 예비혼합물에 대한 것이다.

모든 소는 체중(체중은 1주 동안의 예비기간의 처음에 측정된다)에 대하여 2.95퍼센트율의 표준 사료와 다음과 같은 조성을 갖는 톱드레스(topdress)라고 불리는 조성물 2파운드를 합하여 투여한다.

주(1) 비타민 A와 D 예비혼합물의 1파운당 비타민 A 2,000,000usp 단위 및 비타민 D 225,750usp 단위를 함유한다.

1주의 예비기간동안에 모든 소들에게 대조 톱드레스를 투여한다. 처리기간의 시초에 시험 동물은 톱드레스와 혼합된 A41030 복합체(시험화합물)로 8주 동안 각각 처리를 받는다. 대조용 소는 예비기간중에 투여한 톱드레스와 동일한 약제로 혼합되지 않은 톱드레스를 계속 투여한다. 대조용 톱드레스 및 항생물질 A41030 복합체를 함유하는 톱드레스는 상술한 바와 같은 표준 사료 조성물로 아침 급식한지 한시간 이내에 1일 2파운드의 비율로 실험용 소에게 투여한다. 처리군은 항생물질 600mg/미리/일로 투여한다.

이 실험을 상술한 일반적 방법으로 반복하여 실험 2로 표시한다.

평균 1일 우유 생산량, 우유 조성 및 2회 실험에서의 우유 생성의 지속성을 분석하여 그 결과는 표 27에 기술하였다. 지속성 값은 8주 처리기간 중의 평균 우유 생산량을 비처리 예비기간중의 평균 우유 생산량으로 나눈 것으로 계산된다. 지속성 값은 처리시작 전의 능력과 비교하여 처리시작 후에 처리군에서 능력이 얼마나 개선되었는가를 나타내는 것이다. 시험에서 정상적인 지속성은 약 94 내지 약96%로 기대된다. 각 실험에서 A41030 복합체가 투여된 소가 더 높은 지속성을 가타낸다. 이것을 처리에 대하여 뚜렷한 반응을 나타내는 것이다[즉, 대조용 소보다 더 높은 농도로 우유를 생산하는 예비기간의 유지].

표 27에 기술된 우유 조성의 분석은 처리된 소와 비처리된 소 사이에서 유지는 차이가 없지만, 반면에 단백질 함량은 증가하는 것을 설명하는 것이다. 증가된 우유 단백질은 특히 바람직한 반응인데, 왜냐하면 소량의 증가로도 우유로부터 제조할 수 있는 치즈의 양이 현저히 증가되기 때문이다.

[표 27]

n=동물의 수

a=지속성은 처리기간중의 우유 생산량을 예비기간중의 생산량으로 나눈값으로 계산된다. 지속성 값은 개개 소의 데이타를 사용한 결과이며 평균으로 나타난다.

b 및 c=이들 값은 유의차가 있다.(P<0.05)

-=이용할 수 없다.

항생물질 A41030 복합체 및 인자 A, B, C, D, E, F 및 G는 전술한 실시예에서 기술한 방법에 의해 동물 사료용으로 분리할 수 있다. 또한 경우에 따라 A41030 항생물질 활성을 생성시킨 후에, 간단하게 전발효 육즙을 건조시키고 건조된 배지를 사료 또는 사료 예비혼합물에 직접 혼합시킬 수 있다.

또한, 본 명세서에 기술된 A41030 항생물질 복합체 및 인자는 설파이트화 페놀포름알데히드 신탄(예, TruTan RT Regula라는 상품명으로 A.J. ＆ O.J. Pilar Inc. of Newark, N.J.에서 판매)과 같은 합성탠닝제(tanning agent)와 혼합할 수 있다. 항생물질과 합성 탠닝제의 조합, 즉 항생물질-신탄 복합체는 상술한 바와 같은 동물 사료 첨가 조성물중에서 구성분으로 분리하지 않고 사용할 수 있다.

반추동물을 포함하여 경제성이 있는 동물은 그들의 일생을 통하여 통상 여러 종류의 성장 촉진제, 질병예방제 및 질병 치료제로 처리된다. 이러한 약물은 주로 조합하여 시용된다. 간이 방법은 다른 치료와 조합하여 실용화 될 수 있다.

이미 기술된 바와 같이 항생물질 A41030 복합체 및 A41030 인자들은 전위내에서 아세테이트의 생성에 비해 프로피오네이트의 생성을 유익하게 변화시킨다. 이러한 처리는 또한 맹장내에서 섬유성의 식물성 물질을 발효시키는 단위동물(monogastric animal)에게도 유익하다. 여기서 언급한 단위동물은 섬유성의 식물성 먹이를 소비하며 맹장내에서 그 중의 적어도 일부를 미생물 발효시켜 소화시키는 동물이다. 맹장내 발효는 전위발효와 유사한 화학적 경로에 따른다.

그들의 먹이중 일부를 맹장 발효로 소화시키는 실험 동물은 말, 돼지 및 토끼이다. 이러한 동물의 전반적인 사료 이용율은 프로피오네이트/아세테이트 비율을 유리하게 변화시키는 이들 항생제를 경구 투여하여 개선된다. 말과 토끼는 맹장 발효가 전체적인 소화과정의 주된 부분이며 따라서 항생제가 특히 유리한 동물의 예이다.

Claims (12)

1. 스트렙토마이세스 버지니아에 NRRL 15156 또는 12525, 또는 A41030-생성 변종 또는 그의 돌연변이체를 액침 호기성 발효 조건하에 탄소, 질소 및 무기염류의 동화원을 함유하는 배지내에서 배양시킴을 특징으로 하여, A41030 복합체, 또는 인자 A, B, C, D, E, F 또는 G, 또는 이들의 약제학적으로 무독한 염을 제조하는 방버.
2. 제1항에 있어서, 제1항의 공정을 이어서 배지로부터 복합체를 분리하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 인자 A, B, C, D, E, F 또는 G를 복합체로부터 분리하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 다음 구조식의 A41030 인자 A 또는 그의 약제학적으로 무독한 염을 제조하는 방법.

   
5. 제3항에 있어서, 다음 구조식의 A41030 인자 B 또는 그의 약제학적으로 무독한 염을 제조하는 방법.

   
6. 제3항에 있어서, 다음 구조식의 A41030 인자 C 또는 그의 약제학적으로 무독한 염을 제조하는 방법.

   
7. (a) 탄소 54.46%, 수소 4.35%, 질소 7.58%, 염소 4.27% 및 나머지는 산소 29.34%인 대략의 원소 분석치 ; (b) 고속 원자 포격 질량 분광분석으로 측정하여 약 1326인 실측 분자량 ; (c) 다음과 같은 식별 가능한 최대 흡수 : 3448-3226(강, 브로드), 2959(약), 1661(강), 1592(강), 1511(강), 1429(약), 1290(약), 1227(약), 1212(중), 1163(약), 1143(약), 1053(중) 및 1010(강)cm^-1를 갖는 적외선 흡수 스펙트럼 : (d) 산성 또는 중성 메탄올 : 물(1 : 1)중에서는 278nm(ε10,600)에서, 염기성 메탄올 : 물(1 : 1)중에서는 298nm(ε19,900)에서 최대 흡수를 갖는 자외선 흡수 스펙트라 ; 및 (e) 66% 수성 디메틸 포름아미드 내에서 약 5.5 및 7.6의 pKa값을 갖는 2개의 적정 가능한 그룹을 가지며 ; (f) 알콜-물 혼합물, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드-물 혼합물, 디메틸포름아미드-물 혼합물, 묽은 수성산 또는 묽은 수성 염기에 용해하는 백색 무정형 고체인 항생물질 A41030인자 D 및 그의 약제학적으로 허용되는 비독성 염의 제조방법.
8. 제3항에 있어서, 다음 구조식의 A41030 인자 E 또는 그의 약제학적으로 무독한 염을 제조하는 방법.

   
9. 제3항에 있어서, 다음 구조식의 A41030 인자 F 또는 그의 약제학적으로 무독한 염을 제조하는 방법.

   
10. 제 3항에 있어서, (a)탄소 50.02%, 수소 4.61%, 염소 4.74%, 질소 6.11% 및 산소 30.70%인 대략의 원소 분석치 ; (b) 고속 원자 포격 질량 분광분석으로 측정하여 약 1684인 실측 분자량 ; (c) 다음과 같은 식별 가능한 최대 흡수 : 3320(매우 브로드, 강), 2975(샤프, 약), 2920(샤프, 약), 1659(노말, 강), 1594(브로드, 강), 1512(샤프, 강), 1492(쇼울더), 1430(샤프, 약), 1386(브로드, 약), 1337(브로드, 약), 1308(샤프, 약), 1264(샤프, 약), 1230(브로드, 중), 1145(브로드, 중), 1077(샤프, 중), 1062(샤프, 중), 1014(샤프, 중) 및 846(브로드, 중)cm^-1를 갖는 적외선 흡수 스펙트럼 : (d) 산성 또는 중성 메탄올 : 물(1 : 1)중에서는 278nm(ε15,000)에서, 염기성 메탄올 : 물(1 : 1)중에서는 298nm(ε18,000)에서 최대 흡수를 갖는 자외선 흡수 스펙트라 ; 및 (e) 66% 수성 디메틸 포름아미드 내에서 약 5.4 및 7.0의 pKa값을 갖는 2개의 적정 가능한 그룹을 가지며 ; (f) 알콜-물 혼합물, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드-물 혼합물, 디메틸포름아미드-물 혼합물, 묽은 수성산 또는 묽은 수성 염기에 용해하는 백색 무정형 고체인 항생물질 A41030인자 G 및 그의 약제학적으로 허용되는 비독성 염의 제조방법.
11. 제1항 내지 10항중의 어느 하나에 있어서, 스트렙토마이세스 버지니아에 NRRL 12525를 배양시키는 방법.
12. 제1항 내지 10항중의 어느 하나에 있어서, 스트렙토마이세스 버지니아에 NRRL 15156를 배양시키는 방법.

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