FI77690B - Foerfarande foer framstaellning av en antibiot, aad 216-komplex med mikroben kibdelosporangium aridum shearer gen. nov., sp. nov. atcc 39323. - Google Patents

Description

1 77690

Menetelmä antibiootin AAD 216-kompleksin valmistamiseksi Kibdeloeporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov.

ATCC 39323-mikrobilla Tämä keksintö koskee uusia vankomysiiniluokan antibiootteja sekä niiden tuottamista ja eristämistä. Keksintö koskee myös uutta mikro-organismia, Kibdeloeporangium aridum Shearer, gen. nov., sp. nov. SK&P-AAD 216 (ATCC 39323). Täsmällisemmin, tämä keksintö koskee antibioottia, jota tässä nimitetään AAD 216-kompleksiksi. Tätä kompleksia tuotetaan viljelemällä K. aridumia vesipitoisella ravintoalustalla, joka sisältää assimilointikelpoisia typpi- ja hiililähteitä, submerssivil-jelynä aerobisissa olosuhteissa, kunnes mainittu mikro-organismi on tuottanut riittävän määrän AAD 216-kompleksia mainitulla alustalla, ja kerätään AAD 216-kompleksi viljelys-alustasta .

Tällä keksinnöllä saadaan aikaan myös AAD 216-kompleksin uusia bioaktiivisia komponentteja; AAD 216A, AAD 216B ja AAD 216C, jotka valmistetaan erottamala ja eristämällä yksittäiet antibioottiyhdistest AAD 216-kompleksista kromatografisin keinoin. Antibiootti AAD 216-kompleksi ja sen pääasialliset bioaktiiviset komponentit; AAD 216A, AAD 216B ja AAD 216C omaavat kaikki antibakteriaalista aktiivisuutta. AAD 216-kompleksi, AAD 216A, AAD 216B ja AAD 216C ovat myös hyödyllisiä käytettyinä eläinten terveydenhoidossa, kuten kasvun edistämisessä ja naudan mastitikeen hoidossa.

Seuraavassa keksinnön yksityiskohtaisessa kuvauksessa on esitetty taulukot 1-7: 2 77690

Taulukko 1: Ohutkerroakromatografiän Rf-arvot B. eubtilieta vastaan AAD 216A:lle, AAD 216B:lle ja AAD 216C:lle verrattuna tunnettuihin antibiootteihin.

Taulukko 2: AAD 216A:n, AAD 216B:n ja AAD 216C:n retentioajat käänteisfaaeikorkeapainenestekromatografiässä verrattuna tunnettuihin antibiootteihin.

Taulukot 3-7: AAD 216-komplekein, rikastetun AAD 216-komplek-sin, AAD 216A:n, AAD 216B:n, AAD 216C:n ja vankomysiinin in vitro minimi-inhibitiokonsentraation (MIC) tulokset määritettynä useille mikro-organismeille käyttäen standardi mikro-tiitterianalyysimenetelmiä.

Taulukot Θ-10: AAD 216-kompleksin ja sen komponenttien AAD 216A:n AAD 216B:n ja AAD 216C:n kasvua edistävä aktiivisuus.

Uusia antibiootteja, AAD 216-kompleksia ja sen pääasiallisia bioaktiivisia komponentteja; AAD 216A:ta, AAD 216B:tä ja AAD 216C:tä, tuotetaan fermentoimalla uutta mikro-organismia Kib-delosprorangium aridum Sheareria gen. nov., sp. nov. SK&F-AAD 216. Edellä mainittu mikro-organismi oli eristetty maa-näytteestä, joka oli kerätty autiomaa-alueelta Pima Countysta Arizonasta. Biologisesti puhdas mikro-organismin kanta on säilytetty American Type Culture Collectioniin, Rockvilleen, Marylandiin tyyppikantana talletusnumerolla ATCC 39323.

Il 3 77690 AAD 216-kompleksilla tarkoitetaan yksittäisten antibioottien seosta, jotka on tuotettu fermentoimalla K. aridumia. Yksittäisten tai osatekijä-antibioottien suhteet ja niiden esiintyminen AAD 216-kompleksissa vaihtelevat riippuen fer-mentaatioprosessin olosuhteista. AAD 216-kompleksi voidaan eristää fermentaatioalustasta selkeyttämällä koko fermentaa-tioliemi suodattamalla ja seostamalla epäpuhdas AAD 216-kompleksi suolahapolla pH 3:ssa 0-10°C:ssa. Tämän jälkeen sakka liuotetaan veteen säätämällä pH noin 6:sta 8:aan ja liuos kaadetaan hartsikolonniin, josta se eluoidaan vesipitoisella metanolilla. Saatu eluentti lyofilisoidaan, jolloin saadaan AAD 216-kompleksi, josta kromatografisesti tuotetaan rikastettua AAD 216-kompleksia. Tyypillisesti, rikastettu AAD 216-kompleksi sisältää 40-80 painoprosenttia AAD 216A:n, AAD 216B:n ja AAD 216C:n seosta.

Rikastetulla AAD 216-kompleksilla noin pH 6 :ssa, joka sisältää HPLC-analyysin mukaan 29 paino-% AAD216A:ta, 10paino-%AAD 216B:tä ja 10 paino-% AAD 216C:tä, on seuraavat ominaispiirteet: a) vaalea valko-keltäinen kiinteä aine, joka hajoaa 300-350° C:ssa.

b) likimääräinen alkuainesisältö 53,22 % hiiltä, 6,14 %, vetyä, 3,73 % typpeä ja 0,28 % tuhkaa.

c) infrapunaspektri kaliumbromidissa, joka antaa piikkejä seuraavilla aaltoluvuilla (cm’^): 3400, 2920, 1660, 1600, 1510, 1460, 1430, 1390, 1320, 1240, 1150, 1060 ja 1020.

d) ultraviolettispektri asetonitriili:vesi (1:1)-seoksessa, joka antaa absorptiomaksimin 280 nm:ssa neutraaleissa ja hap-pamissa olosuhteissa jolloin = 43,9 ja 301 nm:ssa alkaa- lisissa olosuhteissa jolloin = 56,8.

e) positiivinen reaktio perjodaatilla ja negatiivinen reaktio ninhydriinillä.

f) liukenee veteen, metanoliin, dimetyylisulfoksidiin ja dimetyyliformamidiin ja liukenematon etanoliin, asetonitrii-liin, asetoniin, dietyylieetteriin ja alifaattisiin hiilivetyihin.

4 77690

Yksittäiset puhtaat antibioottikomponentit, AAD 216A, AAD 216B ja 216C, voidaan eristää AAD 216-kompleksista käyttäen prepa-ratiivista korkeapainenestekromatografiaa (HPLC). Tyypillisesti, AAD 216-kompleksi kromatografioidaan askelgradienttieluu-tiolla 20-28-prosenttisella asetonitriilillä 0,1 N:ssa fosfaattipuskurissa pH 6:ssa. Sopivat fraktiot, jotka määrätään analyyttisellä HPLC:llä, yhdistetään ja suolat poistetaan hartsikolonnissa ja lyofilisoinnin jälkeen saadaan halutut yksittäiset antibioottikomponentit puhtaana AAD 216A:na, AAD 216B:nä ja AAD 216C:nä.

AAD 216A-antibiootilla on noin pH 6:ssa seuraavat ominaisuus-piirteet: a) vaalea valko-keltainen kiinteä aine, joka hajoaa 300-350°C:ssa.

b) empiirinen kaava C8iH82N8^30C14 c) likimääräinen alkuainesisältö 48,20 % hiiltä, 5,01 % vetyä, 5,21 % typpeä, 6,43 % klooria, ei rikkiä tai orgaanista fosforia, kun vesipitoisuus oli 10,80 %.

d) infrapuna-absorptiospektri kaiiumbromidissa,joka antaa __ 1 piikkejä seuraavilla aaltoluvuilla (cm ): 3400, 2920, 1660, 1600, 1510, 1460, 1430, 1390, 1320, 1300, 1240, 1150, 1060 ja 1020.

e) nopea atomipommitus-(FAB)-massaspektri M+H:lla 1787:ssä (suurin ryhmittymä).

f) ultraviolettispektri asetonitriili:vesi (1:1)-seoksessa, joka antaa absorptiomaksimin 280 nmsssä neutraaleissa ja happamissa olosuhteissa jolloin E^% = 51 ja 301 nmrssä aikalisissä olosuhteissa jolloin E1% = 73.

g) hiilimagneettiresonanssispektri 90,56 MHzillä CD-j0D:D20 (1:9):ssä pH 8,5:ssä, joka antaa seuraavat kemialliset siirtymät ppmtinä suhteessa TMS-standardiin: 177,7, 177,5, 175,5, 174,6, 171,5, 170,8, 170,4, 170,2, 169,1, 161,8, 158,6, 157,9, 155,1 , 155,0, 152,5, 151,9, 151 ,6, 150,7, 146,0, 144,3, 141,7, 138,8, 138.3, 136,0, 134,6, 134,5, 133,7, 130,8, 129,8, 129,4, 128,9, 128,6, 127.4, 127,0, 126,2, 125,6, 125,1 , 122,7, 122,3, 120,9, 119,6, 118,3, 116,4, 110.5, 109,6, 108,3, 104,2, 103,3, 103,1, 100,7, 98,1, 78,4, 5 77690 74.4, 73,9, 73,3, 72,0, 71,6, 71,3, 70,7, 67,3, 65,6, 63,6,62,3 61.6, 60,2, 56,8, 56,3, 55,8, 54,9, 37,2, 32,7, 32,2, 29,8, 29.6, 29,5, 26,2, 23,0 ja 14,5.

h) spesifinen rotaatio “66° (C = 0,3 H^Oissa) .

i) positiivinen reaktio perjodaatilla ja negatiivinen reaktio ninhydriinillä.

j) liukenee veteen, metanoliin, dimetyylisulfoksidiin, dime-tyyliformamidiin ja ei liukene etanoliin, asetonitriiliin, asetoniin, dietyylieetteriin eikä alifaattisiin hiilivetyihin.

k) pK -arvot asetonitriili:vesi (3:7) seoksessa seuraavat: 3,0, 4,9, 7,4, 8,4, 10,0 ja 10,3 pKa~arvoja 10,3 yläpuolelta ei ole määritetty.

AAD 216B-antibiootilla on noin pH 6:ssa seuraavat ominaispiirteet: a) vaalea valko-keltainen kiinteä aine, joka hajoaa 300-350°C:ssa.

b) empiirinen kaava CQ2H84N8°30C14 c) likimääräinen alkuainesisältö 49,67 % hiiltä, 5,07 % vetyä, 5,19 % typpeä, 6,17 % klooria, ei rikkiä eikä orgaanista fosforia, kun vesipitoisuus on 10,8 %.

d) infrapuna-absorptiospektri kaliumbromidissa, joka antaa -1 piikkejä seuraavilla aaltoluvuilla (cm ): 3400, 2920, 1660, 1600, 1510, 1460, 1430, 1390, 1300, 1240, 1150, 1060 ja 1020.

e) nopea atomipommitus-(FAB)-massaspektri M+H:lla 1801:ssä (suurin ryhmittymä).

f) ultraviolettispektri asetonitriili:vesi (1:1)-seoksessa, joka antaa absorptiomaksimin 280 nmsssä neutraaleissa ja happamissa olosuhteissa jolloin = 55 ja 301 nmrssä aikalisissä olosuhteissa jolloin = 72,5.

g) hiilimagneettiresonanssispektri 90,56 MHz:llä 00^00^20 (1:9):ssä pH 8,5:ssä, joka antaa seuraavat kemialliset siirtymät ppm:inä suhteessa TMS-standardiin: 177,9, 177,4, 175,6, 174.4, 171,6, 170,9, 170,5, 170,4, 169,3, 162,4, 158,7, 158,1, 155,2, 155,0, 152,6, 151,3, 150,7, 146,0, 144,3, 141,3,138,8,138,3, 136,1, 134,7, 133,6, 130,7, 129,9, 129,8, 129,4, 129,0, 128,7, 127,7, 127,5, 127,0, 126,3, 125,7, 124,7, 122,8, 122,3,120,9,119,9, 119.6, 118,4, 116,7, 110,5, 109,6, 108,5, 104,2, 103,3, 103,1 6 77690 100.6, 98,1, 78,5, 74,4, 73,9, 73,4, 72,1, 71,7, 71,2, 70,8, 67,3, 65,5, 63,7, 62,3, 61,6, 60,3, 56,8, 56,2, 55,9, 55,0, 39.6, 37,3, 32,7, 30,2, 30,0, 29,7, 28,4, 27,8, 26,3 ja 23,3.

h) spesifinen rotaatio [aj -59° (C = 1,0 H20:ssa).

i) positiivinen reaktio perjodaatilla ja negatiivinen reaktio ninhydriinillä.

j) liukenee veteen, metanoliin, dimetyylisulfoksidiin, dime-tyyliformamidiin ja liukenematon etanoliin, asetonitriiliin, asetoniin, dietyylieetteriin ja alifaattisiin hiilivetyihin.

k) pK -arvot asetonitriili:vesi (3:7)-seoksessa seuraavat: a 3,0, 4,5, 7,5, 8,5 ja 9,5 pK -arvoja 9,7:n yläpuolella ei ä ole määritetty.

AAD 216C:llä on noin pH 6:ssa seuraavat ominaispiirteet: a) vaalea valko-keltäinen kiinteä aine, joka hajoaa 300-350°C:ssa.

b) empiirinen kaava Cgg H86N8°30C14 c) likimääräinen alkuainesisältö 47,89 % hiiltä, 5,09 % vetyä, 4,95 % typpeä, 6,39 % klooria, 3,69 % tuhkaa, ei rikkiä eikä orgaanista fosforia, kun vesipitoisuus oli 8,2 %.

d) infrapuna-absorptiospektri kaliumbromidissa, joka antaa piikkejä seuraavilla aaltoluvuilla (cm ): 3400, 2920, 1660, 1505, 1430, 1390, 1295, 1240, 1150, 1060 ja 1020.

e) nopea atomipommitus-(FAB)-massaspektri M+H:lla 18l5:ssä (suurin ryhmittymä).

f) ultraviolettispekti asetonitriili:vesi (1:1)-seoksessa, joka antaa absorptiomaksimin 280 nm:ssä neutraaleissa ja hap-pamissa olosuhteissa jolloin = 51 ja 3 01 nm:ssä alka- sissa olosuhteissa jolloin E^ = 75.

g) hiilimagneettiresonanssispektri 90,56 MHz:llä CDg0D:D20 (1:9):ssä pH 8,5:ssä, joka antaa seuraavat kemialliset siirtymät ppm:inä käyttäen TMS:ää sisäisenä standardina: 177,9, 177.2, 175,7, 173,6, 171,5, 170,8, 170,6, 170,2, 169,3, 158,6, 157.8, 155,2, 154,9, 152,7, 151,9, 150,9, 146,0, 144,3, 141,3, 138.8, 138,4, 136,0, 134,9, 134,7, 133,8, 130,8, 129,9, 129,8, 129.3, 1 29,1 , 127,7, 1 27,5, 127,0, 126,4, 125,3, 122,7, 121,0, 119,7, 118.3, 116,1, 110,4, 109,6, 108,1, 104,1, 103,2, 101,5, 98,0,

II

7 77690 78.6, 74,6, 73,9, 73,4, 72,1, 71,7, 71,3, 70,3, 67,3, 65,1, 63.7, 62,5, 61,6, 60,3, 56,8, 56,3, 55,3, 54,9, 39,7, 37,4, 32,6, 32,3, 30,5, 30,4, 30,2, 29,9, 28,6, 28,1, 26,4, 23,4 ja 22,0.

h) spesifinen rotaatio = -50,6 (C = 0,6 Η20:βββ).

i) positiivinen reaktio perjodaatilla ja negatiivinen reaktio ninhydriinillä.

j) liukenee veteen, metanoliin, dimetyylisulfoksidiin, dime-tyyliformamidiin ja liukenematon etanoliin, asetonitriiliin, asetoniin, dietyylieetteriin ja alifaattisiin hiilivetyihin. k> pKa-arvot asetonitriili:vesi (3:7)-seoksessa seuraavat: 3,0, 4,2, 7,2, 8,2, 9,9 ja 10,3. pKa~arvoja 10,3:n yläpuolella ei määritetty.

AAD 216-kompleksin ja sen pääasiallisten bioaktiivisten komponenttien, AAD 216A:n, AAD 216B:n ja AAD 216C:n, uutuus vahvistettiin vertaamalla tunnettujen vankomysiini/ristosetiini-antibioottiluokan jäsenten kanssa. Erityisesti, ohutkerros-kromatografiällä B. subtilista vastaan saatuja Rf-arvoja AAD 216A:lle, AAD 216B:lle ja AAD 216C:lle verrattiin tunnettuihin antibiootteihin, kuten taulukossa 1 on alla esitetty.

8 77690

Taulukko 1.

TLC (Avicel)

AB C

A-35512B 0,14 0,25 0, 0,15 A-477 0,51 0,30, 0,40 0, 0,20 0,67, 0,78

Aktaplaniini 0,16 0,06 0,11

Aktinoidiinit A 0,04 0,18, 0,43 0,05 ja B 0,24

Avoparsiini 0,15 0,13 0,07 LL-AM-374 0,08 0,17 0,05

Ristosetiini 0,1 0, 0,10 0,04

Teikomysiini A-2 0,34 0,12, 0,33, 0,77 0,47

Vankomysiini 0,17 0, 0,35 0,1, 0,6 AAD 216A 0,35 0,33 0,83 AAD 216B 0,38 0,35 0,83 AAD 216C 0,44 0,34 0,82 1. Rf-arvot; määritys: B. subtilis-aktiivuus.

Alleviivattu arvo on pääasiallinen aktiivinen komponentti.

A. nBu0H:H0Ac:H20 (4:1:5) B. nPrOH:Petrolieetteri: kons. NH^OH (4:1:2) C. nPr0H:H20 (6:4)

Lisäksi, AAD 216A:n, AAD 216B:n ja AAD 216C:n retentioaikoja käänteisfaasikorkeapainenestekromatografiässä verrattiin ja havaittiin poikkeavan tunnettujen antibioottien vastaavista arvoista, kuten taulukossa 2 on esitetty.

9 77690

Taulukko 2

Retentioaika, min.

Antibiootit Systeemi A^ Systeemi B ^ AAD 216A 15,3 14,5 AAD 216B 15,9 15,2 AAD 216C 17,2 16,1 A 35512B 5,2+ 6,1+ A 477 11,7+ 8,9+

Aktaplaniini 6,3+ 7,5+

Aktinoidiini A/B 5,5 + 8,1+

Avoparsiini 5,8+ 7,6+ LL-AM-374 5,1+ 6,8+

Ristosetiini 3,6 5,4

Teikomysiini A-2 13,6+ 13,8+

Vankomysiini 6,0 7,4 +pääasiallinen komponentti multikomponenttiseoksessa (a) HPLC-systeemi A: kolonni: Ultrasphere ODS, 5 mikronia, 4,6 x 150 mm liuotin: 7-34 % asetonitriiliä (7 % 1 min ajan, sitten nousu 34 %:iin yli 13 min ajaksi ja pidetään 34 %:ssa) pH 3,2:ssa, 0,1 M fosfaatti.

virtaus: 1,5 ml/min. määritys: uv 220 nm (b) HPLC-systeemi B: kolonni: Ultrasphere ODS, 5 mikronia, 4,6x150 mm liuotin: 5-35 % asetonitriili (5 % 1 min ajan, sitten nousu 35 %:iin yli 13 min ajaksi ja pidetään 35 %:ssa) pH 6,0:ssa, 0,025 M fosfaatti.

. . virtaus: 1,5 ml/min.

määritys: uv 220 nm AAD 216A:n, AAD 216B:n ja AAD 216C:n täydellinen hydrolyysi, erikseen, 6 N suolahapossa refluksoiden 18 tuntia ei tuottanut tavallisia aminohappoja, jotka voitiin määrittää yleisellä aminohappoanalyysillä. Aktinoidiinihapon, joka on yleinen vankomysiiniluokan antibiootti, läsnäolo vahvistettiin 10 77690 hydrolyysituotteista korkeapainenestekromatografiällä ja FAB-massaspektrillä verrattaessa luetettavaan näytteeseen. Lisäksi, AAD 216A:n, AAD 216B:n ja AAD 216C:n hydrolyysi, erikseen, 1 N suolahapossa refluksoiden 4 tuntia tuotti mannoosia, mutta ei ristosaminia, glukosaminia tai vankosaminia.

Mikro-organismi

Kibdelosporangium aridumin SK&F-AAD 216 (ATCC 39323) varasto-kantaa säilytettiin laihalla peruna-porkkana- tai kaurahiutale-agarilla. Morfologisia tarkasteluja tehtiin vesiagar-, laihoilla peruna-porkkana-agar-, kaurahiutaleager- ja maauuteagarmaljoilla. Siirroste biokemiallisia ja fysiologisia määrityksiä varten valmistettiin lisäämällä jäädytettyjen kasvua edistävien viljelmä-pullojen sisältö glukoosi-hiivauutelientä sisältävään pulloon, joka asetettiin ravistelijaan (250 kierr./min) 28°C:een kolmesta kuuteen päivään. Viljelmä kerättiin sentrifugoimalla ja pestiin kolme kertaa steriilillä tislatulla vedellä. Inkubointi-lämpötila biokemiallisissa ja fysiologisissa määrityksissä oli 28°C. Tuloksia luettiin useita kertoja 21 päivään saakka malja-kasvatuksille. Useimmat koeputkikasvatukset luettiin useita kertoja 28 päivään saakka. Kuitenkin, urean, allantoiinin ja hippuraatin hajotusmääritykset, kuten myös nitraattien pelkis-tysmääritykset luettiin kuuden viikon ajan.

K. aridumin herkkyyttä antibiooteille tutkittiin asettamalla BBL-herkkyyslevyjä ravintoagarmaljoille, joille oli siirros-tettu K. aridumia levittämällä. Estovyöhykkeiden läpimitat mitattiin viikon inkuboinnin jälkeen 28°C:ssa.

Morfologia. K. aridum on säikeinen organismi, joka muodostaa kahta erilaista myseeliä: (1) substraattimyseeliä, joka tunkeutuu agariin ja muodostaa tiiviin kerroksen agarin pinnalle, ja (2) ilmamyseeliä, jolla on conidia-ketjuja ja/tai itiö-pesäkemäisiä rakenteita. Liikkuvia elementtejä ei havaittu ilma- eikä substraattimyseelissä. Monilla alustoilla K. aridum tuottaa tyypillisiä kiteitä agariin.

Il n 77690

Substraattimyseeli. K. aridum tottaa hyvin kehittynyttä substraattimyseeliä, joka voi hajota palasiksi ilman paikaltaan siirtämistä. Pitkä haaroittunut hyyfi on jakautunut väliseinillä ja on noin 0,4-1,0 m läpimitaltaan. Substraatti-myseelissä on erikoistunutta rakennetta, joka koostuu tavallisesta varresta säteittäin lähtevästä hankahaaraisesta väliseinillä jakautuneesta hyyfistöstä.

Ilmamyseeli. K. aridumin ilmamyseeli tuottaa sauvanmuotoisia pehmeäseinäisiä itiöketjuja, joiden pituus vaihtelee (0,4 pm x 0,8 pm-2,8 pm) . Nämä itiöketjut ovat yleensä hyvin pitkiä, yhdessä ketjussa on yli 50 itiötä, mutta yleensä löytyy myös 10 tai vähemmän itiöitä käsittäviä ketjuja. Itiöketjut voivat syntyä hyyfin kärkeen tai muodostaa lyhyitä sivuketjuja.

Useimmilla alustoilla K. aridumin ilmamyseeli tuottaa myös itiöpesäkemäisiä rakenteita. Nämä voivat syntyä hyyfin kärkeen tai muodostaa lyhyitä sivuketjuja. Itiöpesäkkeen kaltaisia rakenteita ja itiöketjuja voi syntyä samaan ilmahyy-fistöön. Kypsinä nämä itiöpesäkkeen kaltaiset rakenteet ovat pyöreitä, suunnilleen 9-22 pm läpimitaltaan ja koostuvat väliseinällisestä haaroittuneesta hyyfistöstä, joka on sulkeutunut amorfisen väliaineen sisään ja ympäröity selvällä seinämällä. Kun nämä itiöpesäkkeen kaltaiset rakenteet laitetaan agarille, itävät ne heti tuottaen yhden tai useamman alkion.

Kemotaksonomia. Puhdistetut K. aridumin soluseinämävalmisteet, jotka analysoitiin Beckerin menetelmällä (Becker et ai. Appi. Microbiol. 12, 421-23 (1964)), sisälsivät 2,6-diaminopimeliini-hapon meso-isomeeriä, alaniinia, glutamiinihappoa, glukosami-nia ja muramiinihappoa sekä galaktoosia ja pieniä määriä arabinoosia.

Kokonaisten solujen hydrolysaatit, jotka analysoitiin Lechevalierin menetelmällä (Lechevalier, M.P., J. Lab. Clin. Med. 71 , 934-44 (1968)), sisälsivät galaktoosia, glukoosia, 12 77690 mannoosia, riboosia, ramnoosia ja arabinoosia; pieniä määriä maduroosia voi myös olla läsnä. Solu-uutteissa, joiden lipi-dirakenne analysoitiin Lechevalierin menetelmällä (Lechevalier et ai., Can. J. Microbiol. 19, 965-72 (1973)), ei havaittu minkään tyyppisiä mykoliinihappoja. Löytyneet fosfolipidit olivat fosfatidyylietanoliamiini, fosfatidyylimetyylietanoliamiini, difosfatidyyliglyseroli, fosfatidyyli-inositoli ja fosfatidyyli-inositolimannosidit. Täten K. aridumin soluseinä on tyyppiä IV, jonka kokonaissolusokerirakenne on maduroosihitusia sisältävää tyyppiä A (Lechevalier et ai., Int. J. Syst. Bacteriol. 20, 435-43 (1970)) ja fosfolipidirakenne tyyppiä PII sisältäen fos-fatidyylimetyylietanoliamiini, (Lechevalier et ai., Biochem.

System. Ecol. 5, 249-60 (1977)).

Fysiologisia ja biokemiallisia erityispiirteitä K. aridum on gram-positiivinen ja acid-fast-negatiivinen.

Kasvua ei tapahdu anaerobisissa olosuhteissa. Kasvun lämpötila-alue on 15-42°C, lievää kasvua tapahtuu 45°C:ssa. Kasvu 10°C:ssa on vaihtelevaa. Kasvua ei tapahdu 50°C:ssa. Rikki-vetyä muodostuu. Maito peptonisoituu. Gelatiini hydrolysoituu ja nesteytyy. Nitraatti ei pelkisty nitriitiksi. Melaniini-pigmenttejä syntyy. Kaseiini, L-tyrosiini, hypoksantiini, guaniini, elastiini ja testosteroni hydrolysoituvat, mutta adeniini, ksantiini ja selluloosa (Avicel) eivät. Katalaasia ja fosfataasia muodostuu. Urea, eskuliini ja hippuraatti hajoavat; allantoiinin hajoamismääritykset ovat heikosti positiivisia. 8 % NaCl:ssa ei tapahdu kasvua, 5-7 % NaCl:ssa kasvu on vaihtelevaa. Kasvua ei tapahdu lysotsyymiliemessä. Happoa muodostuu L-arabinoosista, D-sellobroosista, dekstrii-nistä, dekstroosista, D-fruktoosista, glyserolista, glyko-geenista, D-galaktoosista, i-inositolista, laktoosista, D-mannitolista, D-mannoosista, a-metyyli-D-glukosidista, a-metyyli-D-mannosidista, melibioosista, D-meletsitoosista, raffinoosista, ramnoosista, D-riboosista, sakkaroosista, trehaloosista, D-ksyloosista ja maltoosista. Happoa ei muodostu dulsitolista, i-erytritolista, inuliinista, D-sorbito-lista tai L-sorboosista. K. aridum käyttää sitraattia, 13 77690 malaattia, sukkinaattia, oksalaattia, laktaattia, asetaattia, pyruvaattia, propionaattia ja formaattia, mutta ei bentsoaat-tia eikä tartraattia.

Herkkyys antibiooteille. Diffuusiomenetelmällä testattaessa K. aridum oli resistentti kiekolle, johon oli imeytetty genta-mysiiniä (10 yg), tobramysiiniä (10 yg) , streptomysiiniä (10 yg), vankomysiiniä (30 yg), penisilliiniä (10 yksikköä), basitrasiinia (2 yksikköä), linkomysiiniä (2 yg), klindamy-siiniä (2 yg) ja kefalotiiniä (30 yg). Klooritetrasykliini (5 yg) aiheutti 18 mm estovyöhykkeet, tetrasykliini (5 yg) 11-12 mm vyöhykkeet, rifampiini (5 yg) 11-15 mm vyöhykkeet, novobiosiini (5 yg) 27-28 mm vyöhykkeet. Kaikki estovyöhykkeet sisälsivät ainakin muutamia resistenttejä pesäkkeitä.

K. aridumin kuvaus kasvatettaessa erilaisilla alustoilla Kaikkia viljelmiä inkuboitiin 28°C:ssa suljetuilla petrimaljoilla ja tarkkailtiin jaksottain 21 päivään asti. Viljelmien värit valittiin vertaamalla joko ISCC-NBS Centroid Color-karttojen tai Dictionary of Color-kirjan (Maerz, A. ja M.R. Paul 2. painos New York, McGraw Hill Book Co., Inc. (1950) väriliuskoihin.

Hiivauute-mallasuuteagar. Kasvu erinomaista; vegetatiivinen kasvu harmaan keltaruskeaa; ilmamyseeliä ei yhtään tai harvakseen, valkoista, itiöketjuja ja itiöpesäkkeen kaltaista rakennetta havaittavissa; keltaruskeaa liukenevaa pigmenttiä; tyypillisiä kiteitä agarissa.

Kaurahiutaleagar. Kasvu hyvää; vegetatiivinen kasvu vaaleasta keltaisenruskeaan; ilmamyseeliä harvakseen, valkoista, paljon itiöketjuja ja itiöpesäkkeiden kaltaisia rakenteita läsnä; ei liukenevaa pigmenttiä; tyypillisiä kiteitä agarissa.

Glyseroli-asparagiiniagar. Kasvu tyydyttävästä hyvään; vege tatiivinen kasvu vaaleankeltaisenruskeaa; ilmamyseeliä har- it 77690 vakseen tai kohtalaisesti, valkoista, joitain itiöketjuja, mutta muutamia tai tuskin ollenkaan itiöpesäkkeiden kaltaisia rakenteita havaittavissa; vaaleaa, harmahtavaa, keltaisenruskeaa, liukenevaa pigmenttiä; tyypillisiä kiteitä agarissa.

Epäorgaanisia suoloja sisältävä tärkkelysagar. Kasvu hyvää; vegetatiivinen kasvu vaaleasta keltaisenruskeaan; ilmamysee-liä harvakseen, valkoista, itiöketjuja ja itiöpesäkkeen kaltaisia rakenteita läsnä; ei liukenevaa pigmenttiä; tyypillisiä kiteitä agarissa.

Czapek-sakkaroosiagar. Kasvu hyvää; vegetatiivinen kasvu vaaleasta keltaisenruskeaan; ilmamyseeliä harvakseen, valkoista, itiöketjuja ja itiöpesäkkeiden kaltaisia rakenteita läsnä; vaaleanharmaankeltäisistä vaaleankeltaisenruskeisiin olevia liukenevia pigmenttejä läsnä; tyypillisiä kiteitä agarissa.

Bennettin agar. Kasvu hyvästä erinomaiseen; vegetatiivinen kasvu harmaankeltaisenruskeaa; ilmamyseeliä ei lainkaan tai harvakseen, valkoista, itiöketjuja ja itiöpesäkkeen kaltaista rakennetta läsnä; keltaisenruskeaa liukenevaa pigmenttiä; ei kiteitä agarissa.

Ravintoagar. Kasvu tyydyttävästä hyvään; vegetatiivinen kasvu keltaisenruskeaa; ilmamyseeliä harvakseen tai kohtalaisesti, valkoista, muutamia itiöketjuja ja muutamia itiöpesäkkeen kaltaisia rakenteita läsnä; keltaisenruskeaa liukenevaa pigmenttiä; tyypillisiä kiteitä vaihtelevasti agarissa.

Laiha peruna-porkkana-agar. Kasvu tyydyttävää, melko litteää; vegetatiivinen kasvu vaaleasta keltaisenruskeaan; ilmamyseeliä harvakseen tai kohtalaisesti, valkoista, paljon itiöketjuja ja itiöpesäkkeen kaltaista rakennetta läsnä; ei liukenevaa pigmenttiä; ei kiteitä agarissa.

is 77690

Peptoni-hiivauute-rauta-agar. Kasvu hyvää; vegetatiivinen kasvu pronssin ruskeaa (Maerz & Paul 16C9); ei ilmamyseeliä? tummanruskehtavan mustaa liukenevaa pigmenttiä; ei kiteitä agarissa.

Tärkkelys-kaseiini-nitraattiagar. Kasvu hyvää; vegetatiivinen myseeli vaaleasta keltaisenruskeaan; ilmamyseeliä harvakseen, valkoista, itiöketjuja ja itiöpesäkkeen kaltaista rakennetta läsnä; vaaleankeltaruskeaa liukenevaa pigmenttiä vaihtelevasti läsnä; tyypillisiä kiteitä agarissa.

Hiivauute-glukoosiagar. Kasvu hyvästä erinomaiseen; vegetatiivinen kasvu tummankeltaisenruskeasta harmaankeltaisenrus-keaan; ilmamyseeliä ei havaittavissa, alle 400X, itiöketjuja harvakseen mutta ei itiöpesäkkeen kaltaista rakennetta; tummankeltaisenruskeaa liukenevaa pigmenttiä; tyypillisiä kiteitä agarissa.

K. aridumin kuvauksen vertaaminen Bergey's Manual of Determinative Bacteriologyn, Approved List of Bacterial Names'in ja muiden uusimpien taksonomisen kirjallisuuden luettelemiin kuvauksiin aktinomykeeteistä osoittaa, että K. aridum eroaa merkittävästi aikaisemmin kuvatuista aktinomykeettien lajeista eikä sitä voida sijoittaa mihinkään aikaisemmin kuvattuun aktinomykeettien sukuun. Mikäli itiöitä on läsnä muissa aktinomykeettien suvuissa, ovat ne oikeita itiörak-kuloita; kypsinä ne sisältävät aplanosporeja tai zoospore-ja, jotka lopulta vapautuvat itiöpesäkkeen seinämän hajotessa tai revetessä. Huolimatta ekstensiivisestä tarkkailusta ja käsittelystä, ei itiöiden vapautumista K. aridumin itiö-pesäkkeiden kaltaisista rakenteista ole koskaan havaittu.

Kun K. aridumin itiöpesäkkeiden kaltaisia rakenteita laitetaan agarille, itävät ne tuottaen yhden tai useamman alkion suoraan itiöpesäkkeen kaltaisesta rakenteesta.

ie 77690

Tyyppiviljelmä ATCC 39323 on tässä kuvattu uuden Kibdelos-porangium aridum-suvun lajina, (tulee sanoista kibdelos, kr. adj., väärä, kaksiselitteinen; spora, kr. n., siemen; angium, kr. n., astia); spesifinen epiteetti, aridum, (aridus, lat. adj., kuiva, hedelmätön) viittaa autiomaan maaperään, josta kanta eristettiin.

AAD 216-kompleksin valmistaminen AAD 216-kompleksia voidaan tuottaa viljelemällä Kibdelospor-angium-kantaa, jolla on tieteen tunnetuin menetelmin saadut ATCC 39323:n, sen aktiivisen mutantin tai sen derivaatan erityispiirteet, submerssikasvatuksena aerobisissa olosuhteissa vesipitoisella ravintoalustalla. Organismi kasvaa ravintoalustalla, joka sisältää assimilointikelpoisen hiili-lähteen, kuten assimiloituvan hiilihydraatin. Esimerkkejä sopivista hiililähteistä ovat sakkaroosi, laktoosi, maltoosi, mannoosi, fruktoosi, glukoosi ja liukeneva tärkkelys. Ravintoalustan tulisi myös sisältää assimilointikelpoinen typpi-lähde, kuten kalajauho, peptoni, soijapapujauho, maapähkinä-jauho, pellavansiemenjauho tai maissinliuotusvesi. Epäorgaanisia ravintosuoloja voidaan myös lisätä alustaan. Tällaisina suoloina voidaan käyttää mitä tahansa tavallista suolaa, joka pystyy tuottamaan liuokseen natrium-, kalium-, ammonium-i, kalsium-, fosfaattia, sulfaatti-, kloridi-, bromidi-, nitraatti-, karbonaatti- tai vastaavia ioneja.

AAD 216-kompleksin tuottamiseen voidaan vaikuttaa kaikilla lämpötiloilla, jotka osaltaan vaikuttavat organismin tyydyttävään kasvuun, eli 15-42°C, ja tuottaminen tapahtuu sopivasti noin 25-28°C lämpötilassa.

Tavallisesti kasvualusta on neutraali, mutta täsmällinen pH voi vaihdella 5,0:n ja 9,0:n välillä riippuen käytetystä spesifisestä alustasta.

Fermentaatio voidaan suorittaa Erlenmayer-pulloissa tai laboratorio- tai tehdasfermenttoreissa, vaihtelevassa kapasiteetissa. Kun käytetään säiliöfermentaatiota, on suotavaa

II

17 77690 valmistaa kasvua edistävä siirroste ravintoliemeen siirros-tantalla pieni määrä viljelyalustaa organismin vegetatiivi-soluilla. Kun täten on saatu siirroste, siirretään se aseptisesti fermenttorissaolevaan alustaan suuressa mittakaavassa tapahtuvaa antibioottien tuottamista varten. Alusta, jota käytetään kasvua edistävään siirrosteeseen voi olla samaa kuin suuremmassa fermentoinnissa käytettävä, vaikkakin myös muita ravintoalustoja voidaan käyttää.

Steriiliä ilmaa puhalletaan kasvualustan läpi, kuten aerobisissa submerssiviljelyissä on tapana. Sekoitus voidaan järjestää fermentaatioteollisuudessa yleisesti tunnetuilla sekoittimilla.

Yleisesti, kompleksin optimituotto saavutetaan 144-186tunnin inku-bointijakson jälkeen sekoitusastia- tai säiliöfermenttorissa. Fermentaation kulkua voidaan seurata analyyttisellä HPLC:llä.

Muodostunut AAD 216-kompleksi sisältää uudet bioaktiiviset komponentit tai itsenäiset antibioottiosatekijät, AAD 216A, AAD 216B ja AAD 216C, jotka voidaan eristää kuten yllä on kuvattu.

Biologinen aktiivisuus AAD 216-kompleksin, rikastetun AAD 216-kompleksin, AAD 216A:n, AAD 216B:n, AAD 216C:n ja vankomysiinin in vitro minimi in-hibitoiva konsentraatio (MIC) määritettiin useille mikro-organismeille käyttäen standardi mikrotiitterianalyysimenetelmää. Tulokset on esitetty seuraavissa taulukoissa 3-7.

Antimikrobiaalinen spektri 18 77690

Taulukko 3

Testiorganismi MIC pg/ml AAD AAD AAD AAD Vankcrry si ini 216 216 216 216

kompleksi ABC

Staph, aureus HH127 6.3 3.1 3.1 3.1 1.6

Staph, aureus SK&F 910 12.5 3.1 3.1 3.1 1.6

Strep, faecilis HH34358 1.6 0.4 0.4 0.8 3.1

Proteus mirabilis SK&F 444 >100 >100 >100 >100 100 E. coli 12140 (SK&F 809) >100 >100 >100 >100 100

Kleb. pneumoniae >100 >100 >100 >100 >100 4200 (SK&F 798)

Pseudomonas aeruginosa >100 >100 >100 >100 >100 HH63

Sterratia marcesens >100 >100 >100 >100 >100 ATOC 13880

Proteus morgani SK&F 179 >100 >100 >100 >100 >100

Providencia SK&F 276 >100 >100 >100 >100 >100

Enterobacter cloacae >100 >100 >100 >100 >100 HH31254

Salmonella gallinarum >100 >100 >100 >100 25 BC595

Staph, epidermidis 25 6.3 6.3 6.3 1.6 SK&F 2479

Listeria monocytogenes 3.1 0.8 0.4 ^0.4 1.6 SK&F 2255

Staph, epidermidis SK&F 651 100 50 25 25 1.6 19 77690

Taulukko 4 (Metisilliini sensitiivinen)

Testiorganismi mtc ηπ/ιηΐ AAD AAD AAD AAD _ Vanko- 216 216 216 216 nysiini

Karpleksi A B__C_

Staph, aureus HH127 12,5 1,6-3,13,1 3,1 1,6

Staph, aureus SK&F 674 12,5 3,1-6,3 6,3 12,5 1,6

Staph, aureus SK&F 910 12,5, 3,1 6,3 6,3 1,6

Staph, aureus SK&F 1761 12,5 3,1 3,1 3,1 1,6

Staph, aureus SK&F 2593 25 6,3 6,3 6,3 1,6

Staph, aureus SK&F 2666 12 5 3.,1 3 /1 6/3 1/6

Staph, aureus SK&F 2677 25 6,3 3,1 6,3 1,6

Staph, aureus SK&F 2678 25 6,3 6,3 6,3 1,6

Staph, aureus SK&F 2680 12 ,5 3 ,1-6 ,3 6 ,3 6,3 1 ,6

Staph, aureus SK&F 2682 25 3,1-6,3 6,3 3,1 1,6

Staph, aureus SK&F 2736 25 3,1-6,3 6,3 6,3 · 1,6

Staph, aureus SK&F 2776 50 12,5 6,3 12,5 1,6

Staph, aureus SK&F 2777 12,5 3,1 3,1 3,1 0,8

Staph, aureus SK&F 2613 6 ,3 1 ,6 1,6 1,6 1,6

Staph, aureus SK&F 2615 12 ,5 3 ,1-6 ,3 6 ,3 6,3 3 ,1

Taulukko 5 (Metisilliini resistentti)

Testiorganismi MIC pg/ml -- AAD AAD AAD AAD Vanko- 216 216 216 216 nysiini

Koipieksi A B__C

Staph, aureus SK&F 675 50 12,5 6,3 12,5 1,6

Staph, aureus SK&F 2612 12,5 6,3 3,1 6,3 1,6

Staph, aureus SK&F 2614 6 ,3 3 ,1 3 ,1 3,1 1,6

Staph, aureus SK&F 2616 25 6,3-12,5 6,3 6,3 0

Staph, aureus SK&F 2620 25 6,3 12,5 12,5 3,1

Staph, aureus SK&F 2621 25 6,3 6,3 6,3 1,6

Staph, aureus SK&F 2594 25 6,3-12,5 6,3 6,3 1,6

Staph, aureus SK&F 2589 25 6 ,3-12 ,5 6 ,3 6,3 1,6

Staph, aureus SK&F 2590 25 6,3-12,5 3,1 6,3 1,6

Staph, aureus SK&F 2591 25 6,3 6,3 6,3 1,6

Staph, aureus SK&F 2592 50 6,3 12,5 12,5 3,1

Staph, aureus SK&F 2595 25 6,3-12,5 6,3 6,3 vl,6

Staph, aureus SK&F 2596 25 6,3-12,5 6,3 6,3 3,1

Staph, aureus SK&F 2597 25 6 ,3-12 ,5 6 ,3 12,5 3 ,1 20 7 7 6 9 0

Taulukko 6 (Anaerobit)

Testiorganismi MIC yg/ml AAD AAD AAD AAD Vanko- 216 216 216 216 nysiini

Kcmpleksi A B C

Bacteroides fragilis >32 32 32 32 32 ATCC 25285 B. fragilis H145 >32 16 16 8 32 L·. fragilis SK&F 3060 >32 32 16 16 32

Ek loeochii SK&F 3087 >32 8-16 16 4 32 B. thetaiotamicron >32 >32 32 32 32 SK&F 3089

Fusobacterium nucleatum>32 32 32 32 32 ATCC 25586

Clostridium perfringens<0,016 £0, 016 0,125^0,016 0,5 MCP-1 C. perfringens MCP-2 ^0,016 ^0, 016 0 ,125^0,016 0,5 C. perfringens 0,25 0, 031-0, 063 0 ,125 0 ,125 1,0 ATCC 19408

Clostridium difficile 1,0 0,25 0,25 0,5 2 SK&F 3062 C. difficile SK&F 3065 1,0 0,5 0,25 0,5 4 C. difficile SK&F 3091 <0,016 0, 125-0 ,25 0 ,25 0 ,031 2 C. difficile SK&F 3092 1,0 0 ,125 0,25 0 ,25 2 C. difficile SK&F 3096 1, 0 0 ,25 2 0,25 2 C. difficile SK&F 3098 <.0,016 <^0 ,016 2 0 ,031 2

Taulukko 7

Testiorganismi MIC ucr/ml

Rikastettu Vanko- ___ AAD 2Ί6 kompleksi AAD 216A irysiini

Staph, aureus HH 127 b ,3 -—3^1

Staph, aureus SK&F 910 ^6 ,3 3 3, i

Staph, aureus 209P 1,6 15 15

Staph, aureus 100 10q >100 209P-Mutant

Staph, aureus SK&F 674 6,3 3,1 1,6

Staph, aureus 'v-lOO 'ν,ΙΟΟ >100 SK&F 674-P6 Mutant

Staph, aureus SK&F 675 12,5 12,5 3,1

Staph, epidermidis SK&F 2479 25 25 63

II

21 77690

Testiorganismi · MIC pg/ml

Rikastettu Vanko- AAD 216-kompleksi AAD 216A mysiini Staph, epidermidis SK&F 2683 100 100 6/3

Staph, epidermidis SK&F 651 100 100 6, 3

Staph, epidermidis SK&F 2265 100 100 6,3

Strep, faecalis HH 34358 0/4 1/6 6/3

Strep, faecalis SK&F 657 0/4 0/8 3/1

Listeria monocytogenes 0/8 1/S 3/1 SK&F 2255 E. coli 12140 (SK&F 809) >100 >100 >100

Salmonella gallinarum >100 >100 >100 BC595 AAD 216A:n, AAD 216B:n, AAD 216C:n ja vankomysiinin in vivo aktiivisuus, mitattuna ED^Q-arvona, osoitettiin hoitamalla antibiooteilla intraperitoneaalista s.c. infektiota, joka oli aiheutettu hiirille 46,8 LD^^sn määrällä Staph, aureus HH 127:ää, 1 ja 5 tuntia infektioiden jälkeen. ED^-arvot olivat seuraavat: AAD 216A, 5,0 mg/kg; AAD 216B, 5,0 mg/kg; AAD 216C, 7,5 mg/kg; vankomysiini, 1,76 mg/kg.

Tämän keksinnön mukaiset antibioottiset yhdisteet, mukaan luettuna AAD 216-kompleksi ja sen pääasialliset bioaktiiviset komponentit: AAD 216A, AAD 216B ja AAD 216C sekä näiden seokset, osoittavat antibakteriaalista aktiivisuutta.

Näistä voidaan valmistaa farmaseuttisia yhdisteitä, jotka sisältävät ainakin yhtä yllä mainituista antibioottiyhdis-teistä sekä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan. Yhdisteet voivat myös sisältää muita aktiivisia antibakteriaalisia aineita. Yhdisteet voidaan saattaa mihin tahansa farmaseuttiseen muotoon, joka sopii kyseessä olevaan antamisreittiin. Esimerkkejä tällaisista yhdisteistä ovat suun kautta annettavat kiinteät yhdisteet, kuten tabletit, kapselit, pillerit, jauheet ja granulaatit; suun kautta annettavat nestemäiset yhdisteet, kuten liuokset, suspensiot, siirapit ja eliksiirit; sekä parenteraalisesti annettavat valmisteet, kuten steriilit liuokset, suspensiot tai emulsiot.

22 7 7 6 9 0

Antibakteriaalisena aineena käytettäessä yhdisteet annetaan siten, että aktiivisen ainesosan konsentraatio on suurempi kuin tietyn hoidettavan organismin minimi inhibointikonsen-traatio.

AAD 216-kompleksin ja sen komponenttien; AAD 216A:n, AAD 216B:n ja AAD 216C:n, aktiivisuus osoitettiin in vitro kaikenkaikkiaan 58 naudan mastitis-isolaattia vastaan käyttäen konventionaälista agarlaimennusmenetelmää minimi inhibointi-konsentraatioiden (MIC) määräämiseksi. MIC:t AAD 216-komp-leksille, AAD 216A:lle, AAD 216B:lle ja AAD 216C:lle vaih-telivat välillä 0,25 ja yli 128 yg/ml, 0,13 ja yli 128 yg/ml, 0,06 ja yli 128 yg/ml sekä 0,06 ja yli 128 yg/ml, vastaavasti. Vertailuna, vankomysiinin MIC:t samalle mikro-organismille vaihtelevat välillä 0,25 ja yli 128 yg/ml.

Kasvua edistävä aktiivisuus- AAD 216-kompleksin ja sen komponenttien; AAD 216A:n ja AAD 216B:n ja AAD 216C:n, kasvua edistävä aktiivisuus määritettiin siassa in vitro-menetelmällä, jotta voitiin ennustaa käyttökelpoisuus yksimahaisille eläimille, kuten sialle ja siipikarjalle: pötsissä in vitro-menetelmällä, jotta voitiin ennustaa käyttökelpoisuus lihan ja maitovalmisteiden tuottajille sekä lampaille ja in vivo-menetelmällä kananpojalle kasvuvaikutuksen toteamiseksi.

In vitro-menetelmä sialle:

Kuohittu Yorksire-urossika varustetaan kirurgisesti joko suolikanyylillä, joka asetetaan 15 cm:n päähän suoli-ceco-colic-liittymästä, tai cecal-kanyylillä, joka asetetaan apexin ja cecumin alun puoliväliin. Eläintä syötetään 4 kertaa päivässä, rajoittaen 30 kg painavan eläimen ottama energia 4,5 %:iin painosta tai 100 kg painavan eläimen 2,5 %:iin painosta. Sian kasvuannos on:

II

23 77690 (% W/W) (kg/ton)

Puolikarkeaksi jauhettu kuorimaton maissi 70,60 640

Soijapapujauho, 44 % 22,00 200

Vedetön sinimailasjauho, 17 % 4,50 41

Kalsiumpropionaatti 0,15 1

Vitamiini/mineraalisekoitus 2,75 25

Materiaalin näytteenottokanyylin välityksellä alkaa 150-180 min ensimmäisen aamusyötön jälkeen ja jatkuu sen jälkeen 30-120 min välein, riippuen tarvittavan materiaalin määrästä. Näytettä säilytetään murskatussa jäässä, ei alle 5°C, ja sitä kaasutetaan jatkuvasti hiilidioksidilla. Kerätty materiaali suodatetaan. Suodosta käytetään siirrosteena testi-ja kontrollinäytteiden inkuboinneissa. Kaasutettua siirros-tetta, 2,25 ml, laitetaan 10 seen kaasutettuun koeputkeen, jotka jokainen sisältävät 0,75 ml ravintoliuosta ja 0,5 mg jokaista testiyhdistettä. Samanaikaisesti testiyhdistekoe-putkien kanssa inkuboidaan neljä sokeakoe-kontrolliputkea 5 tuntia 37°C:ssa sekoittaen. Lisäksi otetaan neljä tapettua putkea, joita ei inkuboida.

Jokaiseen putkeen lisätään 0,60 ml 25 %:sta metafosforihap-poliuosta, jonka jälkeen putkia säilytetään -4°C:ssa kunnes analyysi suoritetaan. Näytteet sulatetaan ja sentrifugoidaan 25 min ja 20000 kierr./min. Supernatantti dekantoidaan, valmistetaan näytteeksi kaasukromatografiaa ja automaattista analyysiä varten. Tulokset syötetään tietokoneeseen, jotta lopuksi saadaan arvoja, joilla sokeakokeen arvo on 100 %. Virginia-mysiiniä ja vankomysiiniä käytetään positiivisina kontrolleina. Tulokset on esitetty taulukossa 8.

24 7 7 6 9 0

Taulukko 8 VFA* LYS* GLU* LAC* (% Kontrolli) (% Kontrolli) (% Kontrolli) (% Kontrolli)

Yhdiste (ppm)

Virginianrysiini (166,57) 93 163 197 81 (16.67) 130 127 191 76 (1/67) 248 82 182 70

Vankcrtr/siini (166.67) 250 48 190 64 (16.67) 280 42 189 59 (1.67) 92 83 100 99 AAD 216 -kanpleksi (666.67) ** 267 44 189 58 (166.67) 345 50 195 51 (66.67) 390 53 188 46 (16.67) 124 81 113 93 (6.67) 90 101 96 100

AAD 216A

(166.67) 326 63 187 58 - (16, 67) 379 50 191 47 (1.67) 101 94 97 99

AAD 216B

(166.67) 290 50 190 56 (16.67) 365 55 184 47 (1.67) 102 98 97 98

AAD 216C

(166, 67) 294 42 191 57 (16, 67) 398 53 188 45 (1, 67) 101 95 96 98 it 25 7 7 6 9 0 * VFA viittaa kaikkiin haihtuviin rasvahappoihin, nimittäin, asetaattiin, propionaatiin, isobutyraattiin, butyraattiin, isovaleraattiin ja valeraattiin. LYS on lysiini, GLU on glukoosi ja LAC on L-maitohappo.

** AAD 216-kompleksi sisältää 25 % AAD 216A:n, AAD 216B:n ja AAD 216C:n seosta.

In Vitro-menetelmä pötsille:

Protokolla pötsin in vitro-menetelmälle on analoginen sian in vitro-menetelmälle seuraavin muutoksin: (1) Nuori 400 kg:n härkä varustetaan kirurgisesti pötsika-nyylillä.

(2) Eläintä syötetään kerran päivässä seuraavalla annoksella:

Lopullinen ruoka % w/w

Pellavansiemenen kuoria 44,0

Rikottua maissia 22,0

Sinimailasheinää 1" 20,0

Pelletti-lisäys* 10,0

Nestemäistä melassia 4,0 100,0 *Pellettilisäys % w/w

Soijapapuöljyjauho (50 % proteiinia) 50,0

Puolikarkeaksi jauhettua maissia 32,5 D/Kalsiumfosfaattia 6,50

Tavallista suolaa 2,50

Jauhettua kalkkikiveä (Thomasville) 3,50

Ureaa 2,50

Vitamiini A & sekoitus** 2,50 100,00 **Vitamiini A & D^-sekoitus % w/w d ' -

Vitamiini A (30 000 IU/gm) 5,87

Vitamiini D2 (7 260 000 IU/kg) 0,50

Hienoksi jauhettua maissia 93,63 100,00 26 7 7 6 9 0 (3) VFA:n tuottaminen on kuvattu propionaatin tuottona prosentteina tuotetusta VFA:n kokonaismäärästä.

(4) Näytteenotto materiaalista kanyylin avulla tapahtuu 120 min syöttämisen jälkeen.

Tulokset on esitetty taulukossa 9.

77690 27

Taulukko 9 Propicnaat- VFA* LYS* GLU* tj- % (% Kontrolli) (% Kontrolli) (% Kontrolli) (% Kont-

Vankanysiini (50 ,0) 107 97 189 127 (5 ,0) 108 85 165 130 (0,5) 97 83 17 105

Avqparsiini (50.0) 113 97 141 132 (5.0) 105 85 166 121 (0,5) 103 96 116 106

Monensiin!natrium (50.0) 109 147 0 156 (5.0) 104 141 126 149 (0,5) 94 109 11 119 AAD 216 -kompleksi (200.0) ** 118 116 78 159 (50.0) ** 117 101 11 159 (20.0) ** 115 95 193 130 (2/0)** 101 92 60 102

AAD 216A

(50.0) 111 114 153 146 (5.0) 93 90 28 135 (0,5) 94 96 121 105

AAD 216B

(50.0) 111 124 20 148 (5.0) 121 107 0 141 (0,5) 100 103 45 103 28 7 76 9 0 * VFA viittaa kaikkiin haihtuviin rasvahappoihin, nimittäin asetaattiiin, propionaattiin, isobutyraattiin, butyraattiin, isovaleraattiin ja valeraattiin. LYS on lysiini ja GLU on glukoosi.

** AAD 216-kompleksi sisältää 25 % AAD 216A:n, AAD 216B:n ja AAD 216C:n seosta.

Kananpojan kasvun tarkastelu:

Yhden päivän broilerikananpoikia, jotka valittiin painon, terveyden ja sukupuolen mukaan, pidettiin ympäristötekijöiden suhteen kontrolloidussa huoneessa 27°C lämpötilassa ja 40 % kosteudessa. Kananpoikia syötetään ad libitum. Vettä tarjotaan ad libitum. Ilmastoon mukautumisperiodin aikana syötetään ruis- tai maissipohjaista ravintoa (päivät 1 ja 2), sitten yhdisteeseen sekoitettuna testi- tai kontrolliolosuh-teissa 3-17 päivinä. Jokaiseen testi- tai kontrolliryhmään käytetään joko 8 tarhallista (64 kananpoikaa) tai 16 tarhal-lista (128 kananpoikaa). Tulokset on esitetty taulukossa 10.

Perusruisdieetti

Ruokavalion osatekijät (% w/w) (kg /ton)

Jauhettu ruis (hienojauhatus) 54,4 494

Soijapapujauho (49 % proteiinia) 27 245

Liha- ja luujauho (50 % proteiinia) 10 91

Vedetön sinimailasjauho 1,25 11

Eläinrasva 4 36

Kuivattu hera (tai laktoosi) 1 9

Jauhettu kalkkikivi 0,67 6,1

Dikalsiumfosfaatti 0,50 5

Jodattu suola 0,23 2,1

Vitamiinisekoitus 0,175 *

Hivenmineraalisekoitus 0,25 2 DL metioniini (98 %) 0,45 4

Koliinikloridi (50 % vesiliuos) 0,150** 1 29 7 7 69 0 * Vitamiinisekoitus sekoitetaan ravintoon samalla kun testi-kemikaalit lisätään 87,5 g vitamiinisekoitusta/49 912,5 g perusravintoa.

** Koska koliini lisätään 50 %:na vesiliuoksena, dieetin prosenttimäärä kaksinkertaistuu.

Taulukko 10

Annos Toisto-----Paino------Syöttö/Lisäys- Kuolleita keir— _PPM to ja vrk 10 vrk 17 3-10 10-17 3-17 kanoja ---%:a kontrollista-----

Virginianysiini 10,0 8 103, 8 116 ,0 97,4 83,6 90, 4 2

Virginiainysi,1 ni 50,0 8 105,0 121 ,3 93,2 74,6 83, 2 1 AAD 216-kanpleksi40,0 8 107, 7 132 ,4 90,9 69,6 79, 6 2 AAD216-kcnpleksil60,0 8 106,1 117 ,1 91,0 80,1 85, 3 3 —Grammaa---Grarmoja/Grainma-

Kcntrolliruis 0,0 8 164, 2 280,4 1,577 2,815 2, 209 2

Historiallinen kontrolli 169,1 298 ,4 1,566 2,563 2,080

Keskihajonta tarhoissa - 3,71 % * AAD 216-kompleksi sisältää 25 % AAD 216A:n, AAD 216B:n ja AAD 216C:n seosta.

:Y. Tämän keksinnön ravinnon rakenne käsittää lihaa ja maitoa tuottavien eläinten normaalin ravintoannoksen täydennettynä sellaisella määrällä ryhmästä, AAD 216-kompleksi, AAD 216A, AAD 216B, AAD 216C tai näiden seokset, valittua aktiivista ainesosaa, joka tehokkaasti lisää eläinten kasvunopeutta ja ravinnon tehoa, mutta joka ei ole siinä määrin toksinen tai haitallinen, että eläimet vähentäisivät ravinnonottoa annoksista. Aktiivisen ainesosan määrä vaihtelee, kuten tie-detään, riippuen tekijöistä, kuten ainesosan hinta, eläimen laji ja koko, keksinnön mukaisen yhdisteen suhteellinen ak-tiivisuus tai perusravintona käytettävän ravintoannoksen tyyppi.

30 7 7 6 9 0

Edustavat ravintoannokset sialle ja siipikarjalle ovat seu-raavat: Annos 18-45 kg painaville urossioille valmistetaan käyttäen seuraavaa valmistusohjetta:

Maissia, jauhettu 78,15 %

Soijapapuöljyjauho, 44 % 17,0 %

Lihajätteitä, 50 % 3,0 %

Osterinkuorimauste 0,4 %

Luujauho 0,5 %

Sinkkioksidi 0,01 %

Vitamiini A, B, B^2 ja D valinnainen -täydennys

Kananpoikien annos broilereille valmistetaan seuraavan kaavan mukaan:

Keltaista maissijauhoa 67,35 %

Soijapapuöljyjauhoa 24,00 %

Menhaden-kalajauhoa 6,00 % Höyrystettyä luujauhoa 1,00 %

Jauhettua kalkkikiveä 1,00 %

Jodattua suolaa 0,34 % 25 %:sta koliinikloridia 0,13 % *-.· B^ 2~vitamiinia 0,10 %

Manganeesisulfaattia 0,02 %

Vitamiiniseosta 0,06 %

Vasta vieroitetun sian ravintoa voidaan lisätä täydennykseksi tai lisäämään ruoan rasvaisuutta. Sika syö 0,9 kg:sta ravintoa päivässä (11 kg:n sika) 4 kg:aan päivässä (68 kg:n sika). Useimmiten annosten perustana on maissi, jota on täydennetty säilötyillä palkokasveilla, vehnänleseillä, kauroilla, ohralla, melassilla tai proteiineilla.

3i 77690

Siipikarjan ravinto käsittää aloitusannoksia, broileriannok-sia ja muninta-annoksia. Ravinto perustuu tavallisesti jauhetulle maissille, maissijauholle tai soijapapujauholle.

Usein broilerin annokset sisältävät korkeaenergisiä täyden-nysaineita, kuten lisättyjä rasvoja, proteiineja ja vitamiineja. Kalkkunoiden annokset ovat samanlaisia, mutta käsittävät ainoastaan aloitusannoksen ja kasvuannoksen. Kananpojat ja fasaanit syövät 13-130 g rehua päivässä, kalkkunat kaksi kertaa enemmän. Arvioitu ravinnonotto riippuu lihaa tuottavan eläimen painosta.

Ryhmästä, joka käsittää AAD 216-kompleksin, AAD 216A:n, AAD 216B:n, AAD 216C:n tai niiden seoksen, valitut aktiiviset ainesosat sekoitetaan tasaisesti näihin rehuannoksiin, jolloin saadaan täydennettyjä rehuja, jotka syötetään tavalliseen tapaan eli useimmiten ad libitum. Mukavasti tämä käy käyttämällä tuottajan valmistamaa formuloijille tai rehun-jakajille myytävää esisekoitusta tämän keksinnön mukaisesta täydentävästä kasvun edistäjästä, vaihtoehtoisesti ilman tai muiden tämän tieteensuunnan tuntemien lisäaineiden kanssa, kuten antelmintiini, typpilähde tai antibiootti, kuten virginiamysiini tai oksytetrasykliini. Ryhmästä, joka käsittää AAD 216-kompleksin, AAD 216A:n, AAD 216B:n, AAD 216C:n tai niiden seoksen, valittujen ainesosien konsentraa-tio esiseoksessa on tavallisesti 5-75 paino-% tai konsen-traatioltaan 100-2000 kertaa suurempi kuin konsentraatio lopullisessa rehuannoksessa. Esiseos voi olla nestemäistä tai kiinteää. Esiseoksessa käytettäviä väliaineita ovat maissiöljy, pellavansiemenöljy, melassi tai tislausjätteet, jolloin saadaan nestemäisiä esiseosvalmisteita. Kiinteisiin esiseosvalmisteisiin käytetään usein perustana sakkaroosia, . . laktoosia, maissijauhoa, jauhettua maissia, jauhoja, kal- siumkarbonaattia tai soijapapujauhoa. Esiseoskoostumus sekoitetaan sitten tasaisesti päärehun kanssa, joka syötetään kohde-eläimelle. Tässä käytettyyn termiin "rehukoostumukset" sisältyvät edellä mainitun kaltaiset esiseoskoostumukset.

32 77690

Ryhmästä, AAD 216-kompleksi, AAD 216A, AAD 216B, AAD 216C ja näiden seokset, valittujen aktiivisten ainesosien pitoisuus lopullisessa annoksessa ei ole toksinen mutta aktiivinen määrä, joka on valittu esimerkiksi väliltä noin 1-1000 osaa aktiivista ainetta painosta per miljoonasosaa koko rehua (ppm) tai noin 2-115 grammaa tonnia kohden. Edullisesti, myrkytön aktiivisen ainesosan määrä valitaan väliltä 10-50 ppm.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä käsittää yksivatsaisten tai märehtijöiden, lihaa tai maitoa tuottavien eläinten, erityisesti liha- ja maitonautakarjän, lampaiden, sikojen ja siipikarjan ruokkimisen tehokkaalla kasvua edistävällä muttei toksisella määrällä aktiivista ainesosaa, joka on valittu AAD 216-kompleksin, AAD 216A:n, AAD 216B:n, AAD 216C:n ja näiden seokset käsittävästä ryhmästä. Muita yksi-vatsaisia eläimiä, joiden ruoansulatusjärjestelmälle on ominaista myöskin fermentaatio cecumissa tai cecumin kaltaisessa kammiossa, ovat jänikset ja hevoset.

Täydennetyt rehuannokset, joita yllä on kuvattu, annetaan eläimelle tunnetuilla menetelmillä. Ad libitum-ruokinta laitumella, tarhassa tai kasvatusaitauksessa on mukavin tapa eläimen kasvun ja maidontuotannon lisäämiseksi sekä operaation ruokintatehokkuuden lisäämiseksi.

Seuraavat esimerkit valaisevat kyseessä olevan keksinnön antibioottien tuottoa, eristämistä ja puhdistamista.

Seuraavissa esimerkeissä käytettyjen ravintoalustojen koostumukset on esitetty alla. Fermentaatioiden saannot määritettiin HPLCrllä verrattuna määrällisesti luotettaviin näytteisiin.

33 77690

Alustaa 13 (H) käytettiin SK&F-AAD 216:sta siirrosteen kasvattamisessa kaikissa kokeissa. Alustan 13H ainesosat ovat: tärkkelys 15 g/1, sakkaroosi 5 g/1, dekstroosi 5 g/1, HY-soija 7,5 g/1, maissinliotusvesi 5 g/1, K2HP04 1,5 g/1,

NaCl 0,5 g/1, CaCO^ 1,5 g/1 ja mineraali "S" 5 ml/1, pH säädetään 7,0 :ksi.

Mineraali"Sn koostumus on seuraava:

ZnS0417H20 2,8 g/1, Fe(NH4)2HCgH50? 2,7 g/1, CuS0415H20 0,125 g/1, MnS04-H20 1,0 g/1, CoCl216H20 0,1 g/1,

Na2B40?-H20 0,09 g/1 ja Na2Mo0412H20 0,05 g/1.

V-2-alustan ainesosat ovat: soijapapujauhoa 15 g/1, sokeri-juurikasmelassia 10 g/1, glukoosia 10 g/1, Estrasan 4:ää (metyylioleaatti) 10 g/1 ja NaCl 0,3 g/1, pH 7,2:ksi.

Esimerkki 1 Siirrosteen kasvatus

Koko kasvusto K. aridumin (ATCC 39323) vinopinnalta suspendoitiin 10 ml:aan steriiliä vettä ja siirrostettiin aseptisesti 4 l:n ilmastettuun pulloon, joka sisälsi 500 ml alusta 13 H:ta. Ravistelijassa tapahtuneen inkuboinnin jälkeen, 250 kierr./min, 280°C:ssa 3 päivää, valmista viljelmää käytettiin 14 l:n lasisen sylinterifer-menttorin siirrostamiseen (esimerkki 2), jossa valmistettiin toinen siirroste.

Esimerkki 2

Toinen siirrostevaihe 14 l:n lasinen sylinterifermenttori(New Brunswick Model 19), jossa oli 10 1 steriiliä alusta 13 H:ta siirrostettiin aseptisesti 500 ml:11a esimerkistä 1 saatua vegetatiivivil-jelmää. Fermentointi suoritettiin seuraavan taulukon mukaisin säädöin:

Sekoitus: 400 kierr./min 0-72 tuntia

Ilmastus: 0,4 v/v/m1 0-72 tuntia

Lämpötila: 28°C

v/v/m - ilman tilavuus per alustan tilavuus per minuutti « 77690

Viisi litraa saatua vegetatiiviviljelmää käytettiin 75 l:n fermenttorin siirrostamiseen (esimerkki 3), jossa valmistettiin kolmas siirroste.

Esimerkki 3

Kolmas siirrostevaihe 75 1:n fermentointi (Chemapec) suoritettiin samoin kuin esimerkissä 2. Viisi litraa esimerkin 2 vegetatiiviviljelmää käytettiin siirrostamaan 75 l:n fermenttori, joka sisälsi 50 1 alustaa 13H. Fermentointi suoritettiin seuraavan taulukon mukaisin säädöin:

Sekoitus: 250kierr./min 0-72 tuntia

Ilmastus: 0,4 v/v/m 0-72 tuntia

Lämpötila: 28°C

50 1 saatua vegetatiiviviljelmää käytettiin 750 l:n fermenttorin (esimerkki 4) siirrostamiseen halutun AAD 216-komplek-sin tuottamiseksi.

Esimerkki 4 AAD 216-kompleksin tuottaminen 750 l:n fermentointi (ABEC) suoritettiin samoin kuin esimerkissä 3. 50 1 esimerkin 3 vegetatiiviviljelmää käytettiin 750 l:n fermenttorin aseptiseen siirrostamiseen, joka sisälsi 600 1 alustaa V-2. Fermentointi suoritettiin seuraavan taulukon mukaisin säädöin:

Sekoitus: 120 kierr./min 0-168 tuntia

Ilmastus: 0,3 v/v/m 0-168 tuntia

Lämpötila: 26°C

Fermentointiliuos sisälsi AAD 216-kompleksia, joka oli koostunut itsenäisistä osatekijäantibiooteista seuraavasti: AAD 216A = 50 ug/ml, AAD 216B = 60,8 μg/ml ja AAD 216C = 43,5 pg/ml.

35 77690

Esimerkki 5 AAD 216-kompleksin tuottaminen 450 l:n fermentointi (Chemapec) suoritettiin samoin kuin esimerkissä 4. 30 1 esimerkin 3 mukaan tuotettua vegetatii-viviljelmää (kolmas siirrostevaihe) käytettiin 450 l:n fer-menttorin aseptiseen siirrostamiseen, joka sisälsi 300 1 alustaa V-2. Fermentointi suoritettiin seuraavasti:

Sekoitus: 1 20 kierr./min 0-168 tuntia

Ilmastus: 0,4-0,5 v/v/m

Lämpötila: 26°C

Fermentointiliuos sisälsi AAD 216-kompleksia, joka oli koostunut itsenäisistä osatekijäantibiootteista seuraavasti: AAD 216A = 46,2 pg/ml, AAD 216B = 75 ug/ml ja AAD 216C = 48 yg/ml.

Esimerkki 6 AAD 216-kompleksin eristäminen

Koko esimerkin 4 fermentointiliuos (600 1) selkeytettiin pyörivällä rumpusuodattimena (Komline-Sanderson, Laboratory Scale Model) käyttäen suodatinapuainetta (Hyflo Supercel, Johns-Manville Products Corp.) liuoksen omassa pH:ssa (pH

7,7-8,2). Liuoksen suodos (420 1) jäähdytettiin 4°C:een 100 l:n panoskäsittelynä kylmähauteeseen (metanoli/hiili-happojää) asetetussa astiassa. Jäähdytetty liuoksen suodos saostettiin sen jälkeen lisäämällä hitaasti konsentroitua suolahappoa, sekoittaen, pH 3,0:aan saakka. Muodostunut sakka erotettiin pyörivällä tyhjiösuodattajalla käyttäen suodatinapuainetta, kuten aikaisemmin kuvattiin. Suodatin-apuaine-tuote-sakkakakkua uutettiin sekoittamalla se de-ionisoituun veteen (55 1) ja säätämällä pH 7,0:aan 10 minuutiksi. Saatu vesipitoinen uute suodatettiin Whatman 4 suodatinpaperin läpi suodatinapu-aineen poistamiseksi. Täten saatu suodos ajettiin kahden XAD-7 hartsikolonnin (8,5 χ 110 cm) lävitse virtausnopeudella 0,5 til./tunti. Pestiin 8:11a tilavuudella deioni- 36 77690 soitua vettä, jonka jälkeen haluttu AAD 216-kompleksi otettiin talteen eluoimalla vesipitoisella metanolilla (50-100 %). Metanolipitoinen eluaatti, joka sisälsi halutun AAD 216-kom-pleksin konsentroitiin haihduttamalla käyttäen nousevatilmi-haihdutinta 35°C:ssa. Saatu vesipitoinen konsentraatti kylmäkuivatuin Virtis shelf-lyofilisaattorilla, jolloin saatiin 85,1 g AAD 216-kompleksia.

Tämä AAD 216-kompleksi kromatografioitiin Whatman Partisil® Prep 40 ODS-3 (1 kg)-kolonnilla Jobin Yvon Chromatospac-Prep 100-laitteella (askelgradientti 15-33 %:lla asetonitriili-0,1 M fosfaattipuskurilla pH 3,2), jolloin saatiin rikastettua AAD 216-kompleksia, joka analyyttisellä HPLC:llä analysoitaessa sisälsi 1,88 g AAD 216A:ta, 2,6 AAD 216B:tä ja 2,8 g AAD 216C:tä.

Esimerkki 7 AAD 216A;n, AAD 216B:n ja AAD 216C;n eristäminen Esimerkin 6 mukaisesti eristetty rikastettu AAD 216-kompleksi-näyte (38 g, josta ei ollut poistettu suoloja), joka sisälsi analyyttisellä HPLC:llä mitattuna 0,42 g AAD 216A:ta, 1,39 g AAD 216B:tä ja 0,08 g AAD 216C:tä, liuotettiin litraan 15 %:sta asetonitriiliä 0,1 M (pH 6) fosfaattipuskurissa ja pH säädettiin 6,3:ksi. Tätä liuosta ruiskutettiin Waters Prep 50C^ HPLC:hen, jossa oli kolonnina Whatman Partisil® 40 (ODS-3) (50 x 4,8 cm) virtausnopeutena 200 ml/minuutti. Tämän jälkeen kolonnia eluoitiin käyttäen seuraavaa gradi-enttia: (1) 20 % vesipitoinen asetonitriili- ja puskuri- liuos, kunnes polaarinen materiaali (ultraviolettidetektori 210 nmrssä) oli eluoitunut, (2) 24 % asetonitriili-puskuriliuos, kunnes AAD 216A oli eluoitunut, (3) 26 % asetonitriili-puskuriliuos, kunnes AAD 216B oli eluoitunut, (4) 28 % asetonitriili-puskuriliuos, kunnes AAD 216C oli eluoitunut ja (5) 50 % vesipitoinen asetonitriili.

3? 77690 HPLC-kolonnista eluoiduista sopivista fraktioista poistettiin suolat, kuten alla on kuvattu, jolloin saatiin puhtaat itsenäiset antibiootit: 0,25 g AAD 216A:ta, 1,05 g AAD 216B:tä ja 0,06 g AAD 216C:tä.

Suolojen poistamista varten HPLC:n sopivat fraktiot kerätään ja asetonitriili poistetaan alipaineessa. Saadut vesipitoiset näytteet lasketaan XAD-7-hartsikolonniin ja eluoidaan deionisoidulla vedellä kunnes ulosvirtaavan liuoksen kon-duktiivisuus on vähemmän kuin 25 mikro MH0:ta. Tämän jälkeen kolonnia eluoitiin vesipitoisella asetonitriilillä (40-60 %) ja eluentti lyofilisoitiin, jolloin saatiin halutut tuotteet.

Esimerkki 8

Rikastetun AAD 216-kompleksin eristäminen 10 gramman näyte AAD 216-kompleksia, joka oli eristetty esimerkin 6 XAD-7-menetelmän mukaisesti, ja joka sisälsi 0,69 g AAD 216A:ta, 0,23 g AAD 216B:tä, ja 0,21 g AAD 216C:tä (HPLC-analyysi), liuotettiin 17,5 % asetonitriili- ja 0,1 M pH 6 fosfaattipuskuri liuokseen. Liuoksen pH säädettiin S) 6,3:een ja tätä liuosta ruiskutettiin Waters Prep 500^-korkeapainenestekromatografiin, joka oli varustettu 50x4,8 cm:n kokoisella Whatman Partisil ®Prep 40 (ODS-3)-täyttei-sellä kolonnilla. Kolonnia eluoitiin 20 %:lla asetonitriili-puskuriliuoksella polaarisen materiaalin poistamiseksi ja tämän jälkeen eluoitiin 28 %:lla asetonitriili-puskuri-liuoksella, jolloin saatiin AAD 216-kompleksi asetonitrii-li-puskuriliuoksessa. Asetonitriili poistettiin eluentista alipaineessa ja saatu vesipitoinen liuos kaadettiin XAD-7-hartsikolonniin ja pestiin deionisoidulla vedellä, kunnes ulosvirtaavan luoksen konduktiivisuus oli vähemmän kuin 25 mikro MHOrta. Sitten kolonnia eluoitiin vesipitoisella asetonitriilillä (40-60 %) ja eluentti lyofilisoitiin, jolloin saatiin 2,05 g rikastettua AAD 216-kompleksia, joka sisälsi 0,59 g AAD 216A:ta, 0,20 g AAD 216B:tä ja 0,20 g AAD 216C:tä.

38 776 90

Esimerkki 9

Vaihtoehtoinen eristämismenetelmä

Vaihtoehtoisesti, AAD 216-kompleksi XAD-7-puhdistuksen jälkeen kromatografioitiin käyttäen hyväksi esimerkin 7 menetelmää saannon maksimoimiseksi, jolloin saatiin AAD 216A, AAD 216B ja AAD 216C suhteellisen puhtaina.

Neljästä erillisestä ajosta saatu AAD 216A (analyyttisellä HPLCtllä sisälsivät 3,9 g, 2,6 g ja 2,2 g AAD 216A:ta) yhdistettiin ja kromatografioitiin uudestaan samalla HPLC:llä isokraattisella eluoinnilla 22 %:lla asetonitriilillä ja 0,1 M pH 6 fosfaattipuskurilla, jolloin saatiin, suolojen poiston jälkeen, 4,6 g AAD 216A:ta keskeltä ajoa erittäin puhtaassa muodossa. Muut fraktiot uudelleenkierrätettiin lisäpuhdistusta varten.

Samoista neljästä erillisestä ajosta saatu AAD 216B (analyyttisellä HPLC:llä sisälsivät 2,5 g, 3,7 g, 3,7 g ja 1,4 g) yhdistettiin ja kromatografioitiin uudestaan samalla HPLCrllä isokraattisella eluoinnilla 26 %:lla asetonitriilillä ja 0,1 M pH 6 fosfaattipuskurilla, jolloin saatiin, suolojen poiston jälkeen, 2,7 g AAD 216B:tä keskeltä ajoa erittäin puhtaassa muodossa. Muut fraktiot uudelleenkierrätettiin lisäpuhdistusta \arten.

Esimerkki 10

Rikastetun AAD 216-kompleksin vaihtoehtoinen eristämismenetelmä

Esimerkin 6 mukaisesti eristetty AAD 216-kompleksi, joka sisälsi arviolta 720 mg AAD 216A:ta, AAD 216B:tä ja AAD 216C:tä, liuotettiin veteen (200 ml) ja suodatettiin. Suodos sekoitettiin 70 ml:aan affiniteettikromatografia-sorbenttia (Affi-Gel® 10-D ala-D ala, 633 mg D ala-D ala) 0,02 M pH 7,0 natriumfosfaattipuskurissa (katso Cuatrecasas et ai., Biochemistry, voi. 11, no. 12, ss. 2291-2298 (1972) yleisen menetelmän osalta) ja varovasti sekoitettiin 1/2 tuntia.

Seos kaadettiin kolonniin ja vesifaasi eluoitiin pois.

39 77690

Kolonnia pestiin: 0,02 M pH 7,0 fosfaattipuskuri (2 x 250 ml), 0,5 M NH4OAc pH 7,8 (2 x 250 ml), H20 (250 ml), 0,1 M pH 7,8 NH^OAc (250 ml), H20 (250 ml), 40 % vesipitoinen asetonit-riili (70 ml), 40 % vesipitoinen asetonitriili (1400 ml) ja 30 % asetonitriili 0,4 M NaHCO^issa (2 x 250 ml). 1400 ml:nen 40 % vesipitoinen asetonitriilifraktio lyofilisoitiin, jolloin saatiin 607 mg rikastettua AAD 216-kompleksia, joka sisälsi 224 mg AAD 216A:ta, 133 mg AAD 216B:tä ja 158 mg AAD 216C:tä.

Claims (4)

1. Menetelmä antibiootin, AAD 216-komplekein, valmista-mieekei, tunnettu siitä, että viljellään mikrobia Kibdelo-eporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323 tai sen jälkeläisiä vesipitoisella ravintoalustalla, joka sisältää assimilointikelpoisia typpi- ja hiililähteitä submerssi-viljelynä aerobisissa olosuhteissa, kunnes riittävä määrä AAD 216-kompleksia on syntynyt ja eristetään täten tuotettu AAD 216-kompleksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että AAD 216-kompleksi eristetään fermentointi1iuok-sesta selkeyttämällä koko sitä sisältävä fermentointi1iemi ja saostetaan kompleksi tästä selkeytetystä liuoksesta hapolla.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antibioottikomponentit AAD 216A, AAD 216B ja AAD 216C erotetaan kromatografisesti AAD 216-kompleksista.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antibioottikomponentit puhdistetaan suoloista, jolloin saadaan puhdasta AAD 216A:ta, AAD 216B:tä ja AAD 216C:ta.