CS228936B2 - Předběžné, respektive doplňkové krmivo pra vytvoření krmivá pro hospodářská zvířata, zvláště přežvýkavco - Google Patents

Description

Vynález se týká krmivá pro hospodářská zvířata, zvláště přežvýkavce, které podporuje růst drůbeže, vepřů, ovcí a skotu.

Antibiotikum A-4696, faktory Bi, B2, B3, Ci_a, C3 a Ei je možno izolovat z komplexu antibiotika A-4696, který se získá pěstováním mikroorganismu Actinoplanes missouriensis ATCC 31680, ATCC 31682 nebo ATCC 31683 v živném prostředí, které obsahuje využitelné zdroje uhlíku, dusíku a anorganických solí v submerzní kultuře za aerobních podmínek do nahromadění dostatečného množství antibiotika.

Použití svrchu uvedených faktorů je možno zvýšit využití krmivá u přežvýkavců tak, že se těmto živočichům podá takové množství komplexu A-4696 nebo faktorů Βι, B2, B3, Ci_a, C3 a/nebo Ei nebo některé z adičních solí těchto látek s kyselinami, přijatelnými z farmaceutického hlediska, které podporuje růst těchto zvířat, a to jako krmivo, přídavná směs nebo přídavné krmivo.

Obdobným způsobem je také možno urychlit růst kuřat — tak, že se kuřatům podá v krmivu nebo pitné vodě příslušné množství anUbiotika A-4696 ve formě komplexu nebo ve formě některého z nových faktorů Βι, B2, Bj, Ci_a, C3 a/nebo El nebo některá ze solí těchto látek, přijatelných z farmaceutického hlediska.

; í

228836 s

Vysokotlakou kapalinovou chromatografií je možno prokázat, že antibiotikum A-4696 obsahuje několik faktorů, které je možno 0značit jako Βι, B2, B3, C_ia a C3. Mimoto je možno izolovat ještě faktor El, který je z komplexu rovněž možno izolovat, který však může být produktem rozkladu. Chemické, fyzikální a biologické vlastnosti jednotlivýéh faktorů ukazují, že antibiotika možná s výjimkou faktoru Ei jsou složena z téhož peptidového jádra (aglykonu) a aminocukru, a mimoto z různých množství glukózy, mannózy a rhamnózy. Faktor Ei je podobný ostatním faktorům, je však možné, že obsahuje poněkud modifikované peptidové jádro. Bioautografle tvorby aglykonu v průběhu hydrolýzy komplexu antibiotika a jednotlivých faktorů ukazuje, že v průběhu krátké doby vznikne jednoduchá směs antimikrobiálně účinného pseudoaglykonu a aglykonu.

Pod pojmem „antibiotikum A-4696“ se rozumí komplex antibiotik actaplaninového typu, kdežto různé faktory, izolované z komplexu se označují jako antibiotikum A-4696 faktor A, Βι, B2, Bs, Ci_a, C3, Ei a tak dále. Antibiotikum i jeho jednotlivé faktory jsou vysoce úč nné látky, které mají význam v zemědělství, jako růstové látky pro kuřata, vepře, ovce a skot.

Faktory Βι, B2, Bs, Ci_a, C3 a Ei antibiotika A-4696 jsou zásadité látky, které mohou tvořit soli s vhodnými kyselinami a je možno je izolovat z komplexu, který se získá pěstováním mikroorganismu z čeledi Actinoplanes missouriensis v živném prostředí do nahromadění antibiotika. Dále uvedené vlastnosti jednotlivých faktorů se týkají hydrochloridů, přestože je možno známým způsobem připravit i jakékoli jiné z fakmaceutického hlediska přijatelné soli těchto faktorů.

Chromatografií na tenké vrstvě silikagelu, vysokotlakou kapalinovou chromatografií a dalšími metodami je možno prokázat že antibiotikum A-4696 při dělení poskytuje směs různých složek, které rovněž mají antibiotickou účinnost. Tyto složky je možno chromatograficky oddělit od původního antibiotického komplexu chromatografií na sloupci polyamidu. Ohromatografické frakce se odebírají podle spektra v ultrafialovém světle a podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a frakce, které obsahují čisté faktory A, Bi, B2, B3, Ci_a, C3 nebo Ei se slijí a lyofilizují. Totožnost a čistota výsledných lyofilizovaných chromatografických frakcí se stanoví vysokotlakou kapalinovou chromatografií.

Chromatografie antibiotika A-4696 při použití směsi methanolu, chloroformu, koncentrovaného hydroxidu amonného, sek.butanolu a vody v poměru 50 : 25 : 25 : 25 : 10 a Bacillus subtilis jako detekčního organismu poskytuje výsledky, uvedené v následující tabulce.

A-4696 Rf

Při vysokotlaké kapalinové chromatografií antibiotika při teplotě místnosti při použití směsi. 2% vodného roztoku kyseliny octové a methylkyanidu v poměru 90:10 a 2% vodného roztoku kyseliny octové a methylkyanidu v poměru 70 : 30 se získají následující výsledky:

A-4696 K‘

A 1,60

Bi 1,99

B2 3,84

B3 2,50

Ci_a 2,92

C3 4,23

Ei 0,38

Různé další faktory je možno v menším množství oddělit od antibiotika chromatografií na tenké vrstvě a vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Tyto faktory je možno označit jako C_lb, C_2a, C_2b a D a jsou v mnoha směrech podobné ostatním svrchu uvedeným faktorům. Mimoto nelze vyloučit, že by bylo možno získat ještě další nezjištěné faktory. Tyto faktory ještě nebyly izolovány a čištěny v takovém množství, aby bylo možno stanovit jejich vlastnosti.

V případě, že se antibiotikum A-4696 nebo jeho jednotlivé faktory hydrolyzují v mírně kyselém prostředí, například v 5% methanolovém roztoku kyseliny chlorovodíkové při teplotě varu pod zpětným chladičem 70 minut, získá se pseudoglykon. Tuto látku je možno vysrážet a v případě faktorů A, Bi, B2, B3, Ci_a a C3 má následující strukturu:

V případě antibiotika A-4696 faktoru Ei je možné, že tento aglykon je poněkud modifikován, tato skutečnost však dosud nebyla prokázána.

Chromatografií na papíře a na tenké vrstvě bylo možno prokázat, že po hydrolýze komplexu a jednotlivých faktorů obsahují tyto látky kromě pseudoaglykonu ještě různá množství neutrálních cukrů. Totožnost a molární poměry těchto neutrálních cukrů jsou uvedeny v následující tabulce 1:

Tabulka 1

Molární poměry neutrálních cukrů*

A-4696 faktor	Mannóza	Glukóza	Rhamnóza
A	2,80	1,0	—
Bi	2,05	1,0	1,01
B2	1,80	1,0	—
b5	2,37	1,0	—
čia	1,12	1,0	1,08

* Cukry byly stanoveny plynovou chromatografií ve formě trimethylsllylových derivátů. Každý cukr je uveden jako souhrn isomerů a a β.

Jednotlivá antibiotika svrchu uvedeného typu je tedy možno od sebe odlišit, složením neutrálního cukru, který je vázán na pseudoglykon v poloze, která dosud nebyla určena.

Předmětem vynálezu je předběžné, respektive doplňkové krmivo pro vytvoření krmivá pro hospodářská zvířata, zvláště přežvýkavce, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje 0,01 až 90 hmot. % antibiotika A-4696 ve formě komplexu nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelnou adiční sůl s kyselinou, antibiotikum Α-469Θ faktor Bi nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelná adiční sůl s kyselinou, s výhodou ve formě hydrochloridu, který je bílá, krystalická látka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahem hydroxylových skupin a polárních rozpouštědel a nerozpustná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu, allifatických uhlovodících a chlorovaných uhlovodících s přibližným složením 51,51 % uhlíku, 5,25 % vodíku, 4,88 % dusíku, 4,62 % chloru a zbytkem kyslíku, s přibližnou teoretickou molekulovou hmotností 1954, s absorpčním maximem v ultrafialovém světle ve vodě při 280 nm při EJ^_m =42,8 s následujícími pásy v absorpčním spektru v infračerveném světle v bromidu draselném 3380 široký, 2930, 1731, 1693, 1654, 1637, 1615, 1588, 1577, 1521, 1503, 1488, 1423, 1321, 1289, 1229, 1210, 1178, 1154, 1121, 1076, 1060, 1030, 1012, 982, 880, 842, 831 a 810 cm^-1, antibiotikum A-4696 faktor B2 nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelná adiční sůl s kyselinou, s výhodou ve formě hydrochloridu, který je bílá, krystalická látka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahem hydroxylových skupin a polárních rozpouštědlech a nerozpustná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu, alifatických uhlovodících a chlorovaných uhlovodících s přibližným složením 51,96 % uhlíku, 4,87 % vodíku, 5,72 % dusíku, 5,88 % chloru a zbytkem kyslíku, s přibližnou teoretickou molekulovou hmotností 1808, s absorpčním maximem v ultrafialovém světle ve vodě při 280 nm při E= 44,7, s následujícími pásy v absorpčním spektru v infračerveném světle V bromidu draselném: 3409 široké, 2934,1730,

1658, 1614, 1580, 1548, 1504, 1498, 1490, 1426, 1290, 1231, 1210, 1179, 1121, 1061, 1031, 1017, 987, 903, 884 a 818 cm!, antibiotikum A-4696 faktoru B3 nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelná adiční sůl s kyselinou, s výhodou ve formě hydrochloridu, který je bílá, krystalická látka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahem hydroxylových skupin a polárních rozpouštědlech a nerozpustná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu, alifatických uhlovodících a chlorovaných uhuhlíku, 4,74 % vodíku, 5,83 % dusíku, 5,57 °/o chloru a zbytkem kyslíku, s přibližnou teoretickou molekulovou hmotností 1808, s absorpčním maximem v ultrafialovém světle ve vodě při 280 nm při E =46,3, s následujícími pásy v absorpčním spektru v infračerveném světle v bromidu draselném: 3394 široké, 2938, 1733, 1697, 1675, 1656, 1638, 1614, 1591, 1515, 1504, 1489, 1427, 1359, 1291, 1228, 1209, 1180, 1120, 1072, 1051, 1018, 985, 903, 882, 846 a 816 cm^-1, antibiotikum A-4696, faktor Cia nebo z jeho farmaceutického hlediska přijatelná adiční sůl s kyselinou, s výhodou ve formě hydrochloridu, který je bílá, krystalická látka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahem hydroxylových skupin a polárních rozpouštědlech a nerozpustná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu, alifatických uhlovodících a chlorovaných uhlovodících s přibližným složením 53,05 %^! uhlíku, 4,74 % vodíku, 5,83 % dusíku, 5,39 % chloru a zbytkem kyslíku, s přibližnou teoretickou molekulovou hmotností 1792, s absorpčním maximem v ultrafialovém světle ve vodě při 279 nm při Ej'’’m =47,9 s následujícími pásy v absorpčním spektru v infračerveném světle v bromidu draselném: 3380 široké, 2931, 1734, 1650, 1616, 1591, 1505, 1491, 1427, 1359, 1290, 1228, 1213, 1177, 1123, 1072, 1061, 1032, 1017, 987, 903, 832, 814 a 715 ciir¹, antibiotikum A-4696 faktor C3 nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelná adiční sůl s kyselinou, s výhodou ve formě hydrochloridu, který je bílá, krystalická látka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahem hydroxylových skupin a polárních rozpouštědlech a nerozpustná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu, alifatických uhlovodících a chlorovaných uhlovodících s přibližným složením 51,73 % uhlíku, 4,69 °/o vodíku, 5,94 % dusíku, 6,02 % chloru a zbytkem kyslíku, s absorpčním maximem v ultrafialo228936 vám světle ve vodě při 280 nm při E = = 47,9 s náledujícími pásy v absorpčním spektru v infračerveném světle v bromidu draselném: 3378 široké, 2925, 1728, 1689, 1658, 1637, 1616, 1589, 1579, 1573, 1546, 1536, 1529, 1523, 1503, 1489, 1474, 1457, 1426, 1421, 1397, 1387, 1286, 1231, 1206, 1121, 1075, 1062, 1028, 1012, 987, 965, 949, 878, 840, 816, 769, 708 cm^-1, antibiotikum A-4696 faktor El nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelná adiční sůl s kyselinou, s výhodou ve formě hydrochloridu, který je bílá, krystalická látka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahem hydroxylových skupin a polárních rozpouštědel a nerozpustná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu, alifatických uhlovodících a chlorovaných uhlovodících s přibližným složením 50,71 % uhlíku, 4,69 % vodíku, 5,94 % dusíku, 6,02 % chloru a zbytkem kyslíku, s absorpčním maximem v ultrafialovém světle ve vodě při 279 nm při E J°(“_m =39,9 s následujícími pásy v absorpčním spektru v infračerveném světle v bromidu draselném: 3394 široké, 2933, 1657, 1636, 1610, 1589, 1538, 1511, 1505, 1453, 1424, 1393, 1369, 1328, 1320, 1291, 1232, 1212, 1178, 1120, 1075, 1061, 1031, 1018, 986, 973, 904, 878, 847, 813, 770, 752, 738 a 714 cm'l.

Soli antibiotika A-4696 faktorů Βι, B2, B3, C_la, C3 a El, přijatelné z farmaceutického hlediska je možno připravit s anorganickými kyselinami, například s kyselinou chlorovodíkovou, bromovodíkovou, sulfonovou, fosforečnou a podobně. Soli antibiotika s těmitcí kyselinami je možno získat například tak, žo se okyselí roztok volného antibiotika příslušnou kyselinou a pak se sůl vysráží přiváděním acetonu do roztoku. Soli je možno připravit v některých případech také výměnou iontů při použití sloupce s náplní iontoměniče.

Stejným způsobem je také možno užít jiné metody pro výrobu solí. Všechny tyto metody jsou v oboru známy.

Antibiotikum A-4696 faktory Βι, B2, B3, Ci_a, C3 a Ei ovlivňují rychlost růstu v tom smyslu, že urychlují růst a zvyšují využití krmivá u drůbeže, vepřů, ovcí a skotu. Například při denním podávání u drůbeže a vepřů v množství 0,5 až 25 mg/kg tělesné hmotnosti je možno dosáhnout rychlejšího růstu a lepšího využití krmivá než v případě zvířat, která jsou krmena stejným krmivém bez obsahu účinné látky. Pod pojmem „krmivo“ se rozumí celkový příjem živin u daného zvířete, to jest běžného krmivá, koncentrátů, doplňkových krmiv, anorganických solí, vitamínů i směsi s obsahem léčivých látek, objemného krmivá a dalších složek krmné dávky zvířete. Typické základní dávky pro drůbež a vepře jsou uvedeny v US patentu č. 4 115 552.

Výhodně se postupuje tak, že se antibiotikum A-4696, faktory Βι, B2, B3, Ci_a, C3 a Ei nebo vhodné deriváty těchto faktorů nebo jejich směsi podávají perorálně ve vhodném krmivu v množství 2 až 200 g na tunu krmivá, čímž je možno dosáhnout lepšího využij krmivá a rychlejšího růstu. Přidáním účinných faktorů antibiotika A-4696 do krmivá se s výhodou provádí tak, že se nejprve připraví vhodná předběžná směs, například způsobem podle US patentu č. 4 115 552 s obsahem 1 až 200 g antibiotika A-4696, faktorů Βι, B2, Bs, Ci_a, Cs nebo Ei nebo vhodného derivátu nebo směsi těchto faktorů v 1 kg předběžné směsi. Tato směs se pak vmísí do výsledného krmivá. Je také možno postupovat tak, že se účinná látka vmísí do běžného krmivá ve formě koncentrátu nebo doplňkového krmivá s obsahem této látky.

Nové faktory antibiotika A-4696 je možno izolovat z původního antibiotika, které se získává pěstováním některého kmene Actionoplanes za aerobních podmínek ve vhodném ž^:vném prostředí do nahromadění antibiotika v živném prostředí. Jednotlivé faktory je možno izolovat různými způsoby izolace a čištění.

Mikroorganismus, který produkuje antibiotikum A-4696 byl identifikován jako kmen Acíinoplanes missouriensis z čeledi Actinoplanaceae. Jde o čeleď mikroorganismů z řádu Actinomycetales, která byla poprvé popsána v publikaci Dr. John N. Couch, Jour. Ělisha Mitchell Sci. Soc., 71, 148 až 155 a 269 (1955 J, Bergey“ s Manual of Determinative Bacteriology, 7. vydání 825 až 829 (1957) a Jour. Elisha Mitchell Sci. Soc., 79, 53 až 70 (1963).

Biologicky čisté kultury kmenů Actinoplanes nňssourlensis, vhodné pro produkci antibiotika A-4696 a pro následnou izolaci jeho faktorů Βι, B2, B3, Ci_a, C3 a Ei byly uloženy do veřejné sbírky kultur American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, odkud je možno je získat bez omezení pod čísly ATCC 31680, ATCC 31682 a ATCC 31683. Kmen ATCC 31682 je vhodný pro výrobu antibiotika A-4696 s následnou izolací faktorů Bi a Ci_a. Kmen ATCC 31680 je vhodný pro izolaci antibiotika A-4696 faktorů B2 a C3 a kmen ATCC 31683 je vhodný pro izolaci antibiotika A-4696 faktorů Bs a Ei.

Stejně jako v případě jiných mikroorgaírsmů má živné prostředí pro pěstování kmenů Acíinoplanes obsahovat základní stopové prvky, nutné pro růst a vývoj mikroorganismu. Tyto stopové prvky jsou již obvykle přítomny jako nečistoty v ostatních složkách živného prostředí.

Mikroorganismus, užitý pro výrobu antibiotika A-4696 s následnou izolací jeho faktorů Bi, B2, Bs, Ci_a, C3 a El je schopen růstu v poměrně velkém rozmezí pH. Je však žádoucí jej pěstovat v rozmezí pH 6,5 až 7,0. Stejně jako je tomu v případě ostatních mikroorganismů řádu Actinomycetes, mění se pH růstového prostředí postupně v průběhu růstu, takže na konci se obvykle pohybuje v rozmezí 6,5 až 7,5.

Pro výrobu antibiotika A-4696 je výhodné pěstovat mikroorganismus v submerzní kultuře za aerobních podmínek. Poměrně malá množství antibiotika je možno získat z kultur v třepacích lahvích, v případě většího množství antibiotika je nutno užít pěstování ve sterilních tancích ve formě submerzní kultury za aerobních podmínek. Živné prostředí, obsažené ve sterilním tanku je možno očkovat tak, že se ke sterilnímu prostředí přidá suspenze myceliálních fragmentů.

Je tedy žádoucí získat vegetativní očkovací materiál mikroorganismu, což se provádí tak, že se naočkuje malé množství živného prostředí fragmenty mycelia a jakmile se získá mladá vegetativní kultura, přenese se tento materiál asepticky do většího tanku. Živné prostředí pro vypěstování vegetativního očkovacího materiálu může být stejné jako živné prostředí pro získání většího množství antibiotika, je však možno užít i jiného živného prostředí.

Actinoplanes missouriens’s kmeny ATCC 31080, ATCC 31682 a ATCC 31683, produkující faktory antibiotika A-4696 je možno pěstovat při teplotě 20 až 40 °C. Největší množství faktorů uvedeného antibiotika se získá v průběhu pěstování při teplotě 30 °C.

Pří pěstování v submerzní kultuře za aerobních podmínek se živným prostředím nechá procházet sterilní vzduch. Objem vzduchu, který prochází živným prostředím se pohybuje v rozmezí 0,1 až 1,0 objemu vzduchu za minutu na objem živného prostředí. Nejúčinnější růst a produkce antibiotika se dosáhne v případě, že objem vzduchu tvoří alespoň 1/2 objemu vzduchu za minutu na 1 objem živného prostředí.

Rychlost produkce antibiotika A-4696 a jeho faktorů a koncentrace antibiotika v živném prostředí se sleduje tak, že se odebírají vzorky živného prostředí a podrobí se testům na antibiotickou účinnost proti organismůs, které jsou na tyto faktory citlivé. Jedním z použitelných organismů je Bacillus subtilis. Biologickou zkoušku je možno provádět standardním způsobem na plotnách s použitím kalíšků nebo papírových kotoučů.

K maximální produkci antibiotika obvykle dochází v průběhu 4 až 6 dní v třepacích kulturách i v submerzní kultuře za aerobních podmínek.

Antibiotikum A-4696 pro následnou izolaci svých faktorů Bi, B2, Bs, C_la, C3 a Ei je možno izolovat z živného prostředí a oddělit od ostatních případně přítomných látek běžnými metodami s použitím absorpce a extrakce. Adsorpční postupy jsou výhodnější, protože při nich není zapotřebí užít velkých objemů rozpouštědel, jako je tomu v případě extrakčních postupů.

Protože způsob výroby je přibližně stejný v případě, že se užívá kmene ATCC 31680 pro izolaci antibiotika A-4696, faktory B2 a Cs, kmene ATCC 31682 pro izolaci antibiotika A-4696 faktorů Bl a Ci_a a kmene ATCC 31683 pro izolaci antibiotika A-4696 faktorů B3 a Ei, je v následujících příkladech uveden pro jednoduchost pouze způsob pěstování kmene ATCC 31682. V příkladu 1 jsou rov10 něž uvedeny některé rozdíly, které se týkají použití kmene ATCC 31683.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady:

Příklad 1

A. Fermentace ve třepací lahvi

Myceliální fragmenty Actinoplanes missoudiensis kmene ATCC 31682 se naočkují na šikmý agar následujícího složení:

Složka	Množství v %
cerelóza	0,5
bramborový dextrin	2,0
moučka nutrisoy*	1,5
extrakt z kvasme	0,25
uhlič.tan vápenatý	0,1
agar	2,0

* Mouka Nutriosy je dodávána Archer Daniels Midland Company, 4666 Faries Parkway, Oecatur, Illinois 62526.

Šikmý agar naočkovaný kmenem ATCC 31682 se pak inkubuje 6 dnů při teplotě 30 °C. Kultura nesporuluje, takže je nutné rozdrtit mycelium sterilní pipetou. Takto upravená zralá kultura se překryje sterilní destilovanou vodou a opatrně se odebere pipetou nebo sterilní tyčinkou, čímž se získá suspenze mycelia.

Takto získaná suspenze se užije k naočkování 100 ml sterilního vegetativního živného prostředí následujícího složení:

Složka Množství v %

cerelóza	0,5
bramborový dextrin	2,0
mouka Nutrisoy	1,5
extrakt z kvasnic	0,25
uhličitan vápenatý	0,1

Vegetativní žvné prostředí se po naočkování inkubuje 48 hodin při teplotě 30 °C na rotační třepačce při 250 otáčkách za minutu.

ml naočkovaného živného prostředí se užije k naočkování 100 ml dalšího sterilního prostředí následujícího složení.

Složka Množství v % cerelóza 0,5 kvasinky 0,25 mouka Nutrisoy 1,5 kukuřičný škrob 2,0 uhličitan vápenatý 0,1

Sag 471 (protipěnící činidlo) 0,05

Toto druhé prostředí se inkubuje 24 hodin pří teplotě 30 °C za stálého třepání rychlostí 250 otáček za minutu.

0,4 ml tohoto druhého prostředí se užije k naočkování 100 ml produkčního živného prostředí, svrchu uvedeného složení, které se uloží do Erlenmeyerových baněk s obsahu 500 ml a předběžně se sterilizuje 30 minut při teplotě 121 °C.

Složka Množství v % cerelóza 1,0 kukuřičný škrob 3,5 sacharóza 3,0 melasa 1,5 kvasinky 1,0

Proflo (mouka z bavlníkových semen] 1,0 uhličitan vápenatý 0,2 hydrogenfosforečnan draselný 0,05 síran amonný 0,025 síran hořečnatý . 7 H2O 0,5

Sag 471 0,03

Produkční prostředí se inkubuje 96 hodin při teplotě 30 °C na rotační třepačce při 250 otáčkách za minutu. Na konci fermentace má živné prostředí pH 8,0.

Pro výrobu faktorů Bs a Ei antibiotika A-4696 se užije kmen ATCC 31683 pro výrobu vegetativního živného prostředí. 0,4 ml živného prostředí, naočkovaného kmenem ATCC 31683 se pak užije k naočkování 100 ml produkčního prostředí svrchu uvedeného složení v Erlenmeyerových baňkách po 500 ml po předběžné sterilizaci 30 minut při teplotě 121 °C.

Složka Množství %

cerelóza	1,0
kvasinky	2,0
uhličitan vápenatý	0,2
hydrogenfosforečnan draselný	0,05
síran amonný	0,025
Sag 471	0,03

Produkční živné prostředí se inkubuje 96 hodin při teplotě 30 °C na rotační třepačce o 250 otáčkách za minutu. Na konci fermentace má živné prostředí pH 8,0.

B. Fermentace v tanku o objemu 40 litrů

Vegetativní živné prostředí se připraví způsobem, uvedeným v odstavci A. 25 litrů produkčního prostředí se sterilizuje 30 minut v autoklávu při teplotě 121 °C a vloží se do fermentačního tanku o objemu 40 litrů. Toto množství se naočkuje 100 ml vegetativního prostředí. Naočkované produkční prostředí se pěstuje 4 dny při teplotě 30 °C. Živné prostředí se provzdušňuje sterilním vzduchem v množství 1/2 objemu vzduchu na 1 objem živného prostředí za minutu. Míchání se provádí míchacím zařízením pod tlakem, aby bylo zajištěno dokonalé promísení vzduchu s živným prostředím. V průběhu fermentace stoupá postupně pH živného prostředí a počáteční hodnoty 6,5 na výslednou hodnotu 8,0.

C. Izolace antibiotika A-4696.

3800 litrů fermentačního prostředí, připraveného svrchu uvedeným způsobem se zfiltruje po přidání 5 % (hmotnostní/objemová %) pomocného prostředku pro filtraci (Celit 545). Filtrační koláč se znovu uvede v suspenzi v 3600 litrech deionizované vody a pH vodné suspenze se upraví na 10,5 přidáním vodného roztoku hydroxidu sodného. Pevný podíl se oddělí filtrací a promyje se vodou. Filtrát a promývací voda se slijí a výsledný roztok se okyselí 20 % (hmotnostní/objemová %) vodným roztokem kyseliny sírové na pH 4,5. Kyselý roztok se vyčeří filtrací za současného přidání 1 % pomocného prostředku (Celíte 545). Čirý roztok se nechá projít sloupcem o rozměru 0,5 X 1,5 metru s obsahem 350 litrů Amberlitu IR-116 v Na+ formě a sloupec se promyje 1200 litry deionizované vody. Pryskyřice IR-116 se odstraní a po částech se vymývá při pH

10,5 celkem 1000 litry vodného roztoku hydroxidu sodného. Eluát se neutralizuje na pH 7 přidáním 20% (hmotnostní/objemová procenta) vodného roztoku kyseliny sírové a pak se třikrát promyje celkem 150 litry deionizované vody. Voda, užitá k promytí se neutralizuje a slije s neutralizovaným eluátem. Výsledný roztok se koncentruje a pak lyofilizuje. Výsledný surový produkt měl špinavě šedou až tmavě hnědou barvu.

D. Odstranění solí ze surového antibiotika A-4696

1,0 kg surového komplexu se pomalu přidá za energického míchání k 1,5 litrům deionizované vody. Výsledná suspenze se míchá 20 minut a pak se neutralizuje na pH 7 při použití 10% vodného roztoku hydroxidu amonného. Nerozpustný komplex antibiotika A-4696 se oddělí filtrací ve vakuu, promyje se deionizovanou vodou a lyofilizuje. Usušený komplex, zbavený solí se izoluje ve výtěžku přibližně 80 %, vztaženo na biologickou účinnost.

E. Čištění antibiotika A-4696, zbaveného solí

300 g sušeného komplexu zbaveného solí se uvede v suspenzi ve 2 litrech deionizované vody a pH suspenze se upraví na 2,7 přidáním vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 3 N. Okyselený roztok se odstředuje 40 minut při 2500 otáčkách za minutu. Supernatant se slije a nanese se na vrchol sloupce o rozměrech 8 X 85 cm s obsahem 6 litrů odbarvovacího činidla (Duolit S761], Antibiotikum se vymývá deinlzovanou vodou při rychlosti průtoku 30 ml za minutu. Eluce se sleduje chromatografií na tenké vrstvě. Eluát s obsahem antibiotika A-4896 se zahustí při teplotě 35 °C a tlaku 400 Pa na objem 3 litry a pak se lyofilizuje. Odbarvený komplex se tímto způsobem získá jako bílá až špinavě bílá pevná látka ve výtěžku přibližně 70 %, vztaženo na biologickou účinnost.

F. Izolace antibiotika A-4696 faktorů Bi, B2, B3, Ci_a) C3 a El ve formě hydrochloridu g sušeného odbarveného komplexu antibiotika A-4696 se rozpustí ve 100 ml deionizované vody. Výsledný vodný roztok se zfiltruje a nanese na vrchol chromatografického sloupce o rozměrech 5 X 100 cm s obsahem 2 litrů polyamidu (Machery a Magel SC6). Sloupec se vymývá deionizovanou vodou a odebírají se frakce po 25 ml. Eluce se sleduje ultrafialovým světlem a chromatografií na tenké vrstvě. Podle těchto údajů se slijí a lyofilizují frakce s obsahem jednotlivých faktorů. Pro některé typy dělení bylo zapotřebí prodloužit sloupec na 200 cm tak, že byly užity dva sloupce s obsahem polyamidu za sebou. Další čištění bylo prováděno opakovanou chromatografií.

Postupy, uvedené v odstavcích A až F byly prováděny při použití kmene ATCC 31682 při izolaci faktorů Bi a Ci_a antibiotika A-4696, při použití kmene ATCC 31680 v případě izolace faktorů B2 a C3 antibiotika A-4696 a při použití kmene ATCC 31683 v případě izolace faktorů B3 a Ei antibiotika A-4696. Je sice možno k izolaci svrchu uvedených faktorů užít i jiné kmeny Actinoplanes, svrchu uvedené kmeny však jsou pro izolaci jednotlivých faktorů antibiotika A-4696 nejvýhodnější.

Je také možno izolovat faktory Βι, B2, B3, Cia, C3 a Ei antibiotika A-4696 ve formě hydrochloridu při použití jediného kmene Actinoplanes missouriensis následujícím způsobem:

200 mg sušeného odbarveného komplexu antibiotika A-4696, připraveného při použití kmene ATCC 31683 způsobem podle příkladu 1, odstavce A až E se rozpustí ve 2 ml destilované vody. Výsledný roztok se zfiltruje a dělí se chromatografií na sloupci při použití adsorpčních činidel v reverzní fázi, například Li Chroprep^R RP-18 (F. Merck, Darmstadt, NSR) jako stacionární fáze, jako mobilní fáze se užije vodného acetonitrilu s obsahem triethylaminfosfátu, přičemž množství acetonitrilu se v průběhu postupu zvyšuje. Přestože je zřejmé, že odborník může měnit koncentraci acetonitrilu v závislosti na složení fermentačního prostředí, je možno uvést alespoň, že výhodné rozmezí koncentrace acetonitrilu je 10 až 40 °/o. Eluát se sleduje v ultrafialovém světle a frakce s obsahem jednotlivých faktorů se odebírají. Acetonitril se odstraní odpařením ve vysokém vakuu a výsledné vodné roztoky se lyofilizují. Lyofilizované chromatografické frakce se pak znovu rozpustí v destilované vodě, adsorbují se adsorbční činidla v reverzní fázi, například na Sep Pak^R C18 [Waters Associates lne., Milford, Massachusetts) a adsorbční činidlo se vymývá 50% vodným methanolem. Vodné roztoky s obsahem jednotlivých faktorů antibiotika A-4696 se odpaří dosucha a čištěné faktory se pak izolují jako amorfní pevné látky.

Příklad 2

Způsob výroby faktorů Βι, B2, B3, C_la, C3 a Ei antibiot'ka A-4696 ve formě sulfátu

300 g antibiotika A-4696, připravená způsobem podle příkladu 1 odstavce A až D se uvede v suspenzi ve 2 litrech deionizované vody a pH suspenze se upraví na 2,7 přidáním 3N vodného roztoku kyseliny sírové. 0kyselený roztok se odstřeďuje 40 minut při 2500 otáčkách za minutu. Supernatant se slije a nanese na vrchol sloupce o rozměrech 8 X 85 cm s obsahem 6 litrů pryskyřice k odbarvení (Duolit S761). Antibiotikum se vymývá deionizovanou vodou při průtoku 30 mililitrů za minutu. Eluát se sleduje chromatografií na tenké vrstvě a frakce s obsahem Antibiotika A-4696 se zahustí při teplotě 35 °C a tlaku 400 Pa na objem 3 litry a pak se lyofilizují. Odbarvený komplex se izoluje jako bílá až špinavě bílá pevná látka ve výtěžku přibližně 70 %, vztaženo na účinnost. Jednotlivé faktory antibiotika A-4696, a to Bl, B2, B3, C_la, C3 a Ei ve formě sulfátů se izolují způsobem podle příkladu 1 F.

Claims (1)

1. r Předběžné, respektive doplňkové krmivo pro vytvoření krmivá pro hospodářská zvířata, zvláště přežvýkavce, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje 0,01 až 90,0 hmotnostních % antibiotika A-4696 ve formě komplexu nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelnou adiční sůl s kyselinou, antibiotikum A-4696, faktor Bi nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelnou adiční sůl s kyselinou, s výhodou ve formě hydrochloridu, který je bílá, krystalická látka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahem

   VYNÁLEZU hydroxylových skupin a polárních rozpouštědlech a nerozpustná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu, alifatických uhlovodících a chlorovaných uhlovodících a přibližným složením 51,51 % uhlíku, 5,25 % vodíku, 4,88 % dusíku, 4,62 % chloru a zbytkem kyslíku, s přibližnou teoretickou molekulovou hmotností 1954, s adsorpčním maximem v ultrafialovém světle ve vodě při 280 nm při E^,™¹ =42,8 s následujícími pásy v absorpčním spektru v infračerveném světle v bromidu draselném: 3380 široký, 2930, 1731, 1693, 1654, 1637, 1615, 1588, 1577, 1521, 1503, 1488, 1423, 1321, 1289, 1229, 1210, 1178, 1154, 1121, 1076, 1060, 1030, 1012, 982, 880, 842,' 831 a 810 cm'¹, antibiotikum A-4696 faktor Bž nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelné adiční soli s kyselinou, s výhodou ve formě hydrochloridu, který je bílá, krystalická látka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahem hydroxylových skupin a polárních rozpouštědlech a nerozpustná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu, alifatických uhlovodících a chlorovaných uhlovodících s přibližným složením 51,96 % uhlíku, 4,67 % vodíku, 5,72 % dusíku, 5,88 % chloru a zbytkem kyslíku, s přibližnou teoretickou molekulovou hmotností 1808, s absorpčním maximem v ultrafialovém světle ve vodě při 280 nm při E =44,7, s následujícími pásy v absorpčním spektru v infračerveném světle v bromidu draselném: 3409 široké, 2934, 1730,1658, 1614, 1588, 1548, 1504, 1498, 1490, 1426, 1290, 1231, 1210, 1179, 1121, 1061, 1031, 1017, 967, 903, 884 a 818 centimetrů^-1, antibiotikum A-4696 faktoru Bg nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelné adiční sůl s kyselinou, s výhodou ve formě hydrochloridu, který je bílá, krystalická látka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahem hydroxylových skupin a polárních rozpouštědlech a nerozpustná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu, alifatických uhlovodících a chlorovaných uhlovodících s přibližným složením 51,84 % uhlíku, 4,74 % vodíku, 5,83 % dusíku, 5,57 % chloru a zbytkem kyslíku, s přibližnou teoretickou molekulovou hmotností 1808, s absorpčním maximem v ultrafialovém světle ve vodě při 280 nm při E£^^m =46,3, s následujícími pásy v absorpčním spektru v infračerveném světle v bromidu draselném: 3394 široké, 2938, 1733, 1697, 1675, 1656, 1638, 1614, 1591, 1515, 1504, 1489, 1427, 1359, 1291, 1228, 1209, 1180, 1120, 1072, 1051, 1018, 985, 903, 882, 846 a 816 cm^-1, antibiotikum A-4696, faktor C_la nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelná adiční sůl s kyselinou, s výhodou ve formě hydrochloridu, který je bílá krystalická látka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahem hydroxylových skupin a polárních rozpouštědlech a nerozpustná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu, alifatických uhlovodících a chlorovaných uhlovodících s přibližným složením 53,05 % uhlíku,

   4,74 % vodíku, 5,83 °/o dusíku, 5,39 % chloru a zbytkem kyslíku, s přibližnou teoretickou molekulovou hmotností 1792, s absorpčním maximem v ultrafialovém světle ve vodě při 279 nm při E =47,9 s následujícími pásy v absorpčním spektru v infračerveném světle v bromidu draselném: 3380 široké, 2931, 1734, 1650, 1616, 1591, 1505, 1491, 1427, 1359, 1290, 1228, 1213, 1177, 1123, 1072, 1061, 1032, 1017, 987, 903, 832, 814 a 715 cm^-1, antibiotikum A-4696, faktor C3 nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelná adiční sůl s kyselinou, s výhodou ve formě hydrochloridu, který je bílá, krystalická látka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahem hydroxylových skupin v polárních rozpouštědlech a nerozpustná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu, alifatických uhlovodících a chlorovaných uhlovodících a přibližným složením 51,73 °/o uhlíku, 4,69 % vodíku, 5,94 procent dusíku, 6,02 % chloru a zbytkem kyslíku, s absorpčním maximem v ultrafialovém světle ve vodě při 280 nm při E ¹ = = 47,9 s následujícími pásy v absorpčním spektru v infračerveném světle v bromidu draselném: 3378 široké, 2925, 1728, 1689, 1658, 1637, 1616, 1589, 1579, 1573, 1546, 1536, 1529, 1523, 1503, 1489, 1474, 1457, 1426, 1421, 1397, 1387, 1286, 1231, 1206, 1121, 1075, 1062, 1028, 1012, 987, 965, 949, 878, 840, 816, 769 a 708 cm^-1, nebo antibiotikum A-4696, faktor Ei nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelná adiční sůl s kyselinou, s výhodou ve formě hydrohydrochloridu, který je bílá, krystalická látka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahem hydroxylových skupin a polárních rozpouštědlech a nerozpustná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu, ailifatických a chlorovaných uhlovodících s přibližným složením 50,71 % uhlíku, 4,69 °/o vodíku, 5,94 % dusíku, 6,02 % chloru a zbytkem kyslíku, s absorpčním maximem v ultrafialovém světle ve vodě při 279 nm při E ² ™ = = 39,9 s následujícími pásy v absorpčním spektru v infračerveném světle v bromidu draselném: 3394 široké, 2933, 1657, 1636, 1610, 1589, 1538, 1511, 1505, 1453, 1424, 1393, 1369, 1328, 1320, 1291, 1232, 1212, 1178, 1120, 1075, 1061, 1031, 1018, 986, 973, 904, 878, 847, 813, 770, 752, 738 a 714 cm^-1.