DK163331B - Ikke-terapeutisk fremgangsmaade til behandling af sunde malkekoeer til forbedring af deres maelkeproduktion samt ikke-terapeutisk anvendelse af en propionatforoegende maengde af et glycopeptidantibiotikum hertil - Google Patents

Description

DK 163331 B

Den foreliggende opfindelse angår en ikke-terapeutisk fremgangsmåde til behandling af sunde malkekøer til forbedring af deres mælkeproduktion samt en ikke-terapeutisk anvendelse af en propionatforøgende mængde af et glycopeptidanti-5 biotikum hertil.

Det er nu fastslået med sikkerhed, at forbedringer i foderudnyttelseseffektiviteten og vækstfremme i drøvtyggende dyr, der opfodret til kødproduktion, kan opnås ved ændring af den fermenteringsproces, som 10 finder sted i vommen. Drøvtyggende dyr udnytter deres foder ved sønderdeling af de carbonhydrater, der findes deri, til pyruvat og nedbrydning af pyruvatet til flygtige fede syrer, som omfatter acetat, propionat og butyrat.

De flygtige fede syrer absorberes fra tarmen og anvendes 15 til energiproduktion og i vækstmekanismen.

Drøvtyggende dyr er i stand til at udnytte propionat langt mere effektivt end både acetat og butyrat. I overensstemmelse hermed fungerer nogle af de midler, som forøger effektiviteten af foderudnyttelsen og fremmer 20 væksten i drøvtyggende dyr, ved forøgelse af propionat-produktionen i vommen på bekostning af acetat- og butyratproduktionen.

Kravene til og formålene med foderudnyttelsen hos mælkegivende drøvtyggere, såsom malkekøer, varierer væsent-25 ligt fra kravene og formålene fra drøvtyggere, der opdrættes til kødproduktion. Produktionen af flygtige fede syrer i vommen er naturligvis af primær betydning, da den direkte angår dyrets normale tilstand og kvaliteten og kvantiteten af den mælk, som dyret producerer. I den 30 mælkeydende drøvtygger er energien til mælkedannelse imidlertid den mest begrænsende faktor ved mælkeproduktionen.

Acetat er nødvendigt til syntesen af mælkefedt, medens propionat udnyttes til produktion af glucose, som igen er nødvendig til lactosesyntese, og spiller ligeledes 35 en mindre rolle ved mælkefedtproduktionen. Butyrat er mere glycogent end lipogent, idet det lipogene aspekt 2

DK 163331 B

er indirekte, da butyrat først skal sønderdeles til acetatenheder, før det kan udnyttes til syntese af langkædede fedtsyrer, dvs. mælkefedt.

I overensstemmelse hermed er det til forøgelse 5 af mælkeproduktionen i mælkegivende drøvtyggere nødvendigt at forøge propionatproduktionen, men ikke på stor bekostning af acetat- og butyratproduktionen. Væsentligt nedsatte niveauer af acetat og butyrat resulterer i et drastigt formindsket mælkefedtindhold, hvilket gør mælkeproduktionen 10 mindre effektiv med hensyn til både kvalitet og økonomi, da råmælkpriser til dels er bestemt af indholdet af mælkefedt.

Det har nu vist sig, at de glycopeptidforbindelser, der er kendte som forøgende foderudnyttelseseffektiviteten 15 hos drøvtyggere, der udnyttes til kødproduktion, bevirker en overraskende stigning i mælkeproduktion uden nogen uheldig virkning på mælkekvaliteten, når de indgives til mælkeydende dyr, som har en udviklet vomfunktion.

I overensstemmelse hermed angår den foreliggende 20 opfindelse en ikke-terapeutisk fremgangsmåde til behandling af sunde malkekøer til forbedring af deres mælkeproduktion, og den her omhandlede fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der oralt til køerne indgives en propionatforøgende mængde af et glycopeptidantibiotikum.

25 Glycopeptiderne er en kendt forbindelsesklasse, som ændrer drøvtyggeres fermentering. Klassen omfatter sådanne forbindelser som actaplanin, avoparcin, ristocetin, vancomycin, A35512, K288, AM 374 og A477.

Det er specielt overraskende, at glycopeptiderne 30 er i stand til at forøge mælkeproduktionen uden på uheldig måde at påvirke mælkefedtindholdet, når henses til, at andre· kendte midler til forøgelse af fodereffektiviteten ikke er i stand til at forbedre drøvtyggeres mælkedannelse. F.eks. har Pankhurst og McGowan i en 35 australsk rapport fra Ellinbank Dairy Research Institute fra 1978 diskuteret virkningerne af det fodereffektivitets- 3

DK 163331 B

forbedrende polyethermiddel monensin på mælkeproduktionen hos malkekøer. Disse forfattere konkluderer, .at monensin, skønt det bevirker en stigning i det producerede rumfang mælk, formindsker fedtindholdet væsent-5 ligt, således "at produktionen af fedtkorrigeret mælk er uændret.

Med den foreliggende opfindelse er der tilvejebragt en fremgangsmåde til forbedring af drøvtyggeres mælkeydelse, således at det producerede rumfang mælk forøges, uden at 10 dette er ledsaget af en nedgang i mælkefedtindhold.

Ved den her omhandlede fremgangsmåde anvendes der som glycopeptidantibiotikum fortrinsvis actaplanin, avopar-cin, ristocetin, vancomycin, A35512, A477, K288 og AM374. Physiologisk acceptable salte og estere af sådanne af disse 15 glycopeptidantibiotika, som er i stand til dannelse af sådanne derivater, kan også anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan udøves ved formulering af et glycopeptidantibiotikum til bekvem 20 oral indgift til en drøvtygger. Glycopeptiderne kan formuleres som foderforblandinger, foderadditiver, præparater til at slikke på, vandadditiver, eller de aktive midler kan om ønsket formuleres til langsom frigivelse over et længere tidsrum efter en enkelt indgivelse.

25 De glycopeptidantibiotika, som anvendes ved den her omhandlede fremgangsmåde til forbedring af mælkeydelsen, er kendte. Fremgangsmåden gennemføres fortrinsvis ved anvendelse af et glycopeptid, som er valgt blandt avoparcin, A35512, actaplanin, vancomycin, ristocetin eller 30 A477. Fremgangsmåden gennemføres specielt ved anvendelse af avoparcin, A35512 eller actaplanin, ganske specielt actaplanin.

Avoparcin er et kompleks af vandopløselige glycopeptidantibiotika. Komplekset udgøres primært af 35 to hovedkomponenter, idet flere mindre betydende komponenter også er tilstede. Avoparcin, der også er 4

O

DK 163331 B

identificeret soia AV290/ er beskrevet og karakteriseret i US-PS nr. 3.338.786. Anvendelsen af avoparcin og dets derivater til fremme af vægtforøgelsen hos drøvtyggere er beskrevet flere steder, jfr. Sherrod et al., Proc. Anim.

5 Meet.-Am. Soc~. Anim. Sci., West Sect., 1979, 30, (27]- -274), jfr. C.A. 92:5270x (1980), Trevis, Feedstuffs, 1979, 51(42), 20, jfr. C.A. 92:4993y, 1980.

Actaplanin ligner avoparcin i den henseende, at det er et kompleks af glycopeptidantibiotika, som er 10 effektivt til forbedring af foderudnyttelsen hos drøv-tyggende dyr, såsom stude. Actaplanin, der som kompleks er identificeret som A4696, er første gang beskrevet i US-PS nr. 3.952.095. Individuelle faktorer A og B af actaplanin er beskrevet i US-PS nr. 4.115.552. An-15 vendeisen af actaplanin til forøgelse af effektiviteten af foderudnyttelsen hos drøvtyggende dyr er beskrevet i US-PS nr. 3.928.571. Efter dette tidspunkt er adskillelige nye actaplaninfaktorer blevet isoleret og karakteriseret sammen med et pseudoaglycon, som er fælles for alle de 20 forskellige faktorer. Den fremgangsmåde til forbedring af mælkeydelsen, som den foreliggende opfindelse tilvejebringer, kan opnås ved anvendelse af actaplanin som et kompleks eller alternativt ved anvendelse af en vilkårlig af de individuelle faktorer eller egnede derivater deraf. Desuden 25 kan fremgangsmåden udøves ved anvendelse af pseudoaglyconet i actaplanin. Som anvendt i nærværende beskrivelse refererer udtrykket "actaplanin" til A-4696-komplekset og til de individuelle komponenter og blandinger deraf.

Det glycopeptidantibiotikum, som betegnes A35512, 30 er et kompleks af beslægtede faktorer. Komplekset og de forskellige faktorer, som udgør komplekset, og deres anvendelse til forøgelse af foderudnyttelseseffektiviteten og fremme af vækst hos dyr er beskrevet US-PS nr.

4.083,964. A-35512-faktor B-aglycon er beskrevet i 35 US-PS nr. 4.029.769.

DK 163331 B

O

5

Glycopeptidet ristocetin og dets anvendelse som middel til forbedring af foderudnyttelsen er beskrevet i US-PS nr. 3.928.571. Fremstillingen af ristocetin og visse af dets derivater er beskrevet i US-PS nr.

5 2.990.239 og GB-PS nr. 8501408 og 843.560. Det er påvist, at ristocetin er det samme materiale, som er kendt som ristomycin, se Williams et al., J. Chem.

Soc., Chem. Commun. 1979(906).

Anvendelsen af A477 og vancomycin til forbedring 10 af drøvtyggeres foderudnyttelse er beskrevet i US-PS nr.

3.928.571. Et andet vandopløseligt glycopeptidantibiotikum, som forbedrer drøvtyggeres foderudnyttelse, er kendt som K288 og er beskrevet i J. of Antibiotics, Series A, bind 14, side 141 (1961). K288 er også kendt som acti-15 noidin.

US-PS nr. 3.803.306 beskriver anvendelsen af antibiotiket AM374 og visse derivater deraf som vækstfremmende middel til drøvtyggere, der opdrættes til kødproduktion.

20 I overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen gives mælkegivende drøvtyggere, såsom malkekøer og -geder, en propionatforøgende mængde af et glycopeptidantibiotikum, som er kendt som værende effektivt til forøgelse af propionatproduktionen i dyr med en udviklet 25 vomfunktion. Det har uventet vist sig, at disse glycopeptid-antibiotika på denne måde bevirker en stigning i det producerede rumfang mælk uden en ledsagende stigning i foderforbruget og uden en sænkning af kvaliteten af den producerede mælk, dvs. indholdet af mælkefedt. Forøget 30 mælkeprotein kan også iagttages. Den praktiske virkning af den foreliggende opfindelse er opnåelsen af en forbedret mælkeproduktionseffektivitet hos mælkegivende dyr.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udøves, ved at en propionatforøgende mængde glycopeptidantibiotikum 35 oralt indgives til et mælkegivende dyr med en udviklet vomfunktion. Glycopeptidantibiotiket kan indgives med

DK 163331 B

O

6 foderet eller som et foderadditivsupplement i den normale daglige ration til sådanne dyr. Forbindelserne kan alternativt sættes til drikkevandet, eller de kan anbringes i en blok til at slikke på eller lignende.

5 Om ønsket kan de aktive ingredienser formuleres med excipienter til langsom frigivelse, f.eks. voksarter, polymere og copolymere, og indgives i form af en pille eller kapsel med forsinket frigivelse eller i et lignende præparat til langsom frigivelse.

10 Den specifikke doseringsmængde af disse glyco- peptidantibiotika vil variere afhængigt af det specielt anvendte antibiotikum og det specielle doseringsmønster, som følges. I almindelighed opnås der en forbedret mælkeydelse ved at følge et doseringsskema, som tilnærmelsesvis er 15 det samme som det, der følges til forbedret foderudnyttelse i stude. F.eks. forbedres mælkeproduktionen i voksne mælkegivende drøvtyggere med fra ca. 4 til ca. 10% (målt i kg mælk pr. dag), når et glycopeptid, såsom acta-planin, indgives til den mælkegivende drøvtygger i en 20 daglig dosis på fra ca. 0,10 mg/kg/dag til ca. 10,0 mg/kg/dag. På samme måde opnås der med mælkegivende drøvtyggere, som modtager avoparcin i en dosis fra ca. 0,05 til ca. 50 mg/kg/dag^ en forøgelse i den daglige mælkeproduktion på fra ca.

4 til ca. 10%. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen vil i 25 almindelighed blive udøvet ved oral indgivelse af fra ca. 100 til ca. 1600 mg glycopeptid til en drøvtygger pr. dag. Rutinemæssigt vil glycopeptiderne blive indgivet i en mængde på fra ca. 400 til ca. 800 mg/dyr/dag.

Fortrinsvis blandes disse glycopeptidantibiotika 30 med konventionelle foderstoffer til mælkegivende dyr. Besætningen fodres derefter med disse foderstoffer på kendt måde.

Konventionelle foderstoffer til mælkegivende dyr omfatter forskellige kornsorter og blandinger af kornsorter, 35 såsom majs og havre, og grovfoderstoffer, såsom hø, bomuldsfrøskaller, risskaller og ensilage. Glycopeptidanti-

DK 163331 B

O

7 biotika kan blandes med sådanne foderstoffer i en mængde på fra ca. 30 til ca. 300 g pr. ton foder (på basis af tørstof).

Til kommerciel udnyttelse af glycopeptiderne til 5 forbedret mælkeproduktion ifølge den foreliggende opfindelse er det ønskeligt at anvende de aktive ingredienser som en foderadditivforblandirig eller et foderadditiv koncentrat. I sådanne formuleringer er glycopeptiderne ensartet fordelt gennem hele det konventionelle 10 organiske eller uorganiske dyrefoderbærestof, såsom formalet majs, byg, sojabønnemel, hvede, sojamel eller lignende, prisbillige, spiselige ingredienser. Derefter blandes forblandingen ensartet med den normale daglige foderration forud for fodringen af den mælkegivende 15 drøvtygger. Forblandingen tilsættes i en mængde, som er tilstrækkelig til, at dyret modtager en propionat-forøgende mængde glycopeptid.

Som allerede påpeget er de glycopeptidantibiotika, som skal anvendes ved den her omhandlede fremgangsmåde, 20 kendte og kan fremstilles ved fremgangsmåder, som er velkendte for en fagmand. En speciel foretrukket fremgangsmåde ifølge opfindelsen anvender actaplanin. Udover anvendelsen af actaplaninkomplekset, som foretrækkes, kan de individuelle faktorer af actaplanin anvendes.

25 Faktorerne A og B er som ovenfor påpeget let tilgængelige. Foruden disse individuelle faktorer kan fremgangsmåden udøves ved anvendelse af en vilkårlig af de nyligt isolerede faktorer , B2, B^, C^a, C^, E, G og beslægtede faktorer. Disse og lignende individuelle faktorer er 30 fuldstændigt beskrevet i DK-PA nr. 5620/81, 5621/81 og 5622/81.

Da en især foretrukket fremgangsmåde til forøgelse af mælkeproduktionen omfatter, at actaplanin indgives til en mælkegivende drøvtygger med en udviklet vomfunktion, 35 skal fremstillingen af actaplaninkomplekset og visse af de individuelle faktorer af actaplanin, samt

O

8

DK 163331 B

af pseudoaglyconet, beskrives til yderligere illustration af et foretrukket aspekt ved den foreliggende opfindelse.

5 Eksempel 1

Submerse aerobe dyrkningsbetingelser foretrækkes til fremstillingen af antibiotikum-A-4696-faktorerne.

Relativt små mængder af disse antibiotika kan fremstilles ved rystekolbekulturer, men til fremstillingen af store 10 mængder foretrækkes imidlertid submers aerob dyrkning i sterile tanke. Kulturmediet i den sterile tank kan inoculeres med en myceliumfragmentsuspension.

I overensstemmelse hermed er det ønskeligt at fremstille et vegetativt inoculum af organismen ved at 15 inoculere en relativt lille mængde af kulturmediet med myceliumfragmenterne af organismen, og når der er opnået et ungt vegetativt inoculum, overføres dette aseptisk til.den store tank. Det medium, hvori det vegetative inoculum dyrkes, kan være det samme som det, der benyttes 20 til produktion i stor målestok af antibiotikum-A-4696--faktorer, skønt andre medier kan anvendes.

De stammer, ATCC 31680, ATCC 31681, ATCC 31682 og ATCC 31683, af Actinoplanes missouriensis, som producerer antibiotikum-A-4696-faktor, vokser ved temperaturer mellem 25 20°C og 40°C. Det ser ud til, at de største mængder af A”4696-faktorer produceres ved en temperatur på ca.

30°C.

Steril luft blæses gennem kulturmediet ved den submerse aerobe dyrkningsproces. Det rumfang luft, der 30 fordeles i kulturmediet, varierer fra ca. 0,1 til ca. 1,0 rumfang luft pr. minut pr. rumfang kulturmedium. Den mest effektive vækst og antibiotikumproduktion opnås, når luftrumfanget er mindst et halvt rumfang luft pr. minut pr. rumfang kulturmedium.

35 Produktionshastigheden af antibiotikum-A-4696- -faktorer og antibiotikumaktivitetskoncentrationen i

DK 163331 B

O

9 kulturmediet kan følges under vækstperioden ved undersøgelse af prøver af fermenteringsmediet for antibiotikumaktivitet overfor organismer, der vides at være følsomme overfor disse antibiotika. En sådan forsøgsorganisme, 5 som er anvendelig til illustration af den her omhandlede opfindelse, er Bacillus subtilis. Bioafprøvningen kan gennemføres ved hjælp af standardplademetoder eller ved papirskiveafprøvning på agarplader.

Almindeligvis indtræder den maksimale produktion 10 af antibiotikum i løbet af fra ca. 4 til ca. 6 dage i rystekolber eller submerse aerobe kulturfermenteringer.

Antibiotikum A-4696 til efterfølgende isolering af antibiotikum-A-4696-faktorer B^ , B£, B^, C^a, og kan isoleres fra kulturmediet og skilles fra andre 15 stoffer, som kan være til stede ved adsorptions- eller ekstraktionsteknik. Adsorptionsteknik foretrækkes, fordi sådanne fremgangsmåder undgår anvendelsen af de store rumfang opløsningsmidler, som er nødvendige ved ekstraktionsprocesser.

20 Da fremgangsmåderne til fremstilling af actaplanin er praktisk taget identiske, når der anvendes stammerne. ATCC 31680 (til isolering af faktorerne Es^ og i antibiotikum A-4696), ATCC 31682 (til isolering af faktorerne B1 og C^a i antibiotikum A-4696) og ATCC 31683 (til isolering af 25 faktorerne B^ og E^ i antibiotikum A-4696) , skal for overskuelighedens skyld kun anvendelsen af ATCC 31682 beskrives her. Visse fremgangsmådeforskelle, som angår produktionsmediet og anvendelsen af stamme ATCC 31683, er ligeledes omtalt, hvor dette er hensigtsmæssigt.

30 A. Rystekolbefermentering

Myceliumfragmenter af Actinoplanes missouriensis, for overskuelighedens skyld illustreret her med stamme ATCC 31682, inoculeres på en næringsagarskråkultur med 35 følgende sammensætning: 10

DK 163331 B

o

Ingrediens Mengde

Teknisk glucose 0,5%

Kartoffeldextrin 2,0% 5 ^ Nærmgsso3amel 1,5% Gærekstrakt 0,25%

CaC03 0,1%

Agar 2,0% v Nær ing s so j amel fås fra Archer Daniels Midland Company, 4666 10 Faries Parkway, Decatur, Illinois 62526.

Den med ATCC 31682 inoculerede skråkultur inkuberes derefter i 6 dage ved 30°C. Kulturen sporulerer ikke, således at det er nødvendigt at macerere mycelium-15 måtten med en sterilt pipette. Den macererede modne kultur dækkes med steril destilleret vand og skrabes omhyggeligt med pipetten eller en steril stav til opnåelse af en myceliumsuspension.

:Oen således opnåede suspension anvendes til 20 inoculering af 100 ml af et sterilt vegetativt medium med følgende sammensætning:

Ingrediens_ Mængde

Teknisk glucose 0,5% 25 Kartoffeldextrin 2,0% Næringssojamel 1,5% Gær ekstrakt 0,25%

CaC03 0,1% 30

Det inoculerede vegetative medium dyrkes i 48 timer ved 30°C på et rotationsrysteapparat, der arbejder ved 250 omdrejninger pr. minut. 10 ml af det inoculerede vegetative medium inoculeres over i et 100 ml af et sterilt "stød"-medium med følgende sammen - 35 . .

sætning: 11

DK 163331 B

o

Ingrediens_Mængde_

Teknisk glucose 0,5% Gær 0,25% Nærings s_o jamel 1,5%

Majsstivelse 2,0%

CaC03 0,1% "Sag 471"* 0,05% ^ Siliconantiskummiddel, som kan fås fra 10 Union Carbide.

Det inoculerede "stød"-medium inkuberes i 24 timer ved 30°C under konstant omrystning på et rotationsrysteapparat, der arbejder ved 250 omdrejninger pr. minut.

Fire portioner af "stød"-mediet på hver 10 ml 15 inoculeres over i portioner på 100 ml af et produktions medium med den nedenfor viste sammensætning i 500 ml Erlenmeyerkolber og steriliseres ved 121°C i 30 minutter.

Ingrediens_Mængde_ 20 Teknisk glucose 1,0%

Majsstivelse 3,5%

Saccharose 3,0%

Melasse 1,5% Gær 1,0% 25 "Proflo" (bomuldsfrømel) 1,0%

CaC03 0,2% K2HP04 0,05% (NE4)2SC4 0,025%

MgS04 * 7H20 0,5% 30 "Sag 471" 0,03%

Produktionsfermenteringen rystes i ca. 96 timer ved en temperatur på 30°C på et roterende rysteapparat, der arbejder ved 250 omdrejninger pr. minut. pH-værdien 35 ved afslutningen af fermenteringscyklusen er ca. 8,0.

DK 163331 B

O

12

Til produktion af faktorerne B3 og af antibiotikum A-4696 anvendes stamme ATCC 31683 til fremstilling af "stød"-mediet på den ovenfor beskrevne måde. Fire portioner, hver på 10 ml, af det med stamme ATCC 31683 inoculerede 5 "stød"-medium inoculeres i portioner på 100 ml af et produktionsmedium af den nedenfor viste sammensætning i 500 ml Erlenmeyerkolber og steriliseres ved 121°C i 30 minutter.

10 _

Ingrediens_Mængde_

Teknisk glucose 1,0% Gær 2,0%

CaC03 0,2% 15 K2HP03 0,05% (NH4)2S04 0,025% "Sag 471" 0,03%

Produktionsfermenteringen rystes i ca. 96 timer 20 ved en temperatur på 30°C på et roterende rysteapparat, der arbejder ved 250 omdrejninger pr. minut. pH-værdien ved afslutningen af fermenteringscyklusen er ca. 8,0.

B. Fermentering i 40 liter tank.

25 Fremstillingen af inoculum sker ved den inkubering af "stød"-medium, der er detaljeret beskrevet i ovenstående afsnit A. 25 liter af et produktionsmedium som skitseret ovenfor steriliseres ved autoklavering ved 121°C i 30 minutter og fyldes i en fermenteringstank med en 30 kapacitet på 40 liter. 100 ml "stød"-medium inoculeres over i det sterile produktionsmedium. Det inoculerede produktionsmedium får lov at fermentere i 4 dage ved 30°C. Fermenteringen gennemluftes med steril luft i en mængde på ca. et halvt rumfang luft pr. rumfang kulturmedium pr.

35 minut. Det fermenterende produktionsmedium omrøres med et blandeapparat under anvendelse af et skovlhjul af

DK 163331 B

O

13 en passende størrelse, som drejer med en passende hastighed, som sikrer tilstrækkelig indblanding af luft i mediet. Kulturmediets pH-værdi vokser gradvis fra et begyndelsesniveau på ca. 6,5 til ca. 8,0, efterhånden som fermente-5 ringen skrider frem. Fermenteringen kan bringes op på større skala, ved at medium og inoculum forøges i overensstemmelse med de forhold og de metoder, som er beskrevet ovenfor.

På denne måde kan en større mængde af fermenterings-10 næringsmediet hensigtsmæssigt produceres til isolering af antibiotikum-A-4696-faktorerne.

C. Isolering af antibiotikum A-4696.

3800 liter fermenteringsnæringsmedium fremstillet 15 som ovenfor beskrevet filtreres efter tilsætning af 5% (vægt/volumen) filterhjælp ("Celite 545"). Filterkagen suspenderes igen i 3600 liter deioniseret vand, og pH-værdien af den vandige suspension indstilles til en pH-værdi på 10,5 under anvendelse af vandigt natrium-20 hydroxid. De suspenderede faststoffer fraskilles ved filtrering og vaskes med vand. Filtratet og vaskevæskerne forenes, og den resulterende opløsning syrnes med 20% (vægt/volumen) vandig svovlsyre til en pH-værdi på 4,5. Den sure opløsning gøres klar ved filtrering under anvendelse af 1% filter-25 hjælp ("Celite 545"). Den klare opløsning ledes gennem en kolonne (55 x 152 cm) indeholdende 350 liter "Amberlite IRA-116" (Na+-form), og kolonnen vaskes med 1200 liter deioniseret vand. "IRA-116"-harpiksen fjernes fra kolonnen og elueres portionsvis ved en pH-værdi på 30 10,5 med en vandig opløsning af natriumhydroxid (i alt 1000 liter). Harpikseluatet neutraliseres (pH-værdi 7) med 20% (vægt/volumen) vandig svovlsyre og vaskes derpå med 3 portioner deioniseret vand (i alt 150 liter). Vand-vaskevæskerne neutraliseres og forenes med det neutrali- 35 serede eluat. Den resulterende opløsning koncentreres og frysetørres dernæst. Det fremstillede, rå kompleks varierer i farve fra gyldenbrunt til mørkebrunt.

O

14

DK 163331 B

D. Fjernelse af salte fra råt antibiotikum A-4696.

1/0 kg råt kompleks sættes langsomt under kraftig omrøring til 1,5 liter deioniseret vand. Den resulterende suspension omrøres i 20 minutter og neutraliseres derefter 5 (pH-værdi 73 under anvendelse af en 10%'s vandig ammonium- hydroxidopløsning. Det uopløselige antibiotikum-A-4696--kompleks fraskilles ved vakuumfiltrering, vaskes med deioniseret vand og frysetørres. Det tørrede, afsaltede kompleks genvindes i et udbytte på ca. 80% (baseret på 10 bioaktivitet).

E. Rensning af afsaltet antibiotikum A-4696.

300 g tørret/ afsaltet kompleks suspenderes i 2 liter deioniseret vand, og suspensionens pH-værdi ind-15 stilles til en pH-værdi på 2,7 ved tilsætning af 3N vandig saltsyre. Den syrnede opløsning centrifugeres i 40 minutter ved 2500 omdrejninger pr. minut. Den ovenstående væske fradekanteres og fyldes på en kolonne (8 x 85 cm) indeholdende 6 liter affarvende harpiks ("Duolite S761").

20 Aktiviteten elueres med deioniseret vand ved en strømnings hastighed på 30 ml/minut. Elueringen overvåges ved tyndt-lagschromatografi. Den afgangsvæske, som indeholder antibiotikum A-4696, koncentreres (3 mm Hg, 35°C) til et rumfang på 3 liter og frysetørres. Det affarvede kompleks 25 udvindes som et fast stof, som er hvidt til gyldenbrunt, i et udbytte på ca. 70% (baseret på bioaktivitet).

F. Isolering af faktorer B^, B2, B^, c^a' og E·^ af antibiotikum-A-4696 som hydrochlorid.

30 10 g tørret, affarvet kompleks af antibiotikum A-4696, (fremstillet som ovenfor beskrevet) opløses i 100 ml deioniseret vand. Den resulterende vandige opløsning filtreres og fyldes på en chromatografikolonne (5 x 100 cm) indeholdende 2 liter polyamid ("Machery & Nagel SC6").

35 Kolonnen elueres med deioniseret vand, og 200-300 frak tioner (hver på 25 ml) opsamles. Elueringen overvåges

DK 163331 B

O

15 ved hjælp af UV-aktivitet og ved tyndtlagschromatografi. Fraktionerne forenes i overensstemmelse med TLC-identitet og frysetørres. Til nogle af adskillelserne er det nødvendigt at fordoble kolonnelængden til 200 cm ved anvendelse af 5 to af polyamidkolonnerne i rakke. Yderligere rensning opnås ved gentagen chromatografi.

De ovenfor under A-F beskrevne fremgangsmåder følges under anvendelse af stamme ATCC 31682, når der ønskes isolering af faktor og C^a af antibiotikum 10 A-4696, under anvendelse af stamme ATCC 31680, når der ønskes isolering af faktor og Cg af A-4 696, og under anvendelse af stamme ATCC 31683, når der ønskes produktion af faktor Bg og af antibiotikum A-4696. Skønt andre Actinoplanesstammer producerer de ovenfor nævnte faktorer, 15 foretrækkes de nævnte stammer til produktionen af de nævnte faktorer af antibiotikum A-4696.

Eksempel 2

En alternativ fremgangsmåde til isolering af faktorer 20 B^, B2/ Bg, C]_a' og E^ af antibiotikum A.-4696 som hydrochlorider under anvendelse af en enkelt stamme af Actinoplanes missouriensis er som følger: 200 mg tørret, affarvet kompleks af antibiotikum A-4696 (fremstillet ud fra stamme ATCC 31683 som beskrevet 25 i ovenstående eksempel 1, A-E) opløses i ca. 2 ml destilleret vand. Den resulterende vandige opløsning filtreres og adskilles ved kolonnechromatografi under anvendelse af omvendte faseadsorbenter, f.eks. "Li Chroprej^- jf.

RP-18”, som den stationære fase. og vandige acetonitril-30 gradienter indeholdende triethylaminphosphat som den mobile fase. Selv om det vil forstås, at en fagmand vil variere acetonitrilkoncentrationsgradienten afhængigt af sammensætningen af en speciel fermentering, er en foretrukket koncentrationsgradient 10-40%. Kolonneafgangs-35 strømmen overvåges ved hjælp af UV-aktivitet, og frak tioner, som indeholder de individuelle faktorer, opsamles.

o 16

DK 163331 B

Acetonitrilet fjernes ved inddampning under højvakuum, og de resulterende vandige opløsninger frysetørres. De frysetørrede chromatografifraktioner genopløses derefter i destilleret vand, adsorberes på omvendte faseadsorbenter, 5 f.eks. patroner af "Sep Pak ® C18H (tilgængelig fra

Waters Associates Inc., Milford, Massachusetts, USA), (tilgængelig fra E. Merck, Darmstadt, Vesttyskland) og elueres med 50%'s vandigt methanol. De vandige opløsninger indeholdende de individuelle faktorer af 10 antibiotikum A-4696 inddampes til tørhed, hvorefter de rensede faktorer af antibiotikum A-4696 udvindes som tørre, amorfe, faste stoffer.

Eksempel 3 15

Fremstilling af antibiotikum-A-4696-pseudo-aglycon- -dihydrochlorid._ 2,0 g kompleks af antibiotikum A-4696 (fremstillet som beskrevet i eksempel 2) opløses i 50 ml 5%'s methanolisk HC1 og tilbagesvales i 70 minutter. Reaktionsblandingen 20 o inddampes til tørhed ved 35-40 C under formindsket tryk.

Remanensen fortyndes med en lille mængde vand, hvilket resulterer i dannelsen af af et fast stof, som isoleres ved filtrering. Faststoffet lufttørres, opløses i en lille mængde methanol og genudfældes ved tilsætning af aceto-25 , nitril, indtil der dannes et granulært fast stof. Derefter tra- filtreres det ønskede produkt, tørres og påvises ved hjælp af væskechromatografi med høj ydeevne (HPLC) at være et enkelt homogent produkt. Identiteten og strukturen af det ønskede produkt beskræftes ved hjælp af plasmadesorp-30 tionsmassespektroskopi, protonkernemasseresonans og elementæranalyse.

Antibiotikum-A-4696-pseudo-aglycon-dihydrochloridet kan også fremstilles som ovenfor beskrevet ved hydrolyse af individuelle faktorer eller blandinger af faktorer, 35 som er indeholdt i komplekset af antibiotikum A-4696.

O

17

DK 163331 B

Eksempel 4.

Fremstilling af faktor G i actaplanin.

Der fremstilles en næringsagarskråkultur med følgende sammensætning: 5

Ingrediens_Mængde (¾ efter vagt)

Teknisk glucose 0,5

Kartoffeldextrin 2,0 10 Næringssojamel 1,5 Gærekstrakt 0,25

Calciumcarbonat 0,1

Agar 2,0 15 Skråkulturen inoculeres med ATCC 31681 og inkuberes derefter ved 30°C i ca. 6 dage. Efter inkubering dækkes myceliummåtten på skråkulturen med sterilt destilleret vand og skrabes løs med en steril stang eller podenål til opnåelse af en vandig suspension af myceliet.

20 Den vandige suspension anvendes som inoculum for 100 ml sterilt vegetativt medium med samme sammensætning som det ovenfor beskrevne agarskråkulturmedium. Det inocu-lerede medium inkuberes i ca. 48 timer ved en temperatur på ca. 30°C. Under inkuberingen omrøres det vegetative 25 medium på et roterende rysterapparat, der arbejder med ca. 250 omdrejninger pr. minut. Efter vækst af det vegetative medium udtages 10 ml af den dyrkede kultur og anvendes som inoculum til et sterilt "stød"-medium med følgende sammensætning: 30

Ingrediens Mængde (% efter vægt)

Teknisk glucose 0,5 Gær 0,25 Næringssojamel 1,5 35 Majsstivelse 2,0

Ca lc iumcarbonat 0,1

Antiskummiddel "(Sag 471") 0,05

O

18

DK 163331 B

"Stød"-mediet inkuberes i ca. 24 timer ved en temperatur på ca. 30°C, medens det holdes i bevægelse på et roterende rysteapparat ved 250 omdrejninger pr. minut.

Det dyrkede "stød"-medium anvendes derefter til inoculering 5 af det sterile A-4696G-produktionsmedium med følgende sammensætning:

Ingrediens Mængde (% efter vægt)

Teknisk glucose 2,5 10 Gær 2,0

Calciumcarbonat 0,2

Ammoniumsulfat 0,025

Dikaliumhydrogenphosphht 0,05

Glycerol 1,5 15 Melasse 1,5

Majsstivelse 3,5

Antiskummiddel ("Sag 471") 0,03

Fermenteringen gennemføres i 143 timer ved en 20 temperatur på ca. 30°C under omrøring og gennemluftning med steril luft i en mængde på ca. 1/2 rumfang luft pr. rumfang kulturmedium pr. minut. Under fermenteringen vokser mediets pH-værdi fra en begyndelsesværdi på ca.

6,5 til en pH-værdi på ca. 8,0. Ved afslutningen af fer?-.

25 menteringen (ca. 143 timer) indeholder mediet ca. 5000 aktivitetsenheder pr. ml.

En portion på 30 liter af hele fermenteringsnæringsmediet fortyndes med 30 liter acetone, og pH-værdien indstilles på 1,8 med 6N saltsyre. Det syrnede helnærings-30 medium filtreres under anvendelse af en filterhjælp, og de uopløselige stoffer vaskes med vand på filteret. Filtratets pH-værdi indstilles på 3,5 med 150 ml 50%'s natriumhydroxid, og filtratet koncentreres i vakuum til et rumfang på 29 liter. pH-værdien genindstilles 35 fra 2,2 til 3,1 med natriumhydroxid, og der filtreres igen til fjernelse af uopløseligt materiale. Filtratet indeholdende

DK 163331 B

O

19 antibiotikum ledes over en kolonne med en diameter på 7,6 cm indeholdende 5 ml "Mitsubishi Dianion HP-20"--ikke-funktionel harpiks (styren-divinylbenzen-harpiks), der er forbehandlet med methylalkohol og vasket med vand.

5 Strømningshastigheden er 250 ml/minut. Efter adsorption af antibiotiket på harpiksen vaskes kolonnen med 5 liter vand og elueres successivt med 21 liter 21%'s vandig methylalkohol, 15 liter 50%'s vandig methylalkohol og 15 liter 50%'s vandig acetone. Der opsamles fraktioner 10 på 4 liter af vaskevæske og eluat. Fraktionerne 8, 9 og 10 indeholder størstedelen af den antibiotiske aktivitet og er ligeledes fri for de fleste af urenhederne. Fraktionerne 8, 9 og 10 forenes og koncentreres til et rumfang på 6 liter under vakuum. Efter at koncentratets pH-værdi 15 er indstillet på 6,8 med vandigt natriumhydroxid, hældes koncentratet ud i 60 liter isopropylalkohol. A-4696G udfælder fra det fortyndede koncentrat og frafiltreres og tørres. Der fås 54,2 g A-4696G i praktisk taget ren form. Det opnåede A-4696G renses yderligere ved HPLC.

20 A-4696G opløses som fri base i methylalkohol, og opløsningen fortyndes med IN saltsyre. Efter omrøring fortyndes den syrnede opløsning med acetone til udfældning af A-4696 G-dihydrochloridet.

25

Eksempel 5

Det er ved adskillelige forsøg in vivo blevet påvist, at indgivelse af en propionatforøgende mængde af et glycopeptidantibiotikum til en mælkegivende drøvtygger 30 med en udviklet vomfunktion manifesterer sig ved en forbedret ernæringsreaktion i form af forøget mælkeproduktion uden en ledsagende uheldig forringelse af mælkens sammensætning. Et sådant forsøg har indebåret anvendelsen af otte mælkegivende Holstein-køer. Høerne er blevet opdelt i to 35 grupper på fire. I de første fem uger af et forsøg på femten uger fik den ene gruppe på fire dyr en normal foderration af korn og hø med vand til rådighed ad libitum

O

20

DK 163331 B

plus et foderadditiv uden forsøgsforbindelse. Den anden gruppe på fire dyr fik samme ration af foder og vand plus en daglig dosis af actaplanin (som kompleks) på 360 mg pr. dyr i form af et foderadditiv.

5 Under den anden periode på fem uger af forsøget fik de fire dyr, som fik actaplanin under de første fem uger, kun foder og vand, medens de dyr, som ikke var blevet behandlet under den første periode på fem uger, fik en daglig dosis på 360 mg actaplanin pr. dyr plus den normale 10 ration af foder og vand. I de sidste fem uger af forsøget er dyrene blevet behandlet som i de første fem uger.

Mælkeproduktion og mælkesammensætning fra hvert enkelt dyr er blevet overvåget dagligt gennem hele forsøget på femten uger. Vægtændringen for hver enkelt ko 15 er ligeledes blevet bestemt ved forsøgets afslutning.

Gennemsnittet af den daglige mælkeproduktion og -sammensætning for de dyr, som har fået actaplanin, er blevet udregnet og er anført i nedenstående tabel I som den "behandlede gruppe". De dyr, som ikke har fået actaplanin 20 i de betegnede forsøgsperioder, er betegnet som "kontrolgruppen". Forsøgsresultaterne er anført i tabel I.

Tabel I 25

Dyrenes Mælkeproduktion Mælkefedt Mælkeprotein vægt kg/dag % % kg

Kontrolgruppe 17,85 3,24 3,05 595 30 Behandlet gruppe 18,57 3,24 3,13 596

Forsøgsresultaterne viser, at actaplanin i en daglig dosis på 360 mg/dyr bevirker en ernæringsreaktion i mælkegivende drøvtyggere, som manifesterer sig ved en 35 forøgelse i mælkeproduktion på ca. 4% (efter vægt). En sådan forøgelse i mælkeudbyttet opnås uden en ledsagende nedgang i mælkens smørfedtindhold. Ydermere afviger pro-

DK 163331 B

O

21 teinindholdet i den mælk, som produceres af mælkegivende drøvtyggere, som modtager et glycopeptidantibiotikum, ikke væsentligt fra proteinindholdet fra ubehandlede dyr. Desuden er der ingen væsentlig ændring i legemsvægt hos de 5 behandlede dyr.

Et lignende forsøg er blevet udført under anvendelse af 24 mælkegivende Holstein-køer, som er blevet underkastet en bedømmelse med omskiftning over tolv uger. Dyrene er blevet delt i fire grupper på hver seks køer 10 (grupperne A, B, C og D), og under hele forsøget har alle dyr fået en normal daglig ration af foder og vand. I de første tre uger af forsøget har de fire grupper på hver seks dyr fået actaplanin som følger: Gruppe A har ikke fået actaplanin, gruppe B har fået 200 mg/dyr/dag, grup-15 pe C har fået 400 mg/dyr/dag, og gruppe D har fået 800 mg/-dyr/dag. Under den anden periode på tre uger blev hver enkelt gruppe opdelt i yderligere tre grupper på hver to dyr. Dyrene fra den oprindelige gruppe A er blevet doseret som følger: To køer har fået 200 mg/dyr/dag, to køer har fået 400 mg/dyr/dag, og to køer har fået 800 mg/dyr/-dag. Dyrene i den oprindelige gruppe B er blevet doseret som følger: To køer har fået 0 mg/dyr/dag/ o køer har fået 400 mg/dyr/dag, og to køer har fået 800 mg/dyr/dag.

Dyrene i gruppe C er blevet doseret som følger: To køer pe har fået 0 mg/dyr/dag, to køer har fået 200 mg/dyr/dag, og to køer har fået 800 mg/dyr/dag. Dyrene i den oprindelige gruppe D er blevet doseret som følger: To køer har fået 0 mg/dyr/dag, to køer har fået 200 mg/dyr/dag, og to køer har fået 400 mg/dyr/dag.

30

Under den tredie forsøgsperiode på tre uger er doseringen af dyrene blevet skiftet om, således at hvert enkelt dyr har fået actaplanin i overensstemmelse med dets behandling under den første periode på tre uger. På samme måde har behandlingen under den afsluttende periode 35 på tre uger været den samme som i den anden periode på tre uger. Denne dosering med omskiftning er opsummeret nedenfor.

22

DK 163331 B

'tf O O O o o o o o o ooo oo oo oo ¢) (S ^ CO O 'tf CO O CM 00 O CM 'tf

Td OMMS-I 5-i Μ 5μ $-i S-i 5i S-i 5i 5j H >t >c >1 >1 >i >1 >i >t >t μ Ti t) Ό Td Td Td tJ t3 Ό tJ τί O)

O) CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM

\j c A \^ s ^ ^^ \ o o o

C’) O O O

O CM -tf 00

<D

Td 5) U 5-1 M

0 £*1 £*1 Κ*Ί •M Ti Td Td Td Μ <D vo vo vo vo * yy yy yy yy CMOOO oo ' o o / o o ooo oo oo oo (1) CM 'tf CO O 'tf CO O CM CO O CM -tf

Td 0ΜΜΜ 5-i 5i 5-i M 5^ 5r >i >i >i >i >c >i >t >i >i ^ Ti TJ τ3 Td Td Td T3 Ό Ό Ό T! Tl 0)

0-1 CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM

\t/ \t/ \t/ \t/ \ / . Cn Cn Cn λ ' cd td (d cn Td Td *T3 td \ \ \

Td 5-) Μ 5) \ >1 >i >c 5-1 Td Td Td >1 \ \ \

Td Cn tn Cn \ s s e

Cn h g ο ο ο rij ffl o U o Q o Q) O CM 'tf oo

Td cu <u a) <d 0 ft 5) ft 5) ft 5-) ft μ •H ft >c ft !>i ft >i ft >t MSTd 3 d 3 Td 3 Td (1) Οι 5-1 5j 5j

Hi ΰ ib O to 050 O 50

O

23

DK 163331 B

Den daglige mælkeproduktion og mælkesammensætning er blevet analyseret som ovenfor omtalt. Resultaterne af forsøget er vist nedenfor i tabel II som gennemsnit for hver enkelf af de behandlede grupper.

5

Tabel II

Behandling Mælke- Mælke- Mælke- Vægt-

Actaplanin produktion fedt protein forøgelse mg/dyr/dag kg/dag % % kg 10 0 19,9 3,93 3,27 5,0 200 19,9 3,94 3,28 7,7 400 20,2 3,98 3,29 8,6 800 21,1 3,85 3,33 8,2 15

Disse data viser, at actaplanin indgivet til mælkeydende køer bevirker en mærkbar stigning i mælkeproduktion uden nogen stor uheldig virkning på mælkens kvalitet. Actaplanin bevirker heller ikke nogen væsentlig ændring i mal-20 kekøernes vægtforøgelse i sammenligning med de dyr, som ikke får glycopeptid.

Et tredie forsøg er blevet gennemført under anvendelse af 64 Holstein-køer. Efterhånden som forsøgsdyrene har kælvet, er de blevet overført til seksten blok-25 ke med fire køer pr. blok. inden for hver af de seksten blokke er der blevet givet en tilfældig orden af fire behandlinger, idet disse behandlinger har været 0, 400, 800 og 1200 mg actaplanin pr. dyr pr. dag. Tre uger efter kælvningen har forsøgsdyrene påbegyndt en indledende peri-30 ode på to uger, under hvilken alle dyr har fået en daglig ration af foder og vand, uden at der er blevet indgivet glycopeptid. Alle køer er blevet fodret med majsensilage, korn og høblokke i en mængde på 50:30:20 på tørstofbasis og i en mængde på 2,95% af legemsvægten. Efter den ind-ledende uge på to uger er de påtænkte behandlinger af køerne blevet påbegyndt. Forsøgsdyrene har fået deres

DK 163331 B

O

24 respektive behandlinger i otte uger, og derefter er den ene halvdel af køerne på hver behandling blevet skiftet over til kontrolbehandlingen, medens den anden halvdel er forblevet på den påtænkte behandling. Efter afslut-5 ningen af tolv uger, er de dyr, som er blevet skiftet over efter otte ugers forløb på behandling, blevet taget ud af forsøget. Resten af forsøgsdyrene har fået behandling i hele mælkegivningsperioden.

Resultaterne af forsøget er vist i tabellerne III-10 -v. De anførte data er tilnærmede mindste kvadratgennem- snit for otte ugers perioden, for en forsøgsperiode på seks måneder og for hele mælkegivningsperioderne.

Mælkeproduktionsresultater i kg/dag er vist i tabel III for perioderne på otte uger, seks måneder og 1® hele mælkegivningen. Disse data viser, at de køer, som har fået actaplanin under en otte ugers periode af mælkegivningen, har produceret fra 1,3-1,9 kg mere mælk pr. dag end ubehandlede kontrolkøer. Dette beløber sig til en forøgelse i produceret mælkemængde på fra ca. 6,0 til ca.

20 8,4% som et resultat af indgivelsen af glycopeptid. Mælke produktionsforskelle mellem 0, 400 og 800 mg actaplanin forbliver ens over seks måneder og hele mælkegivningen. Forskellen i produktion mellem ubehandlede kontroldyrer og køer, som har fået 1200 mg actaplanin, vokser til 2,3 25 kg/dag efter seks måneder, en forøgelse på 12,2%, og vokser yderligere til 2,6 kg pr. dag ved fuld mælkegivning, en forøgelse på 14,8%. Skønt de faktiske forskelle i produktion mellem behandlingerne med 0, 400 og 800 mg er praktisk taget de samme efter otte uger, seks måneder og fuld 30 mælkegivning, vokser sandsynlighedsniveauerne for disse forskelle med fremadskridende mælkegivning. Tab af statistisk signifikans mellem kontrolgrupper og actaplanin-behandlede grupper er resultatet af en 34%'s forøgelse i standardfejlen med data fra fuld mælkegivning, hvilket 35 viser, at produktionen i de sidste tre måneder af en fuld mælkegivningsperiode er yderst variabel.

DK 163331B

25 *d . m

< <J\ C\ CNJ

• *. ·, <

W O O H

C -—.

•H .__s OO CO

C vo O o

fO o o O

Ol O O O

I §» 3 3 ,=ϊ., <0 ΰ η Φ P Ό

So, ^ "t ° ‘Ί °1 °s Φ " S Q §

s -o ”5 Π vo rH N O ^ S'SiS'S

* ° I " 5 S ·3 »ϋ £ϊ ? 3*8.2 · £ ϊ Γ s ih 0) C μ ό ft i* _ ^ -n ® Ol i2S> \ P ^ CD ·>-Ι Ό P P 13

Ηί & ° ° o § 6IC%S

1. > c ° °. V Τ’ c 3 Ό C Λ * O. -Η O V V ft J ^ & g * “ in oj G o ft ft ~ R S & S u ° * tcco- - t-o

Hflj ft σ ^ io ^ ' +jæ ft.« H P

w S' ® I £ °° g 00 H β Λ O & § H

01 tn -0.01130) Ή i—11 ro cs*_^*nrn I « c ft^r 0) 5 Λ S i? ; f5 s 5 g s ? o - ® gS**® si l Ϊ i α « 3-SI S3 , *2 . α > HS i «Ή ~ 6 8 ^ o P o ^ t- Λ 0·^ 1 g g* .

g"0 ° * ύ ^ ύ * 2 1/1 p ti S^ α>3 o 0' 01 ™ ω h .g c a: æ h •ri ft rø w φ tn s p "Η SJ. e tn ε -h c ,3 3 g λ in os tn p a: gæ o o o o in o ^ h ~ o> ‘p £ p oh °oj σι r* o <u G ft <3 p ft H ™ p P IH φηΗΗσ-Ρ s 01 M H ft Ό tn o

A- 0) 0) ft P H

7} in ft ft c η ω S Η P HHJSHEjUtU·© s ίο ιοσιοα) tnoflOA! λ>3 hh π HH ft cd p t n α> oil OP-HO-P -Η 0 Λ C r>* ih η ihC C ih C > HHOH“<0 O 0 > o P O P A! P S ft

,j y τ| Ή Ή flJ P G O

A * H * ft Ό O G 0 CD

ό ftp o> p tu ft -i ft β ,ϋ 'tu *8 2> o G P Η G P X fi-H « -ti UJ c- n 5 _j .mi jJ fli .j jJ (—i <rj +J Π3 (o Ή *W C O Ή t C-Sfi Mfi S Ρββ'0)Ρ^ 0) Η στ) tu Utl S ft Φ β

ft (1) -Η Η β P Ή _ P P P

in σΡ0·οΡ0ΐ3Ρ0 m ·· Ό p m si & tn .c p æ .c ^ <g

E-l CD# CD# fe# <0 O

26

DK 163331 B

O

Tabel IV viser procentdata for mælkefedt for de tre tidsperioder og for de forskellige behandlingsgrupper. Der er vist data for mælkefedtindholdet i mælk/ som stammer fra morgenmalkningen (AM) og fra aftenmalkningen (PM).

5 I AM-mælkeprøverne forekommer der små, ikke-signifikante ændringer i mælkefedtindholdet mellem kontrolgruppen og de behandlingsgrupper, som har fået 400 og 800 mg/dyr/dag actaplanin. En overensstemmende, ikke-signifikant nedgang i mælkefedt forekommer (i forhold til kontroldyrene) i 1° AM-prøverne fra køer, som har fået 1200 mg/dyr/dag actaplanin. For PM-mælkeprøver er forskellene i mælkefedtprocent mellem grupperne med 0, 400 og 800 mg actaplanin større end for AM-mælkeprøverne, men forskellene er ikke signifikante. For hver enkelt tidsperiode er mælkefedtpro-15 centen for PM-mælkeprøver fra køer, som har fået 1200 mg/-dyr/dag actaplanin, lavere end mælkefedtprocenten fra kon-trolkøerne (p<0,05).

20 25 30 35 27

DK 163331 B

cd *ϋ \

M

O CN O O 00 CO <31 Ό o co in cn in co i/i 00 \ 04 ------ in h cu m οι oi m n η ε 4-1 <u c i—1 ·*4 1¾ β o σι h οι x ·ί 2 cd o o r- o co o co cd i-4 o »*·*«**

Xltnl di oo η n co co oo n d) β <d

Λ ·Η -P

β Ο Μ > cd Q) ·Η

7Q.tr> CD

44 CU TS

Λ! &> Ιβ Η β > 54 « ft) 10 Ο CN Η 04 Ο Η u g ε O O <31 O O- O 00 o ·*·»*. «.»>. *· H x xi 4-> ^ co ro co co co eo d) r4 r-4 (1) Λ S 3 > cd ε M4 -h E4 in H m *0 (N Ol ^ N Λ o o β 0(310000 4-1 H O ------

£ 5C CO rO CO ·4< CO

d> dl Ο T3 o <v U β di °id 4J ε

<0 4J

d) 10 44 44 β d) I β 44 54 i-4 d) 44 w 2 2 2 2 2 2 ty in r-itj c ft 1¾ ft < ft

2 β cd -H

2 4-1 in β

*H

G

> -i4 tn d) 54 44 I d) r4 CQ d) Ό ft) imd 54 ΰ) g •a o di β 10 4 til =<d 'β 54 54 β ε Ή Ο (ϋ β

Pn Cm 00 >43 ίχι o 28

DK 163331 B

Indenfor mejerividenskaben er en gængs metode til at udtrykke mælkeproduktionen udtrykket "4%- fedt-korrigeret mælk" (FCM). Dette udtryk ligestiller mælkeproduktion med forskellig fedtprocent på en energibasis. Ved 5 anvendelse af de data, der findes i tabel IV for seks måneder, er FCM (kg/dag) produceret af køer, som har fået 0, 400, 800 og 1200 mg/dyr/dag actaplanin, hhv. 18,3, 18,6, 19,4 og 19,2. Dette svarer til en forøgelse i mælkeproduktion på 1,7% (i forhold til ubehandlede kontroldyr) 10 hos køer, som har fået 400 mg/dyr/dag actaplanin, en forøgelse på 5,7% hos køer, som har fået 800 mg/dyr/dag, og en forøgelse på 4,7% hos køer, som har fået 1200 mg/dyr/-dag.

De data, som findes i tabel V, viser, at der hos 15 malkekøer, som får et propionatforøgende glycopeptid, ikke manifesterer sig en forøget foderudnyttelseseffektivitet i form af øget vægt. De pågældende data viser den gennemsnitlige daglige foderindtagelse og den totale legemsvægt for kontroldyrene og de behandlede dyr gennem en fuld mæl-20 kegivningsperiode.

25 30 35 29

DK 163331 B

P tn tn ø g Ti > \ in u g >, o r- ro o Φ o * ' ro t n \ 01 N o in

O) Dl Η N

r-t S

tn o d

•H

Φ d in ø \ø o\ H H o *· » h 0) a O ro ro m tP ø co o) 0 4-)

44 O

rø ø c > -H 0 $4 Ti HØ tn en es ιο 0 'ϋ d O “· * 04 XI 0 S o N ro in 0 <44 g 'C 04 E4 tn 44 •H 0 r-H >

tJi -H

0 tn

rQ rø O ^ CO

d - *· ή CP H o ro ro m H 04 H 44 Ή d m e 0 44 d ø d u 0 44

O C

0

~ O

tn d

4* O

A! •r4 ø ^ tx> 0 44 54 H -0- tn 0 -Η Λ tø 44 0 0 > ø d d w

g 0 u S

0 to 0 0 u -π υ O) ø ø d ø dt a j j 0

DK 163331B

30

Et andet forsøg er blevet udført til bestemmelse af den forholdsmæssige aktivitet af glycopeptider og deres vedvarende evne til ændring af mælkeproduktionen. Holstein--køer er, efterhånden som de har kælvet, blevet overført 5 til blokke på fire køer i hver. Indenfor hver enkelt blok er der blevet givet en tilfældig rækkefølge af behandlinger. Et forsøg på ni uger er blevet påbegyndt to uger efter kælvning. Alle køer har undergået en indledende periode på én uge, i hvilken de har fået majsensilagekoncentrat, 10 korn, hø og vand. I den efterfølgende periode på otte uger har udover den normale foderration en gruppe på seks dyr været uden behandling (kontroldyr), en anden gruppe på seks dyr har fået 600 mg/dyr/dag actaplanin, og en tredie gruppe på seks køer har fået 600 mg/dyr/dag af glycopep-15 tidet A35512B. Den gennemsnitlige daglige mælkeproduktion, mælkesammensætningen og mælkeproduktionens varighed er blevet analyseret. De i tabel VI viste data er gennemsnittene af de daglige bestemmelser under hele forsøgsperioden på ni uger. Tabellen viser den gennemsnitlige mælkeproduktion 20 og mælkens sammensætning hos ubehandlede kontroldyr og behandlede grupper. Varighedsværdierne er blevet beregnet ved at dividere den gennemsnitlige mælkeproduktion under behandlingsperioden på otte uger med den gennemsnitlige produktion under den indledende periode uden behandling. , 25 Varighedsværdierne udtrykker, hvor stor de behandlede gruppers ydeevne er efter behandlingens pågyndelse, sammenlignet med ydeevnen før påbegyndelsen af behandlingen. Det har været forventet, at den normale varighed for forsøget ville være fra ca. 94 til ca. 96%. Alle behandlede grupper 30 havde højere varigheder, hvilket viser en mærkbar reaktion på behandling selv i et kort tidsrum.

Den i tabel VI viste analyse af mælkens sammensætning viser, at mælkefedt er svagt nedsat i de behandlede grupper sammenlignet med ubehandlede kontroldyr, medens 35 proteinindholdet kan forøges (hvor der er tale om A35512B). Voksende mælkeproteinindhold er en særlig ønskelig reaktion, da selv en lille stigning ville føre til en signifikant stigning i den mængde ost, som kunne fremstilles ud fra mælken.

DK 163331B

31 o r~ lo ^ jj ^ in lo tn ^

θ' Μ ^ Η Η H

G "& >-1 Η H

•H * +) tø

WC

G ή σι r~ Ό O) φ ni ni o g +j <#p ~ g O ^ ro ro ro <3 n tn o.

a> Λ «Η tø 4-> cn r- ud S "C in n 0) dP » * * ^ m m m

Ti <D _ & vd φ ^ tJ» ** ·* ·» •H tfP LT) G\ G\ U ^ <J\ <T> & (ΰ >

H

> +J

rH Φ

0 U

Λ tu

(0 U

C_i rt T3 — H O -tf OD'·' ^ dj lD 'd' m (¾¾ N <N m \ M tn Ή M f« “ S ____ i In \ <o H Ό >1 \

T5 ^ M

\ tn >i tn (0 Ό 6 Ό \ tn o e o

ιχ) O

— O

10 tn G ^

C -H

-W G G) i—! i—i 03 >ΰ o ι-t ni G M ft -) (C +J ni m .G C -P m 0 o u ro ffl « < rt!

O

DK 163331B

32

De data, som er fremkommet på den anførte måde og vist i ovenstående tabeller, viser, at et glycopeptid-antibiotikum indgivet til mælkegivende drøvtyggere med en udviklet vomfunktion forøger propionatproduktionen i 5 en sådan udstrækning, at der iagttages en signifikant stigning i den producerede mængde mælk. Ydermere fremkommer stigningen i propionat ikke på bekostning af acetat og butyrat i en sådan udstrækning, at det på uheldig måde går ud over mængderne af mælkefedt og mælkeprotein.

10 Udøvelse af den foreliggende opfindelse tilveje bringer derfor en væsentlig økonomisk forbedring i mælkeproduktionen. Den ved den foreliggende opfindelse tilvejebragte fremgangsmåde til forbedring af mælkeproduktionen hos mælkegivende drøvtyggere resulterer således i forbed-15 rede rumfang af fedtkorrigeret mælk, samt forbedringer i mælkens sammensætning, herunder proteinindholdet.

20 25 30 35

Claims (9)

1. Ikke-terapeutisk fremgangsmåde til behandling af sunde malkekøer til forbedring af deres mælkeproduktion, kendetegnet ved, at der oralt til køerne indgives 5 en propionatforøgende mængde af et glycopeptidantibiotikum.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det anvendte glycopeptid er valgt blandt actaplanin, avoparcin, A35512, A477, AM374, ristocetin, vancomycin og K288.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendeteg net ved, at det anvendte glycopeptid er actaplanin, avoparcin, A35512, vancomycin, ristocetin eller A477.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det anvendte glycopeptid er actaplanin, avo- 15 parcin eller A35512.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det anvendte glycopeptid er actaplanin.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det anvendte glycopeptid er avoparcin.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendeteg net ved, at det anvendte glycopeptid er A35512.

8. Ikke-terapeutisk anvendelse af en propionatfor-øgende mængde af et glycopeptidantibiotikum til forbedring af mælkeproduktionen hos en sund, mælkegivende drøvtygger 25 med en udviklet vomfunktion.

9. Ikke-terapeutisk anvendelse af en propionatforøgende mængde af actaplanin til forbedring af mælkeproduktionen hos en sund malkeko.