CS228936B2

CS228936B2 - Preliminary fodder,or supplementary composition for preparing fodder for live stock,especially ruminants

Info

Publication number: CS228936B2
Application number: CS824513A
Authority: CS
Inventors: Manuel Debono; Kurt E Merkel; Robert E Weeks; Herald J Cole
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1980-12-18
Filing date: 1982-12-17
Publication date: 1984-05-14

Description

Vynález se týká krmivá pro hospodářská zvířata, zvláště přežvýkavce, které podporuje růst drůbeže, vepřů, ovcí a skotu.The invention relates to feed for livestock, in particular ruminants, which promotes the growth of poultry, pigs, sheep and cattle.

Antibiotikum A-4696, faktory Bi, B2, B3, Ci_a, C3 a Ei je možno izolovat z komplexu antibiotika A-4696, který se získá pěstováním mikroorganismu Actinoplanes missouriensis ATCC 31680, ATCC 31682 nebo ATCC 31683 v živném prostředí, které obsahuje využitelné zdroje uhlíku, dusíku a anorganických solí v submerzní kultuře za aerobních podmínek do nahromadění dostatečného množství antibiotika.The antibiotic A-4696, factors Bi, B2, B3, Ci _a , C3 and E1 can be isolated from the A-4696 antibiotic complex, which is obtained by culturing Actinoplanes missouriensis ATCC 31680, ATCC 31682 or ATCC 31683 in a nutrient medium containing useful sources of carbon, nitrogen and inorganic salts in the submerged culture under aerobic conditions to accumulate sufficient antibiotic.

Použití svrchu uvedených faktorů je možno zvýšit využití krmivá u přežvýkavců tak, že se těmto živočichům podá takové množství komplexu A-4696 nebo faktorů Βι, B2, B3, Ci_a, C3 a/nebo Ei nebo některé z adičních solí těchto látek s kyselinami, přijatelnými z farmaceutického hlediska, které podporuje růst těchto zvířat, a to jako krmivo, přídavná směs nebo přídavné krmivo.The use of the above factors can increase feed utilization in ruminants by administering such animals an amount of A-4696 complex or factors Βι, B2, B3, Ci _a , C3 and / or Ei or one of the acid addition salts thereof, pharmaceutically acceptable to promote the growth of these animals, such as feed, admixture or feed.

Obdobným způsobem je také možno urychlit růst kuřat — tak, že se kuřatům podá v krmivu nebo pitné vodě příslušné množství anUbiotika A-4696 ve formě komplexu nebo ve formě některého z nových faktorů Βι, B2, Bj, Ci_a, C3 a/nebo El nebo některá ze solí těchto látek, přijatelných z farmaceutického hlediska.Similarly, the growth of the chickens can also be accelerated by administering to the chickens in the feed or drinking water an appropriate amount of the A-4696 anubiotic as a complex or one of the new factors Βι, B2, Bj, Ci _a , C3 and / or El or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

; í; and

228836 s228836 s

Vysokotlakou kapalinovou chromatografií je možno prokázat, že antibiotikum A-4696 obsahuje několik faktorů, které je možno 0značit jako Βι, B2, B3, C_ia a C3. Mimoto je možno izolovat ještě faktor El, který je z komplexu rovněž možno izolovat, který však může být produktem rozkladu. Chemické, fyzikální a biologické vlastnosti jednotlivýéh faktorů ukazují, že antibiotika možná s výjimkou faktoru Ei jsou složena z téhož peptidového jádra (aglykonu) a aminocukru, a mimoto z různých množství glukózy, mannózy a rhamnózy. Faktor Ei je podobný ostatním faktorům, je však možné, že obsahuje poněkud modifikované peptidové jádro. Bioautografle tvorby aglykonu v průběhu hydrolýzy komplexu antibiotika a jednotlivých faktorů ukazuje, že v průběhu krátké doby vznikne jednoduchá směs antimikrobiálně účinného pseudoaglykonu a aglykonu.High pressure liquid chromatography showed that the A-4696 contains several factors that may 0značit as Βι, B2, B3, and C3 C _i. In addition, factor E1 may also be isolated, but may also be isolated from the complex, but may be a decomposition product. The chemical, physical and biological properties of the individual factors show that antibiotics, possibly with the exception of Factor Ei, are composed of the same peptide nucleus (aglycone) and amino sugar, and in addition different amounts of glucose, mannose and rhamnose. Factor Ei is similar to other factors, but may contain somewhat modified peptide core. Bioautographs of aglycone formation during hydrolysis of the antibiotic complex and individual factors show that within a short time a simple mixture of antimicrobially active pseudoaglycone and aglycone will be formed.

Pod pojmem „antibiotikum A-4696“ se rozumí komplex antibiotik actaplaninového typu, kdežto různé faktory, izolované z komplexu se označují jako antibiotikum A-4696 faktor A, Βι, B2, Bs, Ci_a, C3, Ei a tak dále. Antibiotikum i jeho jednotlivé faktory jsou vysoce úč nné látky, které mají význam v zemědělství, jako růstové látky pro kuřata, vepře, ovce a skot.The term "antibiotic A-4696" refers to a complex of actaplanin-type antibiotics, whereas various factors isolated from the complex are referred to as antibiotic A-4696 factor A, Βι, B2, Bs, Ci _a , C3, Ei and so on. Both the antibiotic and its individual factors are highly effective substances that are important in agriculture, such as growth agents for chickens, pigs, sheep and cattle.

Faktory Βι, B2, Bs, Ci_a, C3 a Ei antibiotika A-4696 jsou zásadité látky, které mohou tvořit soli s vhodnými kyselinami a je možno je izolovat z komplexu, který se získá pěstováním mikroorganismu z čeledi Actinoplanes missouriensis v živném prostředí do nahromadění antibiotika. Dále uvedené vlastnosti jednotlivých faktorů se týkají hydrochloridů, přestože je možno známým způsobem připravit i jakékoli jiné z fakmaceutického hlediska přijatelné soli těchto faktorů.The factors Βι, B2, Bs, Ci _a , C3 and Ei of A-4696 are basic substances which can form salts with suitable acids and can be isolated from the complex obtained by growing the microorganism of the Actinoplanes missouriensis family in a culture medium until accumulation. antibiotics. The following characteristics of the individual factors relate to hydrochlorides, although any other pharmaceutically acceptable salts of these factors may be prepared in a known manner.

Chromatografií na tenké vrstvě silikagelu, vysokotlakou kapalinovou chromatografií a dalšími metodami je možno prokázat že antibiotikum A-4696 při dělení poskytuje směs různých složek, které rovněž mají antibiotickou účinnost. Tyto složky je možno chromatograficky oddělit od původního antibiotického komplexu chromatografií na sloupci polyamidu. Ohromatografické frakce se odebírají podle spektra v ultrafialovém světle a podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě a frakce, které obsahují čisté faktory A, Bi, B2, B3, Ci_a, C3 nebo Ei se slijí a lyofilizují. Totožnost a čistota výsledných lyofilizovaných chromatografických frakcí se stanoví vysokotlakou kapalinovou chromatografií.Silica gel thin layer chromatography, high pressure liquid chromatography, and other methods have shown that antibiotic A-4696 on separation affords a mixture of various components that also have antibiotic activity. These components can be chromatographically separated from the original antibiotic complex by chromatography on a polyamide column. Ohromatografické fractions are monitored by UV-activity and by the results of thin layer chromatography and the fractions containing pure factor A, B2, B3, _C, C3, and E were pooled and lyophilized. The identity and purity of the resulting lyophilized chromatographic fractions were determined by high pressure liquid chromatography.

Chromatografie antibiotika A-4696 při použití směsi methanolu, chloroformu, koncentrovaného hydroxidu amonného, sek.butanolu a vody v poměru 50 : 25 : 25 : 25 : 10 a Bacillus subtilis jako detekčního organismu poskytuje výsledky, uvedené v následující tabulce.Chromatography of A-4696 using 50: 25: 25: 25: 10 methanol, chloroform, concentrated ammonium hydroxide, sec-butanol and water and Bacillus subtilis as detection organism gives the results shown in the following table.

A-4696 RfA-4696 Rf

Při vysokotlaké kapalinové chromatografií antibiotika při teplotě místnosti při použití směsi. 2% vodného roztoku kyseliny octové a methylkyanidu v poměru 90:10 a 2% vodného roztoku kyseliny octové a methylkyanidu v poměru 70 : 30 se získají následující výsledky:High pressure liquid chromatography of the antibiotic at room temperature using the mixture. A 2% aqueous solution of acetic acid and methyl cyanide in a ratio of 90:10 and a 2% aqueous solution of acetic acid and methyl cyanide in a ratio of 70:30 gives the following results:

A-4696 K‘A-4696 K

A 1,60A 1.60

Bi 1,99Bi 1.99

B2 3,84B2 3,84

B3 2,50B3 2,50

Ci_a 2,92Ci _and 2.92

C3 4,23C3 4.23

Ei 0,38Ei 0.38

Různé další faktory je možno v menším množství oddělit od antibiotika chromatografií na tenké vrstvě a vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Tyto faktory je možno označit jako C_lb, C_2a, C_2b a D a jsou v mnoha směrech podobné ostatním svrchu uvedeným faktorům. Mimoto nelze vyloučit, že by bylo možno získat ještě další nezjištěné faktory. Tyto faktory ještě nebyly izolovány a čištěny v takovém množství, aby bylo možno stanovit jejich vlastnosti.Various other factors can be separated to a lesser extent from the antibiotic by thin layer chromatography and high pressure liquid chromatography. These factors may be referred to as _C1b , _C2a , _C2b and D and are in many ways similar to the other factors mentioned above. Moreover, it cannot be ruled out that other unidentified factors could be obtained. These factors have not yet been isolated and purified in an amount sufficient to determine their properties.

V případě, že se antibiotikum A-4696 nebo jeho jednotlivé faktory hydrolyzují v mírně kyselém prostředí, například v 5% methanolovém roztoku kyseliny chlorovodíkové při teplotě varu pod zpětným chladičem 70 minut, získá se pseudoglykon. Tuto látku je možno vysrážet a v případě faktorů A, Bi, B2, B3, Ci_a a C3 má následující strukturu:When the A-4696 antibiotic or its individual factors are hydrolyzed in a mildly acidic medium, for example a 5% methanolic hydrochloric acid solution at reflux temperature for 70 minutes, a pseudoglycone is obtained. This material can be precipitated, and if factors A, B2, B3, C, and C3 _and has the following structure:

V případě antibiotika A-4696 faktoru Ei je možné, že tento aglykon je poněkud modifikován, tato skutečnost však dosud nebyla prokázána.In the case of the A-4696 factor Ei antibiotic, it is possible that this aglycone is somewhat modified, but this has not been established.

Chromatografií na papíře a na tenké vrstvě bylo možno prokázat, že po hydrolýze komplexu a jednotlivých faktorů obsahují tyto látky kromě pseudoaglykonu ještě různá množství neutrálních cukrů. Totožnost a molární poměry těchto neutrálních cukrů jsou uvedeny v následující tabulce 1:Paper and thin-layer chromatography showed that after hydrolysis of the complex and individual factors, these substances contained, in addition to pseudoaglycone, different amounts of neutral sugars. The identity and molar ratios of these neutral sugars are shown in Table 1 below:

Tabulka 1Table 1

Molární poměry neutrálních cukrů*Molar ratios of neutral sugars *

A-4696 faktor A-4696 factor Mannóza Mannóza Glukóza Glucose Rhamnóza Rhamnóza A AND 2,80 2.80 1,0 1.0 — - Bi Bi 2,05 2.05 1,0 1.0 1,01 1.01 B2 B2 1,80 1.80 1,0 1.0 — - b₅ b ₅ 2,37 2.37 1,0 1.0 — - čia chia 1,12 1.12 1,0 1.0 1,08 1.08

* Cukry byly stanoveny plynovou chromatografií ve formě trimethylsllylových derivátů. Každý cukr je uveden jako souhrn isomerů a a β.* Sugars were determined by gas chromatography as trimethylsilyl derivatives. Each sugar is listed as the sum of the isomers a and β.

Jednotlivá antibiotika svrchu uvedeného typu je tedy možno od sebe odlišit, složením neutrálního cukru, který je vázán na pseudoglykon v poloze, která dosud nebyla určena.Thus, the individual antibiotics of the above type can be distinguished from each other by the composition of a neutral sugar that is bound to the pseudoglycone at a position not yet determined.

Předmětem vynálezu je předběžné, respektive doplňkové krmivo pro vytvoření krmivá pro hospodářská zvířata, zvláště přežvýkavce, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje 0,01 až 90 hmot. % antibiotika A-4696 ve formě komplexu nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelnou adiční sůl s kyselinou, antibiotikum Α-469Θ faktor Bi nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelná adiční sůl s kyselinou, s výhodou ve formě hydrochloridu, který je bílá, krystalická látka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahem hydroxylových skupin a polárních rozpouštědel a nerozpustná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu, allifatických uhlovodících a chlorovaných uhlovodících s přibližným složením 51,51 % uhlíku, 5,25 % vodíku, 4,88 % dusíku, 4,62 % chloru a zbytkem kyslíku, s přibližnou teoretickou molekulovou hmotností 1954, s absorpčním maximem v ultrafialovém světle ve vodě při 280 nm při EJ^_m =42,8 s následujícími pásy v absorpčním spektru v infračerveném světle v bromidu draselném 3380 široký, 2930, 1731, 1693, 1654, 1637, 1615, 1588, 1577, 1521, 1503, 1488, 1423, 1321, 1289, 1229, 1210, 1178, 1154, 1121, 1076, 1060, 1030, 1012, 982, 880, 842, 831 a 810 cm^-1, antibiotikum A-4696 faktor B2 nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelná adiční sůl s kyselinou, s výhodou ve formě hydrochloridu, který je bílá, krystalická látka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahem hydroxylových skupin a polárních rozpouštědlech a nerozpustná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu, alifatických uhlovodících a chlorovaných uhlovodících s přibližným složením 51,96 % uhlíku, 4,87 % vodíku, 5,72 % dusíku, 5,88 % chloru a zbytkem kyslíku, s přibližnou teoretickou molekulovou hmotností 1808, s absorpčním maximem v ultrafialovém světle ve vodě při 280 nm při E= 44,7, s následujícími pásy v absorpčním spektru v infračerveném světle V bromidu draselném: 3409 široké, 2934,1730,The subject of the invention is a preliminary or supplementary feed for the production of feed for livestock, especially ruminants, characterized in that it contains from 0.01 to 90% by weight of active ingredient. % of the antibiotic A-4696 in the form of a complex or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof, the antibiotic Α-469Θ factor Bi or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof, preferably in the form of a hydrochloride which is a white, crystalline substance soluble in water, hydroxyl-containing solvents and polar solvents and insoluble in ether, chloroform, benzene, acetone, alliphatic hydrocarbons and chlorinated hydrocarbons having an approximate composition of 51.51% carbon, 5.25% hydrogen, 4.88% nitrogen, 4.62 % chlorine and the remainder has an approximate theoretical molecular weight of 1954 having an absorption maximum in the ultraviolet light in water at 280 nm with EJ = 42.8 _microns with the following bands in the infrared absorption spectrum when determined in KBr: 3380 broad, 2930, 1731 , 1693, 1654, 1637, 1615, 1588, 1577, 1521, 1502, 1488, 1423, 1321, 1289, 1229, 1210, 1178, 1154, 1121, 1076, 1060, 1030, 1012, 982, 880, 842, 831 and 810 cm ^-1 , antibiotic A-4696 factor B2 or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof, preferably in the form of a hydrochloride which is a white, crystalline substance soluble in water, hydroxyl-containing solvents and polar solvents and insoluble in ether, chloroform, benzene, acetone, aliphatic hydrocarbons and chlorinated hydrocarbons having an approximate composition of 51.96% carbon, 4.87% hydrogen, 5.72% nitrogen, 5.88 % chlorine and oxygen residue, with an approximate theoretical molecular weight of 1808, with an ultraviolet absorption maximum in water at 280 nm at E = 44.7, with the following bands in the infrared absorption spectrum in potassium bromide: 3409 broad, 2934,1730 ,

1658, 1614, 1580, 1548, 1504, 1498, 1490, 1426, 1290, 1231, 1210, 1179, 1121, 1061, 1031, 1017, 987, 903, 884 a 818 cm!, antibiotikum A-4696 faktoru B3 nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelná adiční sůl s kyselinou, s výhodou ve formě hydrochloridu, který je bílá, krystalická látka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahem hydroxylových skupin a polárních rozpouštědlech a nerozpustná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu, alifatických uhlovodících a chlorovaných uhuhlíku, 4,74 % vodíku, 5,83 % dusíku, 5,57 °/o chloru a zbytkem kyslíku, s přibližnou teoretickou molekulovou hmotností 1808, s absorpčním maximem v ultrafialovém světle ve vodě při 280 nm při E =46,3, s následujícími pásy v absorpčním spektru v infračerveném světle v bromidu draselném: 3394 široké, 2938, 1733, 1697, 1675, 1656, 1638, 1614, 1591, 1515, 1504, 1489, 1427, 1359, 1291, 1228, 1209, 1180, 1120, 1072, 1051, 1018, 985, 903, 882, 846 a 816 cm^-1, antibiotikum A-4696, faktor Cia nebo z jeho farmaceutického hlediska přijatelná adiční sůl s kyselinou, s výhodou ve formě hydrochloridu, který je bílá, krystalická látka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahem hydroxylových skupin a polárních rozpouštědlech a nerozpustná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu, alifatických uhlovodících a chlorovaných uhlovodících s přibližným složením 53,05 %^!uhlíku, 4,74 % vodíku, 5,83 % dusíku, 5,39 % chloru a zbytkem kyslíku, s přibližnou teoretickou molekulovou hmotností 1792, s absorpčním maximem v ultrafialovém světle ve vodě při 279 nm při Ej'’’m =47,9 s následujícími pásy v absorpčním spektru v infračerveném světle v bromidu draselném: 3380 široké, 2931, 1734, 1650, 1616, 1591, 1505, 1491, 1427, 1359, 1290, 1228, 1213, 1177, 1123, 1072, 1061, 1032, 1017, 987, 903, 832, 814 a 715 ciir¹, antibiotikum A-4696 faktor C3 nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelná adiční sůl s kyselinou, s výhodou ve formě hydrochloridu, který je bílá, krystalická látka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahem hydroxylových skupin a polárních rozpouštědlech a nerozpustná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu, alifatických uhlovodících a chlorovaných uhlovodících s přibližným složením 51,73 % uhlíku, 4,69 °/o vodíku, 5,94 % dusíku, 6,02 % chloru a zbytkem kyslíku, s absorpčním maximem v ultrafialo228936 vám světle ve vodě při 280 nm při E = = 47,9 s náledujícími pásy v absorpčním spektru v infračerveném světle v bromidu draselném: 3378 široké, 2925, 1728, 1689, 1658, 1637, 1616, 1589, 1579, 1573, 1546, 1536, 1529, 1523, 1503, 1489, 1474, 1457, 1426, 1421, 1397, 1387, 1286, 1231, 1206, 1121, 1075, 1062, 1028, 1012, 987, 965, 949, 878, 840, 816, 769, 708 cm^-1, antibiotikum A-4696 faktor El nebo jeho z farmaceutického hlediska přijatelná adiční sůl s kyselinou, s výhodou ve formě hydrochloridu, který je bílá, krystalická látka rozpustná ve vodě, rozpouštědlech s obsahem hydroxylových skupin a polárních rozpouštědel a nerozpustná v etheru, chloroformu, benzenu, acetonu, alifatických uhlovodících a chlorovaných uhlovodících s přibližným složením 50,71 % uhlíku, 4,69 % vodíku, 5,94 % dusíku, 6,02 % chloru a zbytkem kyslíku, s absorpčním maximem v ultrafialovém světle ve vodě při 279 nm při E J°(“_m =39,9 s následujícími pásy v absorpčním spektru v infračerveném světle v bromidu draselném: 3394 široké, 2933, 1657, 1636, 1610, 1589, 1538, 1511, 1505, 1453, 1424, 1393, 1369, 1328, 1320, 1291, 1232, 1212, 1178, 1120, 1075, 1061, 1031, 1018, 986, 973, 904, 878, 847, 813, 770, 752, 738 a 714 cm'l.1658, 1614, 1580, 1548, 1504, 1498, 1490, 1426, 1290, 1231, 1210, 1179, 1121, 1061, 1031, 1017, 987, 903, 884 and 818 cm -1, the A-4696 factor B3 antibiotic or its a pharmaceutically acceptable acid addition salt, preferably in the form of a hydrochloride which is white, a crystalline substance soluble in water, solvents containing hydroxyl groups and polar solvents and insoluble in ether, chloroform, benzene, acetone, aliphatic hydrocarbons and chlorinated carbon, 4.74% hydrogen, 5.83% nitrogen, 5.57% chlorine and oxygen, with an approximate theoretical molecular weight of 1808, with an ultraviolet absorption maximum in water at 280 nm at E = 46.3, with the following: infrared absorption bands in potassium bromide: 3394 wide, 2938, 1733, 1697, 1675, 1656, 1638, 1614, 1591, 1515, 1504, 1489, 1427, 1359, 1291, 1228, 1209, 1180, 1120, 1072, 1051, 1018, 985, 903, 882, 846 and 816 cm ^-1 , antib iotic A-4696, factor Cia or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof, preferably in the form of a hydrochloride which is white, a crystalline substance soluble in water, hydroxyl-containing solvents and polar solvents and insoluble in ether, chloroform, benzene , acetone, aliphatic hydrocarbons and chlorinated hydrocarbons with an approximate composition of 53.05% ^! carbon, 4.74% hydrogen, 5.83% nitrogen, 5.39% chlorine and the rest of the oxygen, with an approximate theoretical molecular weight of 1792, with an ultraviolet absorption maximum in water at 279 nm at Ej m = 47, 9 with the following infrared absorption bands in potassium bromide: 3380 wide, 2931, 1734, 1650, 1616, 1591, 1505, 1491, 1427, 1359, 1290, 1228, 1213, 1177, 1123, 1072, 1061, 1032 , 1017, 987, 903, 832, 814 and 715 CHR ^1, a-4696 factor C3 or its pharmaceutically acceptable acid addition salt, preferably as the hydrochloride salt, is a white, crystalline substance soluble in water and solvents with contains hydroxyl groups and polar solvents and insoluble in ether, chloroform, benzene, acetone, aliphatic hydrocarbons and chlorinated hydrocarbons having an approximate composition of 51,73% carbon, 4,69% hydrogen, 5,94% nitrogen, 6,02% chlorine and the rest of the oxygen, with absorption ma ximem in ultraviolet228936 gives you light in water at 280 nm at E = 47.9 with the following bands in the infrared absorption spectrum in potassium bromide: 3378 broad, 2925, 1728, 1689, 1658, 1637, 1616, 1589, 1579, 1573 1546, 1536, 1529, 1523, 1503, 1489, 1474, 1457, 1426, 1421, 1397, 1387, 1286, 1231, 1206, 1121, 1075, 1062, 1028, 1012, 987, 965, 949, 878, 840 , 816, 769, 708 cm ^-1 , antibiotic A-4696 Factor E1 or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof, preferably in the form of a hydrochloride which is white, a crystalline substance soluble in water, solvents containing hydroxyl groups and polar solvents and insoluble in ether, chloroform, benzene, acetone, aliphatic and chlorinated hydrocarbons having an approximate composition of 50,71% carbon, 4,69% hydrogen, 5,94% nitrogen, 6,02% chlorine and the remainder of the oxygen, with an absorption maximum in ultraviolet light in water at 279 nm at EJ ° (“ _m = 3 9.9 with the following infrared absorption bands in potassium bromide: 3394 broad, 2933, 1657, 1636, 1610, 1589, 1538, 1511, 1505, 1453, 1424, 1393, 1369, 1328, 1320, 1291, 1232 , 1212, 1178, 1120, 1075, 1061, 1031, 1018, 986, 973, 904, 878, 847, 813, 770, 752, 738, and 714 cm -1.

Soli antibiotika A-4696 faktorů Βι, B2, B3, C_la, C3 a El, přijatelné z farmaceutického hlediska je možno připravit s anorganickými kyselinami, například s kyselinou chlorovodíkovou, bromovodíkovou, sulfonovou, fosforečnou a podobně. Soli antibiotika s těmitcí kyselinami je možno získat například tak, žo se okyselí roztok volného antibiotika příslušnou kyselinou a pak se sůl vysráží přiváděním acetonu do roztoku. Soli je možno připravit v některých případech také výměnou iontů při použití sloupce s náplní iontoměniče.Salts of antibiotic A-4696 factors Βι, B2, B3, C, _a, C3, and El, pharmaceutically acceptable can be prepared with inorganic acids, for example hydrochloric, hydrobromic, sulfonic, phosphoric, and the like. For example, salts of an antibiotic with a quenching acid may be obtained by acidifying the free antibiotic solution with the appropriate acid and then precipitating the salt by introducing acetone into the solution. Salts may also be prepared in some cases by ion exchange using an ion exchange column.

Stejným způsobem je také možno užít jiné metody pro výrobu solí. Všechny tyto metody jsou v oboru známy.Other methods for making salts can also be used in the same manner. All of these methods are known in the art.

Antibiotikum A-4696 faktory Βι, B2, B3, Ci_a, C3 a Ei ovlivňují rychlost růstu v tom smyslu, že urychlují růst a zvyšují využití krmivá u drůbeže, vepřů, ovcí a skotu. Například při denním podávání u drůbeže a vepřů v množství 0,5 až 25 mg/kg tělesné hmotnosti je možno dosáhnout rychlejšího růstu a lepšího využití krmivá než v případě zvířat, která jsou krmena stejným krmivém bez obsahu účinné látky. Pod pojmem „krmivo“ se rozumí celkový příjem živin u daného zvířete, to jest běžného krmivá, koncentrátů, doplňkových krmiv, anorganických solí, vitamínů i směsi s obsahem léčivých látek, objemného krmivá a dalších složek krmné dávky zvířete. Typické základní dávky pro drůbež a vepře jsou uvedeny v US patentu č. 4 115 552.Antibiotic A-4696 factors Βι, B2, B3, Ci _a , C3 and Ei influence growth rate in the sense that they accelerate growth and increase feed utilization in poultry, pigs, sheep and cattle. For example, daily administration in poultry and pigs of 0.5 to 25 mg / kg body weight results in faster growth and better feed utilization than in animals fed the same non-active feed. The term 'feed' means the total nutrient intake of a given animal, that is to say conventional feed, concentrates, supplementary feed, inorganic salts, vitamins and mixtures containing active substances, bulky feed and other components of the animal's ration. Typical base doses for poultry and pigs are disclosed in U.S. Patent No. 4,115,552.

Výhodně se postupuje tak, že se antibiotikum A-4696, faktory Βι, B2, B3, Ci_a, C3 a Ei nebo vhodné deriváty těchto faktorů nebo jejich směsi podávají perorálně ve vhodném krmivu v množství 2 až 200 g na tunu krmivá, čímž je možno dosáhnout lepšího využij krmivá a rychlejšího růstu. Přidáním účinných faktorů antibiotika A-4696 do krmivá se s výhodou provádí tak, že se nejprve připraví vhodná předběžná směs, například způsobem podle US patentu č. 4 115 552 s obsahem 1 až 200 g antibiotika A-4696, faktorů Βι, B2, Bs, Ci_a, Cs nebo Ei nebo vhodného derivátu nebo směsi těchto faktorů v 1 kg předběžné směsi. Tato směs se pak vmísí do výsledného krmivá. Je také možno postupovat tak, že se účinná látka vmísí do běžného krmivá ve formě koncentrátu nebo doplňkového krmivá s obsahem této látky.Preferably, the A-4696 antibiotic, factors Βι, B2, B3, Ci _a , C3 and Ei or suitable derivatives of these factors or mixtures thereof are administered orally in a suitable feed in an amount of 2 to 200 g per ton of feed, better feed utilization and faster growth can be achieved. Advantageously, the addition of the A-4696 antibiotic factors to the feed is accomplished by first preparing a suitable premix, for example by the method of U.S. Pat. No. 4,115,552 containing 1 to 200 g of A-4696, factors Βι, B2, Bs , Ci _a , Cs or Ei or a suitable derivative or mixture of these factors in 1 kg of the premix. This mixture is then mixed into the resulting feed. Alternatively, the active ingredient may be incorporated into a conventional feed in the form of a concentrate or feed supplement containing the active ingredient.

Nové faktory antibiotika A-4696 je možno izolovat z původního antibiotika, které se získává pěstováním některého kmene Actionoplanes za aerobních podmínek ve vhodném ž^:vném prostředí do nahromadění antibiotika v živném prostředí. Jednotlivé faktory je možno izolovat různými způsoby izolace a čištění.New factors of antibiotic A-4696 can be isolated from the original antibiotic being produced by culturing one of several strains Actionoplanes aerobic conditions in a suitable ^in: sensation medium until substantial antibiotic activity in the culture medium. Individual factors can be isolated by various methods of isolation and cleaning.

Mikroorganismus, který produkuje antibiotikum A-4696 byl identifikován jako kmen Acíinoplanes missouriensis z čeledi Actinoplanaceae. Jde o čeleď mikroorganismů z řádu Actinomycetales, která byla poprvé popsána v publikaci Dr. John N. Couch, Jour. Ělisha Mitchell Sci. Soc., 71, 148 až 155 a 269 (1955 J, Bergey“ s Manual of Determinative Bacteriology, 7. vydání 825 až 829 (1957) a Jour. Elisha Mitchell Sci. Soc., 79, 53 až 70 (1963).The microorganism that produces the antibiotic A-4696 has been identified as an Acininoplanes missouriensis strain of the Actinoplanaceae family. It is a family of microorganisms of the order Actinomycetales, which was first described in the publication Dr.. John N. dating in Couch, Jour. Mitchell Sci. Soc., 71, 148-155 and 269 (1955 J, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th Edition 825-829 (1957) and Jour. Elisha Mitchell Sci. Soc., 79, 53-70 (1963).

Biologicky čisté kultury kmenů Actinoplanes nňssourlensis, vhodné pro produkci antibiotika A-4696 a pro následnou izolaci jeho faktorů Βι, B2, B3, Ci_a, C3 a Ei byly uloženy do veřejné sbírky kultur American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, odkud je možno je získat bez omezení pod čísly ATCC 31680, ATCC 31682 a ATCC 31683. Kmen ATCC 31682 je vhodný pro výrobu antibiotika A-4696 s následnou izolací faktorů Bi a Ci_a. Kmen ATCC 31680 je vhodný pro izolaci antibiotika A-4696 faktorů B2 a C3 a kmen ATCC 31683 je vhodný pro izolaci antibiotika A-4696 faktorů Bs a Ei.Biologically pure Actinoplanes nessourlensis strains suitable for the production of A-4696 and for subsequent isolation of its factors jehoι, B2, B3, Ci _a , C3 and Ei were deposited in the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. is obtained without limitation under the numbers ATCC 31680, ATCC 31682 and ATCC 31683. The strain ATCC 31682 is suitable for the production of the antibiotic A-4696 with subsequent isolation of factors Bi and Ci _and . The strain ATCC 31680 is suitable for isolating the antibiotic A-4696 factors B2 and C3, and the strain ATCC 31683 is suitable for isolating the antibiotic A-4696 factors Bs and Ei.

Stejně jako v případě jiných mikroorgaírsmů má živné prostředí pro pěstování kmenů Acíinoplanes obsahovat základní stopové prvky, nutné pro růst a vývoj mikroorganismu. Tyto stopové prvky jsou již obvykle přítomny jako nečistoty v ostatních složkách živného prostředí.As with other micro-organisms, the culture medium for the cultivation of Acíinoplanes should contain the essential trace elements necessary for the growth and development of the micro-organism. These trace elements are usually already present as impurities in the other media components.

Mikroorganismus, užitý pro výrobu antibiotika A-4696 s následnou izolací jeho faktorů Bi, B2, Bs, Ci_a, C3 a El je schopen růstu v poměrně velkém rozmezí pH. Je však žádoucí jej pěstovat v rozmezí pH 6,5 až 7,0. Stejně jako je tomu v případě ostatních mikroorganismů řádu Actinomycetes, mění se pH růstového prostředí postupně v průběhu růstu, takže na konci se obvykle pohybuje v rozmezí 6,5 až 7,5.The microorganism used to produce the antibiotic A-4696 with subsequent isolation of its factors Bi, B2, Bs, Ci _a , C3 and E1 is capable of growth over a relatively large pH range. However, it is desirable to cultivate it in the pH range of 6.5 to 7.0. As with other microorganisms of the order Actinomycetes, the pH of the growth medium changes gradually during growth, so that in the end it is usually between 6.5 and 7.5.

Pro výrobu antibiotika A-4696 je výhodné pěstovat mikroorganismus v submerzní kultuře za aerobních podmínek. Poměrně malá množství antibiotika je možno získat z kultur v třepacích lahvích, v případě většího množství antibiotika je nutno užít pěstování ve sterilních tancích ve formě submerzní kultury za aerobních podmínek. Živné prostředí, obsažené ve sterilním tanku je možno očkovat tak, že se ke sterilnímu prostředí přidá suspenze myceliálních fragmentů.For the production of the antibiotic A-4696, it is preferable to cultivate the microorganism in a submerged culture under aerobic conditions. Relatively small amounts of antibiotic can be obtained from shake flask cultures. The culture medium contained in the sterile tank can be inoculated by adding a suspension of mycelial fragments to the sterile medium.

Je tedy žádoucí získat vegetativní očkovací materiál mikroorganismu, což se provádí tak, že se naočkuje malé množství živného prostředí fragmenty mycelia a jakmile se získá mladá vegetativní kultura, přenese se tento materiál asepticky do většího tanku. Živné prostředí pro vypěstování vegetativního očkovacího materiálu může být stejné jako živné prostředí pro získání většího množství antibiotika, je však možno užít i jiného živného prostředí.Accordingly, it is desirable to obtain a vegetative inoculum material of the microorganism by inoculating a small amount of culture medium with mycelium fragments, and as soon as a young vegetative culture is obtained, it is aseptically transferred to a larger tank. The culture medium for growing the vegetative inoculum material may be the same as the culture medium for obtaining a larger amount of antibiotic, but another culture medium may be used.

Actinoplanes missouriens’s kmeny ATCC 31080, ATCC 31682 a ATCC 31683, produkující faktory antibiotika A-4696 je možno pěstovat při teplotě 20 až 40 °C. Největší množství faktorů uvedeného antibiotika se získá v průběhu pěstování při teplotě 30 °C.Actinoplanes missouriens’s strains ATCC 31080, ATCC 31682, and ATCC 31683, producing A-4696 antibiotic factors, can be grown at 20-40 ° C. The greatest number of factors of said antibiotic are obtained during cultivation at 30 ° C.

Pří pěstování v submerzní kultuře za aerobních podmínek se živným prostředím nechá procházet sterilní vzduch. Objem vzduchu, který prochází živným prostředím se pohybuje v rozmezí 0,1 až 1,0 objemu vzduchu za minutu na objem živného prostředí. Nejúčinnější růst a produkce antibiotika se dosáhne v případě, že objem vzduchu tvoří alespoň 1/2 objemu vzduchu za minutu na 1 objem živného prostředí.For cultivation in submerged culture under aerobic conditions, sterile air is passed through the culture medium. The volume of air passing through the culture medium is in the range of 0.1 to 1.0 volume of air per minute per volume of culture medium. The most efficient growth and antibiotic production is achieved when the volume of air is at least 1/2 volume of air per minute per volume of culture medium.

Rychlost produkce antibiotika A-4696 a jeho faktorů a koncentrace antibiotika v živném prostředí se sleduje tak, že se odebírají vzorky živného prostředí a podrobí se testům na antibiotickou účinnost proti organismůs, které jsou na tyto faktory citlivé. Jedním z použitelných organismů je Bacillus subtilis. Biologickou zkoušku je možno provádět standardním způsobem na plotnách s použitím kalíšků nebo papírových kotoučů.The rate of production of the A-4696 antibiotic and its factors and the concentration of the antibiotic in the culture medium is monitored by taking samples of the culture medium and testing for antibiotic activity against organisms that are sensitive to these factors. One useful organism is Bacillus subtilis. The bioassay can be carried out in a standard manner on plates using cups or paper discs.

K maximální produkci antibiotika obvykle dochází v průběhu 4 až 6 dní v třepacích kulturách i v submerzní kultuře za aerobních podmínek.Maximum antibiotic production usually occurs within 4 to 6 days in shake and submerged cultures under aerobic conditions.

Antibiotikum A-4696 pro následnou izolaci svých faktorů Bi, B2, Bs, C_la, C3 a Ei je možno izolovat z živného prostředí a oddělit od ostatních případně přítomných látek běžnými metodami s použitím absorpce a extrakce. Adsorpční postupy jsou výhodnější, protože při nich není zapotřebí užít velkých objemů rozpouštědel, jako je tomu v případě extrakčních postupů.A-4696 for subsequent isolation of factor B2, Bs, C _la, C 3, and E can be isolated from the culture medium and separated from other substances possibly present by conventional methods using absorption and extraction. Adsorption processes are preferred because they do not require the use of large volumes of solvents, as is the case with extraction processes.

Protože způsob výroby je přibližně stejný v případě, že se užívá kmene ATCC 31680 pro izolaci antibiotika A-4696, faktory B2 a Cs, kmene ATCC 31682 pro izolaci antibiotika A-4696 faktorů Bl a Ci_a a kmene ATCC 31683 pro izolaci antibiotika A-4696 faktorů B3 a Ei, je v následujících příkladech uveden pro jednoduchost pouze způsob pěstování kmene ATCC 31682. V příkladu 1 jsou rov10 něž uvedeny některé rozdíly, které se týkají použití kmene ATCC 31683.Because the manufacturing process is approximately the same in the case that use is strain ATCC 31680 for isolation of antibiotic A-4696 factors B2 and C, strain ATCC 31682 for isolation of antibiotic A-4696 factor Bl, and C _{and a} and strain ATCC 31683 for isolation of antibiotic A- For the sake of simplicity, 4696 factors B3 and E1, only the method of growing the ATCC 31682 strain is shown in the following examples. In Example 1, some differences concerning the use of the ATCC 31683 strain are also shown.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady:The invention will be illustrated by the following examples:

Příklad 1Example 1

A. Fermentace ve třepací lahviA. Fermentation in shake flask

Myceliální fragmenty Actinoplanes missoudiensis kmene ATCC 31682 se naočkují na šikmý agar následujícího složení:Mycelial fragments of Actinoplanes missoudiensis strain ATCC 31682 are inoculated on sloping agar of the following composition:

Složka Component Množství v % Quantity in% cerelóza cerellosis 0,5 0.5 bramborový dextrin potato dextrin 2,0 2,0 moučka nutrisoy* nutrisoy meal * 1,5 1.5 extrakt z kvasme yeast extract 0,25 0.25 uhlič.tan vápenatý calcium carbonate 0,1 0.1 agar agar 2,0 2,0

* Mouka Nutriosy je dodávána Archer Daniels Midland Company, 4666 Faries Parkway, Oecatur, Illinois 62526.* Nutriosy flour is supplied by Archer Daniels Midland Company, 4666 Faries Parkway, Oecatur, Illinois 62526.

Šikmý agar naočkovaný kmenem ATCC 31682 se pak inkubuje 6 dnů při teplotě 30 °C. Kultura nesporuluje, takže je nutné rozdrtit mycelium sterilní pipetou. Takto upravená zralá kultura se překryje sterilní destilovanou vodou a opatrně se odebere pipetou nebo sterilní tyčinkou, čímž se získá suspenze mycelia.Slope agar inoculated with ATCC 31682 was then incubated for 6 days at 30 ° C. The culture does not spore, so it is necessary to crush the mycelium with a sterile pipette. The mature culture thus treated is covered with sterile distilled water and carefully removed by pipette or sterile rod to obtain a mycelium suspension.

Takto získaná suspenze se užije k naočkování 100 ml sterilního vegetativního živného prostředí následujícího složení:The suspension thus obtained is used to inoculate 100 ml of a sterile vegetative medium of the following composition:

Složka Množství v %Component Quantity in%

cerelóza cerellosis 0,5 0.5 bramborový dextrin potato dextrin 2,0 2,0 mouka Nutrisoy flour Nutrisoy 1,5 1.5 extrakt z kvasnic yeast extract 0,25 0.25 uhličitan vápenatý calcium carbonate 0,1 0.1

Vegetativní žvné prostředí se po naočkování inkubuje 48 hodin při teplotě 30 °C na rotační třepačce při 250 otáčkách za minutu.After inoculation, the vegetative culture medium is incubated for 48 hours at 30 ° C on a rotary shaker at 250 rpm.

ml naočkovaného živného prostředí se užije k naočkování 100 ml dalšího sterilního prostředí následujícího složení.ml of inoculated culture medium is used to inoculate 100 ml of another sterile medium of the following composition.

Složka Množství v % cerelóza 0,5 kvasinky 0,25 mouka Nutrisoy 1,5 kukuřičný škrob 2,0 uhličitan vápenatý 0,1Ingredients Amount in% cerellose 0.5 yeast 0.25 flour Nutrisoy 1.5 corn starch 2.0 calcium carbonate 0.1

Sag 471 (protipěnící činidlo) 0,05Sag 471 (antifoam) 0.05

Toto druhé prostředí se inkubuje 24 hodin pří teplotě 30 °C za stálého třepání rychlostí 250 otáček za minutu.This second medium is incubated for 24 hours at 30 ° C with shaking at 250 rpm.

0,4 ml tohoto druhého prostředí se užije k naočkování 100 ml produkčního živného prostředí, svrchu uvedeného složení, které se uloží do Erlenmeyerových baněk s obsahu 500 ml a předběžně se sterilizuje 30 minut při teplotě 121 °C.0.4 ml of this second medium is used to inoculate 100 ml of the production medium of the above composition, which are stored in 500 ml Erlenmeyer flasks and pre-sterilized for 30 minutes at 121 ° C.

Složka Množství v % cerelóza 1,0 kukuřičný škrob 3,5 sacharóza 3,0 melasa 1,5 kvasinky 1,0Component Quantity in% cerellose 1.0 maize starch 3.5 sucrose 3.0 molasses 1.5 yeast 1.0

Proflo (mouka z bavlníkových semen] 1,0 uhličitan vápenatý 0,2 hydrogenfosforečnan draselný 0,05 síran amonný 0,025 síran hořečnatý . 7 H2O 0,5Proflo (cotton seed flour) 1.0 Calcium carbonate 0.2 Potassium hydrogen phosphate 0.05 Ammonium sulfate 0.025 Magnesium sulfate 7 H2O 0.5

Sag 471 0,03Sag 471 0.03

Produkční prostředí se inkubuje 96 hodin při teplotě 30 °C na rotační třepačce při 250 otáčkách za minutu. Na konci fermentace má živné prostředí pH 8,0.The production medium is incubated for 96 hours at 30 ° C on a rotary shaker at 250 rpm. At the end of the fermentation, the culture medium has a pH of 8.0.

Pro výrobu faktorů Bs a Ei antibiotika A-4696 se užije kmen ATCC 31683 pro výrobu vegetativního živného prostředí. 0,4 ml živného prostředí, naočkovaného kmenem ATCC 31683 se pak užije k naočkování 100 ml produkčního prostředí svrchu uvedeného složení v Erlenmeyerových baňkách po 500 ml po předběžné sterilizaci 30 minut při teplotě 121 °C.For the production of factors Bs and Ei of the antibiotic A-4696, strain ATCC 31683 is used to produce a vegetative culture medium. 0.4 ml of the culture medium inoculated with ATCC 31683 is then used to inoculate 100 ml of the production medium of the above composition in 500 ml Erlenmeyer flasks after pre-sterilization for 30 minutes at 121 ° C.

Složka Množství %Component Quantity%

cerelóza cerellosis 1,0 1.0 kvasinky yeast 2,0 2,0 uhličitan vápenatý calcium carbonate 0,2 0.2 hydrogenfosforečnan draselný Potassium hydrogen phosphate 0,05 0.05 síran amonný ammonium sulfate 0,025 0,025 Sag 471 Sag 471 0,03 0.03

Produkční živné prostředí se inkubuje 96 hodin při teplotě 30 °C na rotační třepačce o 250 otáčkách za minutu. Na konci fermentace má živné prostředí pH 8,0.The production broth is incubated for 96 hours at 30 ° C on a rotary shaker at 250 rpm. At the end of the fermentation, the culture medium has a pH of 8.0.

B. Fermentace v tanku o objemu 40 litrůB. Fermentation in a 40 liter tank

Vegetativní živné prostředí se připraví způsobem, uvedeným v odstavci A. 25 litrů produkčního prostředí se sterilizuje 30 minut v autoklávu při teplotě 121 °C a vloží se do fermentačního tanku o objemu 40 litrů. Toto množství se naočkuje 100 ml vegetativního prostředí. Naočkované produkční prostředí se pěstuje 4 dny při teplotě 30 °C. Živné prostředí se provzdušňuje sterilním vzduchem v množství 1/2 objemu vzduchu na 1 objem živného prostředí za minutu. Míchání se provádí míchacím zařízením pod tlakem, aby bylo zajištěno dokonalé promísení vzduchu s živným prostředím. V průběhu fermentace stoupá postupně pH živného prostředí a počáteční hodnoty 6,5 na výslednou hodnotu 8,0.The vegetative medium is prepared as described in paragraph A. 25 liters of production medium are sterilized by autoclaving at 121 ° C for 30 minutes and placed in a 40-liter fermentation tank. This amount is inoculated with 100 ml of vegetative medium. The inoculated production medium is grown for 4 days at 30 ° C. The culture medium is aerated with sterile air at a rate of 1/2 volume of air per volume of culture medium per minute. The mixing is carried out by means of a pressurized agitator to ensure perfect mixing of the air with the culture medium. During the fermentation, the pH of the culture medium and the initial value of 6.5 gradually increase to a final value of 8.0.

C. Izolace antibiotika A-4696.C. Isolation of Antibiotic A-4696.

3800 litrů fermentačního prostředí, připraveného svrchu uvedeným způsobem se zfiltruje po přidání 5 % (hmotnostní/objemová %) pomocného prostředku pro filtraci (Celit 545). Filtrační koláč se znovu uvede v suspenzi v 3600 litrech deionizované vody a pH vodné suspenze se upraví na 10,5 přidáním vodného roztoku hydroxidu sodného. Pevný podíl se oddělí filtrací a promyje se vodou. Filtrát a promývací voda se slijí a výsledný roztok se okyselí 20 % (hmotnostní/objemová %) vodným roztokem kyseliny sírové na pH 4,5. Kyselý roztok se vyčeří filtrací za současného přidání 1 % pomocného prostředku (Celíte 545). Čirý roztok se nechá projít sloupcem o rozměru 0,5 X 1,5 metru s obsahem 350 litrů Amberlitu IR-116 v Na+ formě a sloupec se promyje 1200 litry deionizované vody. Pryskyřice IR-116 se odstraní a po částech se vymývá při pHThe 3800 liters of fermentation broth prepared above were filtered after addition of 5% (w / v) filtration aid (Celite 545). The filter cake was resuspended in 3600 liters of deionized water and the pH of the aqueous suspension was adjusted to 10.5 by addition of aqueous sodium hydroxide solution. The solid was collected by filtration and washed with water. The filtrate and washings were combined and the resulting solution was acidified with 20% (w / v) aqueous sulfuric acid to pH 4.5. The acidic solution was clarified by filtration while adding 1% excipient (Celite 545). The clear solution is passed through a 0.5 X 1.5 meter column containing 350 liters of Amberlite IR-116 in Na + form and the column is washed with 1200 liters of deionized water. The IR-116 resin was removed and washed in portions at pH

10,5 celkem 1000 litry vodného roztoku hydroxidu sodného. Eluát se neutralizuje na pH 7 přidáním 20% (hmotnostní/objemová procenta) vodného roztoku kyseliny sírové a pak se třikrát promyje celkem 150 litry deionizované vody. Voda, užitá k promytí se neutralizuje a slije s neutralizovaným eluátem. Výsledný roztok se koncentruje a pak lyofilizuje. Výsledný surový produkt měl špinavě šedou až tmavě hnědou barvu.10.5 total 1000 liters of aqueous sodium hydroxide solution. The eluate was neutralized to pH 7 by addition of 20% (w / v) aqueous sulfuric acid solution and then washed three times with a total of 150 liters of deionized water. The water used for washing is neutralized and decanted with the neutralized eluate. The resulting solution was concentrated and then lyophilized. The resulting crude product was an off-gray to dark brown color.

D. Odstranění solí ze surového antibiotika A-4696D. Removal of salts from crude A-4696 antibiotic

1,0 kg surového komplexu se pomalu přidá za energického míchání k 1,5 litrům deionizované vody. Výsledná suspenze se míchá 20 minut a pak se neutralizuje na pH 7 při použití 10% vodného roztoku hydroxidu amonného. Nerozpustný komplex antibiotika A-4696 se oddělí filtrací ve vakuu, promyje se deionizovanou vodou a lyofilizuje. Usušený komplex, zbavený solí se izoluje ve výtěžku přibližně 80 %, vztaženo na biologickou účinnost.1.0 kg of the crude complex was slowly added to 1.5 liters of deionized water with vigorous stirring. The resulting suspension was stirred for 20 minutes and then neutralized to pH 7 using 10% aqueous ammonium hydroxide solution. The insoluble A-4696 antibiotic complex was collected by vacuum filtration, washed with deionized water, and lyophilized. The dried salt-free complex is isolated in a yield of about 80% based on biological activity.

E. Čištění antibiotika A-4696, zbaveného solíE. Purification of A-4696 salt-free antibiotic

300 g sušeného komplexu zbaveného solí se uvede v suspenzi ve 2 litrech deionizované vody a pH suspenze se upraví na 2,7 přidáním vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 3 N. Okyselený roztok se odstředuje 40 minut při 2500 otáčkách za minutu. Supernatant se slije a nanese se na vrchol sloupce o rozměrech 8 X 85 cm s obsahem 6 litrů odbarvovacího činidla (Duolit S761], Antibiotikum se vymývá deinlzovanou vodou při rychlosti průtoku 30 ml za minutu. Eluce se sleduje chromatografií na tenké vrstvě. Eluát s obsahem antibiotika A-4896 se zahustí při teplotě 35 °C a tlaku 400 Pa na objem 3 litry a pak se lyofilizuje. Odbarvený komplex se tímto způsobem získá jako bílá až špinavě bílá pevná látka ve výtěžku přibližně 70 %, vztaženo na biologickou účinnost.300 g of dehydrated salt-free complex are suspended in 2 liters of deionized water and the pH of the suspension is adjusted to 2.7 by addition of 3 N aqueous hydrochloric acid. The acidified solution is centrifuged for 40 minutes at 2500 rpm. The supernatant was decanted and applied to the top of an 8 X 85 cm column containing 6 liters of decolorizing agent (Duolit S761), eluting the antibiotic with de-lysed water at a flow rate of 30 ml per minute. The A-4896 antibiotics are concentrated to a volume of 3 liters at 35 ° C and 400 Pa and then lyophilized to give a colorless complex as a white to off-white solid in a yield of approximately 70% based on biological activity.

F. Izolace antibiotika A-4696 faktorů Bi, B2, B3, Ci_a) C3 a El ve formě hydrochloridu g sušeného odbarveného komplexu antibiotika A-4696 se rozpustí ve 100 ml deionizované vody. Výsledný vodný roztok se zfiltruje a nanese na vrchol chromatografického sloupce o rozměrech 5 X 100 cm s obsahem 2 litrů polyamidu (Machery a Magel SC6). Sloupec se vymývá deionizovanou vodou a odebírají se frakce po 25 ml. Eluce se sleduje ultrafialovým světlem a chromatografií na tenké vrstvě. Podle těchto údajů se slijí a lyofilizují frakce s obsahem jednotlivých faktorů. Pro některé typy dělení bylo zapotřebí prodloužit sloupec na 200 cm tak, že byly užity dva sloupce s obsahem polyamidu za sebou. Další čištění bylo prováděno opakovanou chromatografií.F. Isolation of A-4696 factors Bi, B2, B3, C1 _a) C3 and E1 in the form of hydrochloride g of the dried bleached A-4696 complex was dissolved in 100 ml of deionized water. The resulting aqueous solution was filtered and applied to the top of a 5 X 100 cm 2 column of polyamide (Machery and Magel SC6). The column is eluted with deionized water and 25 ml fractions are collected. Elution is monitored by ultraviolet light and thin layer chromatography. According to these data, the fractions containing the individual factors are pooled and lyophilized. For some types of splitting it was necessary to extend the column to 200 cm by using two columns containing polyamide in succession. Further purification was performed by repeated chromatography.

Postupy, uvedené v odstavcích A až F byly prováděny při použití kmene ATCC 31682 při izolaci faktorů Bi a Ci_a antibiotika A-4696, při použití kmene ATCC 31680 v případě izolace faktorů B2 a C3 antibiotika A-4696 a při použití kmene ATCC 31683 v případě izolace faktorů B3 a Ei antibiotika A-4696. Je sice možno k izolaci svrchu uvedených faktorů užít i jiné kmeny Actinoplanes, svrchu uvedené kmeny však jsou pro izolaci jednotlivých faktorů antibiotika A-4696 nejvýhodnější.The procedures described in paragraphs A to F were performed using ATCC 31682 strain to isolate Factors Bi and Ci _and A-4696, using ATCC 31680 to isolate Factors B2 and C3 of A-4696 and using ATCC 31683 strain in isolating factors B3 and Ei with antibiotic A-4696. While other Actinoplanes strains may be used to isolate the above factors, the above strains are most preferred for isolation of the individual A-4696 factors.

Je také možno izolovat faktory Βι, B2, B3, Cia, C3 a Ei antibiotika A-4696 ve formě hydrochloridu při použití jediného kmene Actinoplanes missouriensis následujícím způsobem:It is also possible to isolate the factors Βι, B2, B3, Cia, C3 and Ei of the A-4696 hydrochloride form using a single Actinoplanes missouriensis strain as follows:

200 mg sušeného odbarveného komplexu antibiotika A-4696, připraveného při použití kmene ATCC 31683 způsobem podle příkladu 1, odstavce A až E se rozpustí ve 2 ml destilované vody. Výsledný roztok se zfiltruje a dělí se chromatografií na sloupci při použití adsorpčních činidel v reverzní fázi, například Li Chroprep^R RP-18 (F. Merck, Darmstadt, NSR) jako stacionární fáze, jako mobilní fáze se užije vodného acetonitrilu s obsahem triethylaminfosfátu, přičemž množství acetonitrilu se v průběhu postupu zvyšuje. Přestože je zřejmé, že odborník může měnit koncentraci acetonitrilu v závislosti na složení fermentačního prostředí, je možno uvést alespoň, že výhodné rozmezí koncentrace acetonitrilu je 10 až 40 °/o. Eluát se sleduje v ultrafialovém světle a frakce s obsahem jednotlivých faktorů se odebírají. Acetonitril se odstraní odpařením ve vysokém vakuu a výsledné vodné roztoky se lyofilizují. Lyofilizované chromatografické frakce se pak znovu rozpustí v destilované vodě, adsorbují se adsorbční činidla v reverzní fázi, například na Sep Pak^R C18 [Waters Associates lne., Milford, Massachusetts) a adsorbční činidlo se vymývá 50% vodným methanolem. Vodné roztoky s obsahem jednotlivých faktorů antibiotika A-4696 se odpaří dosucha a čištěné faktory se pak izolují jako amorfní pevné látky.200 mg of dried bleached antibiotic complex A-4696, prepared using ATCC 31683 as described in Example 1, paragraphs A to E, is dissolved in 2 ml of distilled water. The resulting solution is filtered and separated by column chromatography using reverse phase adsorption agents such as Li Chroprep ^R RP-18 (F. Merck, Darmstadt, Germany) as the stationary phase, using aqueous acetonitrile containing triethylamine phosphate as mobile phase, the amount of acetonitrile increases during the process. While it will be appreciated by those skilled in the art that the concentration of acetonitrile may vary depending on the composition of the fermentation broth, at least a preferred range of acetonitrile concentration is 10 to 40%. The eluate is monitored in ultraviolet light and fractions containing individual factors are collected. The acetonitrile was removed by evaporation under high vacuum and the resulting aqueous solutions were lyophilized. Lyophilized chromatography fractions were then redissolved in distilled water, adsorbed adsorbent reverse phase, for example on a Sep Pak ^R C18 [Waters Associates, Inc., Milford, Massachusetts) and the adsorbent was eluted with 50% aqueous methanol. Aqueous solutions containing individual A-4696 factors are evaporated to dryness and the purified factors are then isolated as amorphous solids.

Příklad 2Example 2

Způsob výroby faktorů Βι, B2, B3, C_la, C3 a Ei antibiot'ka A-4696 ve formě sulfátuProcess for the production of factors Βι, B2, B3, C _1a , C3 and Ei of the antibiotic A-4696 in the form of sulfate

300 g antibiotika A-4696, připravená způsobem podle příkladu 1 odstavce A až D se uvede v suspenzi ve 2 litrech deionizované vody a pH suspenze se upraví na 2,7 přidáním 3N vodného roztoku kyseliny sírové. 0kyselený roztok se odstřeďuje 40 minut při 2500 otáčkách za minutu. Supernatant se slije a nanese na vrchol sloupce o rozměrech 8 X 85 cm s obsahem 6 litrů pryskyřice k odbarvení (Duolit S761). Antibiotikum se vymývá deionizovanou vodou při průtoku 30 mililitrů za minutu. Eluát se sleduje chromatografií na tenké vrstvě a frakce s obsahem Antibiotika A-4696 se zahustí při teplotě 35 °C a tlaku 400 Pa na objem 3 litry a pak se lyofilizují. Odbarvený komplex se izoluje jako bílá až špinavě bílá pevná látka ve výtěžku přibližně 70 %, vztaženo na účinnost. Jednotlivé faktory antibiotika A-4696, a to Bl, B2, B3, C_la, C3 a Ei ve formě sulfátů se izolují způsobem podle příkladu 1 F.300 g of antibiotic A-4696, prepared as described in Example 1, paragraphs A to D, are suspended in 2 liters of deionized water and the pH of the suspension is adjusted to 2.7 by addition of a 3N aqueous sulfuric acid solution. The acidified solution is centrifuged at 2500 rpm for 40 minutes. The supernatant was decanted and applied to the top of a 8 X 85 cm column containing 6 liters of decolorizing resin (Duolit S761). The antibiotic is eluted with deionized water at a flow rate of 30 milliliters per minute. The eluate was monitored by thin layer chromatography and the fractions containing Antibiotics A-4696 were concentrated at 35 ° C and 400 Pa to 3 L and then lyophilized. The bleached complex was isolated as a white to off-white solid in a yield of approximately 70% based on potency. Individual factors A-4696, and a B2, B3, C _la, C 3, and E sulfates were isolated according to Example 1, F.

Claims

Pre and / or supplementary feed for the production of feed for livestock, especially ruminants, characterized in that it contains from 0.01 to 90.0% by weight of the antibiotic A-4696 in the form of a complex or a pharmaceutically acceptable addition salt thereof as active ingredient. acid, antibiotic A-4696, factor Bi or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof, preferably in the form of a hydrochloride, which is a white, water-soluble crystalline substance, solvents containing

OF THE INVENTION hydroxyl groups and polar solvents and insoluble in ether, chloroform, benzene, acetone, aliphatic hydrocarbons and chlorinated hydrocarbons and having an approximate composition of 51.51% carbon, 5.25% hydrogen, 4.88% nitrogen, 4.62% chlorine and the remainder has an approximate theoretical molecular weight of 1954, an adsorption maximum in the ultraviolet light in water at 280 nm with E ^, ¹ = 42.8 ™ following absorption bands in its infrared spectrum in KBr: 3380 broad, 2930, 1731, 1693, 1654, 1637, 1615, 1588, 1577, 1521, 1502, 1488, 1423, 1321, 1289, 1229, 1210, 1178, 1154, 1121, 1076, 1060, 1030, 1012, 982, 880, 842, '831 and 810 cm ^-1 , antibiotic A-4696 Factor B1 or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof, preferably in the form of a hydrochloride which is white, a crystalline substance soluble in water, hydroxyl-containing solvents and polar solvents and insoluble in ether, chloroform, benzene, acetone, aliphatic hydrocarbons and chlorinated hydrocarbons having an approximate composition of 51.96% carbon, 4.67% hydrogen, 5.72% nitrogen, 5.88% chlorine and the remainder of the oxygen, with an approximate theoretical molecular mass 1808, with ultraviolet absorption maximum in water at 280 nm at E = 44.7, with the following bands in the infrared absorption spectrum in potassium bromide: 3409 broad, 2934, 1730,1658, 1614, 1588, 1548, 1504 , 1498, 1490, 1426, 1290, 1231, 1210, 1179, 1121, 1061, 1031, 1017, 967, 903, 884 and 818 centimeters ^-1 , the antibiotic A-4696 factor Bg or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof , preferably in the form of a hydrochloride which is white, a crystalline substance soluble in water, solvents containing hydroxyl groups and polar solvents and insoluble in ether, chloroform, benzene, acetone, aliphatic hydrocarbons and chlorine hydrocarbons having an approximate composition of 51,84% carbon, 4,74% hydrogen, 5,83% nitrogen, 5,57% chlorine and oxygen content, with an approximate theoretical molecular weight of 1808, with an ultraviolet absorption maximum in water at 280 nm when E £ ^ ^m = 46.3, the following distinguishable bands in the infrared absorption spectrum when determined in KBr: 3394 broad, 2938, 1733, 1697, 1675, 1656, 1638, 1614, 1591, 1515, 1504, 1489, 1427, 1359, 1291, 1228, 1209, 1180, 1120, 1072, 1051, 1018, 985, 903, 882, 846 and 816 cm ^-1 , the antibiotic A-4696, factor C _1a, or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof, preferably in the form of the hydrochloride, which is a white crystalline substance soluble in water, solvents containing hydroxyl groups and polar solvents and insoluble in ether, chloroform, benzene, acetone, aliphatic hydrocarbons and chlorinated hydrocarbons having an approximate composition of 53.05% carbon,

4.74% hydrogen, 5.83% nitrogen, 5.39% chlorine and oxygen residue, with an approximate theoretical molecular weight of 1792, with an ultraviolet absorption maximum in water at 279 nm at E = 47.9 with the following bands in the infrared absorption spectrum in potassium bromide: 3380 wide, 2931, 1734, 1650, 1616, 1591, 1505, 1491, 1427, 1359, 1290, 1228, 1213, 1177, 1123, 1072, 1061, 1032, 1017, 987 , 903, 832, 814 and 715 cm ^-1 , antibiotic A-4696, factor C3 or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof, preferably in the form of a hydrochloride, which is a white, water-soluble crystalline substance, hydroxyl-containing solvents groups in polar solvents and insoluble in ether, chloroform, benzene, acetone, aliphatic hydrocarbons and chlorinated hydrocarbons and an approximate composition of 51.73% carbon, 4.69% hydrogen, 5.94% nitrogen, 6.02% chlorine and the remainder with an absorption maximum The ultraviolet water at 280 nm with E ¹ = 47.9 having the following absorption bands in its infrared spectrum in KBr: 3378 broad, 2925, 1728, 1689, 1658, 1637, 1616, 1589, 1579, 1573, 1546, 1536, 1529, 1523, 1503, 1489, 1474, 1457, 1425, 1421, 1397, 1387, 1286, 1231, 1206, 1121, 1075, 1062, 1028, 1012, 987, 965, 949, 878, 840, 816, 769 and 708 cm ^-1 , or the antibiotic A-4696, Factor Ei or a pharmaceutically acceptable acid addition salt thereof, preferably in the form of a hydrochloride which is white, a water-soluble crystalline substance, hydroxyl-containing solvents and polar solvents and insoluble in ether, chloroform, benzene, acetone, aliphatic and chlorinated hydrocarbons having an approximate composition of 50.71% carbon, 4.69% hydrogen, 5.94% nitrogen, 6.02% chlorine and the remainder of the oxygen, s absorption maximum in ultraviolet light in water at 279 nm at E ² = 39.9 s the following bands in the infrared absorption spectrum in potassium bromide: 3394 wide, 2933, 1657, 1636, 1610, 1589, 1538, 1511, 1505, 1453, 1424, 1393, 1369, 1328, 1320, 1291, 1232, 1212, 1178 , 1120, 1075, 1061, 1031, 1018, 986, 973, 904, 878, 847, 813, 770, 752, 738, and 714 cm ^-1 .