HU193213B - Process for preparing aad 216 antibiotic complex and main components thereof by means of fermentation of kibdelosporangium aridum - Google Patents

Process for preparing aad 216 antibiotic complex and main components thereof by means of fermentation of kibdelosporangium aridum Download PDF

Info

Publication number
HU193213B
HU193213B HU842726A HU272684A HU193213B HU 193213 B HU193213 B HU 193213B HU 842726 A HU842726 A HU 842726A HU 272684 A HU272684 A HU 272684A HU 193213 B HU193213 B HU 193213B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
aad
complex
water
acetonitrile
mixture
Prior art date
Application number
HU842726A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT39208A (en
Inventor
Betty A Bowie
David J Newman
Marcia C Shearer
Robert D Sitrin
Joseph R Valenta
Original Assignee
Smithkline Beckman Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Smithkline Beckman Corp filed Critical Smithkline Beckman Corp
Publication of HUT39208A publication Critical patent/HUT39208A/hu
Publication of HU193213B publication Critical patent/HU193213B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/04—Actinomyces

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás vankomicin-tí-’ pusú új antibiotikumok előállítására, valamint eljárás a hatóanyagként egy vagy több fenti antibiotikumot tartalmazó gyógyszerkészítmény, illetve állati takarmánykeverék előállítására.
A találmány szerinti eljárás értelmében az új antibiotikumot egy új baktériumtörzszsel, a Kibdelosporangium aridum gén. nov., sp. nov. SKandF - AAD 216-tal (ATCC 39323) fermentáljuk.
A találmány tárgya közelebbről eljárás a továbbiakban AAD 216 komplexnek nevezett antibiotikum előállítására, oly módon, hogy a K. aridumot asszimilálható nitrogén- és szénforrást tartalmazó vizes táptalajban tenyésztjük,merített tenyészetben, aerob körülmények között, míg a fenti mikroorganizmus jelentős mennyiségű AAD 216 komplexet termel, és az AAD 216 komplexet kívánt esetben kinyerjük a fermentléből.
Az AAD 216 komplexből kromatográfiás eljárással végzett elválasztással és izolálással előállíthatjuk a komplexet alkotó egyes biológiailag aktív új vegyületeket, az AAD 216A-t, AAD 216B-t és AAD 216C-t is. Az AAD 216 antibiotikum-komplexet, és biológiailag aktív fő komponensei, az AAD 216A, AAD 216B és AAD 216C is antibakteriális hatással rendelkeznek. Az AAD 216 komplexet, és az AAD 216A-t, AAD 216B-t és AAD 216C-t az állatgyógyászatban is használhatjuk, növekedést serkentő szerként, továbbá a szarvasmarha-masztitisz kezelésére.
Az új antibiotikumot, az AAD 216 komplexet és biológiailag aktív fő komponenseit, az AAD 216A-t, AAD 216B-t és AAD 216C-t egy új mikroorganizmus, a Kibdelosporangium aridum gén. nov., sp. nov. SKandF-AAD 216 fermentálásával állítjuk elő. A fenti mikroorganizmust egy arizonai, Pimá County-beli sivatagos területről begyűjtött talajmintából izoláltuk. A biológiailag tiszta mikroorganizmus tenyészetét az American Type Culture Collectionnál (Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) helyeztük letétbe, a törzs letéti száma ATCC 39323.
AAD 216 komplex alatt a K. aridum fermentálásával előállított antibiotikum-elegyet értjük. Szakemberek számára érthető módon az AAD 216 komplexben lévő egyes antibiotikum-komponensek aránya a fermentálási művelet körülményeitől függően változik. A fermentléből az AAD 216 komplexet úgy nyerhetjük ki, hogy a fermentlevet szűrjük, majd a nyers ÁAD 216 komplexet 0-l0°C-on hidrogén-kloriddal pH 3 értékre savanyítva kicsapjuk a szűrletből. A csapadékot ezután vízben oldjuk, a pH 6-8 érték beállításával, majd gyantaoszlopra visszük, ahonnan vizes metanollal eluáljuk. Az eluátumot liofilizáljuk, az így nyert ÁAD 216 komplexet kromatográfiás eljárással tisztítva dúsított AAD 216 komplexet kapunk. A dúsított AAD 216 komplex általában 40-85 sú)y%-ban tartalmazza az AAD 2I6A, AAD 216B és AAD 216C elegyét. 2
A dúsított AAD 216 komplex — amely analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiás meghatározás szerint 29 súty% AAD 216Á-t, 10 súly% AAD 216B-t és 10 súly% AAD 216C-t tartalmaz — pH 6 körüli értéken az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik:
a) halvány fehéres-sárgás szilárd anyag, amely 300-350°C-on bomlik;
b) közelítő elemi összetétele: 53,22% szén,
6,14% hidrogén, 3,73% nitrogén és 0,28% hamu;
c) KBr-ban felvett infravörös spektruma: vmax (cm-1): 3400, 2920, 1660, 1600, 1510,
1460, 1430, 1390, 1320, 1240, 1150, 1060 és 1020;
d) acetonitril-víz 1:1 arányú elegyben felvett ultraibolya spektruma semleges és savas körülmények között 280 nm-nél mutat abszorpciós csúcsot, E1?g=43',9; bázikus körülmények között az abszorpciós csúcs 301 nm-nél van, E)jj=56,8;
e) perjodáttal pozitív, ninhidrinnel negatív próbát ad;
f) vízben, metanolban, dimetil-szulfoxidban és dimetil-formaminban oldódik, etanolban, acetonitrilben, acetonban, dietil-éterben és alifás szénhidrogénekben nem oldódik.
Az egyes tiszta antibiotikum-komponenseket, az AAD 216A-t, AAD 216B-t és AAD 2l6C-t preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással izolálhatjuk az AAD 216 komplexből. Közelebbről, az AAD 216 komplexet lépcsőzetes gradiens-elúciós módszerrel kromatografáljuk, az eluálást 20—28% acetonitrilt tartalmazó 0,1 n foszfát-pufferrel (pH 6) végezzük. Az analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással kiválasztot megfelelő frakciókat egyesítjük, gyantaoszlopon sómentesítjük és liofilizáljuk. Tiszta AAD 216A, AAD 216B és AAD 216C antibiotikum-komponenseket kapunk a fenti műveletekkel.
A tiszta AAD 216A pH 6 körüli értéken az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik:
a) halvány sárgás-fehér szilárd anyag, 300350°C-on bomlik;
b) összegképlete C8|H82N8O30Cl4;
c) közelítő elemi összetétele: 48,20% szén,
5,01% hidrogén, 5,21% nitrogén, 6,43% klór, ként és szerves foszfort nem tartalmaz, a víztartalom 10,80%;
d) KBr-ban felvett infravörös spektruma: vmaí (cm1): 3400, 2920, 1660, 1600, 1510,
1460, 1430, 1390, 1320, 1300, 1240, 1150, 1060 és 1020;
e) tömegspektruma gyors atomokkal való bombázás mellett (FAB) 1787 (főcsoport) (M+H);
f) acetonitril-víz 1:1 arányú elegyében felvett ultraibolya spektruma neutrális és savas körülmények között 280 nm-nél mutat abszorpciós csúcsot, E,^ =51; bázikus kö.rülmények között az abszorpciós csúcs 301 nm-nél van, E,^ = 73;
-2193213
g) szén-mágneses rezonancia spektruma
90,56 MHz-en CD3OD- D2O (1:9) elegy ben PH 8,5-nél a következő kémiai eltolódásokat mutatja (ppm-ben) TMS standardhoz viszonyítva:
177,7, 177,5,
170.4, 170,2, Γ55.1, 155,0, 1.46,0, 144,3,
134.6, 134,5, 128,9, 128,6,
125.1, 122,7,
116.4, 110,5,
103.1, 100,7.
72,0, 71,6,
63.6, 62,3,
55,8, 54,9,
29.6, 29,5,
175.5, 174,6,
169.1, 161,8,
152.5, 151,9,
141.7, Γ38.8,
133.7, 130,8, 127,4, 127,0,
122.3, 120,9,
109.6, 108,3,
98.1, 78,4,
71.3, 70,7, ,61,6, 60,2,
37.2, 32,7,
26.2, 23,0,
171.5, 170,8,
158.6, 157,9,
151.6, 150,7,
138.3, 136,0,
129.8, 129,4,
126.2, 125,6,
119.6, 118,3,
104.2, 103,3,
74,4, 73,3,
67.3, 65,6,
56.8, 56,3,
32.2, 29,8, 14,5;
h) optikai forgatóképesség: [a]^5 — -66° (c = 0,3, víz);
i) perjodáttal pozitív, ninhidrinnel negatív reakciót ad;
j) vízben, metanolban, dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban oldódik, etanolban, acetonitrilben, dietil-éterben, alifás szénhidrogénekben, acetonban oldhatatlan;
k) pKa értékei acetonitril — víz 3:7 arányú elegyben: 3,0, 4,9, 7,4, 8,4, 10,0 és 10,3, a 10,3 feletti pKü értékeket nem határoztuk meg.
A tiszta AAD 216B pH 6 körüli értéken az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik:
a) halvány sárgás-fehér szilárd anyag, 300-350°C-on bomlik;
b) összegképlete: C82H84N8O30Cl4;
c) közelítő elemi összetétele: 49,67% szén, 5,07% hidrogén, 5,19% nitrogén, 6,70% klór, ként és szerves foszfort nem tartalmaz, a víztartalma 10,8%;
d) KBr-ban felvett infravörös spektruma: Vmax (cm-1): 3400, 2920, 1660, 1600, 1510,
1460, 1430, 1390, 1300, 1240, 1150, 1060 és 1020;
e) tömegspektruma gyors atomokkal való bombázás mellett (FAB) 1801 (főcsoport) (M+H);
f) acetonitril — víz 1:1 arányú elegyben felvett ultraibolya spektruma neutrális és savas körülmények között 280 nm-nél mutat abszorpciós csúcsot, E,y = 55; bázikus körülmények között az abszorpciós csúcs 301 nm-nél van, Ε,γβ = 72,5;
g) szén-mágneses rezonancia spektruma
90,56 MHz-en CD3OD—D2O 1:9 arányú elegyben pH 8,5 értéken a következő kémiai eltolódásokat mutatja (ppm-ben) TMS standardhoz viszonyítva:
177,9, 177,4, 175,6, 174,4,
170,4, 169,3, 162,4, 158,7,
152.6, 151,3, 150,7, 146,0,
138.3, 136,1, 134,7, 133,6,
129.4, 129,0, 128,7, 127,7,
125.7, 124,7, 122,8, 122,3,
118.4, 116,7, 110,5, 109,6, 103,1, 100,6, 98,1, 78,5, 7171.6, 170,9, 170,5,
158,1, 155,2, 155,0, 60
144,3, 141,3, 138,8,
130.7, 129,9, 129,8,
127.5, 127,0, 126,3,
120,9, 119,9, 119,6,
108.5, 104,2, 103,3, __
1,4, 73,9, 73,4, 72,1, b5
j)
k)
71.7, 71,2, 70,8, 67,3, 65,5, 63,7, 62,3, 61,6, 60,3,
56.8, 56,2, 55,9, 55,0, 39,6, 37,3, 32,7, 30,2, 30,0, 29,7, 28,4, 27,8, 26,3, 23,3;
h) optikai forgatóképessége [a]= -59° (c = 1,0, víz);
i) perjodáttal pozitív, ninhidrinnel negatív reakciót ad;
j) vízben, metanolban, dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban oldódik, etanolban, acetonitrilben, acetonban, dietil-éterben és alifás szénhidrogénekben oldhatatlan;
k) pKa értékei acetonitril-víz 3:7 arányú elegyben: 3,0, 4,5, 7,5, 8,5 és 9,7 a 9,7 feletti pKa értékeket nem határoztuk meg.
az
a)
b)
c)
d)
f)
g)
A tiszta AAD 216C pH 6 körüli értéken alábbi tulajdonságokkal rendelkezik: halvány sárgás-fehér szilárd anyag, 300350°C-on bomlik;
összegképlete: C83H86N8O30Cl4; közelítő elemi összetétele: 47,89% szén, 5,09% hidrogén, 4,95% nitrogén, 6,39% klór, 3,69% hamu, ként és szerves foszfort nem tartalmaz, a víztartalom 8,2%; KBr-ban felvett infravörös spektruma:
2920, 1660, 1600, 1505, 1390, 1295, 1240, 1150, 1020;
gyors
Vtnax (CITl
3400 1430,
1060, tömegspektruma bombázás mellett (FAB) (M+H);
acetonitril-víz 1:1 arányú elegyben felvett ultraibolya spektruma neutrális és savas körülmények között 280 nm-nél mutat abszorpciós csúcsot, E,% =51; bázikus körülmények között az abszorpciós csúcs 301 nm-nél van, E,^ = 75;
szén-mágneses rezonancia spektruma
90,56 MHz-en CD3OD—D2O 1:9 arányú elegyben pH 8,5 értéken a következő kémiai eltolódásokat mutatja (ppm-ben) TMS standardhoz viszonyítva:
177.9, 177,2, 175,7, 173,6, 171,5,
170,6, 170,2, 169,3, 158,6, 157,8,
154.9, 152,7, 151,9, 150,9, 146,0,
141,3, 138,8, 138,4, 136,0, 134,9, atomokkal való 1815 (fő csoport)
170,8,
155.2,
144.3,
134.7, 129,1,
122.7,
109.6,
78.6,
60.3,
37.4, 29,9,
h)
133.8, 130,8, 129,9, 129,8, 129,3,
127,7, 127,5, 127,0, 126,4, 125,3,
121,0, 119,7, 118,3, 116,1, 110,4,
108.1, 104,1, 103,2, 101,5, 98,0.
74.6, 65,1, 63,7, 62,5, 61,6,
56.8, 56,3, 55,3, 54,9, 39,7,
32.6, 32,3, 30,5, 30,4, 30,2,
28.6, 28,1, 26,4, 23,4, 22,0.
optikai forgatóképessége [«|d =-50,6° (c = 0,6, víz);
perjodáttal pozitív, ninhidrinnel negatív reakciót ad;
vízben, metanolban, dimetil-szulfoxidban, dimetil-íormamidban oldódik, etanolban, acetonitrilben, acetonban, dietil-éterben és alifás szénhidrogénekben oldhatatlan; pK0 értékei acetonitril-víz 3:7 arányú elegyben: 3,0, 4,2, 7,2, 8,2, 9,9 és 10,3, a 10,3 feletti pKa értékeket nem határoztuk meg.
-3193213
Az AÁD 216 komplex, és komponensei, az AAD 216A, AAD 216B és AAD 216C újdonságát a vankomicin-risztocetin antibiotikum-osztály ismert tagjaival végzett összehasonlítás alapján határoztuk meg. Közelebbről, a Eb subtilissel biológiailag előhívott vékonyréteg-kromatográfiás R/ értékeket határoztuk meg, ismert antibiotikumokkal összehasonlítva. Az eredményeket az I. táblázatban adjuk meg.
I. táblázat: AAD 216A, AAD 216B és AAD 216C vékonyréteg-kromatográfiás R/ értéke különböző futtatóelegyek esetén, ismert antibiotikumokkal összehasonlítva
R^ érték’
Antibiotikum . T
A-35512B 0,14
A-477 0,51
Aktap1anín 0,16
Aktínoidin A ésB 0,04 0,24
Avoparcin 0,15
LL-AM-374 0,08
Risztocetin 0,1
Teichomicin 0,34
Vankomicin 0,17
AAD 216A 0,35
AAD 21 6B 0,38
AAD 216C 0,44
': Avicel rétegen, előhívás: B. subtilis elleni hatás alapján, a fő komponens R/ értéke aláhúzva
A:n-butanol—ecetsav—víz (4:1:5) C:n-propanol—víz (6:4)
B:n-propanol- petroléter- cc. ammónium-hidroxid (4:1:2)
Az AAD 216A, AAD 216B és AAD 216C fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással meghatározott retenciós idejét is összehasonlítottuk az ismert antibiotikumokéval. Mint a II. táblázat eredményeiből látható, a retenciós idők is különböznek az ismert antibiotikumok retenciós idejétől.
II. táblázat
Antibiotikum Retenciós A rendiét) szer idő (perc) B rendeb) szer
1 2 3
AAD 216A 15,3 14,5
AAD 216B 15,9 15,2
AAD 216C 17,2 16,1
A-35512B 5,2* 6,1*
A-477 11,7* 8,9*
Aktaplanin 6,3* 7,5*
Aktinoidin A és B 5,5* 8,1*
Avoparcin 5,8* 7,6*
LL-AM-374 5,1* 6,8*
0,25 0 0,15
0,30 0
0,40 0,20
0,06 0,67 0,78 0,11
0,18 0,05
0,43 0,13 0,07
0,17 0,05
0 0,04
0,10 0,12 0,77
033 0,47 0 0,1
0,35 0,6
0,33 0,83
0,35 0,83
0,34 0,82
II. Táblázat folytatása
1 2 3
Risztocetin 3,6 5,4
Teichomicin A-2 13,6 13,8*
Vankomicin 6,0 7,4
// többkomponensű elegy fo komponense (cl) nagynyomású folyadékkromatográfiás rendszer: oszlop: Ultrasphere ODS, 5 mikron, 4,6*150 mm oldószer: 7—35% acetonitril (7% az 1. perc50 ben, majd 13 perc alatt 34%-ra növeljük, és utána 34%-on tartjuk) 0,1 mól/l-es foszfát-pufferben (pH
3,2) átfolyási sebesség: 1,5 ml/perc 55 detektálás: UV-abszorpció 220 nm-en (b) nagynyomású folyadékkromatográfiás rendszer:
oszlop: Ultrasphere ODS, 5 mikron, 4,6 x x 150 mm oldószer: 5-35% acetonitril (1. percben 5%, majd 13 perc alatt 35%ra növeljük, és utána 35%-on tartjuk) 0,025 mól/l-es foszfát-puíferben (pH 6,0) gg átfolyási sebesség: 1,5 ml/perc detektálás: UV-abszorpció 220 nm-en.
-4193213
Az AAD 216A-Í, AAD 216B-t és AAD 216C-t külön-külön 6 n sósavoldattal 18 órán át visszafolyató hütő alatti forralással teljesen elhidrolizálva nem kapunk természetes aminosavat, standard aminosav-analízissel kimutatható mennyiségben. A vankomicin-csoportba tartozó antibiotikumokban szokásosan előforduló áktinoidinsav jelenlétét a hidrolízistermékek nagynyomású folyadékkromatográfiás és FAB tömegspektrometriás elemzésével mutattuk ki, autentikus mintával összehasonlítva. Az AAD 216A, AAD 216B és AAD 216C 1 n sósavoldatban 4 óra alatt, visszafolyató hűtő alatti forralással kapott hidrolizátumában mannózt találtunk, míg risztózamint, glükózamint vagy vankózamint nem tadtunk kimutatni.
A Kibdelosporangium aridum SKandFAAD 216 (ATCC 39323) törzset híg burgonyás-sárgarépás vagy zablisz-agaron tartjuk fenn. A morfológiai vizsgálatokat vizes agar-lemezen, híg burgonyás-sárgarépás agar-lemezen, zabliszt-agar-lemezen vagy talaj-extraktum-agar-lemezen végezzük. A biokémiai és fiziológiai vizsgálatok céljára az alábbiak szerint készítünk inokulumot: csőben lévő lefagyasztott élő tenyészetet glükóz-élesztőkivonat táptalajt tartalmazó lombikba viszszük, majd rotációs rázógépre helyezve 28°C-on 250 fordulat/perc sebességgel 3-6 napon át rázatjuk. A tenyészetet centrifugáljuk, és steril desztillált vízzel háromszor mossuk. A biokémiai és fiziológiai vizsgálatok során az inkubálást 28°C-on végezzük. A szilárd táptalajokon végzett vizsgálatok eredményeit különböző időpontokban, a 21. napig olvassuk, le. A folyékony táptalajokkal végzett vizsgálatok eredményeit különböző időpontokban, egészen a 28. rfapig olvassuk le. Azonban a karbamid, allantoin és hippurát lebontási vizsgálatakor, valamint a nitrátok redukciójának vizsgálatánál 6 héten át olvassuk le az eredményeket.
A K- aridum különböző antibiotikumokkal szembeni érzékenységét úgy határozzuk meg, hogy K. aridum tenyészettel felülrétegezett táptalaj agar-lemezre helyezzük a különböző antibiotikumokkal átitatott korongokat (BBL érzékenységi korong).
A K. aridum morfológiailag a fonalas mikroorganizmusok közé tartozik, amely kétféle differenciálódásra képes micél'iimokat képez:
1) szubsztrát micéliumot, amely a táptalaj agarba behatolva az agar felületén tömör réteget képez, vagy
2) lég-micéliumot, amely konidium-láncokat és/vagy sporangium-szerű szerkezeteket hordoz. A lég- vagy szubsztrát micéliumokban nem észlelhetők mozgásra képes elemek. Sok tápközeg esetén a K. aridum jellegzetes kristályokat képez az agarban.
A K. aridum jól fejlett szubsztrát micéliumokat termel, amelyek rendellenesség nélkül fragmentálódhatnak. A hosszú, elágazó hifák válaszfalasak, és 0,4-1,0 pm átmérőjűek. A szubsztrát micéliumon közös szárból szerteágazó, villásan elágazó, válaszfalas híjákból álló specializálódott szerkezetek találhatók.
A K- aridum lég-micéliuma pálcika alakú, simafalú spórákból álló, változó hosszúságú láncokat termel (0,4 pm x 0,8-2,8 pm). A spóraláncok rendszerint igen hosszúak, több, mint 50 spórából állnak, de néhány rövid, legfeljebb 10 spórából álló lánc is rendszerint jelen van. A spóraláncok a csúcson, vagy rövid oldalláncokon képződhetnek.
A legtöbb táptalajon a K. aridum lég-micéliuma sporangium-szerű szerkezeteket is képez. Ezek a csúcson, vagy rövid oldalláncokon képződhetnek. Ugyanazon a lég-hifán képződhet sporangium-szerű szerkezet és spóralánc is. A fenti érett sporangium-szerű szerkezetek kerek, kb. 9-22 pm átmérőjű képződmények, amelyek jól definált fallal körülvett amorf mátrixba ágyazott válaszfalas, elágazó hifákból állnak. Ha a sporangium-szerű testeket agarra helyezzük, azok egy vagy több csiracsövet eresztve közvetlenül sarjadzanak.
K. aridum kemotaxonomiája .
A K. aridum tisztított sejtfal-preparátuma Becker [Appl. Microbiol. 12, 421-423 (1964)] módszere szerint elemezve a 2,6-diamino-pimelinsav mezo-izomerjét, alanint, glutaminsavat, glükózamint és murámsavat, valamint galaktózt, és igen kis mennyiségben arabinózt tartalmaz. A Leshevalier [J. Láb. Clin. Med. 71, 934-944 (1968)] módszere szerint analizált teljes sejt hidrolizátum galaktózt, glükózt, mannózt, ribózt, ramnózt és arabinózt tartalmaz; maduróz is jelen lehet, nyomnyi mennyiségben. A lipidtartalom szempontjából analizált sejt-extraktumokban semmilyen típusú mikolsav nem található, Lechevalier és munkatársai [Can. J. Microbiol. 19, 965-972 (1973)] módszere szerint végezve a vizsgálatot. A foszfolipidek közül foszfatidil-etanolamin, foszfatidil-metil-etanolamin, diíoszíatidil-glicerol, foszf atidil-inozitol és foszíatidil-inozitol-mannozidok vannak jelen. A fentiek szerint a K. aridum IV. típusú sejtfallal rendelkezik, A típusú teljes cukor-öszszetétellel, maduróz nyomokkal [Lechevalier és munkatársai: Int. J. Syst. Bacteríol. 20, 435-443 (1970) ], és PH típusú foszíolipid-öszszetétellel, foszfatidil - metil - etanolaminnal (Lechevalier és munkatársai: Biochem. System. Ecol. 5, 249-260 (1977)].
K. aridum fiziológiai és biokémiai jellemzői
A K. aridum Gram-pozitív, nem savállóan festődő mikroorganizmus. Anaerob körülmények között nem szaporodik. 15 és 42°C közötti hőmérséklettartományban szaporodik, kis mértékben 45°C-on is nő. A szaporodás 10°C-on esetleges. 50°C-on egyáltalán nem szaporodik. Hidrogén-szulfidot termel. A tejet peptonizálja. A zselatint hidrolizálja és befoiyósítja. A nitrátot nem redukálja nitritté. A ka5
-5193213 zeint, L-tirozint, hipoxantint, guanint, elasztint és tesztoszteront hidrolizálja, de az adenint, xantint és cellulózt (Avicel) nem. Katalázt és foszfatázt termel. A karbamidot, eszkulint és hippurátot bontja; az allantoin-bontási kísérletek gyengén pozitívak. 8%-os nátrium-klorid-oldatban nem szaporodik; a szaporodás 5-7%-os nátrium-klorid-oldatban esetleges. Lizozimes táptalajban nem szaporodik. L-arabinózból, D-cellobiózból, dextrinből, dextrózból, D-fruktózból, glicerinből, glikogénből,D-galaktózból, i-inozitolból, laktózból, D-mannitolból, D-mannózból, a-metil-D-glükozidból, a-metil-D-mannozidból, melibiózból, D-melezitózból, raffinózból, ramnózból, D-ribózból, szacharózból, trehalózból, D-xilózból és maltózból savat termel. Dulcitból, i-eritritból, inulinból, D-szorbitból vagy L-szorbózból nem termel savat. A citrátot, malátot, szukcinátot, oxalátot, laktatót, acetátot, piruvátot, propionátot és formiátot felhasználja; a benzoátot és tartarátot nem.
A K. aridum antibiotikumokkal szembeni érzékenysége
Diffúziós módszerrel meghatározva a Karidum rezisztensnek mutatkozik a 10 pm gentamicinnel, 10 pg tobramicinnel, 10 pg streptomicinnel 30 pg vankomicinnel, 10 egység penicilinnel, 2 egység bacitracinnal, 2 pg linkomicinnel, 2 pg klindamicinnel, és 30 pg cefalotinnal átitatott korong alkalmazása esetén 5 pg klórtetraciklin 18 mm-es gátlózónát; 5 pg tetraciklin 11-12 mm-es gátlózónát; 5 pg rifampin 11-15 mm-es gátlózónát; 5 pg novobiocin 27-28 mm-es gátlózónát eredményez. Minden gátlózóna esetén található néhány rezisztens telep.
K. aridum jellemzői különböző táptalajokon tenyésztve
Minden tenyészetet 28°C-on inkubálunk, zárt Petri csészében, és 21 napon át tartjuk megfigyelés alatt. A tenyészetek színét vagy az ISCC-NSB Centroid Color Charts színeivel, vagy a Dictionary of Color [Maerz A. és Paul M.R. 2. kiadás, New York, McGraw Hill Book Go., Inc. (1950)] színmintáival összehasonlítva adjuk meg.
Élesztőkivonat-malátakivonat agar: kiváló növekedés; a vegetatív tenyészet szürkés sárga-barna; lég-micélium igen ritka, fehér, spóraláncokkal vagy anélkül és sporangium-szerü testekkel; nincs oldódó pigment; az agarban jellegzetes kristályok láthatók.
Zabliszt-agar: jó növekedés; vegetatív tenyészet piszkos fehértől sárgás-barnáig; légmicélium ritka, fehér, sok spóralánccal és sporangium-szerű testekkel; nincs oldódó festék; az agarban jellegzetes kristályok vannak.
Glicerin-aszparagin-agar: közepes — jó növekedés; a vegetatív tenyészet halvány sárga-barna; ritka — mérsékelt lég-micélium, fehér, nehány spóralánccal és néhány sporangium-szerű testtel vagy anélkül;
halvány szürkés, sárgás-barna oldódó pigment; agarban jellegzetes kristályok vannak.
Szervetlen só-keményítő-agar: jó növekedés; a vegetatív tenyészet piszkos fehér sárgás-barna; kevés, fehér lég-micélium, spóraláncokkal és sporangium-szerű testekkel; nincs oldódó pigment; az agarban jellegzetes kristályok vannak.
Czapek-féle szacharóz-agar: jó növekedés; a vegetatív tenyészet piszkos fehér — sárgás-barna színű; ritka, fehér lég-micélium, spóraláncok és sporangium-szerű testek vannak; halvány szürkés sárga — halvány sárgás-barna oldható pigment; az agarban. jellegzetes kristályok vannak.
Bennet-féle agar:jó—kiváló növekedés; a vegetatív tenyészet szürkés sárgás-barna; ritka, vagy semmi légmicélium, fehér, spóraláncok és sporangium-szerű testek jelen vannak; sárgás-barna oldható pigment; az agarban nincs kristály.
Nutrient agar: közepes — jó növekedés; a vegetatív tenyészet sárgás-barna; ritka — mérsékelt lég-micélium, fehér, kevés spóralánc és kevés sporangium-szerű test van jelen; sárgás-barna oldható pigment; az agarban a jellegzetes kristályok változóan vannak jelen.
Híg burgonyás-sárgarépás-agar: közepes növekedés, viszonylag egyenletes; a vegetatív tenyészet piszkos fehér — sárgás-barna; ritka — mérsékelt, fehér lég-micélium, számos spóralánccal és sporangium-szerű testtel; nincs oldódó pigment; az agarban nincs kristály.
Pepton-élesztőkivonat-vas-agar: jó növekedés; a vegetatív tenyészet bronzbarna (Maerz és Paul 16C9); nincs légmicélium; sötétbarna oldódó pigment; nincs kristály az agarban.
Keményítő-kazein-nitrát-agar: jó növekedés; a vegetatív micélium piszkosfehér — sárgás-barna; ritka, fehér légmicélium, spóraláncokkal és sporangium-szerű testekkel; az agarban jellegzetes kristályok vannak.
Élesztőkivonat-glükóz-agar: jó — kiváló növekedés; a vegetatív tenyészet sötét sárgás-barna-szürkés sárgás-barna; lég-micélium nem látható 400 x nagyítás alatt; kevés spóralánc van, de sporangium-szerü test nincs; sötét sárgás barna oldható pigment; az agarban jellegzetes kristályok vannak.
A K. aridum jellemzőit a Bergey-féle Manual of Determinative Bacteriology-ban, vagy az Approved List of Bacterial Names irodalmi helyen vagy más ismert taxonómiai irodalmi helyen az actinomycetesre leírt jellemzőkkel összehasonlítva megállapíthatjuk, hogy a K. aridum jelentősen eltér az actinomycetacea-k korábban leírt specieseitől, és nem lehet beilleszteni az actinomycetaceae-k egyetlen korábban ismert genusában sem. A sporangíumok, ha egyáltalán jelen vannak is más acti-6193213 nomycetaceae nemzetségekben, valódi spórazsákocskák, amelyek érett állapotban aplanospórákat vagy zoospórákat tartalmaznak, amely spórák a sporangium falának feloldódásakor vagy elroncsolódásakor kiszabadul- 5 nak. Számos kísérlet és beható megfigyelés ellenére sem sikerült soha észlelni ezzel szemben azt, hogy a K- aridum sporangium-szerű szerkezeteiből spórák váltak volna szabaddá. Ha a sporangium-szerű testeket agarra he- 10 lyezzük, azok egy vagy több csíracsövet eresztve közvetlenül sarjadzanak.
A leírásban jellemzett ATCC 39323 törzset tehát egy új nemzetség, a Kibdelosporan- 15 gium egy fajának tekintjük (a név a görög kibdelos = hamis, megtévesztő; a görög spóra = csíra és a görög angium — edény szóból származik), a fajjelölő szó, azaridum (aridus, latin szó, jelentése száraz) a sivatagos ta- 20 lajra utal, ahonnan a mikroorganizmust izoláltuk.
Az AAD 216 komplexet a találmány értelmében úgy állítjuk elő, hogy egy Kibdelos- ^5 porangium törzset — amely az ATCC 39323 törzs jellemzőivel rendelkezik, vagy annak egy aktív mutánsát/vagy származékát, melyet önmagában ismert módon állíthatunk elő — merített tenyészetben aerob körülmények között 30 vizes táptalajban tenyésztjük. A mikroorganizmus asszimilálható szénforrást, például asszimilálható szénhidrátot tartalmazó tápközegben tenyészthető. Szénforrásként használhatunk például szacharózt, laktózt, mai- 35 tózt, mannózt, fruktózt, glükózt, és oldódó keményítőt. A táptalajnak egy asszimilálható nitrogénforrást is tartalmaznia kell, például hallisztet, peptont, szójabab-lisztet, földimogyoró-lisztet, gyapotmag-lisztet vagy kukori- 4C calekvárt. A mikroorganizmus szaporodásához szükséges szervetlen sókat is biztosítanunk kell a táptalajban. Szervetlen sóként bármely olyan sót használhatunk, amely nátrium-, kálium-, ammónium-, kalcium-, fősz- 45 fát-, szulfát-, klorid-, bromid-, nitrát-, karbonát- és egyéb hasonló ionokat képes szolgáltatni.
Az AAD 216 komplex előállítását olyan hőmérsékleten kell végezni, amelyen a mikroorganizmus megfelelő mértékben képes szaporodni, például 15 és 42°C közötti hőmérséklettartományban. A fermentálást célszerűen 25 és 28°C között végezzük.
A tápközeg rendszerint semleges kémhatású, a pH értéke 5,0 és 9,0 között változhat, az éppen használt táptalajtól függően.
A fermentálást . Erlenmeyer-lombikban, vagy laboratóriumi illetve ipari fermentorban végezhetjük, különböző térfogatokban. Abban az esetben, ha tartályban végezzük a fermentálást, először előnyösen valamilyen táptalajban vegetatív inokulumot készítünk, oly módon, hogy kis térfogatnyi táptalajt beoltunk az organizmus élő sejtjeivel. A fenti módon kapott inokulumot aszeptikus körülmények között bevisszük a tartály-fermentorba, ahol azután az antibiotikumot ipari méretben állítjuk elő. Az inokulum előállítására ugyanazt a táptalajt használhatjuk, mirtt amelyben a nagyobb léptékű fermentálást végezzük, de használhatunk attól eltérő táptalajt is.
A táptalajon steril levegőt buborékoltatunk keresztül, mint az az aerob merített tenyészetek esetén általában szokásos. A keverést a fermentációs iparban általában használt keverőkkel biztosítjuk.
Általában az AAD 216 komplex optimális termelését 144-186 óra inkubálással érhetjük el, keverős-üveg vagy tartály-fermentorban. A fermentáció lefolyását analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással követhetjük nyomon.
A fenti módon kapott AAD 216 komplexben lévő új bioaktív komponensek vagy egyes antibiotikumok, az AAD 216A, AAD 216B és AAD 216C a fentebb már ismertetett módon izolálhatok.
Az AAD 216 komplex, a dúsított AAD 216 komplex, az AAD 216A, AAD 2l6B, AAD 216C és vankomicin in vitro minimális gátlási koncentrációját számos mikroorganizmus esetén meghatározzuk, a szokásos mikrotiter eljárással. Az eredményeket az A-E. táblázatokban adjuk meg.
A. táblázat: Antibakteriális hatásspektrum
Mikroorganizmus Minimális gátlási koncentráció ( /ig/ml)
AAD 216 komplex AAD 216 A AAD 216 B AAD 216 C Vanko- micin
Staph. aureus HH127 3,1 1 ,6
6,3 3,1 1,6
Staph aureus SKandF 12,5 3,1 3,1 3,1 1 ,6
910
Strep. faecalis 1,6 0,4 0,4 0,8 3,1
HH34358
Proteus mirabilis >100,0 >100,0 >100,0 > 11 00,0 100,0
SRandF 444
-7193213
A. Táblázat folytatása
Mikroorganizmus Minimális gátlási koncentráció (/íg/ml)
AAD z^AD 216 A AAD AAD 216 216 B C Vanko- micin
216
komplex
E.coli 12140 (SKandF 809) >100,0 >100,0 >100,0 >100,0 100,0
KI eb. pneumoniae 4200 (SKandF 798) >100,0 >100,0 >100,0 >100,0 >100,0
Pseudomonas aeruginosa HH63 >100,0 >100,0 >100,0 >100,0 >100,0
Serratia marcescens ATCC 13880 > 100,0 >100,0 >100,0 > 100,0 >100,0
Proteus morgani SRan,dF 179 > 100,0 > 100,0 >100,0 >100,0 >100,0
Providencia SKandF 276 > 100,0 > 100,0 >100,0 >100,0 >100,0
Enterobacter cloacae HH31254 >100,0 >100,0 >100,0 >100,0 >100,0
Salmonella gallinarum BC595 >100,0 >100,0 >100,0 >100,0 > 25,0
Staph. epidermidis SKandF 2479 25,0 6,3 6,3 6,3 1,6
Listeria monocytogenes SKandF 2255 3,1 0,8 0,4 0,4 1 ,6
Staph. epidermidis 100,0 50,0 25,0 25,0 1 ,6
SKandF 651
B. táblázat: Meticillin-érzékeny törzsekre kifejtett hatás
Mikroorganizmus Minimális gátlási koncentráció ( Aig/ml)
AAD AAD 216 216 komplex A AAD 216 B AAD 216 C Vankomi- cin
Staph. aureus HH127 12,5 1,6-3,1 3,1 3,1 1,6
Staph. aureus SKandF 674 12,5 3,1-6,3 6,3 12,5 1,6
Staph. aureus SKandF 910 12,5 3,1 6,3 6,3 1,6
Staph. aureus SRandF 1761 12,5 3,1 3,1 3,1 1 ,6
Staph. aureus SKandF 2593 25,0 6,3 6,3 6,3 1 ,6
Staph. aureus SKandF 2666 12,5 3,1 3,1 6,3 1 ,6
Staph. aureus SKandF 2677 25,0 6,3 3,1 6,3 1 ,6
Staph. aureus SKandF 2678 25,0 6,3 6,3 6,3 1 ,6
Staph. aureus SKandF 2680 12,5 3,1-6,3 6,3 6,3 1,6
Staph. aureus 25,0 3,1-6,3 6,3 3,1 1,6
SKandF 2682
-8193213
B.'Táblázat folytatása
Mikroorganizmus Minimális gátlási koncentráció (yug/ml)
AAD AAD 216 216 komplex A AAD 216 B AAD 216 C Vankomicin
Staph. aureus SKandF 2736 25,0 3,1-6,3 6,3 6,3 1,6
Staph. aureus SKandF 2776 50,0 12,5 6,3 12,5 1 ,6
Staph. aureus SKand 2777 12,5 3,1 3,1 3,1 0,8
Staph. aureus SKandF 2613 6,3 1,6 1,6 1,6 1,6
Staph. aureus SKandF 2615 12,5 3,1-6,3 6,3 6,3 3,1
C. táblázat: Meticillin-rezisztens törzsekre kifejtett hatás
Mikroorganizmus Minimális gátlási koncentráció (/Ug/ml)
AAD AAD AAD AAD Vankomi-
216 216 216 216 cin
komplex A B C
Staph. aureus 50,0 12,5 6,3 12,5 1,6
SKandF 675
Staph. aureus 12,5 6,3 3,1 6,3 1 ,6
SKandF 2612 *
Staph. aureus 6,3 3,1 3,1 3,1 1,6
SKandF 2614
Staph. aureus 25,0 6,3-12,5 6,3 0,8
SKandF 2616
Staph. aureus 25,0 6,3 12,5 12,5 3,1
SKandF 2620
Staph. aureus 25,0 6,3 6,3 6,3 1 ,6
SKandF 2621
Staph. aureus 25,0 6,3-12,5 6,3 6,3 1 ,6
SKandF 2594
Staph. aureus 25,0 6,3-12,5 6,3 6,3 1 ,6
SKandF 2589 -
Staph. aureus 25,0 6,3-12,5 3,1 6,3 1,6
SKandF 2590
Staph. aureus 25,0 6,3 6,3 6,3 1,6
SKandF 2591
Staph. aureus 50,0 6,3 12,5 12,5 3,1
SKandF 2592
Staph. aureus 25,0 6,3-12,5 6,3 6,3 1,6
SKandF 2595
Staph. aureus 25,0 6,3-·2,5 6,3 6,3 3,1
SKandF 2596
Staph. aureus 25,0 6,3-12,5 6,3 12,5 3,1
SKandF 2597
-9193213
D. táblázat: Anaerob törzsekre kifejtett hatás
Minimális gátlási koncentráció (^ug/ml) Mikroorganizmus ----------------------------------------
AAD 216 komplex AAD 216 A AAD 216 B AAD 216 C Vankomi- cin
Bacteroides fragilis ATCC 25285 >32 32 32 32 32
B. fragilis H145 > 32 '6 16 8 32
B. fragilis SKandF 3060 > 32 32 16 16 32
B. loeochii SKandF 3087 > 32 8-16 16 4 32
B. thetaiotamicron SKandF 3089 > 32 32 32 32 32
Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 > 32 32 32 32 32
Clostridium perfringens MCP-1 0,016 < 0,016 0,125 ¢0,016 0,5
C. perfringens MCP-2 < 0,016 4 0,016 0,125 íí 0,016 0,5
C. perfringens ATCC 19408 0,25 0,031-0, 063 0,125 0,125 1,0
Clostridium difficile SKandF 3062 1,0 0,25 0,25 0,5 2
C. difficile SKandF 3065 1,0 0,5 0,25 0,5 4
C. difficile SKandF 3091 έ0,016 0,125-0, 25 0,25 0,031 2
C. difficile SKandF 3092 1,0 0,125 0,25 0^25 2
C. difficile SKandF 3096 1,0 0,25 2 0,25 2
C. difficile SKandF 3098 έ0,016 í 0,016 2 0,031 2
E. táblázat: Antibakteriális hatásspektrum
Mikroorganizmus Minimális gátlási koncentráció (/Ug/ml)
Dúsított AAD 216 komplex AAD 216 A Vankomicin
Staph. aureus HH127 6,3 6,3 3,1
Staph. aureus SKandF 910 6,3 6,3 3,1
Staph. aureus 209P 1,6 1 ,6 1,6
Staph. aureus 209P-mutáns 100 100 >100
Staph. aureus SKandF 674 6,3 3,1 1,6
-10193213
20
E. Táblázat folytatása
Mikroorganizmus Minimális gátlási konctntráció (/ig/ml)
Dúsított AAD 216 komplex AAD Vankomicin 216 A
Staph. aureus SKandF-674-P6- -mutáns ~100 ~100 >100
Staph. aureus SKandF 675 12,5 12,5 3,1
Staph. epidermidis SKandF 2479 25 25 6,3
Staph. epidermidis SKandF 2683 100 100 6,3
Staph. epidermidis SKandF 651 100 100 6,3
Staph. epidermidis SKandF 2265 100 100 6,3
Strep. faecalis HH 34358 0,4 1,6 6,3
Strep. faecalis SKandF 657 Listeria monocyto- 0,4 0,8 3,1
genes SKandF 2255 0,8 1,6 3,1
E. coli 12140 (SKandF 809) Salmonella gallina- >M00 >100 >100
rum BC595 > 100 >100 > 100
Az AAD 216A, AAD 216B, AAD 216C és vankomicin in vivő hatását s.c. kezelés esetén 46,8 LD50 dózisú Staph. aureus HH127-tel (LD50; az állatok 50%-ának pusztulását oko- 40 zó baktériumszámot jelenti) intraperitoneálisan fertőzött egéren határoztuk meg. Az állatokat a fertőzés utáni l. és 5 órában kezeltük az antibiotikumokkal. Az ED50 értékek a következők: 45
AAD 216A 5,0 mg/kg
AAD 216B 5,0 mg/kg
AAD 216C 7,5 mg/kg
vankomicin 1,76 mg/kg.
A találmány szerinti eljárással előállított
antibiotikumok, az AAD 216 komplex, és fő biológiailag aktív komponensei, az AAD 216A,
AAD 216B és AAD 216C antibakteriális hatással rendelkeznek. A találmány tárgykörébe tartozik tehát a hatóanyagként legalább egy fenti 55 antibakteriális hatású vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására vonatkozó eljárás is. A gyógyászati készítmények egyéb — nem szinergista hatású — antibakteriális hatóanyagot is tartalmazhatnak. A go gyógyszerkészítmények az alkalmazás módjától függően különböző gyógyszerformákká formálhatók. Orális alkalmazása céljára szilárd gyógyszerkészítményként például tablettákat, kapszulákat, pirulákat, porokat és θ,granulákat; folyékony készítményként például oldatokat, szuszpenziókat, szirupokat és elixireket; parenterális alkalmazásra például steril oldatokat, szuszpenziókat és emulziókat készíthetünk.
A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítményeket antibakteriális szerként használva úgy adagoljuk, hogy a hatóanyag koncentrációja nagyobb legyen, mint az adott baktérium leküzdésére alkalmas minimális gátlási koncentráció.
Az AAD 216 komplex, és komponensei, az AAD 216A, AAD 216B és AAD 216C hatását in vitro 58 szarvasmarha-masztitis-izolátumon is meghatároztuk, a szokásos agarhigításos vizsgálattal mérve a minimális gátlási koncentrációkat; A minimális gátlási koncentrációk a következők:
AAD 216 komplex 0,25 - 128
AAD 216A 0,13 — 128
AAD 216B 0,06 — 128
AAD 216C 0,06 — 128
vankomicin 0,25 — 128
pg/ml pg/ml pg/ml pg/ml pg/ml.
Az AAD 216 komplex és komponensei, az AAD 216A, AAD 216B és AAD 216C növekedésserkentő hatását egy gyomrú állatokban — például sertés és baromfi — várható hatás becslésére sertés in vitro modellen és in vivő csirke növekedési modellen, kérődzők — például szarvasmarha, kecske és juh —
-11193213 esetén várható hatás becslésére bendő in vitro modellen vizsgáltuk.
Sertés in vitro modell
Yorksire sertésbe vagy csfpőbél-kanült 5 helyezünk, a csipőbél és a vakbél találkozásától 15 cm-re, vagy vakbél-kanült, á vakbél kezdete és csúcsa között, középen. Az állatot naponta négyszer etetjük, 30 kg-os állat esetén a testsúly kg 4,5%-a, 100 kg-os állat ese- 10 tén 2,5%-a a tápanyagfelvétel. A sertéstáp összetétele az alábbi:
. .. , ,, súly% közepesre daralt morzsolt 70,60 kukorica 15 szójabab-liszt, 44% 22,00 szárított lucernaliszt, 17% 4,50 kalcium-propionát 0,15 vitamin/ásványi anyag keverék 2,75 -,q
A kanülökön keresztüli mintavételt az első reggeli etetést követő 150-180. percben kezdjük, és 30-120 percenként veszünk újabb mintákat, a szükséges anyag mennyiségétől függően. A mintát őrőlt jégen tartjuk, 5°C-nál nem alacsonyabb hőmérsékleten, és folyamatosan szén-dioxid gázt vezetünk bele. Az öszszegyűjtött anyagot szűrjük. A szűrletet használjuk inokulumként a vizsgálati és kontroll minták inkubálására. 2,25 ml gázzal telített inokulumot mérünk mind a 10 gázosított kémcsőbe, amely még 0,75 ml táptalajt és 0,5 mg vizsgált anyagot tartalmaz. A vizsgált anyagot tartalmazó kémcsöveket négy vakpróbát tartalmazó kontroll kémcsővel együtt 5 órán át 37°C-on ínkubáljuk, keverés közben. Négy másik kontroll kémcsövet nem inkubálunk.
A kémcsövekbe 0,6,0 ml 25%-os metafoszforsav-oldatot mérünk, majd 4°C-on tároljuk az analízis elvégzéséig. A mintákat felolvasztjuk és 25 percen át 20000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A felülúszó folyadékot dekantáljuk, és gázkromatográfiás, valamint automata analízis céljára szétmérjük. Az eredményeket számítógépbe táplálva kapjuk azokat az adatokat, amelyekben a vakpróba értéke 100%. Pozitív kontrollként virginiamicint és vankomicint használunk.
Vegyület Mennyiség· (ppm) VFA* (Kont- roll %) LYS* (Kont- roll %) GLU* (Kont- roll % LAC* (Kont- roll %)
Virginiamicin 166,67 93 163 197 81
16,67 130 127 191 76
1 ,67 248 82 182 70
Vankomicin 166,67 250 48 190 64
16,67 280 42 189 59
1 ,67 92 83 100 99
AAD 216 666,67 267 44 189 58
komplex** 166,67 345 50 195 51
66,67 390 53 188 46
16,67 124 81 113 93
6,67 90 101 96 100
AAD 216A 166,67 326 63 187 58
16,67 379 50 191 47
1,67 101 94 97 99
AAD 216B 166,67 290 50 190 56
16,67 365 55 184 47
1 ,67 102 98 97 98
AAD 216C 166,67 294 42 191 57
16,67 398 53 .188 45
1,67 101 95 96 98
*VFA az összes illékony zsírsavat, közelebbről acetátot, propionátot, izobutirátot, butirátot. izovalerátot és valerátot jelenti,
LYS jelentése lizin GLU jelentése glükóz és LAC L-tejsavat jelent **az AAD 216 komplex 25%-ban tartalmazza az AAD 216A, AAD 2I6B és AAD 216C elegyét.
Bendő in vitro modell A bendő in vitro modell azonos a íenti sertés in vitro modellel, a következő eltérésekkel g0 (1) a kanült egy 400 kg-os szarvasmarha ben dőjébe helyezzük;
(2) az állatot naponta egy alkalommal etet jük a következő összetételű táppal:
teljes táp súly % gyapotmag-tok 44,0 darált kukorica 22,0
-12193213 lucernaszéna 1 20,0 szemcsézett adalék* 10,0 folyékony melasz 4,0
100,0 *szemcsézett adalék súly% szójababolaj liszt (50% protein) 50,0 közepesre darált kukorica 32,0
D/calcium-foszfát 6,5 konyhasó 2,5 őrölt mészkő (Thomasville) 3,5 karbamid 2,5
A és D, vitamin-keverék** 2,5
Γ00.Ό
**A és D2 vitamin-keverék súly%
A-vitamin (30000 IU/g) D2-vitamin (16000000 IU/ 5,87
/453,6 g 0,50
finomra őrölt kukorica 93,63 100,00
(3) a VFA-termelés befolyásolását az összes termelt VFA %-ában kifejezett propionát mennyiségével jellemezzük;
(4) a mintavétel a kanülön keresztül az etetés utáni 120. percben történik.
Vegyület Mennyisége (ppm) VFA* (kont- roll 2) LYS* (kont- roll %) GLU* (kont- roll %) Propio-* nát % (kontroll Z)
Vankomicin 50,0 107 97 189 127
5,0 108 85 165 130
0,5 97 83 17 105
TAvoparcin 50,0 113 97 141 132
5,0 105 85 166 121
0,5 103 96 116 106
Monensin- 50,0 109 147 0 156
-nátrium 5,0 104 141 126 149
0,5 94 109 11 119
AAD 216 200,0 118 116 78 159
komplex ** 50,0 117 101 11 15S
20,0 115 95 193 130
2,0 101 92 60 102
AAD 216A 50,0 11 1 114 153 146
5,0 93 90 28 135
0,5 94 96 121 105
AAD 216B 50,0 111 124 20 148
5,0 121 107 0 141
0,5 100 103 45 103
AAI 216C 50,0 101 1 10 0 151
5,0 111 96 45 136
0,5 83 103 29 120
VFA az összes illékony zsírsavat, közelebbről acetátot, propionátot, izobutirátot, butirátot, izovalerátot és valerátot jelenti,
LYS jelentése lizin,
GLU jelentése glükóz
6z AAD 216 komplex 25%-ban tartalmazza az AAD 216A, AAD 216B és AAD 216C elegyet.
Növekedés vizsgálata csirkén
Egy napos, súly, egészségi állapot és nem szempontjából válogatott rántanivaló csirkéken végezzük a vizsgálatot,melyeket 26,6°C-os 40% nedvességtartalmú kondicionált helységben tartunk. A csirkéket ad libitum etetjük. A vizet is ad libitum kapják az állatok. A szoktatást szakaszban (1. és 2. nap) az állatokat rozs vagy kukorica alaptáppal etetjük, majd a 350 17. napon az alaptápot a vizsgálandó vegyületekkel keverjük, illetve kontroll feltételek mellett adjuk. Minden vizsgálati és kontroll csoportban vagy 8 ketrecét (64 csirke) vagy ketrecet (128 csirke) használunk.
Rozs alaptáp súly% őrölt rozs (finomra őrölt) 54,0 szójabab-liszt (49% protein) 27,0 hús- és csontliszt (50% protein) Jo’o szárított lucernaliszt 1,25 állati zsír 4’Q szárított tejsavó (vagy laktóz) i’o őrölt mészkő 957 dikalcium-foszfát θ’βθ jódozott só θ’23 vitamin-keverék 0,175* nyomelem-keverék θ’25
-13193213
DL-metionin (98%) 0,45 kolin-klorid (50%-os vizes oldat) 0,150** *-a vitamin-keveréket a vizsgálandó vegyülettel együtt keverjük a tápba, 87,5 g vitaminkeverék/49,91125 kg rozs alaptáp koncentrációban **mivel a kolint 50%-os vizes oldat formájában adjuk, a tápban a %-os koncentráció kétszeres.
Vegyület Dózis (PPm) Ketre- cek szama Súly 10. nap 17. nap —Kontrt Táp/gyarapodás 3-10. 10-17 3-17. Elhullott csirkék száma***
nap nap >11 Z-ában ---- nap
Virginia- 10,0 8 103,8 116,0 97,4 83,6 90,4 2
micin 50,0 8 105,0 121,3 93,2 74,6 83,2 1
AAD 216 40,0 8 107,7 132,4 90,9 69,6 79,6 2
komplex·* 160,0 8 106,1 117,1 91,0 80,1 85,3 3
----gramm--- -----gramm/gramm---
Kontroll 0,0 8 164,2 280,4 1,577 2,815 2,209 2
(rozs)
Alapkontroll·**** 169,1 298,4 1,566 2,563 2,080
Ketrecek közötti variációs koefficiens***** : 3.71Z
* az AAD 216 komplex 25^-ban tartalmazza az AAD 216A, AAD 216B és AAD 216C elegyét ** ketrecenként 8 csirke *** kísérlet során elpusztult csirkék száma ***·* kontroll állatok gyarapodása a kísérlet megkezdése előtt variációs koefficiens a standard deviáció és a 17. napon mért testtömegek átlagértékének hányadosából számítjuk ki, %-ban
A találmány szerinti eljárással előállítható takarmánykeverékek a húsállatok és tejelő állatok szokásos takarmánya mellett hatóanyagként AAD 216 komplexet, AAD 216A-t, 35
AAD 216B-t vagy AAD 216C-t, vagy a fenti hatóanyagok elegyét tartalmazzák: A hatóanyagból annyit adagolunk a takarmányba, hogy azzal a növekedésserkentő hatást és a fokozott takarmányhasznosítást elérjük, £i° ugyanakkor még ne legyen toxikus vagy olyan mértékben ártalmas, hogy az állatok táplálékfelvételének csökkenését okozza. A hatóanyag mennyiségét számos tényező — például a hatóanyag ára, az állat fajtája és sú- 45 lya, a hatóanyag relatív aktivitása, vagy az alaptápként használt takarmány típusa — befolyásolja.
Sertés vagy baromfi esetén például az alábbi összetételű takarmányok megfelelőek. 60
18-45 kg-os sertések etetésére az alábbi
összetevőkből készítettünk tápot:
őrölt kukorica szójabab olaj liszt hús hulladék 78,15% 17,0% 3,0%
osztrigahéj ízesítő 0,4%
csontliszt 0,5%
cink-oxid 0,01%
A-, B-, Bj2' és D-vitamin adalék tetszés szerint
Rántanivaló csirkék etetésére a következő
összetételű tápot használhatjuk:
sárga kukoricaliszt 67,35%
szójabab olaj liszt 24,00%
menhaden halliszt 6,00%
gőzölt csontliszt 1,00%
őrölt mészkő 1,00%
jódozott só 0,34%
25%-os kolin-klorid 0,13%
Bl2-vitamin 0,10%
mangán-szulfát 0,02%
vitamin-keverék 0,06%
A szopós malacnak, hízónak vagy a vágás előtt álló állatnak a takarmányához adalékokat is keverhetünk, egy kb. 10 kg súlyú sertés naponta kb. 1 kg takarmányt, egy kb. 70 kg-os állat kb. 4 kg takarmányt kap naponta. A legtöbb takarmány kukorica alaptápból áll, melyet hüvelyes sílótakarmánnyal, búzakorpával, zabbal, árpával, melasszal vagy protein-adalékkal egészítünk ki.
A baromfitápokat csirketápra, rántanivaló csirketápra és tojós tápra oszthatjuk. A tápok általában darált kukorica, kukoricaliszt vagy szójababliszt alapúak. A rántanivaló csirkéknek való tápok gyakran nagy energiatartalmú adalékokat, például zsiradékot, proteint és vitaminokat is tartalmaznak. A pulykatápok hasonló összetételűek, de csak kétféle — indulási és fejlődő állatnak való — tápot használunk. A csirkék vagy fácánok naponta kb. 0,013 — 0,13 kg tápot kapnak, a pulykák napi adagja ennek kétszerese. A becsült táplálékfelvételt a húsállat korától és súlyától függ.
A fenti tápokat az AAD 216 komplexszel, AAD216A-val, AAD 216B-vel, AAD 216C-vel. vagy a fenti hatóanyagok elegyével egyenletesen összekeverve kapjuk a kiegészített tápokat, amelyeket azután a szokásos módon, rendszerint ad libitum etetünk fel az állatokkal. A fenti célra célszerűen a találmány szerinti
-14193213 növekedésserkentőből — adott esetben egyéb adalékokkal, például féreghajtószerrel, nitrogénforrással vagy nem szinergista hatású antibiotikummal, így virginiamicinnel vagy oxitetraciklinnel kiegészítve — premixet készítünk, melyet a takarmányt előállító vagy az állattenyésztő helyen kevernek a kész takarmányhoz. Az AAD 216 komplex, AAD 216A, AAD 216B, AAD 216C vagy a fenti hatóanyagok elegyének koncentrációja a premíxben rendszerint 5-75 súly%, vagy 100-2000-szer nagyobb, mint a kész takarmányban. A premix szilárd vagy cseppfolyós halmazállapotú lehet, hordozóanyagként kukoricaolajat, gyapotmag-olajat, melaszt vagy lepárlási maradékot használhatunk a cseppfolyós premix előállítására. A szilárd premix készítmények hordozóanyaga például szacharóz, laktóz, kukoricaliszt, őrölt kukorica, liszt, kalcium-karbonát vagy szójabab-liszt lehet. A premix készítményeket a teljes takarmánnyal egységesen összekeverve etetjük meg az állatokkal. A leírásban takarmánykészítmények alatt a fenti premix készítményeket is értjük.
Az AAD 216 komplex, AAD 216A, AAD 216B, AAD 216C vagy a fenti hatóanyagok elegyének koncentrációja a teljes takarmányban közelítőleg 1-1000 súlyrész hatóanyag /1000000 súlyrész teljes takarmány (ppm), vagy közelítőleg 2-115 g/tonna. A fenti koncentrációtartományban a hatóanyag nem toxikus, és a kívánt hatás kifejtésére képes menynyiségben van jelen. A hatóanyag koncentrációja előnyösen 10-50 ppm.
A találmány szerinti eljárással előállítható vegyületek alkalmasak egy gyomrú vagy kérődző, húsáilat vagy tejelő állat — közelebbről vágómarha vagy tehén, juh, sertés és baromfi — takarmányozására, oly módon, hogy az állatoknak AAD 216 komplexet, AAD 216A-t, AAD 216B-t, AAD 216C-t vagy a fenti hatóanyagok elegyét adjuk nem toxikus, nö.ekedésserkentő hatást kiváltó mennyiségben. Az egy gyomrú állatok közé — amelyekre jellemző, hogy emésztő-rendszerükben az emésztés vakbélben vagy vakbélhez hasonló kamrában játszódik le — tartoznak még a nyúl és a ló is.
A fentebb ismertetett kiegészített tápokat a szokásos módon etetjük meg az állatokkal. Az ad fibitum etetés mind a legelőn tartott, mind a ketrecben vagy a pajtában tartott állatok esetén a legcélszerűbb módja az állat súlygyarapodásának és tejelésének fokozására és a takarmányhasznosítás fokozására.
A találmány szerinti eljárással előállítható antibiotikumok fermentálását, izolálását és tisztítását közelebbről — a korlátozás szándéka nélkül — az alábbi példákkal kívánjuk szemléltem.
A példákban említett táptalaj összetételét alább ismertetjük. A fermentálási hozamokat analitika nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással határoztuk meg, autentikus mintákkal összehasonlítva az ismeretlen anyagokat.
A kísérletekben az SKandF-AAD 216 törzs
tenyésztésére 13H-tápközeget használ:
amelynek összetétele az alábbi:
keményítő 15 g/1
szacharóz 5 g/1
dextróz 5 g/1
HY-szója 7,5 g/1
kukoricalekvár 5 g/1
dikálium-hidrogén-íoszfát l,5g/l
nátrium-klorid 0,5 g/1
kalcium-karbonát 1,5 g/1
ásványi keverék 5 ml/1
pH 7-re állítva.
Az ásványi keverék az alábbi összetevők-
bői áll:
ZnSO4-7H2O 2,8 g/1
Fe(NH4)2HC6H5O7 2,7 g/1
CuSO4-5H2O 0,125 g/1
MnSO4-H2O 1,0 g/1
CoC12’6H20 0,1 g/1
Na2B4O7-H2O 0,09 g/1
Na2MoO4-2H2O 0,05 g/1
A V-2 táptalaj összetétele az alábbi: szójabab-liszt 15 g/1 cukorrépa melasz 10 g/1 glükóz 10 g/1
Estrasan 4 (metil-oleát) 10 g/1 nátrium-klorid 0,3 g/1 pH 7,2-re állítva.
1. példa
Irtokulum készítés (első leoltás)
A K. aridum (ATCC 39323) ferde agáron fenntartott tenyészetét 10 ml steril vízben szuszpendáljuk és steril körülmények között egy 4 literes levegőztetett lombikban lévő 500 ml 13H-táptalajba visszük. A tenyészetet rázógépen 250 fordulat/perc sebesség mellett 28°C-on 3 napon át rázatjuk, majd a kapott tenyészetet a 2. példában leírt módon egy 14 literes üveg fermentoredényben lévő táp-, talaj oltóanyagaként használjuk.
2. példa
Második inokulum készítés literes üvegfermentorban (New Brunswick Model 19) lévő 10 1 steril 13H-táptalajt steril körülmények között beoltunk az 1. példában kapott 500 ml vegetatív tenyészettel. A fermentálást a következő paraméterek betartása mellett végezzük:
keverés: 400 fordulat/perc a 0-72. órában; levegőztetés: 0,4 v/v/nC a 0-72. órában; hőmérséklet: 28°C.
^v/v/m jelentése térfogat levegő/téríogat táptalaj/perc
A kapott tenyészet 5 l-ével a 3. példában leírtak szerint oltjuk be a 75 literes fermentort a harmadik inokulum előállítása céljából.
3. példa
Harmadik inokulum készítés
Egy 75 l-es fermentort (Chemapec) a 2. példában ismertetett paraméterek mellett üzemeltetünk. A fermentorban lévő 50 I 13H-táp-15193213 talajt a 2. példa szerint előállított vegetatív tenyészet 5 l-ével oltjuk be. A fermentor üzemeltetését az alábbiak szerint végezzük: keverés: 250 íordulat/perc a 0-72. órában·; levegőztetés: 0,4 v/v/m a 0-72. órában; hőmérséklet: 28°C.
A fenti módon kapott vegetatív tenyészet l-ével oltjuk be a 4. példában leírtak szerint a 750 1-es fermentort, amelyben a kívánt AAD 216 komplexet állítjuk elő.
4. példa
AAD 216 komplex előállítása
A 750 1-es fermentort (ABEC) a 3. példában leírt módon üzemeltetjük. A 750 1-es fermentorban lévő 600 1 V-2 táptalajt a 3. példában előállított inokulum 50 l-ével oltjuk be. A fermentort a következő paraméterek betartásával üzemeltetjük:
keverés: 120 fordulat/perc a 0-168. órában; levegőztetés: 0,3 v/v/m a 0-168. órában; hőmérséklet: 26°C.
A fermentlében képződött AAD 216 komplex az alábbi összetételben tartalmazza az egyes antibiotikum-komponenseket:
AAD 216A 50 pg/inl;
AAD 216B 60,8 pg/mt; és
AAD 216C 43,5 pg/ml.
Az egyes komponensek fizikai tulajdonságai az alábbiak.
AAD 216A: pH 6 körüli értéken az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik:
a) halvány sárgás-fehér szilárd anyag, 300350°C-on bomlik;
b) összegképlete C8|H82N8O30Cl4;
c) közelítő elemi összetétele: 48,20% szén,
5,01% hidrogén, 5,21% nitrogén, 6,43% klór, ként és szerves foszfort nem tártál máz, a víztartalom 10,80%;
d) KBr-ban felvett infravörös spektruma v,„„ (cm'1): 3400, 2920, 1660, 1600, 1510,
1460, 1430, 1390, 1320, 1300, 1240, 1150, 1060 és 1020;
e) tömegspektruma gyors atomokkal való bombázás mellett (FAB) 1787 (főcsoport) (Μ+H);
f) acetonitril-víz 1:1 arányú elegyében felvett ultraibolya spektruma neutrális és savas körülmények között 280 nm-nél mutat abszorpciós csúcsot, E!%= 51;
bázikus körülmények között az abszorpciós csúcs 301 nm-nél van, E,?= 73;
g) szén-mágneses rezonancia spektruma
90,56 MHz-en CD3OD—D?O (1:9) elegyben pH 8,5-nél a következő kémiai eltolódásokat mutatja (ppm-ben) TMS standardhoz viszonyítva: .
177,7, 177,5, 175,5, 174,6, 171,5, 170,8,
170.4, 170,2, 169,1, 161,8, 158,6, 157,9,
155.1, 155,0, 152,5, 151,9, 151,6, 150,7,
146,0, 144,3, 141,7, 138,8, 138,3, 136,0,
134,6, 134,5, 133,7, 130,8, 129,8, 129,4,
128,9, 128,6, 127,4, 127,0, 126,2, 125,6,
125.1, 122,7, 122,3, 120,9, 119,6, 118,3,
116.4, 110,5, 109,6, 108,3, 104,2, 103,3,
103.1, 100,7, 98,1, 78,4, 74,4, 73,3, 72,0,
71,6, 71,3, 70,7, 67,3, 65,6, 63,6, 62,3, 61,6,
60.2, 56,8, 56,3, 55,8, 54,9, 37,2, 32,7, 32,2, 29,8, 29,6, 29,5, 26,2, 23,0, 14,5;
h) optikai forgatóképesség: [a]25’ = -66° (c = 0,3, víz);
i) perjodáttal pozitív, ninhidrinnel negatív reakciót ad;
j) vízben, metanolban, dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban. oldódik, etanolban, acetonitrilben, dietil-éterben, alifás szénhidrogénekben, acetonban oldhatatlan;
k) pKa értékei acetonitril-víz 3:7 arányú elegyben: 3,0, 4,9, 7,4, 8,4, 10,0 és 10,3;
AAD 216B: pH 6 körüli értéken az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik:
a) halvány sárgás-fehér szilárd anyag, 300350°C-on bomlik;
b) összegképlete: C82H84N8O30Cl4;
c) közelítő elemi összetétele: 49,67% szén, 5,07% hidrogén, 5,19% nitrogén, 6,70% klór, ként és szerves foszfort nem tartalmaz, a víztartalom 10,8%;
d) KBr-ban felvett infravörös spektruma:
(cm-1): 3400,2920, 1660, 1600, 1510, 1460, 1430, 1390, 1300, 1240, 1150, 1060 és 1020;
e) tömegspektruma gyors atomokkal vató bombázás mellett (FAB) 1801 (fő csoport) (M+H);
f) acetonitril-víz 1:1 arányú elegyben felvett ultraibolya spektruma neutrális és savas körülmények között 280 nm-nél mutat abszorpciós csúcsot, E^= 55; bázikus körülmények között az abszorpciós csúcs 301 nm-nél van, E#o= 72,5;
g) szén-mágneses rezonancia spektruma
90,56 MHz-en CD3OD—D2O 1:9 arányú elegyben pH 8,5 értéken a következő kémiai eltolódásokat mutatja (ppm-ben) TMS standardhoz viszonyítva:
177,9, 177,4, 175,6, 174,4, 171,6, 170,9,
170.5, 170,4, 169,3, 162,4, 158,7, 158,1,
155.2, 155,0, 152,6, 152,3, 150,7, 146,0,
144.3, 141,3, 138,8, 138,3, 136,1, 134,7,
133.6, 130,7, 129,9, 129,8, 129,4, 129,0,
128.7, 127,7, 127,5, 127,0, 126,3, 125,7,
124.7, 122,8, 122,3, 120,9, 119,9, 119,6,
118.4, 116,7, 110,5, 109,6, 108,5, 104,2,
103.3, 103,1, 100,6, 98,1, 78,5, 74,4, 73,9,
73.4, 72,1, 71,7, 71,2, 70,8, 67,3, 65,5, 63,7,
62.3, 61,6, 60,3, 56,8, 56,2, 55,9, 55,0, 39,6,
37.3, 32,7, 30,2, 30,0, 29,7, 28,4, 27,8, 26,3, 23,3;
h) optikai forgatóképessége [a]^5 =-59° (c = 1,0, víz);
i) perjodáttal pozitív, ninhidrinnel negatív reakciót ad;
j) vízben, metanolban, dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban oldódik, etanolban, acetonitrilben, acetonban, dietil-éterben és alifás szénhidrogénekben oldhatatlan;
k) pKo értékei acetonitril-víz 3:7 arányú elegyben: 3,0, 4,5, 7,5, 8,5 és 9,7.
AAD 216C: pH 6 körüli értéken az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik:
-16193213
a) halvány sárgásHehér szilárd anyag, 300350°C-on bomlik;
b) összegképlete: C83H86N8O30Cl4;
c) közelítő elemi összetétele: 47,89% szén, 5,09% hidrogén, 4,95% nitrogén, 6,39% klór, 3,69% hamu, ként és szerves foszfort nem tartalmaz, a víztartalom 8,2%:
d) KBr-ban felvett infravörös spektruma: vmax (cm'1): 3400, 2920, 1660, 1600, 1505,
1430, 1390, 1295, 1240, 1150, 1060, 1020;
e) tömegspektruma gyors atomokkal való bombázás mellett (FAB) 1815 (fő csoport) (M-(-H);
f) acetonitril-víz 1:1 arányú elegyben felvett ultraibolya spektruma neutrális és savas körülmények között 280 nm-nél mutat abszorpciós csúcsot, Efl= 51; bázikus körülmények között az abszorpciós csúcs 301 nm-nél van, E,«,p= 75;
g) szén-mágneses rezonancia spektruma
90,56 MHz-en CD3ÖD—D2O 1:9 arányú elegyben pH 8,5 értéken a következő kémiai eltolódásokat mutatja (ppm-beu) TMS standard-hoz viszonyítva:
177.9, 177,2, 175,7, 173,6, 171,5, 170,8,
170.6, 170,2, 169,3, 158,6, 157,8, 155,2,
154.9, 152,7, 151,9, 150,9, 146,0, 144,3,
141.3, 138,8, 138,4, 136,0, 134,9, 134,7,
133,8, 130,8, 129,9, 129,8, 129,3, 129,1,
127.7, 127,5, 127,Q, 126,4, 125,3, 122,7,
121,0, 119,7, 118,3, 116,1, 110,4, 109,6
108,1, 104,1, 103,2, 101,5, 98,0, 78,6
74,6, 73,9, 73,4, 72,1, 71,7, 71,3,
70.3, 67,3, 65,1, 63,7, 62,5, 61,6,
60.3, 56,8, 56,3, 55,3, 54,9, 39,7,
37.4, 32,6, 32,3, 30,5, 30,4, 30,2,
29.9, 28,6, 28,1, 26,4, 23,4, 22,0
h) optikai forgatóképessége [«In = -50,6° (c = 0,6, víz);
i) perjodáttal pozitív, ninhidrinnel negatív reakciót ad;
j) vízben, metanolban, dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban oldódik, etanolban, acetonitrilben, acetonban, dietil-éterben és alifás szénhidrogénekben oldhatatlan;
k) pK„ értékei acetonitril—víz 3:7 arányú elegyben: 3,0, 4,2, 7,2, 8,2, 9,9 és 10,3. 5. példa
AAD 216 komplex előállítása
Egy 450 1-es fermentort (Chemapec) a
4. példában leírtak szerint üzemeltetünk. A fermentorban lévő 300 I V-2 táptalajt 30 1
3. példa szerint előállított harmadik átoltással kapott inokulummal oltunk be. A fermentor üzemeltetési paraméterei a következők: keverés: 120 fordulat/perc a 0-168. órában; levegőztetés: 0,4-0,5 v/v/m;
hőmérséklet: 26°C.
A fenti módon kapott íermentlében az AAD
216 komplex összetétele az alábbi:
AAD 216A 46,2 pg/ml;
AAD 216B 75 pg/ml; és AAD 216C 48 pg/ml.
Az egyes komponensek fizikai jellemzői megegyeznek a 4. példában megadottakkal.
6. példa
AAD 216 komplex izolálása
A 4. példa szerint előállított 600 1 fermentlevet forgódobos szűrőn (Komline-Sanderson, Laboratory Scale Model) szűrve tisztítjuk, szűrési segédanyag (Hyflo Supercel, Johns-Manville Products Corp.) alkalmazása mellett, a fermentlé pH-jának megfelelő pH értéken (7,7-8,2). A kapott 420 1 szűrletet 100 1-es adagokban hidegfördőbe (metanol-száraz jég) helyezett tartályban 4°C-ra hűtjük. A hideg szürletet ezután lassan adagolt tömény sósavoldattal keverés közben pH 3 értékre savanyítva kicsapjuk. A kapott csapadékot rotációs vákuumszűrőn, a fentebb említett szűrési segédanyag alkalmazása mellett különítjük el. A segédanyagból és csapadékból álló szűrő-pogácsát 55 1 ionmentes vízzel keverve és pH-ját 7,0-ra állítva 10 percen át extraháljuk. A kapott vizes extraktumot Whatman 4-es szűrőpapíron átszűrve eltávolítjuk a szűrési segédanyagot. A kapott szűrletet két XAD-7 gyantaoszlopra (8,5 x 110 cm) visszük, 0,5 térfogat/óra sebességgel. 8 térfogatnyi ionmentes vízzel mossuk az oszlopot (pH 7,0), majd a kívánt AAD 216 komplexet 50-100%-os vizes metanollal eluáljuk. A kívánt AAD 216 komplexet tartalmazó eluátum-frakciókat 35°C-on fiimbepárló segítségével koncentráljuk. A kapott vizes koncentrátumot liofilizálva (Virtis shelf lyophilizer) 85,1 g AAD 216 komplexet kapunk.
A kapott AAD 216 komplexet 1 kg Whatman Partisil’Prep 40 ODS-3-mal töltött Jobin Yvon Chromatospac-Prep 100 oszlopon kromatografálva, 15-33% acetonitril-0,1 mól/ /1-es foszfát-puffer (pH 3,2) lépcsős gradienssel eluálva dúsított AAD 216 komplexet kapunk, amely analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiás elemzés szerint 1,88 g AAD 216A-Í, 2,6 g AAD 216B-t és 2,8 g AAD 216C-t tartalmaz. Az egyes komponensek fizikai jellemzői azonosak a 4. példában megadotakkal.
7. példa
AAD 216A, AAD 216B és AAD 216C izolálása g nem sómentesített, 6. példa szerint előállított dúsított AAD 216 komplexet — amely analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiás elemzés szerint 0,42 g AAD 216A-Í, 1,39 g AAD 2I6B-Í és 0,08 g AAD 216C-t tartalmaz — 1 liter 15% acetonitrilt tartalmazó 0,1 mól/l-es foszfát-pufferben (pH 6) oldunk, és a pH-t 6,3-ra állítjuk. Az oldatot Whatman PartisiÜ 40 (ODS-3) oszlopos Waters Prep 500δ nagynyomású folyadékkromatográfiás készülékre visszük, az oszlop mérete 50 x 4,8 cm, az átfolyási sebesség 200 ml/perc. Az oszlopot ezután a következő gradiensekkel eluáljuk:
(1) 20% vizes acetonitril és pufferoldat, míg a poláros anyagok (210 nm-nél mért UV-abszorpció alapján kimutatva) eluálódnak;
-17193213 (2) 24% acetonitriles pufferoldat, míg az
AAD 216A eluálódik;
(3) 26% acetonitriles pufferoldai, míg az
AAD 216B eluálódik;
(4) 28% acetonitriles pufferoldat, míg az
AAD 216C eluálódik; és (5) 50%'-os vizes acetonitril.
A nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopról kapott megfelelő frakciókat az alább ismertetett módon sómentesítve 0,25 g AAD 216A-t, 1,05 g AAD 216B-t és 0,06 g AAD 216C-t kapunk tiszta formában. Az egyes komponensek fizikai állandói megegyeznek a 4. példában megadottakkal.
A sómentesítést úgy végezzük, hogy a nagy nyomású folyadékkromatográfiás oszlopról kapott megfelelő frakciókat egyesítjük, és az acetonitrilt csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A kapott vizes oldatot XAD-7 gyantával tölött oszlopra visszük és.ionmentes vízzel addig eluáljuk, míg az eluátum vezetőképessége 25 pS alá csökken. Az oszlopot ezután 40-60%-os vizes acetonitri 1 lel eluáljuk, az eluátumot liofilizálva kapjuk a kívánt terméket.
8. példa
Dúsított AAD 216 komplex izolálása g AAD 216 komplexet, melyet a 6. példában leírtak szerint a XAD-7 oszlopról nyertünk, és amely 0,67 g AAD 216A-t, 0,23 g AAD 216B-t és 0,21 g AAD 216C-t tartalmaz, 17,5% acetonitrilt tartalmazó 0,1 mól/l-es foszfát-pufferben (pH 6) oldunk. Az oldat pH-ját 6,3-ra állítjuk, majd 50 x 4,8 cm-es, Whatman Partisil' Prep 40 (ODS-3) t. töltetű oszloppal ellátott Waters Prep 50011 nyagynyomású folyadékkromatográfra visszük. Az oszlopot 20% acetonitrillel és pufferoldattal eluálva eltávolítjuk a poláros anyagot, majd 28% acetonitrilt tartalmazó pufferoldattal eluálva kapjuk az acetonitriles pufferoldatban dúsított AAD 216 komplexet. Az eluátum acetonitril-tartalmát csökkentett nyomáson eltávolítjuk, majd a kapott vizes oldatot XAD-7 gyantával töltött oszlopra visszük és ionmentes vízzel addig mossuk, míg az elfolyó oldat vezetőképessége 25 pS alá csökken. Az oszlopot ezután 40-60%-os vizes acetonitriloldattal eluáljuk, és az eluátumot liofilizálva 2,05 g dúsított AAD 216 komplexet kapunk, amely 0,59 g AAD 216A-t, 0,20 g AAD 216B-t és 0,20 g 216C-t tartalmaz. Az egyes komponensek fizikai állandói megegyeznek a 4. példában megadottakkal.
9. példa
Másik izolálási eljárás
Az AAD 216 komplexet a XAD-7 oszlopon végzett kromatografálás után a 7. példában ismertetett módon kromatografálva növelhetjük a tiszta állapotú AAD 216A, AAD 216B és AAD 216C hozamát.
A fenti módon négy párhuzamos kromatografálásból kapott AAD 216A frakciókat — amelyekben az AAD 216A mennyisége ana litikai nagynyomású folyadékkromatográfiás meghatározás szerint 3,9 g 2,5 g és 2,2 g — 18 egyesítjük és ugyanazon a nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopon újra kromatografáljuk, az eluálást 22%-os acetonitrillel és 0,1 mól/l-es foszfát-pufferrel (pH 6) végezzük. Sómentesítés után a középső frakciókból 4,6 g nagy tisztaságú AAD 216A-t kapunk. A többi frakciót további tisztítás céljából visszavezetjük az oszlopra.
A fenti módon négy párhuzamos kromatografálásból kapott AAD 216B frakciókat — amelyekben az AAD 216B mennyisége 2,5 g, 3,7 g, 3,7 g és 1,4 g, analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiás meghatározás szerint — egyesítjük, és ugyanazon a nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopon újra kromatografáljuk, az eluálást 26%-os acetonitrillel és 0,1 mól/l-es foszfát-pufferrel (pH 6) végezzük. Sómentesítés után 2,7 g nagy tisztaságú AAD 216B-t kapunk a középső frakciókból. A többi frakciót további tisztítás céljából visszavezetjük a oszlopra. Az AAD 216B fizikai tulajdonságai megegyeznek a 4. példában megadottakkal.
10. példa
Dúsított AAD 216 komplex izolálásának harmadik módja
A 6. példában leírtak szerint izolált AAD 216 komplexet — amely közelítőleg 720 mg AAD 216A-t, AAD 216B-t és AAD 216C-t tartalmaz — 200 ml vízben oldjuk, majd szűrjük. A szűrletet 70 ml Affi-Gel11 10 D-ala-D-ala affinitási kromatográfiás szorbenssel (633 mg D-ala-D-ala) elegyítjük 0,02 mól/l-es nátrium- foszfát-puf fér ben (pH 7,0) Cuatrecasas és munkatársai [Biochemistry 11(12) 22912298 (1972)] módszere szerint, és 0,5 órán át enyhén keverjük. Az elegyet oszlopra visz· szűk és a vizes fázist lefolyatjuk. Áz oszlopot 2 x 250 ml 0,02 mól/l-es foszfát-pufferrel (pH 7,0); 2 x 250 ml 0,5 mól/l-es ammónium-acetát-pufferrel (pH 7,8); 250 ml vízzel; 250 ml 0,1 mól/l-es ammónium-acetát-pufferrel (pH 7,8); 250 ml vízzel; 70 ml 40%-os vizes acetonitrillel; 1400 ml 40%-os vizes acetonitrillel; és 2 x 250 ml 30% acetonitrilt tartalmazó 0,4 mól/l-es nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal mossuk. Az. 1400 ml 40%-os vizes acetonitrillel kapott frakciót liofilizálva 607 mg dúsított AAD 216 komplexet kapunk, amely 224 mg A AD 216A-t, 133 mg A AD 216B-t és 158 mg AAD 216C-t tartalmaz. Az egyes komponensek fizikai tulajdonságai megegyeznek a 4. példában megadottakkal.

Claims (6)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás az AAD 216A komponenst — amely pH 6 körüli értéken az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik:
    i) halvány sárgás-fehér szilárd anyag, 300350°C-on bomlik;
    ii) összegképlete C8lH82N8O30Cl3;
    iií) közelítő elemi összetétele: 48,20% szén,
    5,01% hidrogén, 5,21% nitrogén, 6,43%
    -18193213 klór, ként és szerves foszfort nem tartalmaz, a víztartalom 10,80%;
    iv) KBr-ban felvett infravörös spektruma: vműI (cm·1): 3400,2920, 1660, 1600, 1510,
    1460, 1430, 1390, 1320, 1300, 1240, 1150, 1060 és 1020;
    v) tömegspektruma gyors atomokkal való bombázás mellett (FAB) 1787 (fő csoport) (M+H);
    vi) acetonitril—víz 1:1 arányú elegyében felvett ultraibolya spektruma neutrális és savas körülmények között 280 nm-nél mutat abszorpciós csúcsot, Ε(ί^51; bázikus körülmények között az abszorpciós csúcs 301 nm-nél van/E,.^ 73;
    vii) szén-mágneses rezonancia spektruma
    90,56 MHz-en CD:jODD?O (1:9) elegyben pH 8,5-nél a következő kémiai eltolódásokat mutatja (ppm-ben) TMS standardhoz viszonyítva:
    177,7, 177,5, 175,5, 174,6, 171,5, 170,8,
    170.4, 170,2, 169,1, 161,8, 158,6, 157,9,
    155.1, 155,0, 152,5, 151,9, 151,6, 150,7,
    146,0, 144,3, 141,7, 138,8, 138,3, 136,0,
    134.6, 134,5, 133,7, 130,8, 129,8, 129,4,
    128,9, 128,6, 127,4, 127,0, 126,2, 125,6,
    125.1, 122,7, 122,3, 120,9, 119,6, 118,3,
    116.4, 110,5, 109,6, 108,3, 104,2, 103,3,
    103.1, 100,7, 98,1, 78,4, 74,4, 73,3,
    72,0, 71,6, 71,3, 70,7, 67,3, 65,6,
    63.6, 62,3, 61,6, 60,2, 56,8, 56,3,
    55,8, 54,9, 37,2, 32,7, 32,2, 29,8,
    29.6, 29,5, 26,2, 23,0, 14,5:
    víii) optikai forgatóképesség: [a]^5 =-66° (c = 0,3, víz);
    ix) perjodáttal pozitív, ninhidrinnel negatív reakciót ad;
    x) vízben, metanolban, dímetil-szulfoxidban, dimétil-formamidban oldódik, etanolban, acetonitrilben, dietil-éterben, alifás szénhidrogénekben, acetonban oldhatatlan;
    xi) pKa értékei acetonitril—víz 3:7 arányú légyben: 3,0, 4,9, 7,4, 8,4, 10,0 és 10,3 -,
    AAD 216B komponenst — amely pH 6 körüli értéken az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik:
    i) halvány sárgás-fehér szilárd anyag, 300350°C-on bomlik;
    ii) összegképlete: C82H84NgO30Cl4;
    iii) közelítő elemi összetétele: 49,67% szén, 5,07% hidrogén, 5,19% nitrogén, 6,70% klór, ként és szerves foszfort nem tartalmaz, a víztartalom 10,8%;
    iv) KBr-ban felvett infravörös spektruma: vmM (cm1): 3400, 2920, 1660, 1600, 1510,
    1460, 1430, 1390, 1300, 1240, 1150, 1060 és 1020;
    v) tömegspektruma gyors atomokkal való bombázás mellett (FAB) 1801 (fő csoport) (M+H);
    vi) acetonitril—víz 1:1 arányú elegyben felvett ultraibolya spektruma neutrális és savas körülmények között 280 nm-nél mutat abszorpciós csúcsot, Ε,β/(>= 55; bázikus körülmények között az abszorpciós csúcs 301 nm-nél van, E,%= 72,5;
    vii) szén-mágneses rezonancia spektruma 90,56 MHz-en CD3OD—D2O 1:9 arányú elegyben pH 8,5 értéken a következő kémiai eltolódásokat mutatja (ppm-ben) TMS standardhoz viszonyítva:
    177,9, 177,4, 175,6, 174,4, 171,6, 170,9, 170,5, 170,4, 169)3, 162,4, 158,7, 158,1, 155,2, 155,0, 152,6, 151,3, 150,7, 146,0, 144,3, 141,3, 138,8, 138,3, 136,1, 134,7, 133,6, 130,7, 129,9, -129,8, 129,4, 129,0, 128,7, 127,7, 127,5, 127,0, 126,3, 125,7, 124,7, 122,8, 122,3, 12C.9, 119,9, 119,6, 118,4, 116,7, 110,5, 109,6, 108,5, 104,2, 103,3, 103,1, 100,6, 98,1, 78,5, 74,4 73,9, 73,4, 72,1, 71,7, 71,2, 70,8 67,3, 65,5, 63,7, 62,3, 61,6, 60,3 56,8, 56,2, 55,9, 55,0, 39,6, 37,3 32,7, 30,2, 30,0, 29,7, 28,4, 27,8 26,3, 23,3, viií) optikai forgatóképessége Mn = = -59° (c = 1,0, víz)
    ix) perjodáttal, pozitív, ninhidrinnel negatív reakciót ad;
    x) vízben, metanolban, dímetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban oldódik, etanolban, acetonitrilben, acetonban, dietil-éterben és alifás szénhidrogénekben oldhatatlan;
    xi) pKa értékei acetonitril—víz 3:7 arányú elegyben: 3,0, 4,5, 7,5, 8,5 és 9,7 -, és AAD 216C komponenst — amely pH 6 körüli értéken az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik:
    i) halvány sárgás-fehér szilárd anyag, 300350°C-on bomlik;
    ii) összegképlete: C83Hg6N8O30CI4;
    iii) közelitő elemi összetétele: 47,89% szén, 5,09% hidrogén, 4,95% nitrogén, 6,39% klór, 3,69% hamu, ként és szerves foszfort nem tartalmaz, a víztartalom 8,2%;
    iv) KBr-ban felvett infravörös spektruma: vma> (cm1): 3400, 2920, 1660, 1505, 1430,
    1390, 1295,1240, 1150, 1060, 1020;
    v) tömegspektruma gyors atomokkal való bombázás mellett (FAB) 1815 (fő csoport) (M+H);
    vi) acetonitril—víz 1:1 arányú elegyben felvett ultraibolya spektruma neutrális és savas körülmények között 280 nm-nél mutat abszorpciós csúcsot, Ε,^= 51; bázikus körülmények között az abszorpciós csúcs 301 nm-nél van, El?&= 75;
    vii) szén-mágneses rezonancia spektruma
    90,56 MHz-en CD3OD — D2O 1:9 arányú elegyben pH 8,5 értéken a következő kémiai eltolódásokat mutatja (ppm-ben) TMS standard-hoz viszonyítva:
    177.9, 177,2, 175,7, 173,6, 171,5, 170,8,
    170.6, 170,2, 169,3, 158,6, 157,8, 155,2,
    154.9, 152,7, 151,9, 150,9, 146,0, 144,3,
    141,3, 138,8, 138,4, 136,0, 134,9. 134,7,
    133,8, 130,8, 129,9, 129,8, 129,3, 129,1.
    127.7, 127,5, 127,0, 126,4, 125,3, 122,7,
    121,0, 1 19,7, 118,3, 1 16,1, 1 10,4, 109,6.
    108,1, 104,1, 103.2, 101,5, 98,0, 78.6.
    74,6, 73,9, 73,4, 72,1, 71,7, 71,3,
    -19193213
    70.3, 67,3, 65,1, 63,7, 62,5, '61,6,
    60.3, 56,8, 56,3, 55,3, 54,9, 39,7,
    37.4, 32,6, 32,3, 30,5, 30,4, 30,2,
    29,9, 28,6, 28,1, 26,4, 23,4, 22,0, viii) optikai forgatóképessége [a]£5 =-50,6° 5 (c = 0,6, víz);
    ix) perjodáttal pozitív, ninhidrinnel negatív reakciót ad;
    x) vízben, metanolban, dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban oldódik, etanolban, 10 acetonitrilben, acetonban, dietil-éterben és alifás szénhidrogénekben oldhatatlan;
    xi) pKo értékei acetonitril—víz 3:7 arányú elegyben: 3,0, 4,2, 7,2, 8,2, 9,9 és 10,3, tartalmazó AAD 216 antibiotikum-komplex 15 és a fenti fő komponensei előállítására, azzal jellemezve, hogy Kibdelosporangium aridum gén. nov., sp. nov. ATCC 39323 mikroorganizmus törzset vagy annak valamely mutánsát asszimilálható nitrogén- és szénforrást 20 tartalmazó tápközegben, merített aerob tenyészetben tenyésztünk, és a kapott AAD 216 komplexet kívánt esetben izoláljuk, és a kívánt esetben az AAD 216A, AAD 216B és/vagy AAD 216C komponenseket szétválasztjuk. 25
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az AAD 216 komplex kinyerésére a íermentlevet derítjük, és a derített fermentléből az AAD 216 komplexet valamely savval kicsapjuk.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az AAD 216 komplexet kromatográfiás eljárással választjuk szét AAD 216A AAD 216B és/vagy AAD 216C antibiotikum-komponenseire.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antibiotikum-komponensek sómentesítésével tiszta AAD 216A-t, AAD 216B-Í és AAD 216C-Í állítunk elő.
  5. 5. Eljárás baktériumellenes hatású gyógyászati készítmények előállításra, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított AAD 216 komplexet, vagy annak AAD 216A, AAD 216B vagy AAD 216C komponensét,vagy a komponensek elegyét a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal öszszekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk.
  6. 6. Eljárás növekedésserkentő hatású takarmánykeverék előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított AAD 216 komplexet, vagy annak AAD 216A, AAD 216B vagy AAD 216C komponensét, vagy a komponensek elegyét az állatok etetésére szokásosan használt tápokkal összekeverjük.
HU842726A 1983-07-13 1984-07-12 Process for preparing aad 216 antibiotic complex and main components thereof by means of fermentation of kibdelosporangium aridum HU193213B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/513,513 US4548974A (en) 1983-07-13 1983-07-13 Antibiotics produced by Kibdelosporangium aridum shearer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT39208A HUT39208A (en) 1986-08-28
HU193213B true HU193213B (en) 1987-08-28

Family

ID=24043597

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU842726A HU193213B (en) 1983-07-13 1984-07-12 Process for preparing aad 216 antibiotic complex and main components thereof by means of fermentation of kibdelosporangium aridum

Country Status (23)

Country Link
US (1) US4548974A (hu)
EP (1) EP0132118B1 (hu)
JP (5) JPH0695941B2 (hu)
KR (1) KR850001284A (hu)
AT (1) ATE47142T1 (hu)
AU (1) AU587565B2 (hu)
CA (1) CA1210721A (hu)
DE (1) DE3480092D1 (hu)
DK (1) DK163001C (hu)
DZ (1) DZ658A1 (hu)
ES (1) ES534248A0 (hu)
FI (1) FI77690C (hu)
GR (1) GR81517B (hu)
HK (1) HK50193A (hu)
HU (1) HU193213B (hu)
IE (1) IE57727B1 (hu)
IL (1) IL72369A (hu)
NO (1) NO158814C (hu)
NZ (1) NZ208849A (hu)
PH (1) PH22062A (hu)
PT (1) PT78877B (hu)
ZA (1) ZA845336B (hu)
ZW (1) ZW10784A1 (hu)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4548974A (en) * 1983-07-13 1985-10-22 Smithkline Beckman Corporation Antibiotics produced by Kibdelosporangium aridum shearer
ATE72818T1 (de) 1985-06-20 1992-03-15 Smithkline Beecham Corp Vancomycintyp-antibiotika.
US4694069A (en) * 1985-09-30 1987-09-15 Smithkline Beckman Corporation Kibdelosporangium aridum SK&F-AAD-609
US4797280A (en) * 1986-06-10 1989-01-10 Smithkline Beckman Corporation Antibiotics produced by Kibdelosporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323
US4742045A (en) * 1986-07-30 1988-05-03 Smithkline Beckman Corporation Glycopeptide antibiotics
MX9204281A (es) * 1991-07-24 1993-04-01 Smithkline Beecham Corp Composiciones alimenticias antibioticas y metodo para mejorar la eficiencia alimenticia y promover el crecimiento en animales monogastricos
KR0179447B1 (ko) * 1996-12-10 1999-02-01 황춘근 골프공
KR0179448B1 (ko) * 1996-12-26 1999-02-01 황춘근 골프공
US6787040B2 (en) * 2000-05-16 2004-09-07 Immunocept, L.L.C. Method and system for colloid exchange therapy
AU2003900927A0 (en) * 2003-02-28 2003-03-13 Biodiem Ltd Growth promotion method
ES2368236B1 (es) * 2009-12-23 2012-09-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Agentes antibacterianos.
CN104830815B (zh) * 2015-06-02 2018-02-23 江南大学 一种采用全细胞转化高效生产α‑苯丙酮酸的方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4083964A (en) * 1976-05-24 1978-04-11 Eli Lilly And Company Antibiotic A-35512 for increasing feed utilization efficiency in an animal
US4378348A (en) * 1979-12-28 1983-03-29 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. OA-7653 Substance
US4322406A (en) * 1980-12-18 1982-03-30 Eli Lilly And Company Antibiotic A-4696 factors B1, B2, B3, C1a, C3 and E1
US4667024A (en) * 1983-07-13 1987-05-19 Smithkline Beckman Corporation Process for the preparation of purified vancomycin class antibiotics
US4548974A (en) * 1983-07-13 1985-10-22 Smithkline Beckman Corporation Antibiotics produced by Kibdelosporangium aridum shearer
US4521335A (en) * 1983-07-13 1985-06-04 Smithkline Beckman Corporation Aglycone and pseudo-aglycones of the AAD 216 antibiotics

Also Published As

Publication number Publication date
ATE47142T1 (de) 1989-10-15
DK163001B (da) 1992-01-06
ZA845336B (en) 1985-05-29
JP2594777B2 (ja) 1997-03-26
IL72369A (en) 1992-09-06
JPH0820596A (ja) 1996-01-23
DK163001C (da) 1992-06-01
AU3040884A (en) 1985-01-17
GR81517B (hu) 1984-12-11
JP2603047B2 (ja) 1997-04-23
CA1210721A (en) 1986-09-02
NO842863L (no) 1985-01-14
ES8505723A1 (es) 1985-06-01
JPH0820595A (ja) 1996-01-23
FI842807A0 (fi) 1984-07-12
NZ208849A (en) 1987-09-30
FI77690B (fi) 1988-12-30
AU587565B2 (en) 1989-08-24
JPH0695941B2 (ja) 1994-11-30
PT78877A (en) 1984-08-01
PH22062A (en) 1988-05-20
EP0132118A2 (en) 1985-01-23
DK338784D0 (da) 1984-07-10
ES534248A0 (es) 1985-06-01
DZ658A1 (fr) 2004-09-13
PT78877B (en) 1986-10-23
US4548974A (en) 1985-10-22
EP0132118A3 (en) 1987-06-03
KR850001284A (ko) 1985-03-18
ZW10784A1 (en) 1984-10-03
DK338784A (da) 1985-01-14
EP0132118B1 (en) 1989-10-11
IE841760L (en) 1985-01-13
HUT39208A (en) 1986-08-28
DE3480092D1 (en) 1989-11-16
IL72369A0 (en) 1984-11-30
HK50193A (en) 1993-05-27
FI77690C (fi) 1989-04-10
NO158814C (no) 1988-11-02
FI842807A (fi) 1985-01-14
JPH08835B2 (ja) 1996-01-10
NO158814B (no) 1988-07-25
JPS6041491A (ja) 1985-03-05
JPH0739384A (ja) 1995-02-10
JPH0649088A (ja) 1994-02-22
IE57727B1 (en) 1993-03-24
JP2594778B2 (ja) 1997-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4548974A (en) Antibiotics produced by Kibdelosporangium aridum shearer
GB2124620A (en) A47934 antibiotic and its production
US4918054A (en) Antibiotics called `chloropolysporins B and C`, a process for their preparation, and their therapeutic and veterinary use
KR960012063B1 (ko) 글리콜펩티드 항생물질 pa-45052 및 그의 제조방법
US4683201A (en) Antibiotic A80190-producing Actinomadura oligospora and process
US4694069A (en) Kibdelosporangium aridum SK&amp;F-AAD-609
IE60394B1 (en) Antibiotic A10255 complex and factors, process, microorganisms for its production
US4742045A (en) Glycopeptide antibiotics
US4557933A (en) Antibiotic called &#34;chloropolysporin&#34;, a process for its preparation, and its therapeutic and veterinary use
US4672036A (en) Pure cultures of Kibdelsporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323 and mutants thereof
EP0055071B1 (en) Antibiotic a-4696 factor g
EP0211490B1 (en) Antibiotics of the vancomycin-class
EP0255299A2 (en) Glycopeptide antibiotics
US4797280A (en) Antibiotics produced by Kibdelosporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323
US4637981A (en) Antibiotic A-4696 factor G
US4996148A (en) A80407 antibiotics
US5213797A (en) A80407 antibiotics

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: PFIZER INC., US

HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee