PT78877B

PT78877B - Antibiotics produced by kibdelosporangium aridum

Info

Publication number: PT78877B
Application number: PT78877A
Authority: PT
Original assignee: Smithkline Beckman Corp
Priority date: 1983-07-13
Filing date: 1984-07-10
Publication date: 1986-10-23
Also published as: CA1210721A; FI842807A; NO158814B; DK163001C; EP0132118B1; NO842863L; ES534248A0; ZA845336B; DK338784D0; HU193213B; JPH08835B2; US4548974A; ATE47142T1; PT78877A; DZ658A1; JPH0820595A; AU3040884A; NO158814C; JP2594777B2; JPH0820596A

Description

Descrição do K. aridum em meios vários

Todas as culturas foram incubadas a 28&C em placas de petri fechadas e observadas a intervalos atá 21 dias. As cores das culturas foram determinadas por comparação com as cores quer das "ISCC-NBS Centroid Color Charts" quer do "Dictionary of Color” /~Maerz, A, o M. R. Paul 2nd ed. Nem York: McGraaj Hill Book Co., Inc. (l950)_7.

Em extracto de levedura-agar de extracto de malte-crescimento excelente; crescimento vegetativo castanho amarelo acin zentado; . micálios aáreos de nenhum a muito poucos, brancos, estão presentes estruturas semelhantes a sporangium e cadeias de esporos; pigmento solúvel castanho-amarelo; cristais característicos presentes no agar.

Em agar de aveia - bom crescimento; crescimento vegetativo branco-sujo a castanho-amarelo; micálios aáreos raros, brancos, estão presentes numerosas cadelas de esporos e corpos com estrutura de sporangium; sem pigmentos solúveis; cristais caracterlsticos presentes no agar.

Agar de asparagina-glicerol - Crescimento razoável a bom; crescimento vegetativo castanho-amarelo claro; micálios aários raros a moderados, brancos, algumas cadeias de esporos mas poucas, se alguma, estrutura semelhante a sporangium; pig-

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-14mento solúvel castanho-amarelo acinzentado claro; cristais característicos presentes no agar.

Agar de amido-sais inorgânicos-bom crescimento; crescimento vegetativo branco-sujo a castanho-amarelo; micélios sérios raros, brancos, presentes cadeias de esporc3 e estruturas como a do esporàngio; seij^igraentos soláveis; cristais característicos presentes no agar·

Agar de sucrose-Czapek - bom crescimento; crescimento vegetativo de branco-sujo a castanho-amarelo; micélios aéreos raros, brancos, presentes cadeias de esporos e estruturas do t_i po esporàngio; presente pigmento solúvel de amarelo acinzentado a castanho-amarelo claro; presentes cristais característicos no agar.

Agar de Bennett - crescimento de bom a excelente; crescimento vegetativo castanho-amarelo acinzentado; micélios aéreos de nenhum a esparsos, brancos, presentes cadeias de esporos β estruturas do tipo esporàngio; pigmento solúvel castanho-amarelo; sem cristais no agar.

Agar nutriente - Crescimento de razoável a bom; crescimento vegetativo castanho-amarelo; micélios aéreos esparsos a moderados, brancos, presentes algumas cadeias de esporos e algumas estruturas do tipo esporàngio; pigmento solúvel castanho-amarelo; presença variável no agar de cristais característicos·

Agar brando de batata e cenoura - crescimento razoável, relativamente plano; crescimento vegetativo de branco-sujo a castanho-amarelo; micélios aéreos de esparsos a moderados, brari cos, presentes numerosas cadeias de esporos e estruturas do tipo esporàngio; sem pigmentos solúveis; não foram detectados cristais no agar.

Agar de Peptona-Extracto de Ferro de levedura - bom cre.s cimento; crescimento vegetativo castanho-bronze (Maerz & Paul 1689); sem micélios aéreos; pigmento solúvel preto acastanhado escuro; não foram detectados cristais no agar.

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-15Agar de Amido-Nitrato de caseína - Bom crescimento; micélios vegetativos de branco-sujo até castanho-amarelo; micôlios aéreos esparsos, brancos, presentes cadeias de esporos e estruturas tipo esporângio; presença variável de pigmento solúvel castanho amarelo claro; cristais característicos presentes no agar.

Agar de Extracto de Levedura-Glucose - Crescimento de bom a excelente; crescimento vegetativo de castanho amarelo escuro atá castanho amarelo acinzentado; raicôlios aéreos, não visíveis, sob ampliação 400X presentes cadeias de esporos esparsas mas nenhuma estrutura tipo esporângio; pigmento solúvel castanho amarelo escuro; cristais característicos presentes no agar.

Uma comparação da descrição do K. aridura com as descrições ds actinomicetos constantes no ^NBergey's Manual of Determi nativa Bacteriology”, a Lista Aprovada dos Nomes das Bactérias e outra recente literatura taxonóraica, indica que o K. aridura difere significativamente das espécies de actinomicetos anteriormente descritas e não pode ser incluído em qualquer dos géneros ds actinomicetos anteriormente descritos. Os esporângios, quando existem em outros géneros de actinomicetos, são verdadeiras vesículas ds esporos ("spore vesicles”); na maturidade contêm aplanosporos ou zoosporos que eventualmente são libertados por ruptura ou dissolução da parede do esporângio. Apesar de e>ç tensa observação e manipulação, a libertação de esporos da estru tura do tipo esporângio do K. aridum nunca foi observada. Quando colocadas sobre agar, as estruturas tipo-esporângio do K. aridum germinam pela produção de um ou mais tubos de germe directamente da estrutura do tipo esporângio.

A cultura tipo ATCC 39323 é aqui descrita como uma espécie ds um novo género KibdBlosporanqium aridum (de Kibdelos, adje£ tivo grego, falso, ambíguo; de spora, grego, uma semente; angiura, nome grego, um barco); o epíteto específico aridum (aridus, adjectivo latino, seco, árido) refere-se ao solo desértico do qual a cultura foi isolada.

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PREPARAÇÃO DO COMPLEXO AAD 216

O complexo AAD 216 pode ser produzido cultivando uma estirpe de Kibdelosporanqium com as características da ATCC 39323 □u de um seu mutante ou derivado, obtido por processos conhecidos na arte, em condiçães de submersão aeróbia num meio nutriente aquoso. 0 organismo cresce num meio nutriente contendo uma fonte de carbono assimilável, por exemplo, um carbohidrato assimilável. São exemplo de fontes de carbono adequadas a sucrose, lactose, maltose, manose, frutose, glucose e amido solúvel. 0 meio nutri, ente deverá tambám conter uma fonte de azoto assimilável como fa rinha de peixe, peptona, farinha de soja, farinha de amendoim, farinha de semente de algodão ou infuso de milho. Tambám podem ser incorporados no meio sais inorgânicos nutrientes. Estes sais podem incluir qualquer dos sais habituais capazes de fornecer sódio, potássio, amónio, cálcio, como o fosfato, sulfato, cloreto, brometo, nitrato, carbonato ou iães semelhantes.

A produção do complexo AAD 216 pode realizar-se a qualquer temperatura que conduza a um crescimento satisfatório do organismo, por exemplo, 152 - 422C, e é convenienteraente realizada de cerca de 252 atá 282C.

Normalmente o meio ê neutro mas o pH exacto pode variar entre 5.0 e 9.0 dependendo do meio usado.

A fermentação pode conduzir-se em balães de Erlenmeyer ou em fermentadores laboratoriais ou industriais de capacidades várias. Quando se vai usar um tanque de fermentação á desejável produzir um inóculum vegetativo num caldo nutriente, inoculando um pequeno volume do meio de cultura com as células vegetativas do organismo. Depois de obter um inóculum desta maneira, transfere-se assepticamente para o meio do tanque de ferraen tação para produção em grande escala de antibióticos. 0 meio usado para o inóculum vegetativo pode ser o mesmo usado para fermentaçães maiores, ainda que possam ser usados outros meios.

Como á hábito em processos de cultura submersa aeróbia, fornece-se ar estéril através do meio de cultura. Mantém-se a agitação por meio de agitadores semelhantes aos da indústria de fermentação.

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-17Era geral obtém-se uma produção óptima do complexo após períodos de incubação de cerca de 144-186 horas em fermentadores de vaso agitado ou fermentadores tipo tanque. 0 curso da ferraen tação pode ser acompanhado por HPLC analítico.

0 complexo AAD 216 assim produzido contém os novos comp£ nentes bioactivos ou factores antibióticos individuais AAD 216A, AAD 216B e AAD 216C que podem ser isolados como acima se descreveu.

ACTIVIDADE BIOLOGICA

Á concentração inibidora mínima in vitro (MIC) do comple xo AAD 216, do complexo AAD 216 enriquecido, dos AAD 216A, AAD 216B, AAD 216C e da vancomicina foi determinada para um certo nú mero de microrganismos usando os processos de avaliação por microtitulador padrão. Mostram-se os resultados nos Quadros seguintes de A a E.

Espectro antimicrobiano

QUADRO A

Organismo do ensaio	Complexo AAD 216	AAD 216 A	MIC em AAD 216 B	Λο/ral
AAD 216 C	Vancomi cina
fleDh. aureus HH127	6,3	3,1	3,1	3,1	1,6
íTAbM· aureus SK&F 910	12,5	3,1	3,1	3,1	1,6
trsp. faecilis HH34358	1,6	0,4	0,4	0,8	3,1
'reteus mirabilis SK&F 444	>100	>100	>100	>100	100
eeli 12140 (SK&F 809)	>100	>100	>100	>100	100
(lsb. pneumonias 4200 (SK&F 798)	>100	>100	>100	>100	>100
‘ssudomonas aeruqinosa HH63	>100	>100	>100	>100	>100
srratia marcesens ATCC 13880	>100	>100	>100	>100	>100
>reteus morqani SK&F 179	>100	>100	>100	>100	>100
jtqwidencia SK&F 276	>100	>100	>100	>100	>100
atsrobacter cloacas HH31254	>100	>100	>100	>100	>100
alaonella qallinarum BC595	>100	>100	>100	>100	25
taph. epidermidis SK&F 2479	25	6,3	6,3	6,3	1,6
ísteria monocytoqenes SK&F2255 3,1	0,8	0,4	<\> 0,4	1,6
taph. epidermidis SK&F 651	100	50	25	25	1,6

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QUADRO B (Sensível à meticilina)

ι

Organismo do ensaio

MIC em ytiq/ml

	Complexo AAD 216	AAD 216 A	AAD 216 B	AAD 216 C	Vancomicina
Staph. aureus HH127	12,5	1,6-3,1	3,1	3,1	1,6
Staph. aureus SK&F 674	12,5	3,1-6,3	6,3	12,5	1,6
Wtapb. aureus SK&F 910	12,5	3,1	6,3	6,3	1,6
Staph· aureus SK&F 1761	12,5	3,1	3,1	3,1	1,6
Staph· aureus SK&F 2593	25	6,3	6,3	6,3	1,6
Btaph. aureus SK&F 2666	12,5	3,1	3,1	6,3	1,6
staph· aureus SK&F 2677	25	6,3	3,1	6,3	1,6
Staph. aureus SK&F 2678	25	6,3	6,3	6,3	1,6
Staph. aureus SK&F 2680	12,5	3,1-6,3	6,3	6,3	1,6
Staph· aureus SK&F 2682	25	3,1-6,3	6,3	3,1	1,6
Staph. aureus SK&F 2736	25	3,1-6,3	6,3	6,3	1,6
Staph. aureus SK&F 2776	50	12,5	6,3	12,5	1,6
Staph. aureus SK&F 2777	12,5	3,1	3,1	3,1	0,8
Staph. aureus SK&F 2613	6,3	1,6	1,6	1,6	1,6
Staph. aureus SK&F 2615	12,5	3,1-6,3	6,3	6,3	3,1
QUADRO C (Resistente	à meticilina)
k Organismo do ensaio			MIC	era x/q/ml
P	Complexo	AAD	AAD	AAD
	AAD	216	216	216	Vancomicina
	216	A	B	C
Staph. aureus SK&F 675	50	12,5	6,3	12,5	1,6
Staph· aureus SK&F 2612	12,5	6,3	3,1	6,3	1,6
Staph· aureus SK&F 2614	6,3	3,1	3,1	3,1	1,6
Staph· aureus SK&F 2616	25	6,3-12,5	6,3	6,3	0,8
Staph. aureus SK&F 2620	25	6,3	12,5	12,5	3,1
Staph. aureus SK&F 2621	25	6,3	6,3	6,3	1,6
^taph. aureus SK&F 2594	25	6,3-12,5	6,3	6,3	1,6
Staph. aureus SK&F 2589	25	6,3-12,5	6,3	6,3	1,6
«aph. aureus SK&F 2590	25	6,3-12,5	3,1	6,3	1,6
Staph. aureus SK&F 2591	25	6,3	6,3	6,3	1,6
Stàph. aureus SK&F 2592	50	6,3	12,5	12,5	3,1
Staph. aureus SK&F 2595	25	6,3-12,5	6,3	6,3	/V 1,6
Staph. aureus SK&F 2596	25	6,3-12,5	6,3	6,3	3,1
Staph. aureus SK&F 2597	25	6,3-1^5	6,3	12,5	3,1

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QUADRO D (Anaeróbios)

Organismo de ensaio MIC em /vq/ml

	Complexo AAD 216	AAD 216 A	AAD 216 B	AAD 216 C	Vancomi cina
Kjicteroides fraqilis ATCC 25285	>32	32	32	32	32
jjr fraqilis H145	>32	16	16	8	32
3· fraqilis SK&F 3060	>32	32	16	16	32
3^ loeocbii SK&F 3087	>32	8-16	16	4	32
1» thetaiotamicron PSK&F 3089	>32	> 52	32	32	32
^r«eobacterium nucleatum ATCC 25586	>32	32	32	32	32
ílestridium perfrinqens MCP-1	< 0,016	<0,016	0,125	$0,016	0,5
S* perfrinqens MCP-2	$0,016	$0,016	0,125	$0,016	0,5
5M^:,j»erfrinqens	0,25	0,031-0,063	0,125	0,125	1,0
ATCC 19408
Zlotridium difficile SK&F 3062	1,0	0,25	0,25	0,5	2
< difficile SK&F 3065	1,0	0,5	0,25	0,5	4
difficile SK&F 3091	< 0,016	0,125-0,25	0,25	0,031	2
difficile SK&F 3092	1,0	0,125	0,25	0,25	2
difficile SK&F 3096	1,0	0,25	2	0,25	2
φ difficile SK&F 3098	<0,016	$0,016	2	0,031	2
	QUADRO E
Organismo de ensaio		MIC	em /«a/ml
	Complexo AAD 216 enriquecido	AAD 216A Vancomicina
S^aph. aureus HH 127		6,3		6,3	3,1
Itaph· aureus SK&F 910		V6,3		6,3	3,1
íiaph. aureus 209P		1,6		1,6	1,6
Itaph. aureus 209P-Mutante	100	100	>100
itaph. aureus SK&F 674		6,3		3,1	1,6
»taph. aureus SK&F 674-P6 Mutante		Λ/100	Aà 00 >100
itaph. aureus SK&F 675		12,5	12,5	3,1
itaph· spidermidis SK&F 2479	25	25	6,3

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Organismo de ensaio	MIC Complexo AAD 216 enriquecido	em Ao/ral AAD 216A	Vancomici
Staph. epidermidis SK&F 2683	100	100	6,3
Staph. epidermidis SK&F 651	100	100	6,3
Bfaph» epidermidis SK&F 2265	100	100	6,3
Strep. faecalis HH 34358	0,4	1,6	6,3
ft^ap. faecalis SK&F 657	0,4	0,8	3,1
iiateria monocytooenes	0,8	1,6	3,1
* SK&F 2255
£. coli 12140 (SK&F 809)	M00	>100	>100
Walmonella qallinarum	>100	>100	>100
0C595

fc

A actividade in vivo do AAD 216A, AAD 216B, AAD 216C e da uancomicina, medida como ED^q, foi demonstrada contra infeç. ção s.e. intraperitoneal com 46,8 de LD^q de Staph, aureus !H 127 em ratos por tratamento com antibióticos, 1 β 5 horas após a infecção. Os valores de ΕΟ^θ foram os seguintes: AAD 216A, 5,0 mg/kgj AAD 216B, 5,0 mg/kg; AAD 216C, 7,5 mg/kgj vancomi cina, 1,76 mg/kg.

Os compostos antibióticos incluindo o complexo AAD 216 e os componentes bioactivos principais AAD 216A, AAD 216B e AAD 216C e suas misturas, exibem actividade antibacteriana. 0 invento inclui no seu âmbito a preparação de composições farmacêuticas contendo pelo menos um dos acima mencionados compostos antibióticos e um suporte farmaceuticamente aceitável. As composições podem também conter outros agentes activos antibacterianos. As composições podem ser apresentada sob qualquer forma farmacêutica adequada à via de administração em questão. São exemplo destas composições as composições sólidas para administração oral como as pastilhas, cápsulas, comprimidos, pós e grâ nulos; as composições líquidas para administração oral como so •luções, suspensões,xaropes e elixires; e preparações para admi nistração parentérica como as soluções, suspensões ou emulsões estéreis.

Para utilização como agentes antibacterianos as composi.

ll*’ .

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çães são administradas de modo a que a concentração do ingrediente activo seja maior do que a concentração mínima inibidora para o organismo particular a tratar.

A actividade do complexo AAD 216 e dos seus componentes AAD 216A, AAD 216B e AAD 216C foi demonstrada in vitro contra um total de 58 isolados de mastite bovina, usando o método de di. luição de agar convencional para determinar as concentraçães mínimas inibidoras (MICs). As MICs para o complexo AAD 216, AAD 216A, AAD 216B e AAD 216C variaram de 0,25 até >128 ^/cg/ml,

0,13 a >128 y/q/ml, 0,06 atê > 128 y^g/ml e de 0,06 a >128 ytg/ml, respectivamente. Em comparação, a vancomicina teve MICs, para os mesmos microrganismos, de 0,25 a >128 y^/ml.

ACTIVIDADE PROMOTORA DO CRESCIMENTO

|

ÍS

1

I

1

i

A actividade promotora do crescimento, do complexo AAD 216 e dos seus componentes AAD 216A, AAD 216B e AAD 216C, foi determinada num modelo in vitro de suíno para predizer a utilidade em animais monogástricos, como os porcos e criação; num mçi delo in vitro de rúmen para predizer a utilidade na produção de carne de vaca, leiteira e de carneiros β in vivo num modelo de crescimento de frangos.

Modelo in vitro de suínos.

1

|

í

I

ÍÊ

I

Um porco castrado Yorkshire é cirurgicamente preparado quer com cânula ileal colocada a 15 cm da junção íleo-cecocolica, quer com cânula cecal colocado a meio caminho entre o apex e a origem do cecum. 0 animal é alimentado 4 vezes por dia restringindo a ingestão a 4,5% do peso do corpo em animais de 30 kg

ou a 2,5% do peso do corpo em animais	de 100 kg.	A ração de
crescimento de suínos é	(% m/m)	(kg/T)
Cereal c/ casca, de moagem média	70,60	640
Farinha de soja, 44%	22,00	200
Farinha de luserna desidratada,17%	4,50	41 .
Propionato de cálcio	0,15	1,4
Mistura vitaminas/sais minerais	2,75	25·

iii.·

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-22A amostragem de material, via cânula, começa 150-180 mi nutos depois da primeira alimentação da manhã e continua em qual, quer altura, de 30 a 120 minutos depois, dependendo da quantidade de material necessária· A amostra ê mantida em gelo moído, não mais fria do que 5SC, continuamente gaseificada com anidrido carbónico. 0 material recolhido é filtrado. 0 filtrado á o ing culum usado para as incubações do ensaio e amostras de controle. 0 inoculum gaseificado, 2,25 ml, ê colocado em cada um de 10 tubos de ensaio gaseificados, contendo cada um 0,75 ml de uma solu ção nutriente e 0,5 mg de cada composto em ensaio. Ao mesmo tem po que os tubos de ensaio com o composto, são tambóm incubados 4 tubos de controle, brancos, durante 5 horas a 373C sob agitação. São ainda incluídos 4 tubos mais, "mortos", não incubados.

Cada um dos tubos ê tratado com 0,60 ml de uma solução a 25% de ácido metafosfórico e depois guardado a -4SC atê análise. As amostras são descongeladas e centrifugadas durante 25 mi nutos a 20000 rpm. Decanta-se □ líquido sobrenadante, amostra-se para cromatografia gasosa e análise automática. Os resultados são introduzidos num computador para acabamento de modo a rg ferir números em que o valor do branco de controle seja 100%. Cg mo controles positivos usa-se a virginiamicina e Vancomicina.

Composto (PPM)	VFA* (% Controle)	LYS* (% Controle)	GLU* (% Controle)	LAC* (% Controle)
Virginiamicina
(166,67)	93	163	197	81
(16,67)	130	127	191	76
(1,67)	248	82	182	70
Vancomicina
(166,67)	250	48	190	64
(16,67)	280	42	189	59
(1,67)	92	83	100	99

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-23VFA*

(% Controls)

LYS*

(% Controle)

GLU*

(% Controle)

LAC*

(% Controle)

Composto (ppm) Complexo AAD 216

(666,67)**	267	44	189	58
(166,67)	345	50	195	51
(66,67)	390	53	188	46
(16,67)	124	81	113	93
(6,67)	90	101	96	100

0AB 216A

(166,67)	326	63	187	58
(16,67)	379	50	191	47
(1,67)	101	94	97	99
AAD 2168
(166,67)	290	50	190	56
(16,67)	365	55	184	47
(1,67)	102	98	97	98
AAD 216C
(166,67)	294	42	191	57
1 (16,67)	398	53	188	45
1' '(1,67)	101	95	96	98
* VFA refere-se ao	total	de ácidos gordos	voláteis,	nomeadamente aceta
to, propionato,	isobutirato, butirato,	isovalerato	e valerato. LYS

6 lisina, GLU é glucose e LAC é ácido L-láctico.

0 complexo AAD 216 contêm 25% de uma mistura de AAD 216A, AAD 216B e AAD 216C.

Modelo in vitro do rumen

0 protocolo para o modelo in vitro do rumen ê análogo ao protocolo para o modelo in vitro do suíno com as seguintes modificações :

(l) Um novilho de 400 kg á cirurgicamente preparado com uma cânula de rúraen.

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(2) 0 animal é alimentado uma vez por dia com a seguin-24-

te ração:

Alimento pronto % p/p

Cascas de sementes de algodão 44,0

Cereais partidos 22,0

Feno de luzerna (l^w) 20,0

Suplemento pelatizado 10,0

Molassos líquido 4,0

100,0

*5upleroento peletizado % p/p

Farinha óleo de soja (50% proteína) 50,0

Cereal, moagem média 32,5

Fosfato D/cálcico 6,50

Sai simples 2,50

Calcareo moído (Thomasville) 3,50

Ureia 2,50

XX

Mistura de vitaminas A e D^ 2,50

100,00

**Mistura de vitaminas A e D^ % p/p

Vitamina A (30.000 IU/gm) 5,87 Vitamina (16.000.000 IU/lb 0,50 Cereal finamente moldo 93,63

100,00

(3) A produção de VFA aqui descrita é a produção de pro pionato como percentagem da produção total de VFA.

(4) A amostragem de material, via cânula, faz-se 120 minutos depois da alimentação.

62 765

SKB CASE 14168

	UFA* (# Controle)	LYS* (# Controle)	GLU* (# Controle)	Propionato # (# Controle)
Composto (ppm)
Vancomicina
(50,0)	107	97	189	127
(5,0)	108	85	165	130
(0,5)	97	83	17	105

Avoparcina
(50,0)	113	97	141	132
\| (5,0)	105	85	166	121
(0,5)	103	96	116	106
KonOnsina sódica
(50,0)	109	147	0	156
(5,0)	104	141	126	149
(0,5)	94	109	11	119
Complexo AAD 216
(200,0)7*	118	116	78	159
(50,0)**	117	101	11	159
(20,0)**	115	95	193	130
\| (2,0)**	101	92	60	102
AAD 216A
(50,0)	111	114	153	146
(5,0)	93	90	28	135
(0,5)	94	96	121	105
AAD 216B
(50,0)	111	124	20	148
(5,0)	121	107	0	141
(0,5)	100	103	45	103
AAD 216C
(50,0)	101	110	0	151
(5,0)	111	96	45	136
(0,5)	83	103	29	120

62 765

SKB CASE 14168

-26-

VFA refere-ss ao total de ácidos gordos voláteis, nomeadamejn te acetato, propionato, isobutirato, butirato, isovalerato e valerato. LYS é lisina e GLU á glucose.

** ' 0 complexo AAD 216 contám 25% de uma mistura de AAD 216A,

AAD 2168 e AAD 216C.

Estudo do Crescimento de Frangos

Pintos de um dia escolhidos pelo peso, estado de saúde e sexo, são guardados num quarto de ambiente controlado a uma temperatura de 8O0F (26,7SC) e humidade de 40/. Os pintos são alimentados ad libitum. ffgua disponível ad libitum. E fornecida uma alimentação à base de centeio e cereais durante o periodo

de aclimatação (nos dias 1 e 2), o produto a ensaiar ou que se col nos dias 3 a 17. Usam-se 8 gaiol tos) para cada ensaio ou grupo de Dieta à Base	ração que se mistura depois com oca nas condições de controle, as (64 pintos) ou 16 (128 pincontrole. de Centeio
Ingredientes da Dieta	H_eZb1 ...(-K.gZ.tg.nl
Centeio moído fino	54,4 494
Farinha de soja (49/ proteína)	27 245
Farinha de carne e ossos (50/ proteína) 10 91
Farinha de luserna seca	1,25 11
Gordura animal	4 36
Soro seco (ou lactose)	1 9
Calcâreo moído	0,67 6
Fosfato dicálcico	0,50 4,5
Sal iodado	0,23 2
Mistura de vitaminas	0,175 x
Mistura de sais minerais	0,25 2
DL metionina (98/)	0,45 4
Cloreto de colina (50/ sol. aq.)	0,150** 1,4

A mistura de vitaminas será incluída nas dietas quando se juntam os produtos químicos do ensaio. 87,5 g de mistura de vitaminas/49.912,5 g de dieta à base de centeio.

Uma vez que se junta colina na forma de solução aquosa a 50%, dobra-se a percentagem na dieta.

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SKB CASE 14168

Dose # de --Peso----- —-Alimento/Ganho de

PPM Reps Dia 10 Dia 17 3-10 10-17 3-17 D.Cka

-27-

			......	de Controle------
tfirginiamicina	10,0	B 103,8	116,0	97,4	83,6	90,4	2
íirginiamicina	50,0	8 105,0	121,3	93,2	74,6	83,2	1
*Coaplexo AAD 216	40,0	8 107,7	132,4	90,9	69,6	79,6	2
^Complexo AAD 216	160,0	8 106,1	117,1	91,0	80,1	85,3	3
		----gramas——	-----gramas/grama.....
Centeio de contr£ le	0,0	8 164,2	280,4	1,577	2,815	2,209	2
Xntrole histórico		169,1	298,4	1,566	2,563	2,080
C.V. entre aves	3,71%
* 0 complexo AAD 216 contêm 25% de uma	mistura	de AAD	216A, AAD	216B e

AAD 216C.

As composições alimentares deste invento incluem rações normais alimentares de animais produtores de carne e leite suple mentadas por uma certa quantidade de ingrediente activo escolhido no grupo constituido por complexo AAD 216, AAD 216A, AAD 216B, AAD 216C ou uma sua mistura que seja efectiva na melhoria da taxa de crescimento e eficiência alimentar dos animais mas que não seja tóxica ou nociva ao ponto dos animais reduzirem a ingestão da ração. A quantidade de ingrediente activo varia, como S sabi do na arte, com factores como o custo do ingrediente, a espécie e o tamanho do animal, a actividade relativa do composto de fórmula I ou tipo de ração alimentar utilizada como alimentação básica.

São rações alimentares representativas para suínos e aves as seguintes:

Uma ração de suínos utilizada para crescimento de porcos de engorda de 40-100 libras (18-45 kg) de peso de corpo, preparja -se pela fórmula seguinte:

62 765

SKB CASE 14168

-28-

Milho moído	78,15%
Farinha/óleo de soja, 44%	17,0%
Aparas de carne, 50%	3,0%
Saborizantes de carapaça de ostra	0,4%
Farinha de ossos	0,5%
Oxido de zinco	0,01%
Suplemento de Vitaminas A, B, B^ ⁸ 0	optativo
Prepara-se uma ração para frangos i:	usando a segui
Farinha de milho amarela	67,35%
Farinha/ôleo de soja	24,00%
Farinha de peixe menhadera	6,00%
Farinha de ossos (vapor)	1,00%
Calcário moído	1,00%
Sal iodado	0,34%
25% cloreto de colina	0,13%
Vitamina B₁₂	0,10%
Sulfato de manganêsio	0,02%
Mistura de vitaminas	0,06%

O':!

Qs alimentos para suínos desde as rações para substituir a amamentação atê às de engorda ou de acabamento podem ser suple mentadas. Os suínos comem desde cerca de 2 lb (0,9 kg) de ração por dia (para um porco de 25 lb = 11 kg) atê 9 lb ( 4 kg) por dia (para um porco de 150 lb = 68 kg). A maior parte das rg ções tem uma base de milho suplementada com ensilados de legumes, farelo de trigo, aveia, cevada, melassos cu um suplemento protei. co.

A alimentação de aves compreende as rações de início, rg ções para frangos e rações para postura. Baseiam-se em geral era milho moído, farinha de milho ou farinha de soja. As rações para frangos frequentemente contêm suplemento altamente enérgicos tal como gorduras, proteínas e vitaminas. As rações para perús são semelhantes mas apenas incluem dois tipos, a ração inicial e a de crescimento. Galinhas e faisões comem de 0,03-0,3 lbs {θ,014-0^¾) de alimento por dia, os perús comem duas vezes mais. A ingestão de alimento depende do peso e idade do animal produtor

62 765

SKB CASE 14168

ds carne·

ijiií

«

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1.

Ι?

B

Os ingredientes activos escolhidos entre □ grupo constituído por complexo AAD 216, AAD 216A, AAD 216B, AAD 216C ou uma sua mistura, são uniformemente misturados com aquelas rações para se obterem rações suplementadas que são depois fornecidas segundo o hábito que muitas vezes é ad libitum. Para isto é conveniente que o produtor prepare para venda, quer a formuladores quer a operadores dos lotes de alimento, uma premistura do promotor de crescimento deste invento, opcianalmente combinado ou não com outros suplementos conhecidos da arte tais como um antihelmíntico, uma fonte de azoto ou um antibiótico, por exemplo, virginiamicina ou oxitetraciclina. A concentração de ingredientes activos escolhidos entre o grupo constituído pelo complexo AAD 216, AAD 216A, AAD 216B, AAD 216C ou uma sua mistura, na prômistura ê habitualmente de 5 a 75% em peso ou uma concentração 100 a 2000 vezes maior do que a da ração alimentar completa.

A forma da prémistura pode ser líquida ou sólida. Os veículos para a prémistura são óleo de milho, óleo de algodão, melassos ou destilados solúveis, para uma forma líquida da prémistura.

Para preparações da prémistura em forma sólida são frequentemente usadas como bases a sucrose, lactose, farinha de milho, milho moído, farinha de trigo, carbonato de cálcio ou farinha de soja. A prémistura é depois misturada uniformemente com a ração que é fornecida ao animal em questão. As composições des. tas misturas estão incluídas nos termos "composições alimentares" aqui usados.

A concentração dos ingredientes activos, escolhidos entre o grupo que consiste no complexo AAD 216, AAD 216A, AAD 216B, AAD 216C ou numa sua mistura, na ração completa é uma quantidade não tóxica mas activa, escolhida p. ex. de 1 a 1000 partes de ingrediente activo, em peso, por um milhão de partes da ração total (ppm) ou cerca de 2 a 115 gramas por tonelada. Há vantagem em escolher uma quantidade não tóxica de ingrediente activo da ordem dos 10 a 50 ppm.

0 método deste invento inclui o fornecimento a monogástricos ou ruminantes, animais produtores de carne ou leite, es1/

ii62 765

SKB CASE 14168

-30pecialmente gado bovino β leiteiro, carneiros, porcos e aves, de una quantidade, não tóxica e promotora efectiva do crescimento, de um ingrediente activo escolhido entre o grupo constituido pelo complexo AAD 216, AAD 216A, AAD 216B, AAD 216C ou suas misturas. Outros animais monogástricos cujo tracto digestivo também se caracteriza por fermentações no cscum ou câmara tipo cecum são os coelhos e os cavalos.

As rações alimentares suplementadas acima referidas são dadas ao animal por métodos já conhecidos na arte. A alimentação ad libitum no pasto, no cercado ou na zona de crescimento é da maior conveniência para aumentar a taxa de crescimento e de produção leiteira do animal e para aumentar a eficiência alimen tar da operação.

Os seguintes exemplos ilustram a produção, isolamento e purificação dos antibióticos do presente invento e não devem ser considerados limitantes do presente invento que se descreve nas reivindicações apensas.

Os meios nutrientes usados nos exemplos seguintes têm as composições abaixo indicadas. Os rendimentos para as fermentações foram obtidos por HPLC analítica, por comparação com quaji tidades de amostras autênticas.

0 meio 13 (H) foi usado para sementeira da SK&F-AAD 216 ao longo das experiências. Os ingredientes do meio 13 H são: amido 15 g/l; sucrose 5 g/l; dextrose 5 g/l; soja -HY 7,5 g/l; licor de infusão de milho 5 g/l; ^ΗΡΟ^ 1,5 g/l; NaCl 0,5 g/l; CaCO^, 1,5 g/l; e "Mineral S" 5 ml/l; pH até 7,0.

"Mineral S" tem as seguintes composições:

ZnS0₄7H₂0, 2,8 g/l; FeÍNH^HC^O?, 2,7 g/l;

CuS0₄.5H₂0, 0,125 g/l; MnS0₄.H₂0, 1,0 g/l;

CoC1₂.6H₂0, 0,1 g/l; Na^^.H^, 0,09 g/l; a Na₂No0₄.2H₂0, 0,05 g/l.

Os ingredientes do meio V-2 são: farinha de soja 15 g/l; melassos de beterraba 10 g/l; glucose 10 g/l; "Estrasan 4" (metil oleato) 10 g/l; e NaCl 0,3 g/l a um pH de 7,2.

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SKB CASE 14168

-311

EXEMPLO 1

Primeira Sementeira

0 desenvolvimento completo de uma cultura inclinada de K, aridum foi suspenso em 10 ml de água estéril α inoculado assepticamente numa garrafa aspiradora de 4 1 contendo 500 ml de meio 13 H. Apés incubação num agitador rotativo, 250 rpm, a 28QC durante 3 dias, a cultura desenvolvida foi então empregue para inocular □ vaso de vidro de 14 1 do fermentador do Exemplo 2 para produzir a segunda sementeira·

EXEMPLO 2

Segunda Sementeira

Um vaso de vidro de 14 1 de fermentador (New Brunswick Model 19) com 10 1 de meio estéril 13 H foi inoculado assepticamente com 500 ml de cultura vegetativa do Exemplo 1. 0 vaso foi

manuseado de acordo com a seguinte técnica:

Agitação : 400 rpm de 0 - 72 h Arejamento : 0,4 v/v/m* de 0 - 72 h Temp. : 28SC

* v/v/m - volume de ar por volume de meio por minuto.

Cindo litros da cultura vegetativa resultante foi então usada para inocular □ fermentador de 75 1 do exemplo 3 para produzir uma terceira sementeira.

EXEMPLO 3

Terceira Sementeira

Um fermentador de 75 1 (Chemapec) foi manipulado da mesma forma que no Exemplo 2. Usaram-se cinco litros da cultura ve getativa do Exemplo 2 para inocular o fermentador de 75 1 contsji do 50 1 ds meio 13 H. 0 aparelho de fermentação foi utilizado como seguo:

Agitação : 250 rpm de 0-72 h

Arejamento : 0,4 v/v/ra de 0 - 72 h

Temp. : 28SC

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SKB CASE 14168

-32Cinquenta litros da cultura vegetativa resultante foram então empregues para inocular o fermentador de 750 1 do Exemplo 4 para produzir □ desejado complexo AAD 216.

EXEMPLO 4

Produção de complexo AAD 216

Um fermentador de 750 1 (ABEC) foi utilizado de forma s£ melhante ao Exemplo 3. Cinquenta litros de cultura vegetativa do Exemplo 3 foram utilizados para inocular assepticaraente o fejr mentador de 750 1 contendo 600 1 de meio V-2. 0 fermentador foi

utilizado como segue:

Agitador Arejamento T e mp ·

120 rpm de 0-168 h 0,3 v/v/m de 0 - 168h 26QC

0 caldo de fermentação continha o complexo AAD 216 que era composto pelos factores antibióticos individuais como segue:

AAD 216A =50 /g/mlí AAD 216B = 60,8 y<g/inlí e AAD 216C = 43,5 ^fcg/ml.

EXEMPLO 5

Produção de Complexo AAD 216

Um fermentador 450 1 (Chemapec) foi utilizado de forma análoga ao Exemplo 4. Trinta litros de cultura vegetativa (te_r ceira sementeira) produzida de acordo com o Exemplo 3 faram usa dos para inocular assepticamente o fermentador de 450 1 contendo 300 1 de meio V-2. 0 fermentador foi utilizado como segue:

Agitação : 120 rpm de 0-168 h

Arejamento : 0,4 - 0,5 v/v/m

Temperatura: 262C

0 caldo de fermentação continha o complexo AAD 216 que ergtomposto pelos factores antibióticos individuais como segue:

AAD 216A = 46,2 ^cg/ml AAD 216B = 75 /tg/ml 22D 216C = 48 ^>g/ml.

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SKB CASE 14168

-33EXEMPLO 6

I

........

,ϊ

lt

io «

'Is

d-

R; '

/Β'"''

Rí

Isolamento do Complexo AAD 216

0 caldo de fermentação total (600 l) do Exemplo 4 foi clarificado por filtração em tambor rotativo (Komline-Sanderson, Laboratory Scale Model) usando auxiliar de filtração (Hyflo Supercel, Johns-Manville Products Corp.) ao pH existente bo caldo (pH 7,7 - 8,2). 0 filtrado do caldo (420 l) foi esfriado atá 42 C por tratamento de lotes de 100 1 numa tina colocada num banho frio (metanol/gelo seco). 0 filtrado do caldo arrefecido foi eri tão precipitado por adição lenta de ácido clorídrico concentrado, com agitação, atá pH 3,0. 0 precipitado resultante foi recupera

do por filtração no vácuo, rotativa, usando auxiliar de filtração como foi previamente descrito. 0 bolo de adjuvante de filtração-produto precipitado foi extraída por tratamento com água desionizada (55 l) e ajustamento a pH 7,0 durante 10 minutos. 0 extracto aquoso assim obtido foi filtrado por papel de filtro Whatman ηδ. 4 para remover o adjuvante de filtração. 0 filtrado assim obtido foi passado por duas colunas de resina XAD-7 (8,5x xllO cm) com uma velocidade de fluxo de 0,5 vols/h. Apôs lavagem com 8 volumes de água desionizada (pH 7,0) o complexo AAD 216 foi recuperado por eluição com metanol aquoso (50-100%). 0 elua

do(s) metanólica contendo o desejado complexo AAD 216 foi conceg trado por evaporação usando ura evaporador de película ascendente a 358C. 0 concentrado aquoso resultante foi liofilizado num lio

filizador de prateleira Virtis, produzindo 85,1 g de complexo AAD 216.

(r)

Este complexo AAD 216 foi cromatografado com Partisil'²' Whatman Prep 40 ODS-3 (l kg) num Chromatospac-Prep 100 Jobin Yvon (gradiente 15 a 33 por cento de acetonitrilo - 0,1 M tampão de fosfato pH 3,2) para produzir um complexo AAD 216 enrique eido que por análise HPLC continha 1,88 g de AAD 216A, 2,6 g de AAD 216B e 2,8 g de AAD 216C.

EXEMPLO 7

Uma amostra de um complexo AAD 216 enriquecido isolado

Isolamento de AAD 216A, AAD 216B e AAD 216C

62 765

SKB CASE 14168

-34de acordo com o Exemplo 6 (38 g não-desionizada) que por análise HPLC continha 0,42 g de AAD 216A, 1,39 g de AAD 216B e 0,08 g de AAD 216C, foi dissolvida em 1 1 de acetonitrilo 15% em tara pão de fosfato 0,1 M pH 6 e o pH ajustado a 6,3. Esta solução foi analisada num HPLC Waters Prep 500® oom coluna Partisil® Whatman 40 (ODS-3) (50 cm x 4,8 cm) com uma velocidade de fluxo de 200 ml/minuto. A coluna foi então eluída usando o seguinte gradiente:

(l) acetonitrilo aquoso a 20% e solução tampão atê ser eluldo material polar (detector ultravioleta a 210 nm);

(2)

eluído;

(3)

eluído;

(4)

seja eluído

(5)

solução tampão acetonitrilo 24% até AAD 216A ser

solução tampão acetonitrilo 26% até AAD 216B ser

solução tampão acetonitrilo 28% atê que AAD 216C e

acetonitrilo aquoso a 50%.

As fracções apropriadas que foram eluídas da coluna HPLC foram depois desionizadas como descrito abaixo obtendo-se os antibióticos individuais puros: AAD 216A, 0,25 g; AAD 216B, 1,05 g; e AAD 216C, 0,06g.

0 processo de desionização envolveu a junção das fracções apropriadas da HPLC e remoção do acetonitrilo a pressão rje duzida. As amostras aquosas resultantes foram lançadas numa c£ luna de resina XAD-7 e eluídas com água desionizada até a condu tividade do eluado ser menos que 25 microMHO. A coluna foi então eluída com acetonitrilo aquoso (40-60%) e o eluente liofili zado para se obterem os produtos desejados.

EXEMPLO 8

W'

Isolamento do complexo AAD 216 enriquecido

Uma amostra de 10 g de complexo AAD 216 isolada de acordo com o protocolo XAD-7 do Exemplo 6 que continha 0,69 g de AAD 216A, 0,23 g de AAD 216B e 0,21 g de AAD 216C (análise HPLC) foi dissolvida em acetonitrilo a 17,5 por cento e solução tampão de fosfato 0,1 M pH 6.. 0 pH da solução foi ajustado a 6,3 e esta

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SKB CASE 14168

-35-

solução foi colocada num cromatógrafo liquido alta pressão Watars Prep SOO^ç equipado com uma coluna de 50 cm x 4,8 cm cheia com Partisil^ Whatman Prep 40 (ODS-3). A coluna foi eluida com ac_e tonitrilo a 20 por cento e solução tampão para remover material polar e depois eluida com solução tampão de acetonitrilo a 28% para se obter o complexo enriquecido AAD 216 na solução acetoni trilo-tampão. 0 acetonitrilo foi removido do eluente a pressão reduzida e a solução aquosa resultante foi obtida numa coluna de resina XAD-7 e lavada com água desionizada até a conductividade do produto ds salda ser inferior a 25 micro MHQ. A coluna foi sntão eluida com acetonitrilo aquoso (40-60%) e o eluente liofi lizado para se obterem 2,05 g de complexo AAD 216 enriquecido que continha 0,59 g de AAD 216A, 0,20 g de AAD 216B e 0,20 g de AAD 216C.

EXEMPLO 9

Processo de isolamento alternativo

Alternativamente, o complexo AAD 216 após purificação XAD-7 foi cromatografado utilizando o processo do Exemplo 7 para maximisar a recuperação conseguindo-se AAD 216A, AAD 216B e AAD 216C em estado relativamente puro.

0 AAD 216A assim obtido ds quatro corridas individuais (contendo 3,9 g, 2,6 g e 2,2 g de AAD 216A por análise HPLC) foi combinado e recromatografado na mesma eluição HPLC isocratj. ca eluindo com acetonitrilo a 22% e tampão de fosfato 0,1 M pH 6 para obter, após desionização, 4,6 g de AAD 216A de um corte médio num estado altamente puro. As outras fracções foram recicladas para posterior purificação.

0 AAD 216B assim obtido das mesmas corridas individuais (contendo 2,5 g, 3,7 g, 3,7 e 1,4 g por análise HPLC) foi combinado e recromatografado na mesma eluição isocrâtica HPLC com acetonitrilo a 26% e tampão de fosfato 0,1 M pH 6 para conseguir, após desionização, 2,7 g de AAD 216B de um corte médio em elevado estado de pureza. As outras fracções foram recicladas para posterior purificação.

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,ν

-36EXEMPLO 10

Isolamento alternado do complexo enriquecido AAD 216

0 complexo AAD 216 isolado de acordo com o protocola do Exemplo 6 que continha aproximadamente 720 mg de AAD 216A, AAD 216B e AAD 216C foi dissolvido em água (200 ml) e filtrado. 0 filtrado foi misturado com 70 ml de um adsorvente cromatogrãfico a fim de Affi-Gel^ 10-D ala-D ala (633 mg D ala-D ala) em tampão de fosfato de sódio 0,02 M pH 7,0 (ver Cuatrecasas e outros , Biochemistry, Vol. 11, Ns. 12, pp 2291-2298 (1972) para processo geral) e agitado suavemente durante l/2 hora. A mistu ra foi vasada numa coluna e a fase aquosa foi elulda. A coluna foi lavada com: tampão de fosfato 0,02M pH 7,0 (2 x 250 ml); 0,5 M NH^OAc pH 7,8 (2 x 250 ml); H₂Q (250 ml); 0,1 M pH 7,8 NH^ OAc (250 ml); H₂0 (250 ml); acetonitrilo aquoso 40% (70 ml); acetonitrilo aquoso 40% (1400 ml); e acetonitrilo a 30% em NaHCO^ 0,4 M (2 x 250 ml). A fracção acetonitrilo aquoso a 40%, de 1400 ml, foi liofilizada para se obterem 607 mg de complexo enriquecido AAD 216 contendo 224 mg de AAD 216A, 133 mg de AAD 216B e 158 mg de AAD 216C.

-

Claims

REIVINDICAÇÕES1 - Processo de preparação de um complexo antibiótico AAD 216 pela cultura de microrganismos Kibdelosporanqium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323 ou de mutantes seus, num meio nutriente aquoso contendo fontes assimiláveis de azoto e de carbono sm condiçães de submersão aeróbia atê que se produza uma quantidade substancial do complexo AAD 216, isolando depois o complexo AAD 216 assim preparado.
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1 que compreende ainda o isolamento dos componentes do complexo AAD 216 enriquecido AAD 216A, AAD 216B e/ou AAD 216C.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 1 onde a cul. tura do microrganismo ocorre a uma temperatura de 15S a 42SC.

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SKB CASE 14168

-374 - Processo de acordo cora a reivindicação 1 onde a cul tura do microrganismo se prolonga por 3 a 8 dias.