KR860001231B1 - A47934 항생물질의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

A47934 항생물질의 제조방법
제1도는 항생물질 A47934의 적외선 흡수 스펙트럼(KBr법)을 나타내는 도.
본 발명은 이전에 알려지지 않은 미생물인 스트렙토마이세스 토요카엔시스(Streptomyces toyocaensis) NRRL 15009(기탁기관 : 한국 종균협회, 기탁일 : 1983년 6월 14일, 기탁번호 : KFCC 10042]의 배양에 의한 항생물질 특성을 갖는 신규 발효 생성물의 제조방법에 관한 것이며, 더욱 특히 본 발명은 다음 구조식(I)의 신규 항생물질 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 제조방법에 관한 것이다.
Figure kpo00001
대부분의 미생물은 병원성이며 인간과 동물의 질병 상태를 야기시키는 요인이다. 수 많은 항생물질이 개발되었으며, 이중 일부는 한가지 이상의 병원성 미생물에 대하여 활성을 나타낸다. 그러나, 병원성 미생물의 항생물질-특이 저항성 균주가 나타나게 되었기 때문에 새로운 항생물질의 개발에 대한 필요성이 절실하게 되었다. 특히, 그람 양성균 스타필로코커스(Staphylococcus) 및 스트렙토코커스 (Streptococcus)에 속하는 병원성 미생물은 페니실린 및 에리스토마이신과 같이 통상 사용되는 항생물질에 대하여 저항성이 있다. 〔참조예, W.O. Foye, Principles of Medicinal Chemistry, pp,6840686(1974)〕.
글리코펩타이드 항생물질에 속하는 A47934 항생물질은 그람양성 미생물에 대하여 작용한다. 본 분야에서 이미 알려진 글리코펩타이드 항생물질로는 그중에도 특히 반코마이신 〔미합중국 특허 제3,067,099호 ; 구조는 Williamson et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 6508-6585(1981)에 의해 기술되었다〕; 악타플라닌(항생물질 A-4696) 〔미합중국 특허 제3,952,095호, 구조중의 일부는 미합중국 특허 제4,332, 343호에 기술되었다〕; 리스토세틴 〔영국 특허 제765,886호, 리스트세틴 복합체의 한 인자인 리스토세틴 A의 구조는 Kalman et al, J. Am. Chem. Soc. 102, 897-905(1980)에 의해 기술되었다〕; 및 아보파르신 〔미합중국 특허 제3,338,786호, 구조는 Ellestad et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 6522-6524(1981)에 의해 기술되었다〕이 포함된다.
본 발명에 따르는 항생물질 A47934 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은 유용한 항생물질이다.
A47934 항생물질은 이전에 기술되지 않은 미생물인 스크렙토마이세스 토요카엔시스 NRRL 15009, 또는 A 47934-생성 돌연변이체 또는 변종을 탄소, 질소 및 무기염류의 동화원을 함유하는 배지중, 액침호기성 발효 조건하에서 배양하여 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 다음 구조식(I)의 신규항생물질 및 그의 약학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.
Figure kpo00002
항생물질 A 47934는 융점 >225℃(분해)의 백색 결정성 화합물이다. 고속-원자-포격질량 분광분석에 의해 측정하면 이 항생물질의 분자량은 약 1311 이다.
항생물질 A 47934의1H 핵자기 공명 스펙트럼은 실온, 디메틸설폭사이드 중에서 측정한다. 구조식중 6-원 환은 다음 식에서 지정된 바와 같이 알파벳 문자로 지정된다 :
Figure kpo00003
케미칼 쉬프트(Chemical Shifts)의 표는 다음과 같다.
[표 1]
케미칼 쉬프트*
Figure kpo00004
Figure kpo00005
* 치환가능한 부위는 기록되지 않았다.
분자량, 핵자기공명 및 원소분석치를 기초로 하여, 항생물질 A47934의 실험식은 C58H44Cl3N7O21S 로 확인된다. 물중의 66% 디메틸포름아미드내에서 신규항생물질의 전위차 적정은 약 5.85, 7.9 및 10.3의 pKa 값을 갖는 3개의 적정 가능한 그룹을 나타낸다. (초기 pH6.44). 적정기가 pH4.0 이하의 값을 측정할 수 없기 때문에, -SO3H 그룹의 pKa 값은 측정할 수 없었다. 적정 결과는 A47934 항생물질이 염기와 함께 쉽게 염을 형성할 수 있음을 나타낸다. 항생물질은 또한 pH3이하의 강산과 함께 염을 형성 할 수도 있다.
항생물질 A 47934
Figure kpo00006
=-1.99°(H2O, C=10mg/ml)의 비선광도를 갖는다.
KBr 법으로 측정한 항생물질 A47934의 적외선 흡수 스펙트럼은 첨부된 제1도에 보는바와 같으며, 다음과 같은 식별가능한 흡수극대가 관찰된다 : 3700 내지 2700(매우 브로드, 매우 강), 1658(강), 1615(중) 1590(중), 1510(강), 1491(중), 1472(약), 1429(중), 1398(중), 1326(매우 약), 1265(중), 1231(강), 1205(약), 1163(약), 1140(중), 1058(약), 1045(중), 1005(중), 849(중), 754(약) 및 719(약) cm-1.
산 및 중성 수용액중에서 항생물질 A47934의 자외선 흡수 스펙트럼은 281nm(ε, 10,850)에서 흡수극대를 나타낸다. 염기성 수용액에서 항생물질 A47934의 자외선 흡수 스펙트럼은 297nm(ε, 18,900)에서 흡수 극대를 나타낸다. A47934 항생물질은 이전까지 기술된 적이 없는 스트렙토마이세스 토요카엔시스 NRRL 15009의 균주를 배양하여 생성된다.
본 발명은 또한 이전까지 기술된 적이 없는 스트렙토마이세스 토요카엔시스 NRRL 15009 균주의 생물학적으로 순수한 배양물에 관한 것이다. 편의상, 이 배양물은 배양물 A47934.1로 표시한다.
배양물 A47934.1은 워싱톤의 클레이톤 베이에서 채취된 설물때의 모래 샘플로부터 최초로 분리된 배양물 A47934로 부터 자연 선택에 의해 유도된 변종 균주이다. 본 발명의 항생물질은 임의로 A47934 항생물질이라 칭한다.
배양물 A47934.1은 문헌에 공지된 스트렙토마이세스 그리세오플라부스(Streptomyces griseoflavus) ATCC 25456에 대한 설명〔Shirling and Gottieb, "Cooperative Description of Type cultures of Streptomyces," Imt. J. Syst. Bacterilo. 19(4), 391-512(1969)〕및 또한 문헌에 기술된 스트렙토마이세스 토요카엔시스 니시무라(Nishmura), 카타기리(Katagiri). 사또(Sato), 마야마(Mayama) 및 시마오까(Shimaoka), ATCC 19814에 대한 설명〔Shirling and Gottieb, "Cooperative Description of Type cult-ures of Streptomyces," Imt. J. Syst. Bacterilo. 18(2), 174(1968)〕과의 비교와 여러가지 보조시험을 기초로 하여, 스트렙토마이세스 토요카엔시스 균주로 분류된다.
배양물 A47934.1은 회색(GY) 계열의 포자체 색을 나타내며, 이것은 문헌에 기술된 에스·그리세오플라부스의 황색을 띈 회색 포자체〔Waksman, "The Actinomycetes Vol. II, page 222 : The Williams and Wilkins co., Baltimore(1961)〕와 구별된다. 또 다른 차이점은 에스. 그리세오플라부스가 만니톨과 람노즈를 이용하는 반면에, 배양물 A47934.1은 이용하지 않는다는 점이다.
배양물 A47934.1은 배양, 형태 생리적으로 에스·토요카엔시스 니시무라, 카타기리, 사또, 마야마 및 시마오까 ATCC19814와 유사하다.
A47934.1 배양물의 특정화
형태학
균주 A47934.1은 단축성으로 분지된(monopodially branching) 잘 발달되고 단열되지 않은 기중 균사체를 생성한다. 포장병(Sporophores)은 2내지 3지개의 코일의 개방되고 짧으며, 헐거운 나선중에 배열되며, 그러므로 균주 A47934.1은 프리담등의 나선균(S) 항에 위치한다〔Spirales(S) Section of Pridham et al., "A Guide for the Classification of Streptomycetes According to Selected Groups, Appl. Microbiol. 6, 52-79(1957)〕.
이러한 형태학은 3호 및 4호 ISP 배지상에서 가장 잘 나타난다. 성숙 포자 체인은 체인당 10 내지 50의 포자를 함유한다. 포자 형태는 장타원형 내지 타원형이며, 포자 표면에는 가시가 있다. 포자크기는 폭이 0.58 내지 0.71μM 범위이며 길이가 0.75 내지 0.88μM 이고, 평균크기는 폭이 0.65μM 이고 길이가 0.8μM이다.
배양특징
여러 배지상에서 배양물 A47934.1의 성장 특징은 다음 표1에 기술되어 있다. 색 명칭은 ISCC-NBS Centroid Color Charts Sample No. 2106(National Bureau of Standards, U.S. Department of Comm-erce, 1958) 및 Color Harmony Manyal, 4판(Color Standards Department, Container Corporation of America, Chicago, Illinois, 1958)에 따라 지정된다.
[표 1]
여러 배지 상에서의 배양 특징
G=성장, R=역전, Am=기중 균사체 Sp=용성 색소
배양물 A47934.1 및 스트렙토마이세스 토요카엔시스 ATCC 19814의 탄소 이용 방식은 ISP9호 기본 배지를 사용하여 여기에 필터-멸균된 탄소 공급원을 최종 농도 1.0%가 되도록 가하여 수행함으로써 비교한다. 플레이트는 30℃에서 14일간 배양한 후에 판독한다. 결과는 표 2에 기술되어 있다.
[표 2]
A47934.1과 에스·토요카엔시스 ATCC 19814의 탄소이용 방식
Figure kpo00008
-=이용하지 않음, +=이용함, ±=이용이 확실치 않음. ND=시험하지 않음.
세포벽 시험
미생물의 가수분해된 전 세포를 사용하여, 특징적인 당의 존재를 확인한다. 세포벽의 당은 엠. 피. 레챠베일러의 방법〔M.P. Lechavalier, "Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomycetes (Into Genera"〕의 변형법을 사용하여 측정한다. 이러한 방법은 Subcommittee on Actinomycetes of the American Society of Microbiology, (Dr. Thomas G. Pridham, Convenor)에 의해 후원되는 연구진에 의해 개발되었으며, Institute of Microbiology, Rutgers University, The State University of New Jersey, New Brunswick, N.J., (1971)에 지지되었다.
가수분해된 전세포벽을 사용하여 디아미노 피멜산의 이성체를 측정한다. 디아미노피멜산의 이성체는 베커등의 방법〔Becker et al., Appl. Microbilo. 11, 421-423(1964)〕을 사용하여 측정한다.
이러한 시험의 결과는 후술하는 바와 같다.
시 험 측정 결과
검출된 특징적인 당 글루코즈, 리보즈
2, 6-디아미노 피멜산의 이성체 LL-이성체
배양물 A47934.1과 에스·토요카엔시스 ATCC 19814의 특징 비교는 표 3에 기술되어 있다.
[표 3]
배양물 A47934.1 및 ATCC19814의 특징 비교
Figure kpo00009
ND=시험하지 않음
배양물 A47934.1과 스트렙토마이세스 토요카엔시스 ATCC 19814의 유사성 및 차이점의 요약은 표 4에 기술되어 있다.
[표 4]
배양물 A47934.1 에스·토여카엔시스 ATCC19814의 요약
Figure kpo00010
배양물 A47934.1은 Northern Regional Research Center, U.S.Department of Agriculture, Illinois 61604에 기탁되어(1982. 1.25) 저장 배양물을 구성하였으며, 이것으로부터 기탁번호 NRRL 15009호 사용 할수 있다. 〔기탁기관 : 한국 종균 협회, 기탁일 : 1983년 6우러 14일, 기탁번호 : KFCC 10042〕.
항생물질 A47934는 카복실산 작용기와 -SO3H 작용기르 모두 함유하기 때문에 산성이며 염기와 함께 쉽게 염을 형성할 수 있다. 본 발명의 항생물질은 또한 단지 pH 3 이하의 강산과만 염을 형성하는 아미노 그룹을 함유한다. 이렇게 하여 형성된 약학적으로 허용되는 염도 본 발명의 일부이다. "약학적으로 허용되는 염"이란 온혈동물의 화학 요법제로 유용한 염을 일컫는다. 항생물질 A47934의 대표적으로 적합한 염에는 카복실산 적용기 또는 -SO3H 작용기와 수산화나트륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 수산화칼슘, 수산화칼륨, 트리메틸아민, 수산화암모늄 및 디에탄올아민과 같은 염기와의 표준 반응에 의해 형성된 부가염 및 아미노그룹과 황산, 염산 및 인산과 같은 pH 3 이하의 산과의 반응에 의해 형성된 염이 포함된다.
항생물질 A47934는 그람 양성균에 대해 활성을 나타낸다. 이 항생물질은 또한 가금, 돼지 및 소의 성장촉진 및 사료이용 효율의 개선에 대하여도 활성을 나타낸다.
항생물질 A47934가 미생물의 성장을 억제하는 농도는 여러가지 시험방법에 의해 측정한다. 항생물질 A47934는 여러 종류의 혐기성 세균에 대한 활성을 시험하여 표 5에 기록된 바와 같이 활성이 있음을 확인하였다. MIC 값은 한천 희석법에 의해 측정한다.
[표 5]
혐기성 세균에 대한 항생물질 A47934의 활성
Figure kpo00011
항생물질 A47934는 또한 한천 희석법에 의해 측정된 바와 같이 몇종의 클로스트리디움 디피실레(clostridium difficile)의 균주에 대하여도 활성이 있다. 시험의 결과는 다음 표 6에 기록되었다.
[표 6]
클로스트리디움 디피실레균주에 대한 항생물질 A47934의 활성
Figure kpo00012
항생물질 A47934는 표준 한천 희석 시험에 의해 측정하면, 여러 종류의 그람-양성 병원성 세균에 대하여 활성을 나타낸다. 측정된 MIC 값은 표 7과 같다.
[표 7]
여러 종류의 세균에 대한 항생물질 A47934의 활성
Figure kpo00013
항생물질 A47934는 실험적 세균성 감염에 대하여 생체내 항미생물 활성을 나타낸다. 2가지 용량의 시험화합물을 실험적 감염으로 감염된 마우스에게 피하 투여하여, 활성은 ED50값〔시험 동물의 50%를 보호하는 유효용량 mg/kg : 참조 Warren Wick et al., J. Bacteriol. 81, 233-235(1961)〕으로 측정한다.
항생물질 A47934에 대하여 관찰된 ED50값은 표8에 주어졌다.
[표 8]
A47934의 생체내 활성
ED50(mg/kg X2)
Figure kpo00014
항생물질 A47934는 마우스에게 복강내 투여하면 300mg/kg 이상의 양에서 급성 독성을 나타낸다.
본 발명의 한 관점에서, 본 발명은 항생물질 A47934 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 약 24mg 내지 약 2,000mg 사이의 항생물질-유효용량을 인간 또는 동물에게 투여함을 특징으로 하여 인간이나 동물의 감염증을 치료하는 방법을 제공한다.
인간의 감염증을 치료하는 경우에, 항생물질은 비경구로 예를들어 근육주사나 정맥내 주입으로 투여할 수 있다. 주사를 위해, 항생물질 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은 생리적으로 허용되는 희석제에 목적하는 농도로 용해시켜 투여한다. 적합한 희석제에는 예를들어, 주사용수, 0.9% 식염수, 5% 덱스트로즈링거 용액 또는 기타 통상적으로 사용되는 희석제가 포함된다.
정맥내 주입으로 투여하는 경우에, 항생물질 또는 그의 염은 생리적 액체나 묽은영양액 중에서 적합한 농도, 예를들면 약 5% 내지 약 10%의 농도로 제조하여 액체와 함께 서서히 주입한다. 또한 항생물질은 "피기-백(piggy-back)"방법으로 투여할 수도 있다.
항생물질 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은 밀봉바이알, 고무스토퍼가 있는 멸균바이알 및 플라스틱 포우치(pouche)내에서 단위 용량형으로 제조된다. 이러한 단위 용량형은 산화방지제, 가용화제, 분산제 완충액 등의 부형제를 함유할 수 있다. 한가지 단위용량 제형은, 고무(부틸고무)스토퍼가 있는 바이알 중에 A47934 항생물질 또는 그의 약학적으로 허용되는 염100mg을 함유하는 것이다. 또 다른 단위 용량제형은 멸균 밀봉된 바이알중에 항생물질 A47934 또는 그의 염 250mg을 함유하는 것이다. 정맥내 주입하기 위하여 본 발명의 단위 용량제형은 플라스틱 포우치 중에 항생물질 A47934 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 5g을 함유할 수 있다.
A 47934 항생물질로 사용되는 경우에, 이것은 경구 또는 비경구로 모두 투여할 수 있다.
본 분야 전문가가 기대하는 바와같이, A47934 항생물질은 통상 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 투여한다. A47934 항생물질의 용량은 치료되어야 하는 특정 감염증의 성질 및 중증도 등의 여러 요인에 따라 결정된다. 본 분야 전문가라면, 투여에 적절한 용량범위 및/또는 용량단위가 환자 또는 호스트의 특징 및 감염미생물과 같은 요인과 함께, 제공된 MIC 및 ED50값과 독성데이타를 고려하여 경정할 수 있음을 알 것이다.
A47934 항생물질은 장내에서 위막성 대장염을 일으키는 클로스트리디움 디피실레의 성장을 억제하는데 유용하다. 항생물질은 약학적으로 허용되는 용량형으로 제조된 항생물질 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 유효용량을 경구투여하여 위막성 대장염을 치료하는데 사용할 수 있다. 이러한 목적으로, 항생물질은 젤라틴 캅셀제 또는액체현탁제 형태로 투여할 수 있다.
본 발명의 항생물질은 또한 수의과용 약제로 가축 및 사육용 동물의 유방염과 같은 감염증의 치료에 사용할 수도 있다. A47934 항생물질은 또한 예를들어 식용우와 다른 반추동물의 성장을 증가시켜 동물사육에도 유용하다. 이러한 용도도 본 발명의 일부이며, 다음 항에서 더 상세히 기술한다.
항생물질 A47934가 개선된 전위기능을 갖는 반추동물의 전위내에서 생성되는 휘발성 지방산(VFA)의 비율을 변화시키는데 유효함을 알게되었다. 반추동물의 탄화수소 이용효율은, 동물의 전위내 세균총을 자극하여 아세테이트 또는 부티레이트 화합물보다 프로피오네이트 화합물을 생성시키는 처리에 의해 증가되기 때문에 〔참고 : Church et al. in "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants," Vol 2, 1971, pp.622 and 625〕, 항생물질 A47934는 이러한 동물의 사료이용 효율을 개선시킬 수 있다.
[시험 1]
전위내에서 생성되는 휘발성 지방산의 비율은 변화시키는데 있어서, 항생물질 A47934의 유효성은 미합중국 특허 제3,928,571호에 기술된 시험관내 시험방법을 사용하여 측정한다. 항생물질 A47934에 대한 시험결과는 표 9에 기술하였다.
표 9의 데이타는 비처리 대조플라스크 내에서 생성된 VFA에 대한 처리플라스크 중에서 생성된 VFA의 비로 기록된 것이다. 이러한 데이타의 기록방법은 사료이용을 개선시키는 본 발명 신규방법에 의해 유도되는 전위내 화학변화의 결과를 더욱 명확히 나타내는 것이다.
[표 9]
Figure kpo00015
표 9에 주어진 결과은 항생물질 A47934가 전위내에서 프로피오네이트 생성을 증가시키는데 유효함을 알 수 있다.
본 발명의 항생물질 화합물의 투여는 사료이용을 개선할 뿐 아니라 케토시스를 방지하고 치료한다. 케토시스의 발생기전은 프로피오네이트 화합물의 생성결핍에 의한다. 현재 추천되고 있는 치료방법은 프로피온산 또는 우선적으로 프로피오네이트를 생성하는 사료를 투여하는 것이다.
명백하게, 통상적인 사료로부터 프로피오네이트 생성을 증가시키는 본 발명의 방법은 케토시스의 발생을 줄일 수 있다.
항생물질 A47934가 개선된 전위기능을 갖는 수유동물에서 유즙(milk)생성을 개선시키는데 유용한 다른 클리코펩타이드 항생물질과 구조적으로 유사하기 때문에, 항생물질 A47934도 이러한 효과가 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 항생물질이 반추동물에서 사료이용 효율을 증가시킨다는 것을 알게 되었다. 항생물질 투여의 가장 용이한 방법은 항생물질을 동물의 사료에 혼합하는 것이다.
그러므로, A47934 항생물질은 통상적인 낙농용 동물의 사료조성물과 쉽게 혼합할 수 있다. 다음에 이러한 조성물은 공지의 방법에 따라 가축에게 공급한다.
낙농용 동물의 통상적인 사료는 여러가지 곡물 및 옥수수 및 귀리와 같은 곡물의 혼합물, 및 건초, 면실껍질, 쌀겨, 및 저장사료와 같은 조물질(roughage)사료를 포함한다.
A47934 항생물질은 사료톤당(건조물질 기준)약 30 내지 약 300g의 비율로 이러한 사료조성물과 혼합할 수 있다.
유즙생산을 개선시키기 위한 항생물질 A47934의 상업적 이용을 위하여는, 활성성분을 사료첨가제 예비혼합물 또는 사료첨가제 농축물로 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 제형에 있어서, 항생물질 A47934는 분쇄된 옥수수, 보리, 대두가루, 밀, 콩가루 또는 유사한 것으로 가격이 저렴한 식용성분과 같은 통상적인 유기 또는 무기 동물사료 담체중에 균이하게 분포시킬 수 있다.
다음에 이 예비혼합물을, 수유 반추동물에게 사료를 공급하기 전에 통상의 1일분 사료와 균일하게 혼합한다. 예비혼합물은 동물에게 항생물질 A47934의 프로피오네이트-증가량이 투여되도록 충분한 비율로 가한다.
다음 조성물은 수유 반추동물에게 투여되는 대표적인 사료이며, 여기에서 사료에는 유즙-생산-증가량의 A47934가 첨가될 수 있다.
Figure kpo00016
상기 성분을 균일하게 혼합한 다음 항생물질 A47934를 수유 반추동물이, 이 경우에는 소자 약 600mg/마리/일을 투여받을 수 있도록 가한다.
그러나, 항생물질 화합물은 다른 방법으로도 유용하게 투여할 수 있다. 예를들어, 정제, 침세제, 거환제 또는 캅셀제로 결합시켜 동물에게 투여할 수 있다. 이러한 용량형의 항생물질 화합물 제형은 공지의 방법에 따라 제조할 수 이싸ㄷ. 각 개개 용량단위는 화합물의 사료-효율-개선양을 함유하며, 이것은 처리되는 동물에 대한 적절한 1일용량에 비례한다.
캅셀제는 적절한 형태의 항생물질을 젤라틴 캅셀에 충진시켜 쉽게 제조할 수 있다. 경우에 따라, 항생물질은 더욱 적절한 캅셀충진량으로 그 용량을 증가시키기 위해 당, 전분 또는 정제된 결정성 셀루로즈와 같은 불활성 분말희석제로 희석할 수 있다.
항생물질의 정제는 통상적인 약학적 공정에 의해 제조할 수 있다. 정제의 제조는 잘 알려져 있으며 고도로 진보된 분야이다. 정제는 활성성분 이외에도 일반적으로 기제, 붕해제, 흡수제, 결합제 및 활탁제를 함유한다. 대표적인 기제에는 락토즈, 미세한 분당(fine icing sugar), 염화나트륨, 전분 및 만니틀이 포함된다. 전분은 또한 좋은 붕해제이며 알긴산도 같은 용도로 사용된다. 나트륨라우릴 설페이트 및 디옥틸나트륨 설포석시네이트와 같은 계면활성제가 사용될 수도 있다. 통상 사용되는 흡수제에는 전분 및 락토즈가 포함되며,반면에 탄산마그네슘은 또한 오일성 물질에 대해 유용하다. 빈번히 사용되는 결합제로는 젤라틴, 고무, 전분, 덱스트린 및 여러가지 셀루로즈 유도체가 있다. 통상 사용되는 활탁제 중에는 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 파라핀왁스, 여러가지 금속성비누 및 폴리에틸렌 글리콜이 있다.
이러한 신규방법은 또한 항생물질 화합물을 서방성 거환제 형태로 투여하여 실행할 수도 있다. 이러한 거환제는 정제의 제조방법과 동일한 방법으로 제조할 수 있으나, 단 항생물질의 용해가 지연되도록 하는 방법이 적용된다. 거환제는 장기간 동안에 약물이 방출되도록 제조한다. 느린 용해는 고도로 수-불용성인 형태의 화합물을 선택하여 동무을 줄 수도 있다. 쇠가구(iron filing)와 같은 물질을 가해 거환제의 밀도를 증가시켜 약제가 전위의 하부에 정체되도록 할수 있다.
항생물질의 용해는 약물이 함유되는 불용성 물질의 매트릭스를 사용하여 지연시킨다. 예를들어 식물성 왁스, 정제된 광물성왁스 및 수-불용성 중합체 물질과 같은 물질이 유용하다.
항생물질의 침세제는 수용성 형태의 항생물질을 선택하여 쉽게 제조할 수 있다. 몇가지 이유로 불용성 형태가 바람직하다면, 현탁제로 제조할 수도 있다. 한편, 침세제는 폴리에틸렌 글리콜과 같이 생리적으로 허용되는 용매중의 용액으로 제형화 될 수도 있다.
불용성 항생물질의 현탁제는 선택된 항생물질의 형태에 따라 식물유(예. 땅콩유, 옥수수유, 또는 호마유)와 같은 비용매, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜, 또는 물 중에서 제조할 수 있다.
생리적으로 허용되는 적합한 보조제는 현탁된 항생물질을 유지시키기 위해서 필요하다.
이러한 보조제는 카복시메틸셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알기네이트와 같은 농조화제 중에서 선택할 수 있다. 또한 여러 종류의 계면활성제를 사용하여 항생제를 현탁시킨다. 예를들어 레시틴, 알킬페놀 폴리에틸렌 옥사이드 부가물, 나프탈렌설포네이트, 알킬벤젠설포네이트 및 폴리옥시에틸렌 솔비탄 에스테르가 액체비용매 중에서 현탁제를 제조하는데 유용하다.
또한, 각각의 경우에 친수성, 밀도 및 액체의 표면장려에 영향을 미치는 많은 물질들이 현탁제 제조에 도움을 줄수 있다. 예를들어 실리콘 안티포움(antifoam), 글리콜, 솔비톨 및 당이 유용한 현탁화제로서 사용될 수 있다.
현탁성 항생물질은 현탁제로 또는 사용하기 전에 희석하여 사용하는 항생물질과 보조제의 건조혼합물로서 동물발육제로 사용할 수 있다.
흡입 투여하는 분제 또는 산제의 제조시에는, 항생물질을 대표적으로 탈크, 규조토, 또는 보조제와 같은 몇가지 다른 불활성 성분과 혼합한다.
항생물질은 또한 수용성 또는 수-현탁성 형태의 항생물질 적정량을 물에 가하여 반추동물의 음료수에 혼입시킬 수 있다. 음료수에 가하기 위한 항생물질의 제형은 침세제 제형과 동일한 원리에 따른다.
본 발명의 항생물질 화합물로 동물의 처리하는 가장 실질적인 방법은 화합물을 공급되는 사료형태로 제형화하는 것이다. 통상적인 건조사료, 액체사료 및 펠렛화 사료를 포함한 어떤 형태의 사료도 항생물질 화합물로 약제화 될 수 있다.
동물사료용으로, 발효재비 구성분 및 균사체를 포함한 고체배양물이 추출 및 분리조작없이, 그러나 바람직하게는 물을 제거한 후에 A47934 항생물질의 공급원으로 사용될 수 있다.
예를들어, A47934 항생물질 활성이 생성된 후에, 전발효 육즙을 여과하여 A47934를 함유하는 여과케이크를 건조시킨다. 또한, 건조된 균사체 케이크를 pH10.5에서 알칼리성 수용액으로 추출하여 추출물을 중화시키고 추출물을 건조시켜서 A47934 항생물질을 얻는다. 또한, 전 발효육즙은 동결건조에 의해, 피막건조에 의해, 또는 공비증류하고 건조함에 의해 건조될 수 있다. 다음에 건조된 육즙을 사료 예비혼합물과 직접 혼합할 수 있다.
동물 사료내에 약물을 제형화시키는 것은 잘 알려진 방법이다. 약제화 사료용 조물질로 일반적으로 농축된 약물 예비혼합물이 제조된다.
예를들어, 대표적인 약제 예비혼합물은 예비혼합물 파운드당 약 1 내지 약 400g의 약물을 함유할 수 있다. 이렇게 용량이 광범위한 것은 최종사료 내에서 원하는 약물의 농도가 광범위하기 때문이다. 예비혼합물은 액체 또는 고체일 수 있다.
치료에 유용한 항생물질 화합물의 적정량을 함유하는 동물사료의 제형은 주로 산술적인 문제이다. 동물이 섭취하는 1일분 사료량을 고려하여 각 동물에게 투여되는 화합물의 양 및 사용되는 예비혼합물중의 항생물질 화합물의 농도만을 측정한 다음 사료중 항생물질 화합물의 적절한 농도를 계산한다.
제형화, 혼합 및 펠렛화의 모든 공지방법이 항생물질 화합물을 함유하는 사료의 제조에 모두 적절하다.
이러한 본 발명 관점의 범주는 어떤 특정제형이나 투여방법으로 제한되는 것은 아니다.
이러한 본 발명의 관점은 항생물질의 경구 투여에 의해 반추동물에 의한 사료이용 효율을 증가시키는 방법이다. 투여방식에 관계없이 이것은 본 발명의 범주내에 있는 것으로 간주한다.
항생물질A47934는 또는 닭의 성장촉진제로 활성을 나타내며, 그에 대한 시험은 다음과 같이 수행한다 :
[시험 2]
8일된 폐노브스코트(Penobscot)육계를 시험에 사용한다. 총 560마리의 닭을 사용하며, 이것을 각 7마리 씩의 군으로 나눈다. 35군은 대조군으로 사용하며 5군은 육계배합사료에 사료톤당 항생물질 A47934 20g의 율로 가해진 항생물질로 처리한다. 육계 배합사료는 다음 조성을 갖는다.
Figure kpo00017
1/ 미량무기물 예비혼합물은 완전사료 kg당 망간 75mg, 아연 50mg, 철 25mg 및 요오드 1mg을 제공한다.
2/ 비타민 예비혼합물은 완전사료 kg당 비타민 A3000IU, 비타민 D900ICU, 비타민 E 40mg, 비타민 K 0.7mg, 콜린 1000mg, 나이아신 70mg, 판토텐산 4mg, 리보플라빈 4mg, 비타민 B12100mg 및 비오틴 100mcg을 제공한다.
계산된 분석치 : 단백질, % 18.00, 비타민 K, mg/kg 0.7, Met. 열량, KCal/kg 3239, 콜린, mg/kg 1450, ME/P 비율 179.94(81.79), 나이아신, mg/kg 85, 지방 % 7.37, 판토텐산, mg/kg 11.1, 섬유소, % 2.66, 비타민 B6, mg/kg 7.5, 회, %5.14, 리보플라빈, mg/kg 4.4, 칼슘,% 0.85, 티아민, mg/kg 2.8, 인, % 0.73, 염산, mg/kg 1.1, 사용가능한 인, % 0.50, 비타민 B12, mcg/kg 100, 망간, mg/kg 85, 비오틴, mcg/kg 233, 철, mg/kg 72, 알기닌, % 1.305 (7.25)3/, 구리, mg/kg 11, 리신, % 0.956(5.31), 아연, mg/kg 72, 글리신, %0.901(5.01), 셀레늄, mcg/kg 74, 메티오닌, % 0.433(2.41), 마그네슘, mg/kg 1693, 시스틴, % 0.273(1.52), 칼륨, mg/kg 7158, 총황 아미노산, % 0.706 (3.92), 나트륨, mg/kg 1682, 요오드, mg/kg 1, 트립토판, % 0.252(1.40), 비타민 A, IU/kg 5162, 리놀레산, % 1.25, 비타민 D, ICU/kg 900, 비타민 E, mg/kg 56.2.
3/ ( )속의 값은 식이성 단백질의 퍼센트로 표시한 아미노산을 나타낸다.
사료와 물은 임의로 21일동안 모든 군에 투여할 수 있다. 활성척도 : 체중증가 3% 및 /또는 사료효율 개선 2%. 이 시험의 결과는 표 10에 기술한다.
[표 10]
Figure kpo00018
F/G=총 사료 소비량을 총 체중증가로 나눈 값
또한, 약학적으로 허용되는 염형태의 항생물질 A47934는 닭의 음료수 중에 투여할 수도 있다.
이렇게 하여, A47934 항생물질은 사료톤당 A47934, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 약 5내지 약 30g의 배율로 사료와 함께 닭에게 투여하는 경우, 닭의 성장촉진제로 사용될 수 있다.
항생물질 A47934는 또한 이유기 돼지에게 투여하는 경우에 성장촉진제로 작용한다. 이 활성은 다음 시험 3으로 설명된다.
[시험 2]
항생물질 A47934는 초기 체중이 약 23파운드인 돼지의 먹이중에서 10 내지 50ppm 농도로 시험하며, 먹이중에서 110ppm으로 투여한 티란(Tylan
Figure kpo00019
, 티로신, Elanco)과 비교한다. 시험은 우리내에 철망바닥이 있는 환경적으로 조절된 사육 장치내에서 수행한다. 처리당 4회 반복하며, 28일의 실험기간 동안 각 시험당 4마리의 돼지를 사용한다. 약제 처리되지 않은 먹이를 투여한 대조군에서는 각 시험당 4마리의 돼지를 사용하여 6회 반곡 시험한다. 돼지는 임의로 다음 조성을 갖는 18% 단백질 옥수수-콩 사료를 투여한다.
Figure kpo00020
1/ 예비혼합물 1kg에 다음과 같이 함유한다 : 황산망간으로써의 망간 50g; 탄산 아연으로써의 아연100g; 황산 제일철로써의 철 50g; 산화구리로써의 구리 5g; 요오드화 칼륨으로썽의 요오드 1.5g 및 탄산 칼슘으로써 칼슘 최대 150g 및 최소 130mg.
2/ 예비혼합물 1kg에 다음과 같이 함유한다 : 비타민 D277,161IU; 비타민 E 2,205IU; 리보플라빈 411mg; 판토텐산 1,620mg; 나이아신 2,205mg; 비타민 B124.4mg; 콜린 19,180mg; 엽산 110mg; 피리독신 165mg; 티아민 110mg; 비오틴 22mg.
3/ 예비혼합물 1kg에 비타민 A6,613,800IU를 함유한다.
4/ 예비혼합물 1kg에 나트륨 셀레나이트로써 셀레늄 200mg을 함유한다. 계산된 분석치에는 단지 셀레늄만을 더한다.
계산된 분석치 : 조단백질 %19.10, 에테르 추출물 % 2.83, 조섬유소 % 1.89, 회 % 5.60, 칼슘 % 0.90, 인 % 0.65, Dig. E. KCal/kg. 3545.59, Met. E. KCal/kg. 3270.00, 리보플라빈 mg./kg. 7.88, 나이아신 mg./gk. 27.38, 판토텐산 mg./kg. 24.96, 콜린 mg./kg. 1224.95, 비타민 B12mcg./kg. 50.54, 염산 mg./kg. 1.99, 피리독신 mg./kg. 8.37, 티아민 mg./kg. 4.30, 비오틴 mg./kg. 0.35, 비타민 D IU/kg. 811.61, 비타민 A IU/kg. 3904.05, 비타민 E IU/kg. 23.61, 비타민 K mg./kg. 4.41, 구리 mg./kg. 14.43, 철 mg./kg. 98.12, 요오드 mg./kg. 1.50, 마그네슘 mg./kg. 16277.70, 아연 mg/kg. 119.61, 망간 mg./kg. 61.74, 셀레늄 mg./kg. 1.104/, 리신 % 1.02, 메티오닌 % 0.53, 시스틴 % 0.29, 트립토판 % 0.23, 이소로이신 % 1.03, 알기닌 % 1.15, 히스티딘 % 0.44, 로이신 % 1.72, 페닐알라닌 % 0.97, 티로신 % 0.52, 트레오닌 % 0.77, 발린 % 0.98.
시험이 끝난 후에 개개 돼지의 평균 체중은 53파운드로 증가하였다.
시험의 결과는 표 11에 기술하였다.
[표 11]
Figure kpo00021
ADG=1일 평균 체중 증가
ADF=1일 평균 사료 소비량
F/G=체중증가에 대한 사료 소비량의 비
본 발명의 또 다른 관점은, A47934 항생물질 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 약 10 내지 약 50ppm을 먹이중에 혼합하여 돼지에게 투여함을 특징으로 하여 이유돼지의 성장을 촉진하는 방법을 제공하는 것이다. 약학적으로 허용되는 염 형태의 A47934 항생물질은 음료수를 통해 돼지에게 투여할 수도 있다.
A47934의 이유 돼지의 성장을 촉진하는데 있어서의 유용성 이외에도, 항생물질 A47934는 시판용 크기의 돼지, 즉 체중 약 200파운드의 돼지를 포함한 여러 크기의 돼지의 성장을 촉진하는데도 유용한 것으로 기대된다.
통상, 반추동물을 포함한 경제성이 있는 동물은 그의 생활 과정중에 여러 종류의 성장촉진제, 질병-보호제 및 질병 치료제로 처리된다. 이러한 약제들은 주로 조합하여 사용한다.
본 발명의 방법은 또한 다른 치료방법과 조합하여 수행할 수도 있다.
상기 결과에서 보는 바와 같이, 항생물질 A47934은 전위내에서 아세테이트의 생성을 유리하게 변화시킨다. 또한, 동일한 처리는 맹장내에서 섬유성 식물성 물질을 발효시키는 단위 동물에게도 유익하다. 여기에서 칭하는 단위 동물은 섬유성 식물성 먹이를 섭취하고 적어도 그중의 일부는 맹장내에서 미생물발효에 의해 소화하는 동물을 말한다. 맹장 발효는 전위 발효와 유사한 화학경로를 따른다.
맹장 발효에 의해 먹이중의 일부를 소화시키는 동물의 예로는 말, 돼지 및 토끼가 있다. 이러한 동물의 전반적인 사료 이용은 프로피오네이트/아세테이트 비율을 유익하게 변화시키는 항생물질을 경구 투여하여 개선된다. 말과 토끼는 맹장 발효가 전 소화 과정 중의 대부분인 동물이며, 이러한 동물에 대해 항생물질은 특히 유익하다.
A47934 항생물질은 스트렙토마이세스 토요카엔시스 NRRL 15009, 또는 그의 A47934-생성 돌연변이체 또는 변종을 액침 호기성 발효 조건하, 탄소, 질소 및 무기염류의 동화원을 함유하는 배지 내에서 항생물질 활성의 실질량이 생성될 때까지 배양함을 특징으로 하여 제조된다.
다른 미생물의 경우와 같이, A47934-생성 배양물 NRRL 15009의 특징은 변화받기 쉽다. 예를 들어, NRRL 15009 균주의 또는 이 균주로 부터 유도된 자연적 변종, 돌연변이체(자발적 또는 유도된 돌연변이체), 트란스콘쥬간트(transconjugants) 및 재조합체(플라스미드 상의 재조합 DNA 포함)는 A47934 항생물질을 생성하는 것으로 본 발명에 사용될 수 있다.
스트렙토마이세스 토요카엔시스 NRRL 15009를 사용하여 항생물질 A47934를 생성하는데 여러 종류의 다른 배지를 사용할 수 있다. 그러나 제조의 경제성, 최적 수율 및 생성물 분리의 용이성 때문에 어떤 특정 배지가 바람직하다 이러한 배지는 탄소, 질소 및 무기염류의 등화원을 함유한다. 적합한 탄소 공급원에는 글루코즈, 감자 덱스트린, 타피오카 덱스트린, 옥수수전분 및 당밀이 포함된다. 적합한 질소 공급원에는 대두조립, 산 가수분해된 카제인, 육즙 및 대두가루가 포함된다.
미생물의 성장 및 분화에 필요한 필수 미량 원소는 옥수수 침지액을 사용하여 얻을 수 있으며, 또한 미생물의 성장 및 생합성 필요성을 충족시키는 양으로 배지중의 다른 성분에 불순물로 존재할 수도 있다. 그러나, 배지 내에 추가로 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 클로라이드, 카보네이트, 포스페이트, 설페이트, 니트레이트 및 기타 이온을 수득할 수 있는 용성영양 무기염류를 첨가하는 것이 유익할 수 있다.
NRRL 15009호부터 항생물질 A47934ㅇ의 실질량을 생성하기 위해서 탱크 내에서의 액침 호기성 발효가 사용된다. 소량의 항생물질 A47934는 진탕-플라스크 배양에 의해 수득할 수 있다.
탱크 발효를 위해서는 증식성 접종물이 바람직하다. 증식성 접종물은 소량의 배지를 포자형태, 균사 단편 또는 동결건조된 미생물 펠렛으로 접종하여 새롭고 활동적으로 성장하는 미생물의 배양물을 얻어 제조한다. 다음에 증식성 접종물은 대규모 탱크로 옮기고, 여기에서 적합한 배양 기간이 지난후에 A47934 항생물질의 최적 수율로 생성된다.
접종하지 않은 발효 배지의 pH는 생산용 배지에 의해 변화하지만 모든 발효배지의 pH는 pH 약 6.4 내지 7.0의 범위에 있다.
이러한 A47934-생성 미생물은 약 20 내지 약 40℃의 넓은 온도 범위에서 성장할 수 있다.
NRRL 15009에 의한 항생물질 A47934의 최적 생성은 약 30℃의 온도에서 나타난다.
호기성 액침 배양방법에서 통상적인 것으로, 멸균공기를 배지중에 분산시킨다. 미생물의 효율적 성장을 위해, 탱크법에서 사용되는 공기의 용량은 배지 1용량당 1분에 약 0.1 내지 약 0.5용량의 범위(v/v/m)이다. 165리터 용기내에서의 최적 비율은 약 250RPM의 속도로 회전하는 통상적인 교반기에 의해 교반하면서 약 0.25v/v/m 이다. 거품이 문제가 되는 경우에는, 프로필렌 글리콜과 같은 소량(즉 0.2ml/ℓ)의 거품 방지제를 대규모 발효 배지에 가할 수 있다.
A47934 항생물질의 생성은 발효기간 중에 한천 확산법, 즉 한천 웰(well) 플레이트 시험에 의해, 또는 혼탁도 측정법에 의해 관찰할 수 있다. 사용되는 시험 미생물은 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ATCC 6633 이다. 전육즙 샘플은 수성 수산화나트륨을 사용하여 pH 10.5호 조정하고 시험하기 전에 윈신분리한다.
항생물질 활성은 일반적으로 약 36시간 후에 나타나며, 발효기간중 적어도 7일 이상 동안 유지된다. 항생물질 생성의 피크는 약 4 내지 약 5일의 발효기간에 나타난다.
A47934 항생물질은 본 분야에서 사용되는 방법에 의해 발효 배지로부터 회수할 수 있다. A47934 항생물질의 대부분이 세포상에 또는 세포중에 흡수되기 때문에, 전 발효육즙을 수산화나트륨과 같은 수성 염기를 사용하여 pH 약 10.5로 조정하여 세포로부터 항생물질을 유리시킨다.
필터 에이드로 규조토(Hyfol Super-cel, Johns-Manville Corp.)를 가하고 혼합물을 교반한 다음 적절한 필터 프레스(filter press)를 사용하여 여과한다. 항생물질 활성을 함유하는 여액을 중성 pH, 즉 pH7.0으로 조정하고 다이아이온(Diaion) HP-20〔비드(bead) 형태의 고다공성 스티렌디비닐벤젠 공중합체, Mit-subish Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan에 의해 시판됨〕과 혼합하여 일정시간, 예를들어 약 60분 동안 교반한다. 수성상을 항생물질 활성이 흡수된 수지로부터 흡인 또는 여과에 의해 분리한다. 기타 적합한 흡수제에는 탄소, 실리카겔, 폴리아미드, 알루미나, 거대망상 수지(macroreticular resins; XAD-2. XAD-4 등) 및 이온교환수지, 특히 음이온 교환수지(예. IRA 68, Dowex 1)가 포함되며, 이들은 모두 본 분야에서 공지된 것이다.
흡수된 A47934 활성을 함유하는 HP-20 수지는 물 및 물 : 메틴올(4 : 1)로 세척하고 여과한다. 다음에 용출제로 물 : 메탄올(1 : 1)을 사용하여 항생물질을 수지로 부터 용출시킨다. 용출액을 농축하고 동결건조시켜 담갈색 분말상의 조 A 47934를 수득하고 이것을 공지의 크로마토그라피 방법에 의해 더 정제할 수 있다.
항생 물질 A 47934 는 또는 육즙 여액으로부터 분리할 수도 있는데, 이러한 여액을 완전히 침전시킥 위해 산으로 pH 약 3이 되도록 조정하고 이어서 여과하여 분리한다. A 47934는 pH 약 6.5에서 침전되기 시작하며, pH 약 3에서 침전이 완결된다. 산성화에는 염산, 황산 및 인산과 같은 무기산 및 아세트산 및 포름산과 같은 유기산이 적합하다. 이렇게 하여 수득된 조 A47934는 공지의 크로마토그라피 방법으로 더 정제할 수 있다.
본 발명을 더욱 완전히 설명할 목적으로 다음의 비제한적 실시예가 제공된다.
[실시예 1]
제1단계 접종물의 제조
스트렙토마이세스 토요카엔시스 NRRL 15009의 한천 사면 배양에 사용하기 위해 다음 배지를 제조한다.
Figure kpo00022
상기 성분들을 함께 혼합한 후에, 형성된 배지의 pH는 5.0이며, 이것을 멸균하기 전에 5N수성 수산화나트륨을 사용하여 pH 6.7로 조정한다. 멸균 후 배지의 pH는 6.5 이다.
스트렙토마이세스 토요카엔시스 NRRL 15009의 포자를 상술한 성분으로 구성된 영양한천 사면에 접종한 다음 접종된 사면을 30℃의 온도에서 약 10일동안 배양한다.
다음에 사면으로 부터 배양물의 리오필(lyophiles)을 제조하여 다음 조성의 접종배지를 접종하는데 사용한다.
Figure kpo00023
상기 성분들을 함께 혼합한 후에, 형성된 배지의 pH는 5.6이며, 이것은 멸균시키기 전에 5N수성 수산화나트륨을 사용하여 pH6.5로 조정한다. 멸균시킨 후, 배지의 pH는 6.5 내지 6.7 이다.
접종 배지(50ml)는 250RPM의 속도에서 직경 2인치의 호를 그리며 회전하는 진탕기 상에서 약 48시간 동안, 약 30℃로 250ml 광구 플라스크 내에서 배양한다. 이렇게 배양된 배지는 소량의 발효물(배지의 용량당 약 1%의 접종물)을 접종하는데 사용하거나, 대량 배양물의 제조를 위한 제2단계 배지를 접종하는데 사용한다.
A47934.1의 발효
배양된 제2단계 배지(800ml)를 사용하여 다음 조성의 멸균 생산 배지 100ℓ를 접종한다.
Figure kpo00024
*다우 코닝안티포움 'A'
상기 성분들을 함께 혼합한 후에, 형성된 배지의 pH는 6.5이며, 이것은 멸균하기 전에 5N 수성수산화나트륨을 사용하여 pH7.5로 조정한다. 멸균 후에, 배지의 pH는 6.9 이다.
접종된 생산배지를 165ℓ 발효 탱크내에서 약 30℃ 온도로, 약 4 내지 약 4.75일 동안 발효시킨다.
발효배지에 0.25v/v/m의 속도로 멸균 공기를 통기시키고 통상적 교반기를 사용하여 약 200 내지 250RPM 속도로 교반한다.
[실시예 2]
A47934의 분리
발효 육즙 141ℓ를 5N 수산화나트륨수용액을 가하여 pH10.5로 조정하고 3% 필터 에이드(Hyfol Super-Cel, 규조토, Johns-Manville Corp.)를 가하여 혼합물은 약 1시간 동안 교반한다. 혼합물을 필터 프레스 상에서 여과하여 항생물질 활성을 함유하는 등명한 여액 106ℓ를 수득한다. 이 여액을 5N 수성 염산으로 pH 7.0이 되도록 조정하고, 다이아이온 HP-20수지(비드 형태의 고다공성 스티렌 디비닐벤젠 공중합체, Mitsubishi Chemical Industries, Limited, Tokyo, Japan의 제품) 10.6ℓ를 여액에 가한다. 혼합물을 약 60분 동안 교반하고 수성상을 흡인 또는 여과에 의해 수지로 부터 분리한다.
흡수된 항생물질 활성을 함유하는 수지를 물 30ℓ, 다음에 물 : 메탄올(4 : 1)의 혼합물 30ℓ로 2회 연속적으로, 배치식으로 세척하는데, 각 용량의 용매와 함께 30분 동안 교반하고 여과하여 세척한다. 세척된 수지를 메탄올 : 물(1 : 1) 30ℓ와 함께 약 30분 동안 교반하고, 여과하여 동일 고정을 한번 더 반복해서 수지로 부터 항생물질 활성을 용출시킨다.
메탄올 : 물(1 : 1) 여액을 합해서 진공중에 농축하여 용량이 약 4 내지 5ℓ(고체 약 6 내지 12% 함유)가 되도록 하고 동결건조시켜 약 30 내지 40% 순도의 조항생물질 A47934로 확인된 담갈색 분말 79.1g을 수득한다. 총 수율 약 44 내지 49%로 수득한다.
[실시예 3]
산성침전에 의한 조 A47934의 제조
A47934의 발효육즙 450ml 를 pH 10.5로 조정하여 균사체로 부터 A47934 항생물질을 추출하고 용액을 여과한다. A47934 항생물질을 함유하는 여액을 200ml 분획씩으로 나누고 각 분획은 최대 침전을 얻기 위해 5N 수성염산을 가하여 pH2.5로 조정한다. 원심분리에 의해 침전을 회수하고 물로 세척하여 재원심 분리한다. 한 분획으로부터의 침전을 물에 현탁시키고 동결 건조하여 수-불용성 조 A47934(순도 20퍼센트) 186mg을 수득한다.
다른 분획으로 부터의 침전을 물 50ml에 현탁시키고 5N 수산화나트륨 수용액으로 pH 7.5로 조정하여 동결 건조시킨다. 수용성 조 A47934 항생물질의 수율은 226mg이다(순도 20퍼센트).
이러한 조 A47934 항생물질제제는 공지의 방법, 예를 들면 다이아이온 HP-20 수지 및 역상 HPLC를 사용하여 정제할 수 있다.
[실시예 4]
역상크로마토그라피에 의한 항생물질 A47934의 정제
조 항생물질 A47934 30 내지 40g을 pH 8에서 물 : 아세토니트릴(12 : 8) 350ml에 용해시키고 용액을 암모늄 아세테이트 2g/ℓ를 함유하는 물 : 아세토니트릴(86 : 14) 내에서 평형화시킨 역상수지(왓트만 실리카겔 LP-1/C18) 4ℓ를 함유하는 크로마토스팩 100-유니트(Chromatospac 100-Unit, Instruments SA, Inc., Metuchen, N.J.)에 적용시킨다. 샘플을 적용한 후에 칼럼을 동일 용매계로 전개하여 400ml씩의 분획을 모으며 용출은 254nm에서 관찰한다. 각 분획은 분석용 HPLC〔Zorbax ODS 수지(0.25×25cm 칼럼); 암모늄 아세테이트 2g/ℓ를 함유하는 물 : 아세토니트릴(82 : 18); 225nm(aufs 0.2〕에 의해 시험하여 A47934만을 함유하는 분획을 모으고(예 : 여러가지 조 A47934롯트를 위해 32 내지 60, 37 내지 75 및 51 내지 76 범위의 분획을 모은다), 약 1ℓ의 용량이 되도록 농축한다.
8번의 유사한 실험으로 부터 얻은 농축물을 합하면 총용량이 8ℓ가 되며, 이것을 물로 충진된 다이아이온 HP-20 수지 2ℓ를 함유하는 칼럼에 적용하여 크로마토그라피 공정에 의해 합친 농축물로 부터 암모늄 아세테이트를 분리한다. 다음에 컬럼을 물 6ℓ로 세척하고 물 : 메탄올(4 : 1) 4ℓ 및 몰 : 메탄올(1 : 1) 6ℓ로 용출시킨다. 20% 메탄올 용출액을 400ml로 농축하고 동결 건조시켜 고도로 정제된 A47934 14.82g을 수득한다. 50% 메탄올 용출액을 1ℓ로 농축하고 동결 건조시켜 고도로 정제된 A47934 55.6g을 수득한다.
이러한 탈염 단계에서 총 수율은 81%에 달한다.
[실시예 5]
항생물질 A47934의 결정화
고도로 정제된 A47934 1g을 아세토니트릴 : 물(60 : 40) 50ml에 용해시키고 추가로 아세토니트릴을 가하여 혼탁하게 만든다. 실온에서 16시간 동안 방치한 후에, 분리된 점성이 있으며 어두운 색의 물질을 제거하고 아세토니트릴을 더 가해 요액을 혼탁하게 만든다.
실온에서 더 방치시켜 형성된 결정을 여과에 의해 회수하여 아세토니트릴로 세척하고 건조시킨다.
결정의 중량은 750mg 이다.
결정을 아세토니트릴 : 물(60 : 40) 40ml에 용해시켜 재결정시킨 다음 아세토니트릴 300ml르 교반하면서 가한다. 방치하여 형성된 결정을 여과 분리하여 아세토니트릴로 세척하고 진공중에서 건조시킨다. 건조된 결정의 중량은 550mg 이다. 진공중, 100℃에서 더 건조시키면 휘발성 용매화물에 기인한 11%의 중량손실이 일어난다.
[실시예 6]
A47934의 모노나트륨의 염의 제조
A47934 130mg의 수용액(0.1몰, pH 4.8) 16ml에 수산화나트륨 0.4ml(10mg/ml, 0.1몰)를 가한다. 최종 용액의 pH는 7.2이다.
용액을 동결건조시켜 A47934의 모노나트륨염(Na=2.4%) 153mg을 수득한다.
[실시예 7]
A47934의 디나트륨염의 제조
수산화나트륨(10mg/몰 ml, 0.2몰에 해당) 18ml를 A47934 130mg의 수용액(0.1몰, pH4.8) 16ml에 교반하면서 가하며, 최종 pH는 8.1이다. 용액을 동결 건조시켜 A47934의 디나트륨염(nA=3.6%) 156mg을 수득한다.
[실시예 8]
A47934의 모노 칼륨염의 제조
수산화칼륨 용액 0.56ml(10mg/ml, 0.1몰)를 A 47934 130mg을 함유하는 수용액(pH 4.8, 0.1몰) 16ml에 교반하면서 가하여 최종 pH가 7.1이 되도록 한다. 용액을 동결건조시켜 A47934 모노칼륨염(K=2.14%) 154mg을 수득한다.
[실시예 9]
A47934의 디칼륨염의 제조
수산화칼륨 용액 1.12ml(10mg/ml, 0.1몰)를 A 47934 130mg을 함유하는 수용액(0.1몰, pH 4.8) 16ml에 교반하면서 가하여 pH가 7.95가 되도록 한다. 용액을 동결 건조시켜 A47934 디칼륨염(K=3.94%) 158mg을 수득한다.
[실시예 10]
A47934의 바륨염의 제조
염화 바륨 포화 용액 2ml를 A47934 100mg을 함유하는 수용액 4ml에 가하여 A47934의 바륨염을 침전시킨다. 침전을 원심분리하여 물 5ml로 2회 세척한 다음 각각을 재원심분리한다. 침전을 물 10ml에 재현탁시키고 동결건조하여 수-용성 바륨염 76mg을 수득한다.
[실시예 11]
A47934의 칼슘염의 제조
염화 칼슘의 포화수용액 2ml를 A47934 100mg을 함유하는 수용액 4ml에 교반하면서 가하여 A47934의 칼슘염을 침전시킨다. 침전을 물 5ml 씩으로 2회 세척하고 각각을 원심 분리하여 세척된 침전을 물 10ml에 현탁시키고 동결 건조한다. A47934의 칼슘염 87mg을 수득한다.

Claims (3)

  1. 스트렙토마이세스 토요카엔시스 NRRL 15009(KFCC 10042), 또는 그의 A47934-생성 변종 또는 돌연변이체를 액침 호기성 발효 조건하, 탄소, 질소 및 무기염류의 동화원을 함유하는 배지중에서 배양함을 특징으로 하여, 다음 구조식(I)의 항생물질 A47934 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제조하는 방법.
    Figure kpo00025
  2. 제1항에 있어서, 계속해서 배지로부터 A47934 항생물질을 분리하는 방법.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서, 스트렙토마이세스 토요카엔시스 NRRL 15009를 배양하는 방법.
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