DD210072A5

DD210072A5 - Verfahren zur herstellung des antibiotikums a47934

Info

Publication number: DD210072A5
Application number: DD83252856A
Authority: DD
Inventors: Robert L Hamill; Ralph E Kastner
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1982-07-30
Filing date: 1983-07-07
Publication date: 1984-05-30
Also published as: ES523761A0; DE3366836D1; KR840005483A; GB8318056D0; IL69142A0; GR77578B; CS235045B2; EP0100605B1; AU1649383A; AU557782B2; KR860001231B1; FI832429A0; GB2124620B; DK310683A; ATE22802T1; RO86844B; EP0100605A1; GB2124620A; RO86844A; PT77007B

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums A47944 oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes hiervon durch Zuechtung von Streptomyces toyocaensis NRRL 15009 oder einer A47934 produzierenden Variante oder Mutante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen fuer Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthaelt, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen und durch gegebenenfalls anschliessende an sich bekannte Abtrennung des Antibiotikums aus dem Kulturmedium oder uebliche Ueberfuehrung in pharmazeutisch unbedenkliche Salze. Diese Produkte sind wertvolle antimikrobielle Mittel, erhoehen die Futterausbeute bei Warmbluetern und ergeben bei diesen Tieren unter anderem auch eine Wachstumsverbesserung und erhoehte Milchproduktion.

Description

Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums A47 934 und Kulturmedium zur Durchführung dieses Verfahrens

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums A47 934 durch Züchtung des bisher unbekannten Mikroorganismus Streptomyces toyocaensis NRRL 15009 und auf ein diesen Organismus enthaltendes KuI-

20 turmedium.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Es gibe eine Reihe pathogener Mikroorganismen, die bei Mensch und Tier verschiedene Krankheitszustände hervor-

rugen. Es ist auch bereits eine große Anzahl an Antibiotika bekannt, von denen einige gegenüber ein oder mehr patho genen Mikroorganismen wirksam sind. Infolge der großen Möglichkeit und ständigen Gefahr der Entwicklung antibio'ti kaspezifischer resistenter Stämme pathogener Mikroorganismen besteht jedoch immer ein großer Bedarf an der Entwicklung neuer Antibiotika- Vor allem Krankheitserreger innerhalb der grampositiven Arten von Staphylococcus und Streptococcus sind häufig resistent gegenüber den normalerweise verwendeten Antibiotika, wie Penicillin und Erythromycin, wie beispielsweise aus W.O. Foye, Principles of Medicinal

Chemistry, Seiten 684 bis 686 (1974) hervorgeht. Es sind weiter auch schon Glykopeptid-Antibiotika bekannt, die

- 2 -

sich vor allem durch eine besondere Wirksamkeit gegenüber grampositiven Mikroorganismen auszeichnen. Hierzu gehören unter anderem Vaneomyein gemäß US-PS 3 067 099, dessen Struktur in J. Am. Chem. Soc. 103, 6580 bis 6585 (1981) angegeben ist, Äctaplanin (Antibiotikum A-4596) gemäß US-PS 3 952 095, dessen Teilstruktur, aus US-PS 4 322 hervorgeht, Ristocetin gemäß GB-PS .765 886, bei dem es sich um einen Komplex handelt, dessen Struktur für den Faktor A in J. Am. Chem. Soc. 102, 897 bis 905 (1980) beschrieben ist, und Avoparcin gemäß US-PS 3 338 786, dessen Struktur aus J. Am. Chem. Soc. 103, 6522 bis 6524 (1981) hervorgeht.

Aufgabe der Erfindung:

Die bekannten Antibiotika sind - wie bereits erwähnt in ihrer Wirksamkeit nicht voll befriedigend und unterliegen einer Resisten'iientwicklung der von ihnen zu bekämpfenden Mikroorganismen. Aufgabe der Erfindung ist da-' her die Schaffung eines neuen Antibiotikums mit verbesserter Wirksamkeit und ohne, bereits bestehende Resistenz.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Die obige Aufgabe wird nun erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums A47934 der Formel

r κι f

Ah

flfl

Hc/Y/VY/

dOsH

und dessen pharmazeutisch unbedenklichen Salzen,

das darin besteht, daß man Streptomyces toyocaensis NREL 150.09 oder eine A47934 produzierende Mutante oder-Variante hiervon in einem Kulturmedium; das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen züchtet

25

Das erfindungsgemäße Antibiotikum A47934, das der Familie der Glykopeptid-Antibiotika angehört ,„ oder dessen pharmazeutisch unbedenkliche Salze zeichnen sich durch eine besonders interessante antibiotische Wirksamkeit aus, und zwar vor allem eine starke Wirksamkeit gegenüber grampositiven Mikroorganismen.

Das Infrarotabsorptionsspektrum (in KBr) des Antibiotikums A47 934 geht aus Fig. 1 der Zeichnung hervor.

Das Antibiotikum A47934 ist eine weiße kristalline Verbindung mit einem Schmelzpunkt von über 225°C unter Zer-.

-H-

setzung. Das Antibiotikum hat ein durch Massenspektrometrie mittels Bombardement mit schnellen Atomen bestimmtes Molekulargewicht von etwa 1311. 5

Das Η-magnetische Kernresonanzspektrum des Antibiotikums A47934 ist in Dimethylsulfoxid bei Raumtemperatur bestimmt worden. Die sechsgliedrigen Ringe der Strukturformel sind durch Buchstaben des Alphabets bezeichnet, wie dies aus folgender Formel hervorgeht:

* 5». .82 3·χ Λ 1

Ησ \/ ΌΗ ν

Oh

Aus der folgenden Tabelle I gehen die Daten für die chemischen Verschiebungen hervor.

- 5 TABELLE, I

Chemische Verschiebungen*

Ring A

Zuordmma

Chem. Verschiebung Zuordnung

Ring E Chem.Verschiebung

-NH -2' -1 ' -2

-5 -6

Ring B

Ring C

Ring D

6,78 4,12 5,02 7,63 7,19 7,45

-NH	7,62
-1'	5,57
-2	5,67
-6	5,03

-NH	7,45
-2¹	4,86
-I¹	3,30
-1 '	2,82
-2	7,68
-3	7,16
-6	7,20

-NH	8,29
-I¹	4,43
-2	6,26
-4	6,37

-NH -1 -2 -6

Ring F

8,64 4,55 7,24 6,78

-NH	7,65
-1 '	5,21
-2	6,38
-4	6,35
-6	6,30
Ring G
-1'	4,76
-2	6,57
-5	7,65
-6	7,12

*Austauschbare Protonen sind nicht aufgeführt

. Auf Basis des Molekulargewichts, der Daten der magnetischen Kernresonanz und -der Daten der Elementaranalyse ergibt sich für das Antibiotikum Ά47934 die empirische For-

^{mel C}58^H44^C13^N7°21-^S·

Eine potentiometrische -Titration des neuen Antibiotikums in einem Gemisch aus 6 6 % Dimethylformamid und Wasser zeigt drei titrierbare Gruppen mit pK -Werten von etwa

5,85, 7,9 und 10,3 (anfänglicher pH-Wert = 6,44). Der ρκ -Wert für die Gruppe -SO-,Η ist nicht bestimmt worden, a j

da das Titriergerät bei einem pH-Wert von unter 4,0 nicht registriert. Die bei der Titration erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß das Antibiotikum A4793 4 mit Basen ohne weiteres Salze bildet. Das Antibiotikum bildet auch Salze mit starken Säuren, die einen pH-Wert von 3 oder darunter haben.

Das Antibiotikum A47934 zeigt einen spezifischen Drehwert von /^/q^{5 =} -¹'"^{0 (H}2⁰' ^c = ¹⁰ mg/ml).

Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A47934 in KBr geht aus Fig. 1 der Zeichnung hervor. Darin lassen sich folgende unterscheidbare Abserptionsmaxima beobachten: 3700 bis 2700 (sehr breit, intensiv), 1658 (stark), 1615 (mittel), 1590 (mittel), 1510 (stark),.1491 (mittel), 1472 (schwach),1429 (mittel), 1398 (mittel), 1326 (sehr schwach), 1265 (mittel), 1231 (stark), 1205 (schwach), 1163 (schwach), 1140 (mitte" 1), 1058 (schwach), 1045 (mittel), 1005 (mittel), "849 (mittel), 754 (schwach) und 719 (schwach.) cm -

Die Ultraviolettabsorptionsspektren des Antibiotikums A47934 sowohl in sauren als auch in neutralen wäßrigen Lösungen verfügen über Absorptionsmaxima bei 281 nm.(£ = 10850). Das Ultraviolettabsorptionsspektrum des Antibiotikums A47934 in basischer wäßriger Lösung zeigt ein "Absorptionsrnaximum bei 297 nm (£ = 18900).

Das Antibiotikum A47934 wird durch Züchtung des bis jetzt nicht -beschriebenen Stamms «von Streptomyces toyocaensis NRRL 15009 produziert.

° Zur Erfindung gehört ferner auch die biologisch reine Kultur des bisher nicht beschriebenen Stamms von Streptomyces toyocaensis NRRL 15009. Diese Kultur ist der Einfachheit halber im Labor der Anmelderin als Kultur A47934.1

bezeichnet worden

10

Die Kultur A47934.1 ist ein Variantenstamm, der durch natürliche Selektion aus der Kultur A47934 erhalten worden ( ) ist und ursprünglich aus einer Flutsandprobe isoliert worden ist, die in Clayton Bay, Washington, V.St.Α., ,gesam- -5 melt worden ist.

Die erfindungsgemäße antibiotische Substanz wird willkürlich als Antibiotikum A47934 bezeichnet.

Die Kultur A47934.1 ist als Stamm von Streptomyces toyocaensis klassifiziert worden, und zwar aufgrund -eines Vergleichs mit einer veröffentlichten Beschreibung von Streptomyces griseoflavus ATCC 25456 gemäß Shirling und Gottlieb, "Cooperative Description of Type Cultures of _r-_w 2 5. Streptomyces", Int. J. Syst. Bacteriol. 19(4), 3 91 bis ^ 512 (1969), und mit einer veröffentlichten Beschreibung von Streptomyces toyocaensis Nishimura, Katagiri, Sato, Mayama und Shimoaoka, ATCC 19814 gemäß Shirling und Gottlieb, "Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces", Int. J. Syst. Bacteriol. 18(2), 174 (1968)· zusammen mit bestimmten ergänzenden Untersuchungen.

Die Kultur A-47934.1 zeigt eine Sporenmassenfarbe in der grauen (GY) Farbreihe, und sie unterscheidet sich somit . . 35 von der gelblich-grauen Sporenmassenfarbe von Streptomyces griseoflavus gemäß der Beschreibung von Waksman, * "The Äctinomycetes, Band II, Seite 222" (The Williams and Wilkins Co., Baltimore, V.St.A., (1961)). Ein weiterer

Unterschied besteht darin, daß Streptomyces griseoflavus Mannit und Rhamnose verwertet, während dies für die Kultur A47934.1 nicht gilt.

Die Kultur A4793 4.1 ist in bezug auf ihre Züchtungseigenschaft, Morphologie und Physiologie ähnlich zu Streptomyces toyocaensis Nishimura, Katagisi, Sato, Mayama und Shimaoka ATCC 19 814.

Charakterisierung der Kultur. A47934.1

Der Stamm A47934.1 bildet gut entwickelte nicht fragmentierende Luftmycelien, die monopodial verzweigt sind. Sporophoren sind in offenen kurzen und losen Spiralen aus zwei bis drei Spulen angeordnet, und der Stamm A47934.1 · ist daher gemäß Pridham et al, "A Guide for the Classification of Streptomycetes According to Selected Groups", Appl. Microbiol. 6, 5 2 bis 7 9 (19 57), dem Abschnitt der Spiralen (S) zuzuordnen.

Diese Morphologie läßt sich am besten auf ISP-Medien Nr. 3 und 4 beobachten. Reife Sporenketten enthalten im allgemeinen 10 bis 50 Sporen pro Kette. Die Sporenform ist länglich bis oval, und die Sporenoberfläche ist dornig. Die Sporengröße reicht von 0,58 bis 0,71 μτη in der Breite und von 0,75 bis 0,88 μΐη in der Länge, so daß sich eine mittlere. Größe mit einer Breite von 0,6,5 μΐη und einer Länge von 0,8 3 μπί ergibt.

KuItürCharakteristiken

Die Wachstumscharakteristiken der Kultur A47934.1 auf verschiedenen Medien gehen aus der folgenden Tabelle I hervor.

Die Zuordnung der Farbnamen beruht auf ISCC-NBS Centroid Color Charts Sample Mo. 2106 (National Bureau of Stan-

dards, U.S. Department, Container Corporation of America, Chicago, Illinois, V.St.A.., 1958).

TABELLE I

Kulturcharakteristiken auf verschiedenen Medien

Medium Charakteristiken

Hefeextrakt-MaIzextrakt-Agar (ISP Medium Nr. 2)

Hefemehl-Agar (ISP Medium Nr. 3)

Anorganische Salze-Stärke-Agar (ISP Medium Nr. 4 )

Glycerin-Asparagin-Agar (ISP-Medium Nr. 5)

Czapek-Agar

Tomatenpaste-Hefemehl-Agar

G = Wachstum R - Unterseite Am = Luftmycel Sp = Lösliches Pigment

G R

Am Sp

G R

Am Sp

G R

Am Sp

G R

Am Sp

G R

Am Sp

G R

Am Sp

Reichlich 68.S.OY

Gut: 2ih helloliv-grau

Keines

Gut

91.d.gy.Y

Gut: 2ih helloliv-grau

Keines

Reichlich 94.1.01Br Reichlich: Keines

2ih helloliv-grau

Reichlich 67.brill.0Y

Gut: 2ih helloliv-grau

Keines

Gut

91.d.gy.Y

Gut: 2ih helloliv-grau

Keines

Reichlich 9 4.1.01Br Reichlich: Keines

2ih helloliv-grau

15

20

^2S

30

35

- 11 -

Die Kultur A47934.1 und von Streptomyces toyocaensis ATCC 19814 werden hinsichtlich ihrer Kohlenstoffverwertungsmuster unter Verwendung von Grundmedium ISP Nr. 9 miteinander verglichen, dem bis zu einer gleichen Endkonzentration von 1,0 % filtersterilisierte Kohlenstoffquellen zugesetzt worden sind. Die Ablesung der Platten erfolgt nach 14-tägiger Inkubation bei 30⁰C. Die dabei erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle II hervor.

- 12 TABELLE II

KohlenstoffVerwertungsmuster von A479 34.1 und Streptomyces

toyocaensis ATCC 19814 5

Kohlenstoffquelle A47934.1 ATCC 19814

Kein Kohlenstoff -

D-Glucose + +

L-Arabinose + +

Cellobiose . + NU

D-Fructose + · +

-^ D-Galactose + NU

Isoinosit + +

D-Mannit - . +

Melibiose - NU

Raffinose - ·

D-Rhamnose

Ribose + NU

Salicin - NU

Saccharose -

D-Xylose + +

- = Keine Verwertung

+ ⁼ Verwertung

_J +_ = Zweifelhafte Verwertung

NU = Nicht untersucht

Zellwandstudien

30

Unter Verwendung hydrolysierter Gesamtzellen des Organismus bestimmt man die Anwesenheit bestimmter diagnostischer Zucker. Zur Bestimmung der Zellwandzucker bedient man sich einer Abwandlung des von M.?. Lechavalier beschriebenen Verfahrens /Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomycetes Into Genera/. Diese Methoden sind auf Arbeitssitzungen des Subcommittee on Actinomycetes of the American Society of Microbiology (Dr.

* Thomas G. Pridham, Convenor) entwickelt worden, die am Institute of Microbiology, Rutgers University, The State University of New Jersey, New Brunswick, N.J., V.St.A.

(1971) abgehalten wurden, δ

Unter Verwendung hydrolysierter Gesamtzellen bestimmt man die Isomeren von Diaminopimelinsäure, wobei man sich zu dieser Bestimmung der Isomeren der Diaminopimelinsäure des Verfahrens von Becker et al., Appl. Microbiol. 11, 421 bis 423 (1964) bedient.

Hierbei gelangt man zu folgenden Ergebnissen:

Versuch !Ergebnis

^: '

25

30

Festgestellte diagnostische Zucker Isomere' von. 2 , 6-Diaminopimelinsaure

Glucose, Ribose LL-Isomer

Ein Vergleich der Charakteristiken der Kultur A47934.1 und von,Streptomyces toyocaensis ATCC 19814 geht aus der folgenden Tabelle III hervor.

35

TABELLE III

Vergleich der Charakteristiken der Kultur A47934.1 und von

ATCC 19814

Charakteristiken	A47034.1	ATCC 19814
Farbe der Luftsporenmasse	Grau	Grau
KohlenstoffVerwertungsmuster	+	T
(D-Mannit)	-	+
(D-Xylose)	+	+
Gelatineverflüssigung	4.
Melanoidpigment	-	-
ISP Nr. 1	-	-
ISP Nr. β	-	-
ISP Nr. 7	-	-
ISP Nr. 7 modifiziert	-	NU
Morphologie	S	S
NaCl-Verträglichkeit in Pro	9	NU
zent
Nitratreduktion	+
Farbe der Unterseite	Y-Br	Y-Br
Hydrolysierte Magermilch	+	+
Lösliche Pigmente	-	'-
Sporenform	. länglich	länglich
Sporenoberfläche	dornig	dornig
Stärkehydrolyse	+	+
Temperaturbereich in ⁰C	15 bis 40	NU

NU = Nicht untersucht

Eine Zusammenfassung der Ähnlichkeiten und Unterschiede der Kultur A47934.1 und von Streptomyces toyocaensis ATCC 19814 geht aus der folgenden Tabelle IV hervor.

- 15 TABELLE IV

Zusammenfassung der Kultur A47934.1 und von Streptomyces

toyocaensis ATCC 19814

Ähnlichkeiten

Unterschiede

Farbe der Luftsporenmasse (GY) Verwertung von Man-Kohlenstoffverwertuigsmuster nit und Xylose

Abwesenheit unterscheidbarer Pigmente durch Streptomyces Gelatineverflüssigung toyocaensis

Abwesenheit von Melanoidpigmenten .Morphologie (S) Nitratreduktion

Beeinflussung von Magermilch

Abwesenheit von löslichen Pigmenten Sporenkettenlänge (10 bis 50) Sporenoberflächenornamentation (Spy) Stärkehydrolyse

Die Kultur A47934.1 ist beim Northern Regional Research Center, US-Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61604, V.St.A. hinterlegt (25. Januar 1982) und Teil der dortigen Kulturen-Sammlung, von der sie unter der Nr. NRRL 15009 frei bezogen werden kann.

Das Antibiotikum A47934 ist sauer, weil es sowohl eine Carbonsäurefunktion als auch eine Funktion -SO,H enthält, so daß sie mit Basen ohne weiteres zur Bildung von Salzen befähigt ist. Das Antibiotikum enthält ferner auch eine Aminogruppe, die lediglich mit starken Säuren mit einem pH-Wert von 3 oder darunter Salze bildet. Die auf diese -^: Weise gebildeten pharmazeutisch unbedenklichen Salze sind ebenfalls Teil der Erfindung. Unter solchen pharmazeutisch unbedenklichen Salzen werden Salze verstanden, die sich bei der Chemotherapie warmblütiger Tiere verwenden lassen. Zu Beispielen für geeignete Salze des'Antibioti-

kums A47934 gehören die Säureadditionssalze, die durch übliche Reaktion der Carbonsäurefunktion oder der Funktion -SO-,Η mit Basen, wie Natriumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Calciumhydroxid, Kaliumhydroxid, Tri- ° methylamin, Ammoniumhydroxid oder Diethanolamin, gebildet werden, und ferner auch die Salze, die durch Reaktion der Aminogruppe mit Säuren entstehen, die einen pH-Wert von 3 odex" weniger haben, wie mit Schwefelsäure, Chlorwasserstoff säure oder Phosphorsäure

·

Das Antibiotikum A47934 ist gegenüber grampositiven Mikroorganismen wirksam. Weiter erhöht dieses Antibiotikum auch das Wachstum und die Futterausbeute von Geflügel, Schweinen und Rindern

..

Das Ausmaß, in welchem das Antibiotikum A4793 4 das Wachs- turn von Organismen hemmt, ist unter Verwendung verschiedener Testverfahren bestimmt worden.

Das Antibiotikum A47934 hat sich bei entsprechenden Untersuchungen als gegenüber einer Anzahl von anaeroben Bakterien wirksam erwiesen, wie dies aus. der folgenden Tabelle V hervorgeht. Die MIC-Werte werden durch das Agar-Verdünnungsverfahren bestimmt.

TABELLE V

Wirksamkeit des Antibiotikums A47934 gegenüber anaeroben

Bakterien 30

Versuchsorganismen MIC-Werte (μg/ml)

Clostridium difficile 2994 0,5

Clostridium perfringens 81 0,5

35 Clostridium septicum 1128 0,5

Eubacterium aerofaciens 1235 1/0

Peptococcus asaccharolyticus 1302 0,5

Peptococcus prevoti 12 81 1,0

- 17 TABELLE V (Fortsetzung)

Versuchsorganismen MIC-Werte

Peptostreptococcus anaerobius 1428 0,25

δ Peptostreptococcus intermedius 1264 1,0

Propionibacterium acnes 79 1,0

Bacteroides fragilis 111 32,0

Bacteroides fragilis 1877 32,0

Bacteroides fragilis 1936B 32,0

Bacteroides thetaiotaomicron 1438 . 32,0 Bacteroides melaninogenicus 1856/28 >128,0

Bacteroides melaninogenicus 2736 16,0

("V Bacteroides vulgatis 1211 32,0

Bacteroides corrodens 1874 32,0

Fusobacterium symbiosum 1470 2,0

Fusobacterium necrophorum 6054A 0,25

Das Antibiotikum A47934 ist ferner auch wirksam gegenüber einer Reihe von Stämmen von Clostridium difficile, wie sich ebenfalls durch eine Bestimmung nach dem Agar-Verdünnungsverfahren ergeben hat. Die dabei erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle VI hervor.

TABELLE VI

5

W Wirksamkeit des Antibiotikums A47934 gegenüber Stämmen

von Clostridium difficile

Clostridium difficile MIC-Werte

8484 <0,5

6890 <0,5

2634 . <l,0

7 8 <0,5

A-I9 4 <0,5

A-195 <0,5

A-196 <0,5

A-279 <l,0

A-28Q <0,5

TABELLEVI (Fortsetzung)

Clostridium difficile MIC-Werte

A-281 <0,5

WAL-2112 <0,5

WAL-3657 <0,5

WAL-4268 . <0,5

107B <0,5

HlF <),5

1153 , <0,5

3424-5B <0,5

-3816 <0,5

395ÖD ' <0,5

15 Das Antibiotikum A47934 ist ferner auch wirksam gegenüber einer Anzahl grampositiver pathogener Bakterien, und"dies ist ebenfalls wiederum durch übliche Agar-Ver dünnungsversuche bestimmt worden. Die dabei erhaltenen MIC-Werte gehen aus der folgenden Tabelle VII hervor.

TABELLE VII

Wirksamkeit des Antibiotikums A47934 gegenüber einer

Reihe von Bakterien 25

Versuchsorganismen „ MIC-Werte ^

Staphylococcus aureus Xl.1 0,06

Staphylococcus aureus V41 0,125

30 Staphylococcus aureus X400 0,25

Staphylococcus aureus S13E 0,125

Staphylococcus epidermidis EPIl 0,25

Staphylococcus epidermidis EPI2 2,0

Streptococcus pyogenes C20 3 0,25

3 5 Streptococcus pneumoniae Park 1 0,0 6

Streptococcus Group D X66 · 0,5

Streptococcus Group D 9960 · 0,5

Haemophilus influenza CL. 2,0

- 19 1TABELLE VII (Fortsetzung)

Versuchsorganismen MIC-Werte

Haemophilus influenza 76 4,0

Shigella sonnei N9 >128,0

Escherichia coli NlO ^> 128,0

Escherichia coli EC14 >128,0

Escherichia coli TEM >128,0

Klebsiella pneumoniae X26 >128,0

Klebsiella pneumoniae KAE >128,0

Klebsiella pneumoniae X68 >128

Enterobacter aerogenes C32 >128

Enterobacter aerogenes EB17 >128

Enterobacter cloacae EB5 >128

Enterobacter cloacae 265A " >128

Salmonella typhi X514 >128

Salmonella typhi 1335 >128

Pseudomonas aeruginosa X528 >128

Pseudomonas aeruginosa X239 >128

Pseudomonas aeruginosa Psl8 ->.128

Pseudomonas aeruginosa Ps72 >128

Serratia marcescens X99 >128

Serratia marcescens SE3 >128

Proteus morganii PR15 >128

Proteus inconstans PR33 ,. >128

Proteus rettgeri PR7 >128

Proteus rettgeri C24 >128

Citrobacter freundii CF17 >128

Das Antibiotikum A47934 hat sich in vivo ferner auch gegenüber experimentell hervorgerufenen Bakterieninfektionen als antimikrobiell wirksam erwiesen. Verabreicht man zwei Dosen der jeweils zu untersuchenden Verbindung subkutan Mäusen mit den angegebenen Infektionen, dann wird die beobachtete Wirksamkeit als ED__n-Wert gemessen (wirk

» DU '

same Dosis in mg/kg, die für einen Schutz von 5 0 % der Versuchstiere ausreicht: siehe Warren Wick et-al., J. Bacteriol. 81, 233 bis 235 (1961)).Die bei diesen Versu-

chen für das Antibiotikum A47934 beobachteten ED__Q-Werte gehen aus der folgenden Tabelle VIII hervor.

TABELLE VIII

In vivo-Wirksamkeit von A47934 ED-,,-Werte (mg/kg χ 2)

Antibiotikum Streptococcus Streptococcus Staphylococcus

pyogenes (C203) pneumoniae aureus (3055)

(Park I)

L ,

A47934 . 3,38 . 1,77 <0,3

Bei intraperitonealer Verabreichung an Mäuse ergibt sich für das Antibiotikum A47934 eine akute Toxizität von über 3 00 mg/kg.

Die Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Behandlung von Infektionen bei Menschen oder Tieren gerichtet, das darin besteht, daß man Menschen oder Tieren eine antibiotisch wirksame Dosis zwischen etwa 25 und etwa 2000 mg

"des Antibiotikums A47934 oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes hiervon verabreicht.

Zur. Behandlung von Infektionen beim Menschen kann man das Antibiotikum auf parenteralem Weg verabreichen, beispielsweise durch intramuskuläre Injektion oder durch intravenöse Infusion. Zur Injektion wird das Antibiotikum oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz hiervon in einem physiologisch unbedenklichen Verdünnungsmittel mit der gewünschten Konzentration gelöst und verabreicht. Zu geeigneten Verdünnungsmitteln gehören beispielsweise Wasser zur Injektion, 0,9 %-ige Kochsalzlösung, 5 %-ige Dextroselösung, Ringer-Lösung oder sonstige herkömmliche Verdün- nungsmittel. Für eine Verabreichung durch intravenöse In-35. fusion wird das Antibiotikum oder Salz hiervon in einer physiologischen Flüssigkeit oder verdünnten Nährlösung mit einer geeigneten Konzentration zubereitet, beispielsweise einer Konzentration zwischen etwa 5 und etwa 10 %,

und langsam mit der Flüssigkeit infundiert. Wahlweise kann das Antibiotikum auch durch die sogenannte Huckepack-Methode verabreicht werden.

° Das Antibiotikum oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz hiervon kann in hermetisch verschlossenen Ampullen, sterilen und mit Gummistcpfen verschlossenen Fläschchen oder Kunststoffbeuteln zu Einheitsdosierungen formuliert werden. Solche Einheitsdosierungsformen können Hilfsstöffe, wie Antioxidationsmittel, Löslichkeitsvermittler, Dispergiermittel, Puffer und dergleichen, enthalten. Eine solche Einheitsdosisformulierung kann 100 mg des Antibiotikums A47934 oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes hiervon in einem mit einem Kautschukstopfen (Bu-

^° tylkautsch.uk) verschlossenen Fläschchen enthalten. Eine andere Einheitsdosisformulierung kann 250 mg des Antibiotikums A47934 oder eines Salzes hiervon in einer sterilen verschlossenen Ampulle enthalten. Eine zur intravenösen Infusion geeignete erfindungsgemäße Einheitsdosisformulierung .enthält 5 g des Antibiotikums A47934 oder eines ., pharmazeutisch unbedenklichen Salzes hiervon in einem Plastikbeutel.

Bei Verwendung von A47 934 als Antibiotikum kann man die_ses entweder oral oder parenteral verabreichen. Selbstverständlich wird das Antibiotikum A47934 normalerweise zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger .oder Verdünnungsmittel verabfolgt. Die zu verabreichende Dosis an Antibiotikum A479 3 4 ist abhängig von einer Reihe von Überlegungen, wie der Art und Schwere der jeweils zu behandelnden Infektion. Für eine Verabreichung geeignete Dosisbereiche und/oder Dosiseinheiten lassen sich vom Fachmann ohne weiteres anhand der hierin enthaltenen MIC-Werte und ED__n~Werte sowie der Toxizitätswerte zu- . sammen mit Faktoren bestimmen, wie den Eigenschaften des Patienten oder Wirts und des infizierenden Organismus.

Das Antibiotikum A47934 eignet sich auch zur Unterdückung

des Wachstums von Clostridium difficile, nämlich des Organismus, der im Intestinum pseudomembranöse Kolitis hervorruft. Das Antibiotikum kann zur Behandlung pseudomembranöser Kolitis verwendet werden, indem man eine wirksarne Dosis des Antibiotikums oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes hiervon oral verabreicht, und zwar als pharmazeutisch unbedenkliche Dosierungsform. Hierzu kann man das Antibiotikum in Gelatinekapseln oder in flüssiger Suspension verabfolgen.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum kann auch in der Veterinärmedizin zur Behandlung von Infektionskrankheiten, wie Mastitis, bei Haustieren und landwirtschaftlichen Nutztieren eingesetzt werden. Ferner eignet sich das Antibiotikum auch bei der Tierzucht, beispielsweise zur Verbesserung des Wachstums von Rindern und sonstigen Wiederkäuern. Diese Anwendungsmöglichkeiten stellen weitere Gesichtspunkte der Erfindung dar, die in den folgenden Abschnitten näher beschrieben werden.

Das Antibiotikum A479 34 eignet sich auch zur Veränderung des Verhältnisses an flüchtigen Fettsäuren (VFA), die im Pansen von Wiederkäuern gebildet werden, welche über eine entwickelte Pansenfunktion verfügen. Bekanntlich nimmt die Effizienz der Kohlenhydratverwertung bei Wiederkäuern durch Behandlungen zu, die die Pansenflora des jeweiligen Tiers so stimulieren, daß anstelle von Acetat- oder Butyr^atverbindungen Propionatverbindungen produziert werden, wie dies aus "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", Band 2 (1971), Seiten 62 2 und 625 von Church et al. hervorgeilt, und das Antibiotikum A47934 verfügt daher über die Fähigkeit zur Verbesserung der Effizienz der Futterverwertung bei solchen Tieren.

Die Wirksamkeit des Antibiotikums A479 3 4 zur Veränderung des Verhältnisses an flüchtigen Fettsäuren, die im Pansen gebildet werden, wird unter Anwendung des in US-PS

3 928 571 beschriebenen in vitro-Versuchs bestimmt. Die bei diesem Versuch unter Verwendung des Antibiotikums A47934 erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle IX hervor.

Die in dieser Tabelle IX angegebenen Versuchswerte stellen das Verhältnis aus den in den behandelten Kolben gebildeten freien Fettsäuren und den in den unbehandelten Kontrollkolben gebildeten freien Fettsäuren dar. Diese Art der Angabe der Versuchsdaten macht die Ergebnisse der Veränderung in der chemischen Zusammensetzung des Pansens besonders deutlich, die durch das vorliegende neue ( } Verfahren zur Verbesserung der Futterverwertung bewerkstelligt wird.

15

20

	4	TABELLE	IX	,81	Propionat	Butyrat
Verbindung	10	Menge	Acetat	,95	1,32	1,03
A47934	2	μ g/ml	0	,09	1,12	1,00
A47934	1	μ g/ml	0	,99	1,10	1,03
A47934	μ g/ml	1		1,11	1,01
A47934	pg/ml	0

25

Die in obiger Tabelle IX angegebenen Daten zeigen, daß sich mit dem Antibiotikum A47934 die Bildung von Propionat im Pansen wirksam erhöhen läßt.

Durch Verabreichung des erfindungsgemäßen Antibiotikums läßt sich nicht nur die Futterverwertung verbessern, sondern auch eine Ketose verhindern oder behandeln. Der eine Ketose verursachende Mechanismus beruht auf einer mangelnden Produktion von Propionatverbindungen. Eine der gegenwärtig empfohlenen Behandlungsmethoden besteht in einer Verabfolgung von Propionsäure oder einem Futter, das bevorzugt Propionate bildet. Das vorliegende Verfahren regt offensichtlich die Bildung von Propionat aus normalem Fut-

- 24 ter an und verringert die Gefahr einer Ketose.

Infolge der Strukturverwandtschaft des Antibiotikums A47934 mit anderen Glykopeptid-Antibiotika, die sich zur ^ Verbesserung der Milchproduktion bei milchgebenden Tieren verwenden lassen, welche über eine entwickelte Pansenfunktion verfügen, ist zu erwarten, daß auch das vorliegende Antibiotikum A47934 über eine solche Wirksamkeit verfügt.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum ergibt, wie bereits erwähnt, eine Erhöhung der Wirksamkeit der Futterverwertung bei Wiederkäuern. Die einfachste Art der Verabreichung des Antibiotikums besteht in einem Vermischen mit dem jeweiligen Tierfutter.

15 .

Das Antibiotikum A47934 kann daher ohne weiteres mit herkömmlichen Futterzusammensetzungen für Milchvieh vermischt werden. Solche Zusammensetzungen werden dann dem jeweiligen Viehbestand in üblicher Weise verfüttert.

Zu herkömmlichen. Futtermitteln für Milchvieh gehören die verschiedensten Kornarten und Kornmischungen, wie Mais und Hafer, und die Rauhfutter, wie Heu, Baumwollsaathülsen, . Reishülsen und Silage. Das Antibiotikum A47934 kann mit solchen Futterzusammensetzungen in Mengen von etwa 30 bis etwa 300 g pro Tonne Futter (auf Trockenbasis) vermischt werden.

Für eine kommerzielle Anwendung des Antibiotikums A47934 zur Verbesserung der Milchproduktion empfiehlt sich der Einsatz des Wirkstoffs in Forin eines Futtervorgemisches oder eines Futterkonzentrats. In solchen Formulierungen kann das Antibiotikum A47934 gleichförmig durch einen herkömmlichen organischen oder anorganischen Träger für ein Tierfutter verteilt sein, wie gemahlenem Mais, Gerste, Sojabohnenschrot, Weizen, Sojamehl oder einem ähnlichen wohlfeilen Futterbestandteil. Das jeweilige Futtergemisch vermischt man dann gleichförmig mit der normalen täglichen

- 25 -

Futterration, bevor man die Ration dem jeweiligen milchgebenden Wiederkäuer verfüttert. Das Vorgemisch wird in solcher Menge zugesetzt, daß sich für das jeweilige Tier eine propionaterhöhende Menge an Antibiotikum A47934 ergibt.

Die folgende Zusammensetzung ist eine typische Ration, welche milchgebenden Wiederkäuern verabreicht wird und die mit einer die Milchproduktion erhöhenden Menge an A47934 versetzt werden kann.

Bestandteile	h Protein)	Gew.-%
Mais		32,15
Gerste		10,0
Melasse		7,5
Hafer		. 10,0
Sojabohnenölschrot (48 '		13,8
Zuckerrübenpulpe		2,5
Maisglutenfutter	12,5
Brennereikorn	7,5
Spurenmineralgemisch	0,05
Salz	1,0
Dicalciumphosphat	2,0

100,00

Die obigen Bestandteile werden gleichförmig miteinander vermischt und dann mit einer solchen Menge an Antibiotikum A47934 versetzt, daß milchgebende Wiederkäuer, nämlieh in diesem Fall Kühe, etwa 600 mg Antibiotikum pro Kopf und Tag erhalten.

Das Antibiotikum kann jedoch auch auf irgendeine andere Art verabreicht werden. So kann man es beispielsweise in Tabletten, Tränken, BoIi oder Kapseln einarbeiten und in dieser Form den jeweiligen Tieren verabreichen. Solche Dosierungsformen des Antibiotikums lassen sich in üblicher Weise formulieren. Jede einzelne Dosierungseinheit

soll eine Menge an die Futtereffizienz verbessernder Verbindung enthalten, die in direkter Beziehung zur jeweils geeigneten Tagesdosis für das zu behandelnde Tier steht.

Kapseln lassen sich ohne weiteres herstellen, indem man Gelatinekapseln mit irgendeiner gewünschten Form des Antibiotikums füllt. Gewünschtenfalls kann man das Antibiotikum auch mit einem inerten pulverförmigen Verdünnungsmittel verdünnen, wie Zucker, Stärke oder gereinigter kristalliner Cellulose, um auf diese Weise das Volumen zu erhöhen, damit sich das Ganze leichter in Kapseln abfüllen läßt.

Tabletten des Antibiotikums können unter Anwendung herkömmlicher pharmazeutischer Verfahren hergestellt werden. Die Herstellung von Tabletten ist eine wohlbekannte und weit fortgeschrittene Technik. Zusätzlich zum Wirkstoff enthält eine Tablette gewöhnlich eine Grundlage, einen Zerfallhilfsstoff, ein Absorbens, ein Bindemittel und ein Gleitmittel. Zu typischen Grundlagen gehören Lactose, feiner Staubzucker, Natriumchlorid, Stärke und Mannit. Stärke ist genauso wie Alginsäure auch ein guter Zerfallhilfsstoff. Es lassen sich auch oberflächenaktive Mittel verwenden, wie "Natriumlaurylsulfat oder Dioctylnatriumsulfosuccinat. Zu herkömmlich verwendeten Absorptionsmitteln gehören wiederum Stärke und Lactose, wobei für ölige Substanzen auch Magnesiumcarbonat geeignet ist. Häufig verwendete Bindemittel sind Gelatine, Gummen, Stärke, Dextrin und verschiedene Cellulosederivate. Als Gleitmittel verwendet man gewöhnlich Magnesiumstearat, Talkum, Paraffinwachs, verschiedene Metallseifen und Polyethylenglykol.

Die antibiotische Verbindung kann auch in Form eines Bolus mit verzögerter Wirkstofffreigäbe verabreicht werden, Solche BoIi werden genauso hergestellt wie Tabletten, mit Ausnahme der zusätzlichen Verwendung eines Mittels zur Verzögerung der Auflösung des Antibiotikums. BoIi werden so zubereitet, daß sie eine Wirkstofffreigäbe über eine

lange Zeitdauer ergeben. Die langsame Auflösung wird durch Auswahl einer in Wasser in hohem Ausmaß unlöslichen Form des Antibiotikums unterstützt. Um die Dichte des Bolus zu erhöhen und ihn ruhig am Boden des Pansen zu halten, setzt man Substanzen zu, wie Eisenspäne.

Die Auflösung des Antibiotikums läßt sich durch Anwendung einer Matrix aus unlöslichen Materialien verzögern, in die der Wirkstoff eingebettet ist. Brauchbar hierzu sind beispielsweise Substanzen, wie Pflanzenwachse, gereinigte Mineralwachse und wasserunlösliche polymere Materialien.

Tränken des Antibiotikums lassen sich am einfachsten durch Auswahl einer wasserlöslichen Form des Antibioti-

kums herstellen. Möchte man aus irgendeinem Grund eine ·

unlösliche Form haben, dann kann man hierzu eine Suspension herstellen. Wahlweise läßt sich eine Tränke auch als Lösung in einem physiologisch unbedenklichen Lösungsmittel formulieren, wie einem Polyethylenglykol. 20

Suspensionen unlöslicher Formen des Antibiotikums können hergestellt werden in Nichtlösungsmitteln, beispielsweise Pflanzenölen, wie Erdnußöl, Maisöl oder Sesamöl, in einem Glykol, wie Propylenglykol oder Polyethylenglykol, oder in Wasser, und zwar je nach der Form des gewählten Antibiotikums.

Geeignete physiologisch unbedenkliche Hilfsstoffe sind erforderlich, um das Antibiotikum suspendiert zu halten.

Solche Hilfsstoffe können unter anderem aus der Gruppe der Verdickungsmittel ausgewählt werden, wie Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine oder den Alginaten. Zur Suspendierung des Antibiotikums lassen, sich auch manche Klassen an oberflächenaktiven Mitteln verwenden. Zur Herstellung von Suspensionen in flüssigen Nichtlösungsmitteln eignen sich beispielsweise Lecithin, Addukte aus Alkylphenolen und Polyethylenoxid, Naphthalinsulf onate, Alkylbenzolsulfonate und Polyoxyethylensor-

bitanester.

Die Herstellung von Suspensionen läßt sich in einzelnen Fällen zusätzlich auch noch durch Substanzen unterstützen, ^ die die Hydrophilie, Dichte und Oberflächenspannung der Flüssigkeit beeinflussen. So eignen sich als Suspendiermittel beispielsweise auch Antischaummittel auf Siliconbasis, Glykole, Sorbit und Zucker.

¹^ Das suspendierbare Antibiotikum kann dem Tierfutter als Suspension oder als Trockengemisch aus dem Antibiotikum und Hilfsstoffen angeboten werden, welches vor seiner J Verwendung verdünnt werden muß.

zur Herstellung von Stäuben oder Pulvern für eine Verabreichung durch Insufflation vermischt man die Antibiotika normalerweise mit Talkum, Diatomeenerde oder einer sonstigen inerten Substanz als Hilfsmittel.

Die Antibiotika können auch zusammen mit dem Trinkwasser der Wiederkäuer verabreicht werden, indem man eine geeignete Menge einer in Wasser löslichen oder in Wasser suspendierbaren Form des Antibiotikums zu Wasser gibt. Bei der Formulierung des Antibiotikums als Zusatz zu Trinkwasser geht, man genauso vor wie bei der Formulie- -^ rung von Tränken.

Die einfachste Art und Weise zur:Behandlung von Tieren mit dem erfindungsgemäßen Antibiotikum besteht in einem Zusatz zum Futter der Tiere. Jede Futterart kann mit der antibiotischen Verbindung versetzt werden, wie Trockenfutter, Flüssigfutter oder Pelletfutter.

Zur Verwendung in Tierfuttern kann man die Kulturfest-Stoffe unter Einschluß der Bestandteile des Fermentationsmediums und des Mycels als Quelle für das Antibiotikum A47 9 34 ohne Extraktion oder Abtrennung verwenden, wobei das Wasser vorher jedoch vorzugsweise entfernt wird.

So kann man beispielsweise nach Bildung des Antibiotikums A47934 die gesamte Fermentationsbrühe filtrieren und den das Antibiotikum A47934 enthaltenden Filterkuchen trocknen. Ferner kann man den getrockneten Mycelkuchen auch mit einer wäßrigen Alkalilösung mit einem pH-Wert von 10,5 extrahieren, den Extrakt neutralisieren und den Extrakt dann trocknen, wodurch man zum Antibiotikum A47934 gelangt. Weiter kann man auch die gesamte Fermentationsbrühe zur Trocknung entweder lyophilisieren, oder einer Trommeltrocknung unterziehen, oder azeotrop destillieren und dann trocknen. Die dabei erhaltene getrocknete Brühe kann man dann direkt in das Futtervorgemisch einmischen.

Die Methoden zur Einarbeitung von Wirkstoffen in Tierfutter sind wohlbekannt. Gewöhnlich bildet man ein konzentriertes Wirkstoffvorgemisch als Rohmaterial für ein wirkstoff haltiges Futter. Typische Wirkstoffvorgemische enthalten beispielsweise etwa 2 bis 900 g Wirkstoff pro kg Vorgemisch. Der breite Bereich ergibt sich aus dem breiten Bereich der Wirkstoffkonzentration, die man beim fertigen Futter haben möchte. Vorgemische können entweder flüssig oder fest sein.

Die Formulierung.von Tierfuttern, die die für eine Behandlung geeignete Menge an antibiotischer Verbindung enthalten, ist in erster Linie eine Frage der Arithmetik. Man muß nur die Menge an Verbindung errechnen, die man jedem Tier verabreichen möchte. Hierbei ist die Menge an Futter pro Tag, die das jeweilige Tier frißt, und die Konzentration an antibiotischer Verbindung im zu verwendenden Vorgemisch in Betracht zu ziehen, und auf dieser Basis läßt sich dann die geeignete Konzentration an antibiotischer Verbindung im Futter berechnen. Zur Herstellung von Futtermitteln, die die antibiotische Verbindung enthalten, lassen sich alle bekannten Methcden zur Formulierung, Vermischung und Pelletisierung von Futter anwenden. Die Erfindung soll nicht auf eine bestimmte Formulierung oder Methode zur Verabreichung beschränkt sein. Zur Erfindung gehört daher auch ein Verfahren zur Erhöhung der Effizienz der Futte:n/e:nvertung

durch Wiederkäuer, indem man bestimmte Antibiotika oral verabreicht. Jede Art der Verabreichung wird dabei als unter die Erfindung fallend angesehen.

Das Antibiotikum A4793 4 ist auch ein wirksamer Wachstumspromotor bei Hühnchen, wie folgender Versuch zeigt.

Versuch_2

Für diesen Versuch verwendet man 8 Tage alte Brathühnchen (Penobscot). Insgesamt 560 Hühnchen werden in Gruppen mit jeweils 7 Tieren unterteilt. 35 Gruppen dienen als Kontrollen, und 5 Gruppen werden mit dem Antibiotikum behandelt, das man dem üblichen Hühnchenfutter in einer Menge von 20 g Antibiotikum A47934 pro Tonne Futter zusetzt. Das Brathühnchen-Ausgangsfutter ist wie folgt zusammengesetzt:

Brathühnchen-Ausgangsfutter

_π , ,, . , τ, α. Menge auf Menge auf

^Bestandteile Prozent ₈₀ 5_{g 3O}ookg

Gelber gemahlener Mais 65,53 52,42' 1965,9

Sojabohnenschrot, mit Lösungsmittel extrahiert und enthülst (49 %)

Rindertalg 25

Dicalciumphosphat, Futtersorte

Kalkstein

Spurenmineral-Vorgemisch, > TK-Ol (1,02) '

30 Salz

Vitamin-Vorgemisch TK-04-, (1,00) ^l}

Methioninhydroxyanalog

i) Das Spurenmineralvorgemisch sorgt für 7 5 mg Mangan, 50 mg Zink, 25 mg Eisen und 1 mg Iod pro kg fertigem Futter

2) Das Vitamin-Vorgemisch sorgt für 3000 IE Vitamin A,

25,3 6	20,29	760,8
5,00	4,00	150,0
2,15	1,72	64,5
0,83	0,66	24,9
0,10-	0,08	3,0
0,35	0,28	10,5
0,50	0,40	15,0
0,18	0 ,14	5,4
100,00	79,99	3000,00

900 ICE Vitamin D, 40 mg Vitamin E, 0,7 mg Vitamin K,

1000 mg Cholin, 70 mg Niacin, 4 mg Pantothensäure, 4 mg Riboflavin, 100 μg Vitamin B, ~, und 100 μg Biotin pro kg fertigem Futter (ICE = Internationale Hühnchen ° Einheiten).

Berechnete Analyse

Protein, % 18,00

Metabolisierbare Energie, kcal/kg 3 239

Verhältnis von iretabolisierbarer ^79 94 ( g -| 79)

Energie zu Protein ' ~ '

Fett, % 7,37.

Faser, % 2,66

Asche, % ,5,14

Calcium, % 0,85

Phosphor, %. 0,73

Verfügbarer Phosphor, % 0,50

Mangan, mg/kg 8 5

Eisen, mg/kg 7 2

Kupfer, mg/kg 11

²⁰ Zink, mg/kg 72

Selen, μg/kg 74

Magnesium, mg/kg 1693

Kalium, mg/kg 715 8

Natrium, mg/kg 1582

25 Iod, mg/kg 1

Vitamin A, ΙΕ/kg . 516 2

Vitamin D, ICE/kg 900

Vitamin E, mg/kg 5 6,2

Vitamin K, mg/kg 0,7

30 Cholin, mg/kg 1450

Niacin, mg/kg 8 5

Pantothensäure, mg/kg 11,1

Vitamin B,, mg/kg 7,5

Riboflavin, mg/kg 5,5

Thiamin, mg/kg 2,8

Folsäure, mg/kg 1.1

Vitamin B₁₃, μg/kg 100

Biotin, μ9/^ς 233

1,305.	(7,25
0,956	(5,31
0,901	(5,01
0,433	(2,41
0,273	(1,52
0,706	(3,92
0,252	(1,40
	1,25

1 Arginin, %

Lysin, %

Glycin, %

Methionin, % 5 Cystin, %

Gesamte Schwefelaminosäuren, %

Tryptophan, %

Linolsäure, %

3) Die in Klammern angegebenen Werte stellen die Aminosäuren, ausgedrückt als Prozentwerte der Proteinration, dar.

Futter und Wasser erhalten alle Tiergruppen über eine Zeitdauer von 21 Tagen ad libitum. Die Bemessungskriterien für die Wirksamkeit sind wie folgt: 3 %-ige Erhöhung der Gewichtszunahme und/oder 2 %-ige Verbesserung der Futterverwertung. Die bei.diesen Versuchen erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle X hervor.

TABELLE X

Gewichtszunahme Futterverwertung

Behandlung Konzen- g Prozentüa- F/G Prozentuatration Ie Verbes- Ie Verbes-(g/t) serung serung

Kontrolle - 484 - 1,791

A47934 20 519 7,23 1,707 4,69

F/G = Gesamter Futterverbrauch dividiert durch gesamte Gewichtszunahme

Wahlweise kann man das Antibiotikum A47934 in Form eines, pharmazeutisch unbedenklichen Salzes auch im Trinkwasser der Hühnchen verabfolgen.

Das Antibiotikum A47 934 läßt sich daher als Wachstumspromotor bei Hühnchen verwenden, wenn man es Hühnchen zusain-

men mit ihrem Futter in einer Menge von etwa 5 bis etwa 30 g an A47934 oder einem pharmazeutisch unbedenklichen Salz hiervon pro Tonne Futter verabfolgt.

Das Antibiotikum A47 934 wirkt ferner auch als Wachstumspromotor, wenn man es entwöhnten Ferkeln verabreicht. Diese Wirksamkeit wird durch den folgenden Versuch 3 belegt.

Versuch_3

Das Antibiotikum A47934 wird in Mengen von 10 und 50 ppm im· Futter von Ferkeln untersucht, die zu Beginn im Mittel etwa 10,5 kg wiegen, wobei man zu Vergleichszwecken zusamen mit dem Futter auch Tylosin (Tylan von Elanco) in einer Menge von 110 ppm verabreicht. Dieser Versuch wird

^5 in einer gegenüber der Umwelt eingestellten Aufzuchtanlage in Pferchen durchgeführt, die Gitterböden aufweisen. Jede Behandlung wird viermal wiederholt, und es werden jeweils vier Schweine pro Versuch während der 28-tägigen Versuchsdauer verwendet. Es wird mit sechs Versuchswiederholungen aus vier Schweinen pro Wiederholung bei der Kontrollgruppe gearbeitet, die ein Futter ohne Wirkstoff erhält. Man läßt die Schweine ad libitum eine Mais-Soja-Ration mit einem Proteingehalt von 18 % fressen, die wie

folgt zusammengesetzt ist: 25

Schweineration Bestandteile Prozent kg/Tonne

Gemahlener gelber Mais 66,35 663,5

Sojabohnenölschrot, mit Lösungsmittel extrahiert und enthülst, 50 %

Magermilch, getrocknet Calciumcarbonat

Dicalciumphosphat, Futtersorte Salz

Spurenmineral-Vorgemisch, AN-03

19,35	1	9	3,5
10,00	1	0	0
1,20		1	2
1,20		1	2
0,50			5
0,10			1

ο,	05	0	,5
0,	20		2
0,	05	0	,5

- 34 Bestandteile Prozent kg/Tonne

Schweinevitamin-Vorgerr.isch, SW-03 1,00

Vitamin A-Vorgemisch ,> - 3M USP-Einheiten/kg

Methioninhydroxyanaiog, 9 3 %

4 ) Selen-Vorgemisch

1) Jedes kg Vorgemisch enthält folgende Bestandteile:

50 g Mangan als Mangansulfat, 10 0 g Zink als Zinkcar-IC bonat, 50 g Eisen als Eisen(II)-suifat, 5 g Kupfer als Kupferoxid, 1,5 g Iod als Kaliumiodid sowie maximal 150 g und minimal 130 g Calcium als Calciumcarbonat,

2) Jedes kg Vorgemisch enthält folgende Bestandteile: 77161. IE Vitamin D₂, 2205 IE Vitamin E, 411 mg Riboflavin, 1520 mg Pantothensäure, 2205 mg Niacin, 4,4 mg Vitamin B₁₂, 441 mg Vitamin K, 19180 mg Cholin, 110 mg Folsäure, 165 mg Pyridoxin, 110 mg Thiamin und 2 2 mg Biotin.

3) Jedes kg Vorgemiseh enthält 6.613.800 IE Vitamin A. 4) Jedes kg Vorgemisch enthält 200 mg Selen als Natriumselenit. Die berechnete Analyse wird lediglich durch Selen ergänzt.

Berechnete Analyse

Rohprotein, % .19,10

Etherextrakt, % ' 2,8 3

Rohfaser, % 1,8 9

Äsche, % 5 ,60

0 Calcium, % 0,90

Phosphor, % 0,65

Verdaubare Energie, kcal/kg 3 5 4 5,59

Metabolisierbare Energie, kcal/kg 3 27 0,00

Riboflavin, mg/kg 7,88

3 Niacin, mg/kg 2 7,38

Pantothensäure, mg/kg 24,96

Cholin, mg/kg 1224,95

Vitamin B₁₂, (jg/kg 5 0,54

Folsäure, mg/kg .1,99

Pyridoxin, mg/kg 8,37

Thiamin, mg/kg 4,30

Biotin, mg/kg 0,35

Vitamin D, IE/kg 811,61

Vitamin A, IE/kg . 3 904,05

Vitamin E, IE/kg 23,61

Vitamin K, mg/kg 4,41

Kupfer, mg/kg 15,43

Eisen, mg/kg 98,12

Iod, mg/kg 1,50

Magnesium, mg/kg 1627,70

Zink, mg/kg 119,61

Mangan, mg/kg 61,74

Selen, mg/kg . 0,10⁴⁾

Lysin, % 1,02

Methionin, % ' 0,53

. Cystin, % . 0,29

Tryptophan, % 0,23

Isoleucin, % 1,03

Arginin, % 1,15

Histidin, % 0,44

Leucin, % 1,72

Phenylalanin, % 0,97

Tyrosin, % 0,52

Threonin, % 0,77"

Valin, % . 0,98

Am Ende der Versuchsdauer hat sich das mittlere Gewicht des einzelnen Schweins auf 24 kg erhöht. Die bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle XI hervor.

v.y

	Menge ppm	ADG (kg)	TABELLE XI	ADF (kg)	Prozentuale Erhöhung	F/G	Prozentuale Verbesserung
Behandlung	0 10 50 110	0,44 0,45 0,52 0,46	Prozentuale Erhöhung	0,86 0,83 0,90 0,88	-3,2 4,7 2,6	1,97 1,82 1,85 1,92	7,6 6,1 2,5
Kontrolle A47934 A47934 Ty lan		3,1 10,3 4,1

ADG = mittlere Gewichtszunahme ADF = mittlerer täglicher Futterverbrauch

F/G = Verhältnis von Futterverbrauch zu Gewichtszunahme

cn

Zur Erfindung gehört weiter auch ein Verfahren zur Verbesserung des Wachstums entwöhnter Ferkel, das darin besteht, daß man den Ferkeln zusammen mit ihrem Futter etwa 10 bis etwa 50 ppm des Antibiotikums A47934 oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes hiervon verabfolgt. Das Antibiotikum A47934 kann in Form eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes den Ferkeln auch im Trinkwasser verabreicht werden.

Zusätzlich zur Eignung von A47934 zur Verbesserung des Wachstums entwöhnter Ferkel ist auch zu erwarten, daß das Antibiotikum A47934 zur Verbesserung des Wachstums von Schweinen verschiedener Größen geeignet ist, unter Einschluß von Schweinen mit Handelsgröße, nämlich Schwei-

15 nen mit einem Gewicht von etwa 9 0 kg.

Landwirtschaftliche Nutztiere unter Einschluß von Wiederkäuern -werden gewöhnlich mit den verschiedensten wachstumsfördernden Mitteln, krankheitsverhindernden Mitteln und Mitteln zur Behandlung von Krankheiten während der gesamten Lebensdauer behandelt. Solche Wirkstoffe werden häufig in Kombination eingesetzt. Das erfindungsgemäße Antibiotikum A47934 oder eines seiner pharmazeutisch unbedenklichen Salze läßt sich daher auch in Kombi-

25 nation mit anderen Behandlungen anwenden.

Wie die obigen Versuchsergebnisse zeigen, führt das Antibiotikum A47934 zu einer günstigen Veränderung der Bildung von Acetaten im Pansen.Die gleiche Behandlung wirkt sich auch günstig bei monogastrischen Tieren aus, die im Caecum faserartiges pflanzliches Material fermentieren. Unter monogastrischen Tieren werden dabei solche Tiere verstanden, die faserartiges pflanzliches Futter konsumieren und wenigstens zum Teil durch mikrobiologische Fermentation im Caecum verdauen. Die caecale Fermentation folgt einem Chemismus, der zur Fermentation im Pansen ähnlich ist.

Tiere, die einen Teil ihres Futters durch caecale Fermentation verdauen, sind beispielsweise Pferde, Schweine und Hasen. Die gesamte Futterverwertung solcher Tiere läßt sich durch orale Verabreichung dieser Antibiotika verbes-. 5 sern, die das Verhältnis von Propionat zu Acetat günstig verändern. Pferde und Hasen gehören zu den Tieren, bei denen die caecale Fermentation den überwiegenden Teil des gesamten Verdauungsprozesses-ausmacht und bei denen sich diese Antibiotika besonders günstig auswirken.

Das Antibiotikum A47934 wird gebildet durch Züchtung von Streptomyces toyocaensis NRRL 15009 oder einer A47934 produzierenden Mutante oder Variante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submer-" sen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen Menge an antibiotischer Aktivität.

Genauso wie im Falle anderer Organismen sind auch die 2Ό Eigenschaften der das Antibiotikum A47934 produzierenden Kultur, nämlich von NRRL 15009, einer Variation zugänglich. So können zur Bildung des Antibiotikums A47934 erfindungsgemäß beispielsweise auch natürliche Varianten, Mutanten (spontane oder induzierte), Transkonjuganten und Rekombinanten (unter Einschluß rekombinanter DNA an Plasmiden) verwendet werden, die dem Stamm NRRL 15009 entsprechen oder davon abgeleitet sind.

Zur Bildung des Antibiotikums A479 34 mit Streptomyces 30, toyocaensis NRRL 15009 läßt sich eine Anzahl verschiedenster Medien verwenden. Aus Gründen einer wirtschaftlichen Produktion, optimalen Ausbeute und leichten Isolierbarkeit des Produkts sind jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt- Diese Medien sollen assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthalten. Zu geeigneten Kohlenstoffquellen gehören Glucose, Kartoffeldextrin, Tapiocadextrin, Maisstärke und Melasse. Zu geeigneten Stickstoffquellen gehören Sojaboh-

nenschrot, säurehydrolysiertes Casein, Rinderextrakt und Sojabohnenmehl.

Die für das Wachstum und die Entwicklung des Organismus notwendigen essentiellen Spurenelemente können unter Verwendung von Maisquellwasser erhalten werden oder können, als Verunreinigungen in sonstigen Bestandteilen der Medien in Mengen vorkommen, die für das Wachstum und den biosynthetischen Bedarf der Organismen ausreichen. Es kann jedoch von Vorteil sein, wenn man die Kulturmedien

mit weiteren löslichen anorganischen Nährsalzen versetzt, die für Ionen an Natrium, Kalium,Magnesium, Calcium, Am-C ) monium, Chlorid, Carbonat, Phosphat, Sulfat, Nitrat und dergleichen sorgen.

15

Zur Produktion wesentlicher Mengen an Antibiotikum A47934 aus NRRL 15009 bedient man sich einer submersen aeroben Fermentation in Tanks. Kleine Mengen an Antibiotikum A479 34 lassen sich durch Schuttelkolbenkultur herstellen. Bei einer Tankfermentation wird vorzugsweise von einem vegetativen Inokulum Gebrauch gemacht. Zur Herstellung des vegetativen Inokulums beimpft man ein kleines Volumen des Kulturmediums mit der Sporenform,mit Mycelfragmenten oder mit einem lyophilisierten Pellet des Or-,--·,, 25 ganismus, wodurch man zu einer frischen und aktiv wachsenden Kultur des Organismus gelangt. Das vegetative Inokulum wird dann in einen größeren Tank übertragen, in welchem das Antibiotikum A47934 nach geeigneter Inkubationszeit in optimaler Ausbeute erzeugt wird.

30

Der pH-Wert des nichtinokulierten Fermentationsmediums schwankt in Abhängigkeit von dem zur Produktion verwendeten Medium, wobei die pH-Werte aller Fermentationsmedien jedoch in den Bereich von etwa pH 6,4 bis etwa 7,0 fallen.

Der das Antibiotikum A47934 produzierende Organismus kann über einen breiten Temperaturbereich von etwa 2 0 bis etwa

4O⁰C wachsen. Zu einer optimalen Bildung an Antibiotikum A47934 mit NRRL 15009 scheint es bei einer Temperatur von etwa 3 0°C zu kommen.

Genauso wie bei üblichen aeroben submersen Züchtungsverfahren wird auch im vorliegenden Fall durch das Kulturmedium sterile Luft verteilt· Für ein ausreichendes Wachstum des Organismus arbeitet man bei einer Tankproduktion mit einem Luftvolumen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 0,5 Volumina Luft pro Volumen Kulturmedium und pro Minute (V/V/min). In einem 165 1 fassenden Tank beträgt die optimale Luftmenge etwa 0,25 V/V/min, wobei mit einem herkömmlichen Flügelrührer unter einer Umdrehungsgeschwindigkeit von etwa 250 U/min gerührt wird. Kleine Mengen (z. B. 0,2 ml/1) eines Antischaummittels, wie Propylenglykol, können großtechnischen Fermentationsmedien zugesetzt werden, falls das Schäumen problematisch wird.

Die Bildung des Antibiotikums A47 9 34 kann während der ^ Fermentation entweder durch Agar-Diffusion, nämlich durch den bekannten Agar-Plattenversuch, oder durch Tarbidimetrie überwacht werden. Hierbei wird Bacillus subtilis ATCC 6633 als Versuchsorganismus verwendet. Vor dieser Untersuchung wird eine Probe der Gesamtbrühe mit wäßri-2ί5 g_em Natriumhydroxid auf pH 10,5 eingestellt und zentrifugiert.

Die antibiotische Wirksamkeit ist im allgemeinen nach etwa 36 Stunden vorhanden und bleibt wenigstens 7 Tage oder auch länger während der Fermentationszeit aufrechterhalten. Zu einer maximalen Bildung an Antibiotikum kommt es nach einer Fermentations zeit von etwa 4 bis etwa 5 Tagen.

Das Antibiotikum A479 34 kann unter Anwendung üblicher Methoden aus dem Fermentationsmedium gewonnen werden. Der Großteil des Antibiotikums A47934 ist auf oder in den Zellen adsorbiert, und zur Freisetzung des Antibiotikums aus den Zellen stellt man die gesamte Fermentationsbrühe

daher mit einer wäßrigen Base, wie Natriumhydroxid, auf einen pH-Wert von etwa 10,5 ein. Als Filterhilfe wird Diatomeenerde (Hyflo Supercel, Johns-Manville Corp.) zugesetzt, und das Gemisch wird gerührt und dann filtriert, wozu man zweckmäßigerweise eine Filterpresse verwendet. Das die antibiotische Aktivität enthaltende Filtrat wird auf einen neutralen pH-Wert eingestellt, nämlich auf pH 7,0, mit Diaion HP-20- (einem hochporösen Styrol-Div.inyl-benzol-Copolymerisat in Perlenform, das von Mitsubishi

XO Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan erhältlich ist) vermischt und über eine gewisse Zeitdauer gerührt, beispielsweise eine Zeitdauer von etwa 60 Minuten. Die wäßrige Schicht wird vom Harz, auf dem die antibiotische Aktivität adsorbiert ist, durch Aspiration oder Filtration

χ5 abgetrennt. Zu anderen geeigneten Adsorbentien gehören Aktivkohle, Siliciumdioxidgel, Polyamid, Aluminiumoxid, makroretikulare Harze (XAD-2, XAD-4, und dergleichen) und Ionenaustauscherharze, insbesondere Anionenaustauscherharze (wie IRA 68, Dowex 1), wie dies dem Fachmann insgesamt

20 geläufig ist.

Das die Aktivität an adsorbiertem A47934 tragende HP-20-Harz wird mit Wasser und einem Gemisch aus Wasser und Methanol (4:1) gewaschen und dann filtriert. Im Anschluß

2g daran eluiert man das Antibiotikum vom Harz unter Verwendung eines Gemisches aus Wasser und Methanol (1 : 1) als Eluiermittel. Das Eluat wird konzentriert und lyophilisiert, wodurch man zu rohem A47934 als hellbraunes Pulver gelangt, das sich durch übliche chromatographische Ver-

„Q fahren weiter reinigen läßt.

Eine andere Möglichkeit zur Abtrennung des Antibiotikums A47934 vom Brühenfiltrat besteht darin, daß man das Filtrat zur vollständigen Ausfällung mit einer Säure auf einen pH-Wert von etwa 3 einstellt und das Ganze dann filtriert. Das Antibiotikum A47934 beginnt bei einem pH-Wert von etwa 6,5 auszufallen, wobei diese Ausfällung dann bei einem pH-Wert von etwa 3 vollständig ist. Zur Ansäue-

rung eignen sich beispielsweise anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, oder auch organische Säuren, wie Essigsäure oder Ameisensäure. Das hierdurch erhaltene rohe A47934 kann durch bekannte chromatographische Verfahren weiter gereinigt werden .

Ausführungsbeispiele: -

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert, die in keiner Weise beschränkend aufzufassen sind.. . .

Beispiel. 1

Herstellung eines Inokulums der ersten Stufe

Das folgende Medium wird hergestellt und für eine Schrägagarkultur von Streptomyces toyocaensis NRRL 15009 verwendet. ·

Bestandteile Menge (g/l)

Tomatenpaste 20,0

25 Vorgekochtes Hafermehl . 20,0 Agar 2 0,0

Deionisiertes Wasser q.s. auf 1,0 Liter

Nach dem Vermischen der obigen Bestandteile hat das Me-3Q dium einen pH-Wert von 5,0, und dieser wird vor der Sterilisation mit 5n wäßrigem Natriumhydroxid auf pH 6,7 eingestellt. Nach der Sterilisation hat das Medium einen pH-Wert von 6,5.

gg Sporen von Streptomyces toyocaensis NRRL 15009 werden auf eine Nähragarschräge aus den oben angegebenen Bestandteilen geimpft, und die inokulierte Schräge wird dann etwa 10 Tage bei einer Temperatur von 30°C bebrütet. Aus

Menge (	. S.	5,0	g/l)
1	0,0
2	5,0
1	1,0
	0,0
1	2,0
	auf
1,0 Liter

der Schräge bereitet man dann Lyophile der Kultur zu und verwendet diese Lyophile zur Inokulierung eines Saatmediums folgender Zusammensetzung.

5 Bestandteile

Glucose

Kartoffeldextrin So j abohnens ehrot Hefeextrakt 10 Maisquellwasser CaCO₃ Kaltes Leitungswasser

Nach Vermischen der obigen Bestandteile hat das Medium einen pH-Wert von 5,6, den man vor der Sterilisation mit 5n wäßrigem Natriumhydroxid auf pH 6,5 einstellt. Nach Sterilisation beträgt der pH-Wert des Mediums 6,5 bis 6,7.

Das Saatmedium (50 ml) inkubiert man in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Weithalskolben bei etwa 30⁰C über eine Zeitdauer von etwa 48 Stunden auf einem Rotationsschüttler, der unter einem Bogen mit einem Durchmesser von 5 cm bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 250 U/min betrieben wird. Mit dem auf diese Weise inkubierten Medium beimpft man dann entweder kleine Ferment er (unter Verwendung eines Inokulums von etwa 1 % pro Volumen des Fermentermediums) oder ein Medium der zweiten Stufe, um hierdurch ein größeres Volumen an Kultur zu bilden.

Fermentation von A47934.1

Man beimpft 100 1 eines sterilen Produktionsmediums, das die im folgenden angegebene Zusammensetzung hat, mit einem inkubierten Medium der zweiten Stufe (800 ml).

Bestandteile Menge- (g/l)

Antischaummittel* 0,2

Glucose 25,0

Kartoffeldextrin 30,0

⁵ Melasse . 3,0

Sojabohnenschrot 15,0 ·

Säurehydrolysiertes Casein' 1,0

CaCO₃ . 2,5

Kaltes Leitungswasser q.s. auf 1,0 Liter

*) Antifoam A von Dow Corning

Nach Vermischen der obigen Bestandteile hat das Medium einen pH-Wert von 6,5, den man vor der Sterilisation mit 5n wäßrigem. Natriumhydroxid auf pH 7,5 einstellt. Nach der Sterilisation liegt der pH-Wert des Mediums bei 6,9.

Man läßt das inokulierte Produktionsmedium in einem 165 Fermentationstank etwa 4 bis etwa 4/75 Tage bei einer Temperatur von etwa 30⁰C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird mit steriler Luft in einer Menge von 0,25 V/V/min belüftet und mit herkömmlichen Rührern bei einer Geschwindigkeit von etwa 200 bis 250 U/min gerührt.

25 Beispiel 2

Abtrennung des Antibiotikums A47 9 34

Man stellt den pH-Wert der Fermentationsbrühe (141 Liter) durch Zugabe von wäßrigem 5n Natriumhydroxid auf 10,5 ein, gibt 3 % Filterhilfe (Hyflo Supercel, nämlich eine Diatomeenerde von Johns-ManvilIe Corp.) zu und rührt das Gemisch etwa 1 Stunde. Sodann wird das Gemisch auf einer Filterpresse filtriert, wodurch man zu 106 1 eines klaren Filtrats gelangt, das die antibiotische Aktivität enthält. Das FiItrat wird dann mit 5n wäßriger Chlorwasserstoff säure auf pH 7,0 eingestellt und mit 10,6 1 Diaion HP-20-Harz versetzt (nämlich einem hochporösen Styrol-

Divinylbenzol-Copolymerisat in Perlenform von Mitsubishi Chemical Industries, Limited, Tokyo, Japan). Das Gemisch wird etwa 60 Minuten gerührt, worauf man die wäßrige Phase vom Harz durch Aspiration oder Filtration abtrennt. 5

Das Harz mit der adsorbierten antibijotischen Aktivität wird absatzweise sequentiell zuerst mit 30 1 Wasser und dann zweimal mit 30 1 eines Gemisches aus Wasser und Methanol (4 : 1) gewaschen, indem man das Ganze über eine

•^ Zeitdauer von jeweils 30 Minuten mit dem jeweiligen Lösungsmittelvolumen rührt und dann filtriert. Das gewaschene Harz wird etwa 30 Minuten mit 30 1 eines Gemisches aus Methanol und Wasser (1 : 1) gerührt und dann filtriert, . worauf man das gleiche Verfahren noch ein weiteres Mal wiederholt, um hierdurch die antibiotische Aktivität vom Harz zu eluieren. Die Filtrate aus Methanol und Wasser (1 : 1) werden vereinigt, unter Vakuum auf ein Volumen von etwa 4 bis 5 1 eingeengt (Feststoffgehalt etwa 6 bis 12 %) und lyophilisiert, wodurch man zu 79,1 g eines hellbraunen Pulvers gelangt, bei dem es sich um rohes Antibiotikum A47934 handelt, das eine Reinheit von etwa 30 bis 40 % hat. Die Gesamtausbeute beträgt etwa 44 bis 49 %.

Beispiel 3 25

Herstellung von rohem Antibiotikum A47934 durch Fällung mit Säure

450 ml Fermentationsbrühe von A47934 stellt man zur Extraktion des Antibiotikums A479 34 aus dem Mycel auf einen pH-Wert von 10,5 ein und filtriert dann die Lösung. Das das Antibiotikum A47934 enthaltende Fiitrat wird in Teilmengen von jeweils 200 ml aufgeteilt, und jede Teilmenge stellt man mit 5n wäßriger Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,5 ein, um so eine maximale Ausfällung zu erzielen. Die Niederschläge werden durch Zentrifugation gewonnen, mit Wasser gewaschen und erneut zentrifugiert. Der aus einem Anteil erhaltene Niederschlag wird in Wasser suspendiert

und gefriergetrocknet, wodurch man zu 186 mg des in Wasser unlöslichen rohen A47934 gelangt (Reinheit 20 %).

Der Niederschlag vom anderen Anteil wird in 50 ml Wasser suspendiert, worauf man die Suspension mit wäßriger 5n Natriumhydroxidlösung auf pH 7,5 einstellt und gefriertrocknet. Auf diese Weise gelangt man zu 226 mg wasserlöslichem rohem Antibiotikum A47934 (Reinheit 20 %).

Diese rohen Zubereitungen des Antibiotikums A47934 lassen sich unter Anwendung bekannter Verfahren reinigen, beispielsweise unter Verwendung von Diaion HP-20-Harz und ~j Umkehrphasen-HPLC.

Beispiel 4

Reinigung des Antibiotikums A47934 durch ümkehrphasenchromatographie .

^_3n löst rohes Antibiotikum A47934 (30 bis 40 g) in 3 50 ml eines Gemisches aus Wasser und Acetonitril (12 : 8) bei einem pH-Wert von 8 und gibt die erhaltene Lösung dann auf eine Chromatospac 100-Einheit (Instruments- SA, Inc., Metuchen, N.J., V.St.A.), die 4 1 Umkehrphasenharz (SiIi- · ciumdioxidgel LP-1/C_1o von Whatman) enthält, das in einem Gemisch aus Wasser und Aceton (86 : 14} äquilibriert ist, welches 2 g Ammoniumacetat pro Liter enthält. Nach Aufgeben der Probe entwickelt man die Säule mit dem gleichen Lösungsmittelsystem, wobei man Fraktionen von jeweils 400 ml sammelt und die Elution bei 25 4 nm überwacht. Jede Fraktion wird durch analytische HPLC untersucht (Zorbax ODS Harz (0,25 χ 25 cm Säule), Gemisch aus Wasser und Aceton (82 : 18) , das 2 g Ammoniumacetat pro Liter enthält, Überwachung bei 225 nm {Absorbance Units Full Scale = 0,2)), und die lediglich A47934 enthaltenden Fraktionen werden vereinigt (nämlich beispielsweise die Fraktionen 32 bis 60, 37 bis 75 und 51 bis 76 für verschiedene Anteile an rohem' A47934) und auf ein Volumen von etwa 1 Liter eingeengt.

Die aus acht ähnlichen Versuchen erhaltenen Konzentrate werden vereinigt, wobei das Gesamtvolumen 8 1 beträgt, und auf eine Säule gegeben, die 2 1 Diaion HP-20-Harz enthält, das in Wasser gepackt ist, und diese chromatographi- ° sehe Operation dient zur Entfernung des Ammoniumacetats von den vereinigten Konzentraten. Die Säule wird dann mit 6 1 Wasser gewaschen, worauf man sie zuerst mit 4 1 eines Gemisches aus Wasser und Methanol (4 : 1) und dann mit 6 eines Gemisches aus Wasser und Methanol (1 : 1) eluiert.

¹^ Das Eluat mit einem Methanolgehalt von 20 % wird auf 400 ml eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zu 14,82 g hochgereinigtem A47934 gelangt. Das Eluat mit einem Me-(_.' thanolgehalt von 50 % wird auf 1 Liter eingeengt und lyophilisiert., wodurch man 55,6 g-hochgereinigtes A47934 erhält. Bei dieser Entsalzungsstufe ergibt sich eine Gesamtausbeute von 81 %.

Beispi-el5 Kristallisation des Antibiotikums A47934

Man löst 1 g des hochgereinigten A47934 in 50 ml eines Gemisches aus Acetonitril und Wasser (60 : 40) und versetzt die Lösung bis zur Eintrübung mit weiterem Acetoni- ^-, 25 tril. Das nach 16-stündigem Stehen bei Raumtemperatur abgeschiedene klebrige dunkelfarbige Material wird abgetrennt, worauf man die Lösung bis zur Eintrübung mit weiterem Acetonitril versetzt.

Die beim weiteren Stehenlassen bei Raumtemperatur gebildeten Kristalle werden durch Filtration gewonnen, mit Acetonitril gewaschen und getrocknet. Diese Kristalle wiegen 750 mg. Die Kristalle werden zur ümkristallisation in 50 ml eines Gemisches aus Acetonitril und Wasser (60 :..4O)

3.5 gelöst, und die Lösung wird dann unter Rühren mit 300 ml Acetonitril versetzt. Die nach Stehenlassen gebildeten Kristalle werden abfiltriert, mit Acetonitril gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Diese Kristalle wiegen 550 mg.

Eine weitere Trocknung unter Vakuum bei 100⁰C führt zu einem 11 %-igen Gewichtsverlust infolge ursprünglich vorhandener flüchtiger Solvate.

° Beispiel 6

Herstellung des Mononatriumsalzes von A47934

Man versetzt 16 ml einer wäßrigen Lösung von 130 mg A47934 (0,1 Mol, pH 4,8) mit 0,4 ml Natriumhydroxid in einer Menge von 10 μg/ml (0,1 Mol). Der pH-Wert der fertigen Lösung beträgt 7,2. Die Lösung wird gefriergetrocknet, wodurch man zu 15 3 mg des Mononatriumsalzes von A47934 gelangt (Na = 2,4 %)..

Beispiel 7

Herstellung des Dinatriumsaizes von A47934

Man gibt 0,8 ml Natriumhydroxid mit einer Konzentration von 10 mg/ml Wasser (was 0,2 Mol entspricht) zu 16 ml einer wäßrigen Lösung von 130 mg A47934 (0,1 Mol, pH 4,8) unter Rühren. Am Ende beträgt der pH-Wert 8,1. Die Lösung, wird gefriergetrocknet, wodurch man zu 156 mg des Dina-

25 triumsalzes von A47934 gelangt (Na = 3,6 %).

Beispiel 8 Herstellung des Monokaliumsalzes von A47934

Man gibt 0,56 ml einer Lösung von Kaliumhydroxid (10 mg/ ml, 0,1 Mol) unter Rühren zu 16 ml einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von 130 mg an A47934 (pH 4,8, 0,1 Mol), wodurch sich ein End-pH-Wert von 7,1 ergibt. Die Lösung wird gefriergetrocknet, wodurch man zu 154 mg des Monokaliumsalzes von A47934 gelangt (K = 2,14 %). ·

- 49 Beispiel 9

Herstellung des Dikaliumsalzes von A47934

Man gibt 1,12 ml einer Lösung von Kaliumhydroxid (10 mg/ ml, 0,1 Mol) unter Rühren zu 16 ml einer wäßrigen Lösung miteinem Gehalt von 130 mg an A47934 (0,1 Mol, pH 4,8), wodurch sich ein pH-Wert von 7,9 5 ergibt. Die Lösung wird gefriergetrocknet, wodurch man zu 158 mg des Dikaliumsalzes von A47934 gelangt (K = 3,94 %).

Beispiel 10

Herstellung des Bariumsalzes von A47934

15

Man gibt 2 ml einer gesättigten Lösung von Bariumchlorid zu 4 ml einer wäßrigen Lösung, die 100 mg A47934 enthält, wodurch das Bariumsalz von A47934 ausfällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, zweimal mit jeweils 5 ml Wasser gewaschen und jeweils erneut zentrifugiert. Der Niederschlag wird in 10 ml Wasser resuspendiert und die Suspension gefriergetrocknet, wodurch man zu 7 6 mg des in Wasser unlöslichen Bariumsalzes gelangt.

Beispiel 11

Herstellung des Calciumsalzes von A47934

Man gibt 2 ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von CaI-ciumchlorid unter Rühren zu 4 ml einer wäßrigen Lösung, die 100 mg A47934 enthält, wodurch ein Niederschlag des Calciumsalzes von A47934 gebildet wird. Der Niederschlag wird zweimal mit jeweils 5 ml Wasser gewaschen und jeweils zentrifugiert, und der gewaschene Niederschlag in 10 ml Wasser suspendiert und dann gefriergetrocknet, wodurch man zu 87 mg Calciumsalz von A47934 gelangt.

Claims

- 50 Erfindungsansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums

A47934 mit der Struktur
5

r τ τ τ τ ϊ

10

H-OC-CH . Υ" Υ' iH-NHs

20

oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes hiervon, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces toyocaensis NRRL 15009 oder eine A47934 produzierende Variante oder Mutante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen züchtet.

30

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet , daß man das Antibiotikum A479 34 aus dem Kulturmedium abtrennt.

3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch

gekennzeichnet, daß man Streptomyces toyocaensis NRRL 15009 züchtet.

4- . Kulturmedium zur Durchführung des Verfahrens gemäß Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es Streptomyces toyocaensis NRRL 15009 und assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze ent-

5 hält.

Hierzu 1 Saite Zaic 10