DD139520A5

DD139520A5 - Verfahren zur herstellung eines deoxynarasinkomplexes

Info

Publication number: DD139520A5
Application number: DD78208586A
Authority: DD
Inventors: Walter M Nakatsukasa; Gary G Marconi; Norbert Neuss; Robert L Hamill
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1977-10-20
Filing date: 1978-10-20
Publication date: 1980-01-09
Also published as: IT7828926A0; EP0001709A3; JPS6244553B2; AU519966B2; FI58791C; IL55738A0; CH636903A5; CS204037B2; AT362499B; BE871274A; FI783174A; PT68661A; MY8500595A; FR2406639A1; SU818492A3; GB2006774A; IE47665B1; IL55738A; EP0001709B1; RO77417A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines De oxynar asinkomplexe s.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Auf dem Gebiet der Veterinärmedizin werden ständig neue und verbesserte Antibiotika benötigt. Beispielsweise stellt Coccidiose in der Geflügelzucht immer noch ein weit verbreitetes Problem dar. Coccidiose ist eine Folge von Infektionen durch eine oder mehrere Species von Eimeria oder Isospora (vgl. Lund and Fair in "Diseases of Poultry,", 5· Aufl., Herausgeber Biester und Schwarte, Iowa State University Press, Arnes, Iowa, 1965» S. 1056-1096). Die wirtschaftlichen Verluste infolge von Coccidiose sind beträchtlich und verursachen einen Bedarf an besseren anticoccidiellen Mitteln.

~ 2 —

Die Förderung des Wachstums von Wiederkäuern, wie Rindern und Schafen, ist eine -weitere wirtschaftlich wichtige Aufgabe der Veterinärwissenschaft. Dabei kommt der Wachstumsförderung durch Erhöhung des Futterverwertungsgrades besondere Bedeutung zu. Der Mechanismus, auf dem die Verwertung der hauptsächlichen Nährstoffe (Kohlehydrate) von Wiederkäuerfutter beruht, ist allgemein bekannt. Mikroorganismen im Pansen der Tiere bauen Kohlehydrate unter Bildung von Monosacchariden ab und überführen diese Monosaccharide anschließend in Pyruvate. Die letztgenannten Verbindungen werden durch mikrobiologische Vorgänge zu Acetaten, Butyraten oder Propionaten metabolisiert, die gemeinsam als flüchtige Fettsäuren (VFA) bezeichnet werden. Nähere Ausführungen hierüber finden sich bei Leng in "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", Phillipson et al., Herausgeber, Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, 1970, S. 408-410.

Von McCullough in Feedstuffs, Juni 19, 1971, S. 19, Eskeland at al. in J. An. Sei. 33, 282 (1971) und Church et al. in "Digestive Physioloy and Nutrition of Ruminants," Bd. 2, 1971, S. 622 und 625 werden die Verhältnisse des Ausmaßes der VFA-Verwertung erörtert. Acetate - und Butyrate werden zwar verwertet, aber der Grad der Verwertung von Propionaten ist größer. Außerdem kann es, wenn es an Propionat mangelt, bei den Tieren zu Ketosis kommen. Eine günstig wirkende Verbindung regt daher die Tiere zur Bildung eines höheren Anteils an Propionaten aus Kohlehydraten an und erhöht dadurch den Kohlenhydratverwertungsgrad und vermindert gleichzeitig das Auftreten von Ketosis.

20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin sind neue Polyether-Antibiotika. Sie stehen dem bekannten Polyetherantibiotikurr.

Narasin (Antibioticum A-28086 Faktor A; US-PS 4 035 481 und 4 038 384) nahe. Die Struktur von Narasin, die in den genannten Patentschriften und von Occolowitz et al. /Biomed. Mass Spektrpmetry 3, 272-277 (1976j_/ vorgeschlagen worden ist, ist vor kurzem von H- Seto et al. /J. Antibiotics 30 (6) 530-532 (1977_)/ bestätigt worden und wird im folgenden wiedergegeben:

208 5

« ιOJ

χ Ιο ·_

ι ι

O=O,

Λ /

Nach Seto et al. steht Narasin in enger Beziehung mit Salinomycin (Salinomycin = 4-Demethylnarasin). In neuerer Zeit haben J. W. Westley et al. über die C-17-Epimeren von Deoxy- (0-8) -salinomycin /J. Antibiotics 30 (7) 610-612 (1977j_/ berichtet. Die Epimeren von Deoxysalinomycin sind zwar Analoga der erfindungsgemäß erhältlichen Epimeren von Deoxynarasin, doch ist noch kein chemisches Verfahren bekannt, nach welchem die Deoxynarasinepimeren aus den Deoxysalinomycinepimeren hergestellt werden können. Darlegung des Y/esens der Erfindung;

Die Erfindung bezieht sich auf den antibiotisch wirksamen Deoxynarasinkomplex, der wenigstens zwei einzelne Faktoren, 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin, enthält. Der Komplex wird durch Züchten eines Stamms des Organismus Streptomyces aureofaciens Duggar, NRRL 11181 erzeugt.

Der Ausdruck "antibiotisch wirksamer Komplex", wie er auf dem Fermentationsgebiet und hierin verwendet wird, bezieht sich nicht auf eine chemische Komplexverbindung, sondern auf eine Mischung aus gleichzeitig erzeugten antibiotisch wirksamen Einzelfaktoren. Wie für den Fachmann auf dem Gebiet der fermentativen Erzeugung von Antibiotika ohne weiteres verständlich, schwankt das Verhältnis der in einem antibiotisch wirksamen Komplex erzeugten einzelnen Faktoren in Abhängigkeit von den angewandten Fermentationsbedingungen.

Die Herstellung der pharmazeutisch annehmbaren Salze von 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin bildet gleichfalls Teil der Erfindung. Zur Vereinfachung der Erörterung der Anwendbarkeit wird der Ausdruck "Deoxynarasinantibiotikum" gebraucht, der sich auf antibiotisch wirksame Deoxynarasinkomplexe, 20-Deoxynarasin, 20-Deoxy-epi-17-narasin und die pharmazeutisch annehmbaren Salze von 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin bezieht. Die erfindungsgemäß erhältlichen Deoxynarasinantibiotika inhibieren das Wachstum von Organismen, die für lebende Tiere und Pflanzen pathogen sind. So sind die Deoxynarasine.ntibiotika anticoccidielle Mittel, und außerdem erhöhen sie den Futterverwertungsgrad bei Wiederkäuern.

208 58§

Der antibiotisch wirksame Deoxynarasinkomplex enthält 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin, die bei der Fermentation als Mischung erhalten werden. 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin werden in der weiter unten beschriebenen Art und Weise aus dem Deoxynarasinkomplex als gesonderte Verbindungen abgetrennt und isoliert. Der Deoxynaräsinkomplex enthält außerdem geringfügigere Faktoren, die durch die beschriebenen Arbeitsweisen entfernt werden. Der antibiotisch wirksame Deoxynarasinkomplex ist in den meisten organischen Lösungsmitteln löslich, aber unlöslich in Wasser.

20-Deoxynarasin

Einer der erfindungsgemäß erhältlichen Faktoren hat dieselbe absolute Konfiguration wie Narasin. Die Struktur von 20-Deoxynarasin entspricht der folgenden Formel 1:

CJ

-β ·

ο ι

η ο · · β.

CJ

O X

20~Deoxy-epi-17-narasin

Die Struktur von 20-Deoxy-epi-17-narasin, des anderen erfindungsgemäß erhältlichen Faktors, entspricht der folgenden Formel 2:

- 8 -

»••Λ

ο is»·* ο

O.

O=*

to ο · β'χ Ü

\ χ'

Λ ... O

/ χ

β _& . . χ

CO

Eine der besten Methoden zur Unterscheidung von Narasin (A-28086

Faktor A), 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin besteht in

der Anwendung der magnetischen C-Kernresonanz(nmr-Spektrometrie)

13 In Tabelle I sind die C-nmr-Spektren dieser Verbindungen jeweils als freie Säure in Deuterochloroform zusammengestellt (Werte in ppm) .

Tabelle I

Narasin	20-Deoxynarasin	2O-Deoxy-epi-17-narasin
216,5	216,8	, 213,0
173,4	177,9	177,6
132,0	125,2	129,2
122,0	121,9	125,8
106,5	105,0	107,0
99,6	99,3	99,4
88,5	88,1	85,6
78,4	78,1	78,2
77,1	76,6	.77,7.
75,1	75,0	77,0
73,8	73,7	73_;3·
72,0	72,3	72_T6
70,8	71,1	71,1
68,5	68,3	69,1
67,6	56,2	57,7
56_rl	49,9	49,3
4 9,9	49,3	48,7
49,3	41,0	38,9
41,1	40,0	36,6
38,7	38,8	36,4
36,6	36,3	36,2
36,2	35,6	35.7

Tabelle (Fortsetzung)

Narasin 20-Deoxynarasin 20-Deoxy-epi-17-narasin

35,5	32,8	33,9
32^9	31,7	33,7
30,9	\ 31 j 7	32,8
30,5	30,3	30,5
29,4	29,6	29,3
29,0	29,0	2 9 j O
28,0	28₇1	28_r2
26,1	25,8	24_f7
24,0	23,7	23,3
21_T5	21,8	21,8
19,0	18,8	21,1
18,0	17j5	18_T4
16,4	16,3	18,2
15,7	15,7	15,8
14,3	14,1	14_r3
13,2	13,3	13,7
13 _T0	13,2	13,5
12.1	12,5	12,5
12,1-	12^1	12,1
7,0	⁷,3	7,7
6,3	6,5	6,4

Zu weiteren guten Methoden zur Unterscheidung von 20-Deoxynarasin von 20-Deoxy-epi-17-narasin und von den bekannten A-28086-Faktoren gehören Papier- und Dünnschichtchromatographie. So sind beispielsweise die R_f-Werte von Narasin (A-2808 6-Faktor A), A-28086-Faktor D, 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin in verschiedenen papierchromatographischen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Nachweisorganismus die in der folgenden Tabelle II angegebenen.

Tabelle II

Lösungsmittelsystem

Wasser:Methanol:Aceton (12:3:1) mit NH.OH auf pH 10,5 eingestellt und dann mit H PO auf pH 7,5 gesenkt

Narasin

0,20

R -Werte

A-28O86D

0,11

Deoxynarasin Epideoxynarasin

0,08

0,21

Wasser:Methanol.-Aceton (12:3:1) mit NH OH auf pH 10,5 eingestellt und dann mit HCl auf pH 7,5 gesenkt

0,42

0,25

0,21

0,44

1 % Methylisobutylketon (MIBK), 0,5 % NH OH in Wasser

Benzol mit Wasser gesättigt

Wasser:MIBK:Ethylacetat (98:1:1)

0,56	0,38
0,51	0,51
0,77	0,61

0,33 0,74 0,51

0,66 0,55 0,68

In der folgenden Tabelle III werden die R_f-Werte dieser Antibiotika in einem beispielhaften dünnschichtchromatographischen (TLC)-System unter Verwendung von Kieselgel angegeben.

Tabelle III

R_f-Werte

Lösungsmittelsystem Narasin A-28O86D Deoxynarasin Epideoxynarasin

Ethylacetat 0,29 0,35 0,42 0,74

Die Deoxynarasinantibiotika (20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin) sind in verschiedenen organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Ethanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Ethylacetät, Chloroform, Aceton und Benzol, löslich aber in nichtpolaren organischen Lösungsmitteln wie Hexan, nur schwach löslich und in Wasser unlöslich. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß 20-Deoxynarasin als freie Säure in Alkoholen unbeständig ist und in die freie Säureform von 20-Deoxy-epi-17-narasin übergeht. Beispielsweise werden 435,1 mg 20-Deoxynarasinsäure in 40 ml Methanol gelöst und 4 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Lösung wird dann im Vakuum zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wird in Dioxan gelöst und gefriergetrocknet, wodurch 417,8 mg 20-Deoxy-epi-17-narasinsäure 4^rnalten werden.

Mit dem Deoxynarasinkomplex wird gleichzeitig eine andere Substanz erzeugt, die chromatographisch mit dem in US-PS 4 038 384 angegebenen A-28O86-I zusammenfällt. Diese Substanz wird zwar zunächst gleichzeitig mit den Deoxynarasinantibiotika ausgefällt, läßt sich aber durch Kieselgelchromatographie leicht davon abtrennen. Bei der Kieselgeldünnschichtchromatographie verhält sich diese Substanz weniger polar als 20-Deoxynarasin und 20-Deoxyepi-17-narasin, wenn Ethylacetat als Entwicklungslösungsmittel· verwendet wird. Vanillinsprühreagens (3 % Vanillin in Methanol + 0,5 ml konz. H„SO. je 100 ml Lösung) eignet sich für den Nachweis. Nach dem Besprühen mit Vanillin und Erwärmen liefert diese Substanz wie A-28O8 5-I einen blauen Flecken, wohingegen Deoxynara,sinantibiotika. glänzend gelbe Flecken liefern, die später nachdunkeln.

20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin können Salze bilden. Die pharmazeutisch annehmbaren Alkali-, Erdalkali- und Aminsalze von 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin können erfindungsgemäß gleichfalls hergestellt werden. "Pharmazeutisch

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annehmbare" Salze sind Salze, bei denen die Toxizität der Verbindung als Ganzes gegenüber Warmblütern nicht höher ist als die der Form, in der die Verbindung nicht als Salz vorliegt. Beispielhafte Alkali- und Erdalkalisalze von 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin sind die Natrium-, Kalium-, Lithium-, Cäsium-, Rubidium, Barium, Calcium- und Magnesiumsalze. Zu geeigneten Aminsalzen von 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin gehören die Ammoniumsalze und die Salze mit primärem, sekundärem und tertiärem C.-C.-Alkylammonium und Hydroxy-C₂-C.alky!ammonium. Zu beispielhaften Aminsalzen gehören die durch Umsetzung von 20-Deoxynarasin und 20-Deoxyepi-17-narasin mit Ammoniumhydroxid, Methylamin, sec.-Butylamin., Isopropylamin, Diethylamin, Diisopropylamin, Ethanolamin, Triethylamin und 3-Amino-i-propanol gebildeten Salze.

Die Alkali- und Erdalkalisalze von 20-Deoxynarasin und 20-Deoxyepi-17-narasin werden in der für Salze mit Kationen üblichen Weise hergestellt. Beispielsweise wird die freie Säureform des Antibiotikums in einem Lösungsmittel, wie Aceton oder Dioxan/ Wasser, gelöst und mit einer Lösung, die die stöchiometrische Menge der gewünschten anorganischen Base enthält, versetzt. Das so gebildete Salz kann in üblicher Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder durch Verdampfen des Lösungsmittels, isoliert werden.

Die Salze organischer Amine können in ähnlicher Weise hergestellt werden. Beispielsweise kann das gasförmige oder flüssige Aifiin in eine Lösung des Antibiotikumfaktors in einem Lösungsmittel, wie Aceton, eingeführt und dann das Lösungsmittel und überschüssiges Amin durch Verdampfen entfernt werden.

Eine bevorzugte Methode zur Herstellung eines Salzes eines der Deoxynarasinantibiotika besteht in der Auswahl der günstigen Isolierungsmethode, beispielsweise Einstellen des pH-Werts der Mischung mit der entsprechenden Base oder Zugabe eines entsprechenden kationischen Salzes zu dem Extraktionslösungsmittel.

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Auf dem Gebiet der Veterinärpharmazie ist allgemein bekannt, daß es bei der Behandlung von Tieren mit Antibiotika auf die Form des Antibiotikums nicht wesentlich ankommt. In den meisten Fällen erfährt das Mittel unter den Bedingungen im Tier Umwandlungen zu anderen Formen als denen, in denen es verabreicht wurde. Die Salzform, in der es verabreicht werden kann, ist daher für die Behandlungsweise unbeachtlich. Ihre Wahl richtet sich vielmehr nach wirtschaftlichen Gesichtspunkten, Handhabbarkeit und Toxizität.

Die neuen Antibiotika werden erfindungsgemäß durch Züchten eines deoxynarasinerzeugenden Stamms von Streptomyces aureofaciens unter submers aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium bis zur Erzeugung einer beträchtlichen Aktivität erhalten. Die Antibiotika werden durch Anwendung verschiedener allgemein bekannter und angewandter Isolierungs- und Reinigungsarbeitsweisen gewonnen.

Der für die Herstellung der Deoxynarasinantibiotika verwendete Organismus ist durch mit N-Methyl-N¹-nitro-N-nitrosoguanidin induzierte Mutation von Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 erhalten worden. Die taxonomischen Merkmale, aufgrund welcher S. aureofaciens NRRL 8092 als Stamm von Streptomyces aureofaciens Duggar klassifiziert worden ist, sind in US-PS 4 038 384 angegeben. " .' ··

Die zur Erzeugung der Deoxynarasinantibiotika verwendbare Streptomyces aureofaciens-Kultur ist bei Northern Regional Research Center, U.S. Dept. of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604 hinterlegt worden und steht dort unter der Nummer NRRL 11181 für die öffentlicheit zur Verfügung. . . · ·

Die als NRRL 11181 bezeichnete Kultur ist durch Isolierung und Mutation aus einer Kultur von Streptomyces aureofaciens erhalten worden, die aus einer Bodenprobe vom Berg Ararat in der Türkei isoliert worden ist. Das ursprüngliche Bodenisolat wurde auf Agarplatten kultiviert, und Unterkulturen wurden durch Entnahme von Einzelkolonien des Mikroorganismus von der Oberfläche der Agarplatte gewonnen. Eines der Einzelisolate aus einer KuI- , tür des ursprünglichen Bodenisolats ist die hierin mit NRRL 5758 bezeichnete Kultur.

Diese natürlich selektionierte Kultur wurde erneut, auf einer Platte weiter gezüchtet, und eine Einzelkolonie wurde entnommen. Dieses Verfahren des natürliche^ Selektionierens wurde achtmal wiederholt, und zur weiteren Selektionierung wurde eine Einzelkolonie der neunten Generation isoliert.

Das Isolat der neunten Generation wurde in einem chemisch genau definierten Agarmedium mit 1 % Galactose als einziger Kohlenstoffquelle gezüchtet. Durch Ultraschallbehandlung des Agarmediums zur Abtrennung der Sporen wurde eine Sporensuspension hergestellt, und durch Filtrieren der Suspension durch ein Filtrierpapier Whatman Nr. 1 wurden die Hyphenbruchstüeke auf ein Minimum herabgesetzt.

Die Sporensuspension wurde in einem auf einen pH-Wert von 8,8 eingestellten flüssigen Medium, das 2 mg/ml N-Methyl-N¹-nitro-N-nitrosoguan'idin enthält, 72 Stunden bei 30 ⁰C gezüchtet. Die auf diesem Medium wachsenden Kulturen wurden dann gewonnen und mit einer Gewebemühle homogenisiert.

Die homogenisierte Kultur wurde verdünnt und auf Agarplatten aufgetragen, bei 30 ⁰C inkubiert bis Einzelkolonien voneinander unterschieden werden konnten. Eine von diesen Kolonien ausgewählte Einzelkultur wurde zum Anlegen einer neuen Kultur verwendet, die hierin als NRRL 8092 bezeichnet wird.

Die als NRRL 8092 bezeichnete Kultur wurde in einem chemisch genau definierten Agarmedium mit Glucose als der einzigen Kohlenstoffquelle gezüchtet. Durch Ultraschallbehandlung des Agarmediums wurde eine Suspension von Sporen und Hyphenfragmenten hergestellt. Die Mischsuspenion von Sporen und Hyphen wurde dann 2 mg/ml N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin in einem kompliziert aufgebauten flüssigen Medium von pH 8,8 96 Stunden bei 30 ⁰C auf einer Schüttelvorrichtung ausgesetzt, worauf die Kultur gewonnen, homogenisiert und wie vorstehend beschrieben erneut auf einer Platte gezüchtet wurde. Eine der von diesen Agarplatten selektionierten Einzelkolonien wurde zur Herstellung der Kultur verwendet, die hierin als NRRL 111.81 bezeichnet wird.

Wie für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich, ist es aufgrund der vorstehenden Beschreibung ohne weiteres möglich, weitere Stämme zu erzeugen, die praktisch die gleichen biosynthetischen Fähigkeiten wie S. aureofaciens NRRL 11181 haben (d.h. die Fähigkeit, 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin zu erzeugen) , indem S.aureofaciens NRRL 5758, NRRL 8092 oder NRRL 11181 mutagenen Behandlungen unterworfen wird. Zur Erzielung von S.aureofaciens NRRL 11181 wurde zwar N-Methyl-N¹-nitro-N-nitrosoguanidin verwendet, doch können auch andere mutagene Mittel, zum Beispiel ultraviolettes Licht, Röntgenstrahlen, Hochfrequenzwellen, radioaktive Strahlen oder andere chemische Mittel, zum Bewirken einer vergleichbaren Mutagenese verwendet werden. Zur vorliegenden Erfindung gehören daher auch Verfahren zur Erzeugung des antibiotisch wirksamen Deoxynarasinkomplexes, bei dem ein Streptomyces aureofaciens mit praktisch den gleichen biosynthetischen Fähigkeiten wie NRRL 11181 gezüchtet wird.

20S 5

Zur Züchtung von Streptomyces aureofaciens NRRL 1.1181 können die verschiedensten Medien verwendet werden. Bestimmte Kulturmedien sind jedoch aus wirtschaftlichen Gründen, zur Erzielung optimaler Ausbeuten und wegen der Einfachheit der Isolierung des Produkts bevorzugt. Bei Fermentationen in großem Maßstab sind beispielsweise bevorzugte Kohlehydrat liefernde Stoffe Tapiocadextrin und Saccharose, doch können auch Glucose, Maisstärke, Fructose, Mannose, Maltose, Lactose und verwandte Stoffe ver- . wendet werden. Maisöl, Erdnußöl, Sojabohnenöl und Fischöl sind weitere brauchbare Kohlenstoffquellen. Eine bevorzugte Stickstof f quelle ist enzymatisch hydrolysiertes Casein, doch eignen sich auch Peptone, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Aminosäuren, wie Glutaminsäure, und verwandte Stoffe. Zu den anorganischen Salzen, die als Nährstoffe in den Kulturmedien enthalten sein können, gehören die üblichen löslichen Salze, die Ionen von Natrium, Magnesium, Calcium, Ammonium,. Chlor, Carbonat, Sulfat und Nitrat zu liefern vermögen.

Essentielle Spurenelemente, die für das Wachstum und die Entwicklung des Organismus erforderlich sind, sollen gleichfalls in dem Kulturmedium enthalten sein. Diese Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen vor, die für die Wachstumsbedürfnisse des Organismus genügen.

Es kann notwendig sein, geringe Mengen (z.B. 0,2 ml/1) eines Schäumverhütungsmittels, wie Polypropylenglykol, zuzusetzen, wenn beispielsweise bei Fermentationen in großem Maßstab das Schäumen Schwierigkeiten bereitet.

Durch die Zugabe einer kleinen Menge eines Öls, z.B. Sojabohnenöl, wird die Produktion des Antibiotikums gefördert, doch ist dieser Zusatz nicht wesentlich.

Für die Erzeugung großer Mengen der Deoxynarasinantibiotika ist. eine submerse aerobe Fermentation in Tanks bevorzugt. Kleinere

Mengen können duch eine Schüttelkolbenkultur erhalten werden. Wegen der zeitlichen Verzögerung der Antibiotikumerzeugung, die gewöhnlich beim Inokulieren großer Tanks mit der Sporenform des Organismus auftritt, ist die Verwendung eines vegetativen Inokulums bevorzugt. Das vegetative Inokulum wird durch Inokulieren eines kleinen Volumens Kulturmedium mit. der Sporenform oder mit Mycelfragmenten des Organismus hergestellt, da dadurch eine frische, kräftig wachsende Kultur des Organismus erhalten wird. Das vegetative Inokulum wird dann in einen großen Tank überführt. Als Medium für die Züchtung des vegetativen Inokulums kann das gleiche wie für Fermentationen in größerem Maßstab verwendet werden, doch kommen auch andere Medien in Betracht.

Der Deoxynarasin erzeugende Organismus kann bei Temperaturen zwisohen 20 und 40 ⁰C gezüchtet werden. Allem Anschein nach erfolgt die beste Deoxynarasinerzeugung bei Temperaturen von 27 bis 30 ⁰C.

Wie bei aeroben submersen Kulturverfahren üblich, wird sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen. Zur Erzielung eines guten Wachstums des Organismus entspricht das bei der Tankproduktion verwendete Luftvolumen vorzugsweise mehr als 0,1 Volumen Luft je Volumen Kulturmedium und Minute. Für eine gute Antibiotikaerzeugung beträgt das bei der Tankproduktion angewandte Luftvolumen vorzugsweise mehr als 0,25 Volumen Luft/Volumen Kulturmedium und Minute. Ein hoher Gehalt an gelöstem Sauerstoff ist für die Antibiotikumerzeugung nicht abträglich.

Die Bildung der Antibiotika kann während der Fermentation durch Prüfen von Proben der Maische oder von Extrakten der Mycelfeststoffe auf ihre antibiotische Wirksamkeit gegen Organismen verfolgt werden, von denen bekannt ist, daß sie gegenüber den

Antibiotika empfindlich sind. Ein zur Prüfung der erfindungsgemäß erhältlichen Antibiotika geeigneter Organismus ist Bacillus subtilis ATCC 6633, und zweckmäßigerweise wird eine Papierscheibenprüfung auf Agarplatten angewandt.

Eine weitere zweckmäßige Nachweismethode bedient sich der turbidometrischen Prüfung mittels eines semiautomatisierten

(R) Systems (Autoturb^v mikrobiologisches Prüfsystem, Elanco) nach

N. R. Kuzel und F. W. Kavanaugh in J. Pharmaceut. Sei. 60 (5), 764 und 767 (1971). Zur Prüfung der Deoxynarasxnantibiotika werden die folgenden Testparameter angewandt: Staphylococcus aureus (H-Heatley) NRRL B-314 in einem flüssigen Nährmedium (pH 7), Inkubation 4 Stunden bei 37 ⁰C. Testproben und Vergleichsstandard werden in Methanol/Wasser (1:1) gelöst. Der Vergleichsstandard A-28086 Faktor A, wird in Konzentrationen von·1, 2, 3, 4 und 5 mcg/ml eingesetzt.

Der anfängliche pH-Wert des Kulturmediums vor dem Beimpfen schwankt in Abhängigkeit von dem jeweils verwendeten Medium. Im allgemeinen soll er im Bereich von 6,0 bis 7,5 liegen. Am Ende der Fermentation liegt der pH-Wert gewöhnlich etwas höher, nämlich im Bereich von 6,5 bis- 8,0.

Im allgemeinen läßt sich eine antiobiotische Aktivität bereits -am zweiten Tag der Fermentation nachweisen. Die maximale Erzeugung an antibiotischer Aktivität erfolgt gewöhnlich zwischen dem vierten und dem zehnten Tag.

Nach ihrer Erzeugung unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen können die oben beschriebenen Deoxynarasinantibiotika nach auf diesem Gebiet allgemein angewandten Methoden aus dem Fermentationsmedium gewonnen werden. Die bei der Fermentation gebildeten Antibiotika sind sowohl in der Mycelmässe als auch in der filtrierten Maische enthalten. Eine größtmögliche Gewinnung der Deoxynarasinantibiotika wird daher durch eine Kombination von Methoden, wie Filtration, Extraktion und Absorptionschromatographie erreicht. Ein bevorzugtes Lösungsmittel für die Abtrennung der·Deoxynarasinantibiotika aus

der gesamten oder der filtrieren Fermentationsmaische ist Ethylacetat, doch werden auch mit anderen üblicherweise verwendeten Lösungsmitteln befriedigende Ergebnisse erhalten.

Eine besonders vorteilhafte Methode zur Abtrennung der Deoxynarasinantibiotika besteht in folgenden Maßnahmen: Der pH-Wert der gesamten Fermentationsmaische wird auf etwa 3 erniedrigt. Bei diesem pH-Wert können die Deoxynarasinantibiotika durch Filtrieren mit dem Mycel abgetrennt werden. Die Methode ist für die Gewinnung der verwandten Antibiotika A-28086 Faktor A, B und D und Salinomycin in US-PS 4 009 262 angegeben. Bei einer anderen vorteilhaften Ausführungsform dieser Methode wird ein Bicarbonat, z.B. Natriumbicarbonat, in Mengen von etwa 1 g/l zu der Gesamtmaische gegeben. Hierbei können die Deoxynarasinantibiotika in Salzform mit dem Mycel abgetrennt werden. Für die Abtrennung der Antibiotika aus dem Mycel wird vorzugsweise Methanol als Lösungsmittel verwendet ,· doch sind auch andere niedere Alkohole und Ketone geeignet. ·

Auch eine azeotrope Destillation kann mit Vorteil zur Gewinnung der Deoxynarasinantibiotika angewandt werden. Hierbei wird ein mit Wasser ein Azeotrop bildendes organisches Lösungsmittel zu der wäßrigen Fermentationsmaische gegeben, und die erhaltene Mischung wird einer azeotropen Destillation zur Entfernung von wenigstens der Hälfte des Wassers aus der Maische unterworfen, wobei eine Mischung aus Wasser und Lösungsmittel hinterbleibt, worin die Deoxynarasinantibiotika gelöst sind. Unlösliche Nebenprodukte können durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt werden. Danach können die Deoxynarasinantibiotika durch allgemein bekannte Arbeitsweisen, z.B. Verdampfen des Lösungsmittels, Ausfällen durch Zugabe eines Fällungsmittels oder Extraktion, aus der organischen Lösung gewonnen werden.

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Zu mit Wasser Azeotrope bildenden organischen Lösungsmitteln, die zur Durchführung eines derartigen GewinnungsVerfahrens verwendet werden können, gehören Butylalkohol, Amylalkohol, Hexylalkohol,. Benzylalkohol, Butylacetat, Amylacetat, 1,2-Dichlorethan, 3-Pentanon, 2-Hexanon, Benzol, Cyclohexanon, Toluol und die Xylole.

Bei in großem Maßstab durchgeführten Fermentationsverfahren ist die Gewinnung durch azeotrope Destillation von besonderem Vorteil. Wasser und Lösungsmittel im azeotrop übergegangenen Gemisch können in bekannter Weise von einander getrennt und dann zur Wiederverwendung zurückgeführt werden. Das so.entfernte Wasser ist von Verunreinigungen frei und erfordert keine Abwasserbehandlung.

Zur weiteren Reinigung der Deoxynarasinantibiotika können zusätzliche Extraktionen und Adsorptionen angewandt werden. Adsor-

(R) bierende Materialien, wie Kieselgel, Kohle, Florisil (Magnesiumsilicat, Floridin Co., P.O. Box 989, Tallahassee, Fla., V.St.A.) und dergleichen, können mit Vorteil eingesetzt werden.

Die Feststoffe der Kultur, zu denen Bestandteile des Mediums und Mycel gehören, können aber auch ohne Extraktion oder Abtrennung, vorzugsweise nach Entfernung des Wassers, als Ausgangsmaterial des antibiotisch wirksamen Deoxynarasinkomplexes verwendet werden. So kann beispielsweise das Kulturmedium nach der Erzeugung antibiotischer Deoxynarasinaktivität einer Gefrieroder Trommeltrocknung unterworfen und direkt in Futtervormischungen eingemischt werden.

Bei einer anderen Ausführungsform kann das Mycel nach Erzeugung von Deoxynarasinaktivität im Kulturmedium abgetrennt und getrocknet werden, wodurch ein Produkt erhalten wird, das direkt in einer Futtervormischung verwendet werden kann. Bei der Abtrennung des Mycels für eine derartige Verwendung wird das Filtrieren durch Zugabe von Calciurncarbonat (etwa 10 g/l) unterstützt und ein verbessertes Trockenprodukt erhalten.

Unter den soweit angewandten Bedingungen werden 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin als die hauptsächlichen Faktoren mit dem oben beschriebenen und als NRRL 11181 bezeichneten Stamm von Streptomyces aureofaciens erhalten. Daneben werden auch einige untergeordnete Faktoren in Mengen erhalten, die zu gering sind, um eine Charakterisierung zu ermöglichen. Das Verhältnis der Faktoren schwankt zwar in Abhängigkeit von den angewandten Fermentations- und Isolierungsbedingungen, doch wird im allgemeinen mehr 20-Deoxy-epi-17-narasin als 20-Deoxynarasin erhalten.

20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin werden mit Hilfe allgemein bekannter Methoden, wie Säulenchromatographie, Dünnschichtchromatographie oder Gegenstromverteilung, voneinander getrennt und als Einzelverbindungen .isoliert. Beispielsweise kann eine Säulenchromatographie an Kieselgel zur Trennung von 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin durch Elution der Säule mit verschiedenen Lösungsmittelgemischen angewandt werden. Bei Verwendung von Lösungsmittelgemischen aus Benzol und Ethylacetat in Verbindung mit einer Kieselgelsäule wird 20-Deoxy-epi-17-narasin zuerst und 20-Deoxynarasin erst später eluiert. Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwandung von Ethylacetat als Lösungsmittel ist eine zweckmäßige Methode zum Verfolgen des Fortschreitens der Elution.

Die Deoxynarasinantibiotika gemäß der Erfindung sind antibakterielle Mittel. Die mikrobiologischen Aktivitäten von 20-Deoxyepi-17-narasin (freie Säure) sind in Tabelle IV angegeben. Es wurde die übliche Scheibendiffusionsmethode angewandt.

Tabelle IV

Inhibitionszone (mm)

Testorganismus

Staphylococcus aureus 3055 Staphylococcus aureus 3074

Staphylococcus aureus 3130

Streptococcus pyogenes (Gruppe A) Streptococcus sp. (Gruppe D) Diplococcus pneumoniae

Penicillin G-resistent

300 mcg/Scheibe	30 mcg/Scheibe
16,9	13,8
19,5	15,4
19,0	17,2
12,0	10,0
17,0	14,6-
16,0	13,0

"Methicillin-resistent

Die Deoxynarasinantibiotika inhibieren das Wachstum von anaeroben Bakterien. Die minimale inhibierende Konzentration (MIC)/ in der 20-Deoxy-epi-17-narasin (freie Säure) bei der standardisierten Agarverdünnungsprüfung verschiedene anaerobe Bakterien inhibiert, ist in Tabelle V angegeben. Endpunkte wurden nach 24-stündiger Inkubation abgelesen.

Tabelle V Anaerobe Bakterien MIC (mcg/ml)

Actinomyces israelii W8 5 5

Clostridium perfrinqens 81 ₁₆

Clostridiurg septicum 1128 ' ' 16

Eubacterium aerofaciens 1235 ₁₆

Peptococcus asaccharolyticus 1302 8

Peptococcus prevoti 1281 ₄

Peptostreptococcus anaerobius 14 28 4

Peptostreptococcus intermedius 1264 4

Propionibacteriuia acnes 79 ->

Bacteroides fragilis 111 : >128

Wirksamkeit gegen Mycoplasma ist ein anderes wertvolles Merkmal der antimikrqbiellen Wirksamkeit der Deoxynarasinantibiotika. Mykoplasmaspecies, die auch als pleuropneumonieartige Organismen (PPLO) bezeichnet werden, sind für Menschen und verschiedene Tiere pathogen. Gegen PPLO-Organismen wirksame Mittel werden besonders in der Geflügelzucht benötigt. Die minimalen inhibierenden Konzentrationen (MIC) von 20-Deoxy-epi-17-narasin (freie Säure) bei in-vitro-Maischeverdünnungsuntersuchungen gegen verschiedene Mycoplasmaspecies sind in Tabelle VI zusammengestellt.

2OS 5

Tabelle VI .

Organismus MIC (mcg/ml)

M. gallisepticum 25,O

M. hyorhinis . 50,0

M synoviae 50,0

Die Deoxynarasinantibiotika sind auch antivirale Mittel. So hat sich 20-Deoxy-epi-17-narasin bei in-vitro-Plättchenunterdrückungstests ähnlich dem von Siminoff, Applied Microbiology 9 /_1_/, 66-72 (1961) beschriebenen als gegen Rhinovirus Typ 3, Vacciniavirus, Herpesvirus und Influenza-A-Virus als wirksam erwiesen. .

Ein er'f indungsgemäß erhältliches Deoxynarasinantibiotikum kann oral, örtlich oder parenteral an Säuger zur Bekämpfung von Viren verabreicht werden. Die Höhe der Dosis zur Verhütung oder Behandlung von viralen Erkrankungen schwankt zwischen etwa 1 und 5 mg/kg Körpergewicht in Abhängigkeit von dem Virus und davon, ob das Mittel prophylaktisch oder therapeutisch angewandt wird.

.Außerdem können ein Deoxynarasinantibiotikum vorzugsweise zusammen mit einem oberflächenaktiven Mittel enthaltende Lösungen zur Befreiung des in-vitro-Habitats auf dem Viren, zum Beispiel Polio oder Herpes, zugegen sind, verwendet werden. Lösungen, die 1 bis 1500 mcg/ml eines Deoxynarasinantibiotikums enthalten, sind bei der Bekämpfung von Viren wirksam.

Die akuten Toxizitäten von 20 Deoxy-epi-17-narasin (freie Säure) und 20-Deoxynarasin (Na-SaIz) bei der intraperitonealen Verabreichung an Mäuse betragen, ausgedrückt als LD,_ , 201 mg/kg bzw. 5 mg/kg.

Die anticoccidielle Wirksamkeit ist eine sehr wichtige Eigenschaft der erfindungsgemäß erhältlichen Deoxynarasxnantibiotxka. In-vitro-Versuche zeigen, daß 20-Deoxynarasin (Na-SaIz) und 20-Deoxy-epi-17-narasin (freie Säure) gegen Eimeria tenella, den bei Coccidiose am meisten vorkommenden Protozoenorganismus in einem so geringen Verhältnis wie 0,2 ppm wirksam ist.

Ein Fütterungsversuch mit kleinen Küken bestätigt, daß die Deoxynarasxnantibiotxka anticoccidielle Wirksamkeit in vivo haben. Bei diesem Versuch wird durch 20-Deoxynarasin (Na-SaIz), das in einem Verhältnis von 100 ppm im Futter an mit Eimeria tenella geimpfte Küken verabreicht wird, Mortalität verhindert, Gewichtszunahme verbessert und die Anzahl der Wunden der Küken herabgesetzt. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle VII zusammengestellt.

Tabelle VII Behandlung —

% Mortalität

Gewichtszunahme (g)

2/

Wundenbewertung —

infizierte Kontrollen 20-Deoxynarasin (100 ppm)

37,5 0

114 185

4,00 0,13

1/ 2 Käfige mit je 4 Küken pro Behandlung 2/ möglicher Höchstwert = 4,00

Zur Verhütung oder Behandlung von Coccidiose bei Geflügel wird eine anticoccidiell wirksame Menge des Deoxynarasinantibiotikums vorzugsweise oral und täglich an die Tiere verabreicht. Das Deoxynarasinantibiotikum kann auf viele verschiedene Arten zur Verfügung gestellt werden, wird aber zweckmäßigerweise zusammen mit einem physiologisch annehmbaren Träger, vorzugsweise dem von den Tieren verzehrten Futter, gegeben. Bei der Ermittlung einer angemessenen Konzentration eines Deoxynarasinantibiotikums müssen zwar eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden, doch beläuft sich die zu verabreichende Menge im allgemeinen auf 0,003 bis 0,03 Gewichtsprozent und vorzugsweise 0,004 bis 0,02 Gewichtsprozent des Futters.

Die Erfindung bezieht sich auch auf anticoccidielle Futtermittel für .Geflügel aus Geflügelfutter und 35 bis 180 g/t eines Deoxynarasinantibiotikums. ·

Das Vermögen, den Futterverwertungsgrad bei Tieren zu verbessern, ist eine weitere wichtige Eigenschaft der Deoxynarasinantibiotika. Beispielsweise verbessern Deoxynarasinantibiotika den Futterverwertungsgrad bei Wiederkäuern mit voll entwickelter Pansenfunktion,

Wie erörtert wird der Wirkungsgrad der Kohlehydratverwertung bei Wiederkäuern durch Behandlungen erhöht, die die Pansenflora der Tiere zur Bildung von Propionatverbindungen anstelle von Acetatoder Butyratverbindungen anregen. Der Wirkungsgrad der Futterverwertung kann durch Beobachtung der Erzeugung und Konzentration von Propionatverbindungen in der Pansenflüssigkeit mit Hilfe von Methoden gemäß US-PS 4 038 384 verfolgt werden.

Die bei in-vitro-Tests mit 20-Deoxynarasin (Na-SaIz) und 20-Deoxy-epi-17-narasin (freie Säure) erhaltenen Ergebnisse, die das Verhältnis der Konzentrationen von flüchtigen Fettsäuren (VFA) in behandelten Kolben zu den Konzentrationen in Kontrollkolben zeigen, sind in Tabelle VIII wiedergegeben.

Tabelle VIII

Verbindung

20-Deoxy-epi-17-narasin 20-Deoxy-epi-17-narasin 20-Deoxy-epi-17-narasin 20-Deoxynarasin

20-Deoxynarasin

Verhältnis von Behandelt zu Unbehandelt

Dosis	Mol-%	Mol-%	Mol-%	Gesamt-	I
mcg/ml	Acetat	Propionat	Butyrat	VFA	Λ I
10	0,9093	1,2665*	0,6560	1,0325
5	0,9237	1,1836*	©,8201	1,0487
2	0,9581	1,0858	0,9414	1,0717
1	0,8727	1,4597*	0,3942	1,2096
0,3	0,9084	1,3799*	0,4582	1,1829
0,1	0,9504	1,2148*	0,6870	1,1892

* statistisch Signifikat (P<0,01) aufgrund des Zweienden-LSD-Tests (R.G.D. Steel und J. H. Torrie, "Principles and Procedures of Statistics," McGraw-Hill, New York, N, Y., I960, S. 106).

Die erfindungsgemäß erhaltenen Deoxynarasinantibiotika steigern die Propionate und damit den Grad der Futterverwertung, wenn sie oral an Wiederkäuer in Verhältnissen von 0,05 bis 5,0 mg/kg und Tag verabreicht werden. Sehr günstige Ergebnisse werden mit Verhältnissen von 0,1 bis 2,5 mg/kg und Tag erzielt. Eine bevorzugte Methode der Verabreichung eines erfindungsgemäß erhaltenen Antibiotikums besteht im Vermischen desselben mit dem Futter der Tiere. Es kann aber auch auf andere Art und Weise verabreicht werden, beispielsweise in Tabletten oder in der Form von Tränken, Bolus oder Kapseln. Die Zubereitung dieser verschiedenen Dosierungsformen kann nach allgemein bekannten Verfahren erfolgen. Jede j einzelne Dosierungseinheit soll eine Menge einer erfindungsgemäß erhaltenen Verbindung enthalten, die der Tagesdosis für das zu behandelnde Tier entspricht.

Die Erfindung bezieht sich ferner auf Futtermittel zum Mästen von Wiederkäuern, wie Rindern und Schafen. Diese Futtermittel enthalten Rinderfutter und 1 bis 30 g/t eines Deoxynarasinantibiotikums .

Schweinedysenterie ist eine häufig vorkommende Erkrankung, die Jahr für Jahr in der ganzen Welt zu beträchtlichen Tierverlusten führt. In der US-PS 3 947 586 ist angegeben, daß sich Polyetherantibiotika zur Verhütung und Behandlung von Schweinedysenterie eignen. Die Deoxynarasinantibiotika sind neue Glieder der Klasse der Polyetherantibiotika und sind deshalb gleichfalls zur Verhütung und Behandlung von Schweinedysenterie wirksam.

Zur Verhütung oder Bekämpfung der Dysenterie bei Schweinen wird vorzugsweise eine wirksame Menge eines Deoxynarasinantibiotikums dem Futter einverleibt. Dabei werden Verhältnisse von 35 bis 150 g/t des jeweiligen Deoxynarasinantibiotikums eingesetzt. Ein besonders bevorzugtes Verhältnis liegt bei etwa 100 g Wirk- · stoff pro Tonne. Das Vermischen mit dem Tierfutter ist zwar die bevorzugte Methode der Verabreichung, doch können die Antibiotika auch auf anderen Wegen verabreicht v/erden, beispielsweise in. Form

208 5

von Tabletten, Tränken, Bolus oder Kapseln. Jede einzelne Dosierungseinheit soll eine Menge eines erfindunggemäß erhaltenen Antibiotikums enthalten, die der Tagesdosis des zu behandelnden Tieres angepaßt ist.

Die Erfindung bezieht sich ferner auf Futtermittel für Schweine aus Schweinefutter und einer wirksamen Menge eines Deoxynarasinantibiotikums. Wie erörtert liegen die wirksamen Mengen im Bereich von 35 bis 150 g eines Deoxynarasinantibiotikums pro Tonne Futter.

Die Deoxynarasinantibiotika sind antivirale Mittel und wirken auch gegen anaerobe Bakterien, wie Clostridium perfringens. Die Deoxynarasinantibiotika eignen sich deshalb sehr gut zur Behandlung oder Verhütung von Enteritis bei Hühnern, Schweinen, Rindern und Schafen sowie zur Behandlung von Enterotoxämie bei Wiederkäuern. .

Manche Deoxynarasinverbindungen (20-Deoxynarasin und seine Salze) weisen Ionen bindende und Ionen befördernde Eigenschaft auf und sind daher Ionophore (Ionenträger) (vergl. B. C. Pressman, Alkali Metal Chelators- The Ionophores, in "Inorganic Biochemistry, " Bd. 1, G. L. Eichhorn, Elsevier, 1973). Diese Verbindungen können zur selektiven Entfernung eines bestimmten Kations verwendet werden. Beispiele für derartige Verwendungen sind die Entfernung und Gewinnung von Silberionen aus Lösungen in der Fotographie, die Entfernung von toxischen Kationen aus Industrieabwässern vor deren. Abgabe an die Umgebung und die Entsalzung von Seewasser. Eine Deoxynarasinverbindung kann als eine Komponente einer ionenspezifischen Elektrode verwendet werden (vgl. US-PS 3 753 887) . Diese Verbindungen verändern die Kationendurchlässigkeit von natürlichen und künstlichen Membranen. Eine Deoxynarasinverbindung kann deshalb als eine Komponente in einer Membran für den selektiven Transport von Kationen gegen einen Konzentrationsgradienten verwendet werden. Diese Eigenschaft kann zur Gewinnung von Schwermetallen oder Edelmetallen in technischem Maßstab ausgenutzt werden (vgl. E. L. •Cussler, D. F. Evans und Sister M. A. Matesick, Science 172,

"377 M Q-71 W "

20-Deoxynarasin und seine Salze sind darüber hinaus wirksam als Inhibitoren des Enzyms ATPase. ATPase, ein in Zellmembranen vorkommendes alkälxmetallempfindliches Enzym, spielt für die für aktiven Transport notwendige Energie eine Rolle. "Aktiver Transport" bezieht sich auf die energieerfordernde Reihe von Vorgängen, durch die intrazelluläre und extrazelluläre Flüssigkeiten ihre Zusammensetzungen beibehalten. Inhibitoren von ATPase vermindern den Energiebedarf des aktiven Transports. In-vitro-Tests haben gezeigt, daß 20-Deoxynarasin (Natriumsalz) Kationentransport-ATPase in Lebermitochondrien bei einer Halbwertskonzentration von 0,065 mcg/ml inhibiert.

20-Deoxynarasin und seine Salze sind außerdem cardiotonische Mittel. Bei Tests unter Verwendung von isolierter Meerschweinchenatria erhöht 20-Deoxynarasin die Cardxokontraktxlxtät. Ansprechen auf diesen Test wird als Prozentsatz der maximalen kontraktilen Spannung angegeben, die durch eine wirksame Dosis

-4 von Norepinephrin (10 m) hervorgerufen wxrd. Bei exner molaren Konzentration von 10 führt 20-Deoxynarasin (Na-SaIz) zu einer mittleren (+—Standardabweichung) Erhöhung der kontraktilen Spannung um 43,8 +_ 1,4.(n = 4) Prozent. Eine genauere Beschreibung dieses Tests findet sich in US-PS 3 985 893.

Die kontraktile Kraft des Herzmuskels von warmblütigen Säugern kann daher durch Verabreichung einer wirksamen nichttoxischen Dosis von 20-Depxynarasin oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon verstärkt werden. Eine wirksame nicht toxische Dosis ist eine solche im Bereich von 30 bis 500 mcg/kg Körpergewicht. Ein zu bevorzugender Dosisbereich liegt zwischen etwa 30 und 100 mcg/kg Körpergewicht. Hierbei kann das Antibiotikum parenteral, beispielsweise durch intravenöse Infusion verabreicht werden. Eine geeignete Art der Verabreichung ist die Tropfenmethode, wofür das Antibiotikum in eine standardisierte intravenöse Lösung, zum Beispiel eine Dextroselösung, eingebracht wird. /

20-Deoxynarasin wird vorzugsweise in .Dosen von unter etwa 100 mcg/kg verabreicht, bis die gewünschte Verstärkung der kontraktilen Kraft beobachtet wird. Danach kann die verabreichte Menge an 20-Deoxynarsin durch die Infusionsgeschwindigkeit den Bedürfnissen für die Aufrechterhaltung der gewünschten Wirkung angepaßt werden. Wie im Fall der klinischen Verabreichung anderer inotroper Mittel kann die verabreichte Dosis an 20-Deoxynarasin entsprechend der im Einzelfall gegebenen Toleranz für 20-Deoxynarasin, der Art der Herzbeschwerden, z. B. dem Ausmaß der Schädigung des Herzmuskels, sowie Alter und allgemeinem körperlichem Zustand des Patienten abgewandelt v/erden.

20-Deoxynarasin kann als positives inotropes Mittel in den verschiedensten klinischen Situationen verwendet werden, die ganz allgemein als cardiogener Schock bezeichnet werden. Zu derartigen Zuständen gehören beispielsweise Myocardinfarkt, Congestion erzeugendes Herzversagen und postoperativer cardiogener Schock.

Ausfuhrangsbeispiele:

Die Erfindung wird durch die folgenden. Beispiele weiter erläutert.

Beispieli

A. Schüttelkolbenfermentation

Eine Kultur von Streptomyces aureofaciens NRRL 11181 wird auf Schrägagar mit folgender Zusammensetzung hergestellt und erhalten:

Bestandteil

K₂HPO₄ MgSO₄*7H₂O NH₄NO₃ CaCO₃

FeSO₄·7H₂O MnCl₂*7H₂O ZnSO₄*7H₂O Glucose Agar

entionisiertes Wasser pH (nicht nachgestellt)

Menge	•	g	g
2			g
0	r		g
2	1	25 g
2		g
0		5 g	. auf 1 Liter
0	S	001
0	1	001
10	001
20	g
q·	g
7,

Die Schräge wird mit Streptomyces aureofaciens NRRL 11181 inokuliert und bis zu 7 Tage bei 30 ⁰C inkubiert. Die reife Schrägkultur wird mit sterilem Rinderserum bedeckt und zum Ablösen von Sporen mit einer sterilen Schlinge abgeschabt. Die so erhaltene Rinderserumsuspension von Sporen und Mycelfragmenten wird zu maximal 6 Körnern lyophilisiert.

Ein so erzeugtes lyophilisiertes Korn wird zum Inokulieren von 50 ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteil . Menge

Glucose 20 g . ,

Sojabohnenmehl 15 g

Maisquellwasser 10 g

CaCO₃ 2g

Leitungswasser . <3«s. aus 1 Liter

.pH mit 5 η NaOH auf 6,5 eingestellt

Das inokulierte vegetavie Medium wird in 250 ml Erlenmeyer-Kolbeh 24 bis 48 Stunden bei 30 ⁰C auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert, die mit 250 Umdrehungen/Minute durch einen Bogen mit 5 cm Durchmesser rotiert.

Das oben beschriebene inkubierte vegetative Medium (50 ml) wird zum Inokulieren von 250 ml eines der folgenden Fermentationsmedien verwendet.

Medium I;

Bestandteil Menge

Tapiocadextrin* 60 g

enzymatisch hydrolysiertes

Casein** 6 g

enzymatisches Hydrolysat von

Casein*** ' 2 g

CaCO₃ 2 g

MgSO₄.7H₂O 0,5 g

Schwarzölmelasse " 15 g

raffiniertes Sojabphnenöl 5,0 ml/L

Leitungs-H„O . q.s. 1 Liter

pH (nicht eingestellt) 6,6

* Stadex 11, A. E. Staley, Decatur, Illinois, V. St. A. ** Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wise, V. St. A.

*** N-Z Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich,

• New York, V. St. A.

Medium II:

Bestandteil Tapiocadextrin* Glucose

enzymatisch hydrolysiertes Casein**

enzymatisches Hydrolysat von Casein***

Menge	g
30	g
15	g
3	g
1

Bestandteil Hefeextrakt CaCO₃ MgSO₄.7H₂O Schwärzölmelasse raffiniertes Sojabohnenöl Leitungs-H₂0

pH (nicht eingest.)

*** N-Z Amine A, Sheffield Chemical CoJ, Norwich,

New York, V.'St. A.

Medium III:

Menge	/5	g
2		g
2		g
1		g
15	,0	ml/L
5	S.	1 Liter
. q.	,4
6

Bestandteil Sojabohnenmehl Glucose CaCO₃

Na₃SO₄-IOH₂O raffiniertes Sojabohnenöl Methyloleat FeSO..7H_0

MnCl₉-4H„0 Ascorbinsäure entionisiertes H₉O pH (nicht eingestellt)

Die Fermentation wird 1O Tage bei 30 ⁰C auf einer Rundschüttelvorrichtung mit 250 Umdrehungen/Minute und einem 5 cm Bogen geführt.

Menge	g	g
25	g
20	,0
2	,0
1	ml	g
20	ml	g
20	,6	8 g
0	,3	auf 1 Liter
0	,01
0	. S.
q	,5
6

208 5

B. Tankfermentation

Die Tankfermentation wird unter Verwendung von vegetativen und Fermentations-Medien, wie sie unter A für die Schüttelkolbenfermentation beschrieben sind, durchgeführt. 10 ml des vegetativen Mediums werden 2um Inokulieren von 400 ml eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe in einem 2 1 Erlenmeyer-Kolben verwendet. Nach 24 Stunden bei 30 ⁰C werden 8OO ml des vegetativen Mediums der zweiten Stufe zum Inokulieren von 100 1 Fermentationsmedium in einem Fermentationstank mit einem Fassungsvermögen Von 165 1 verwendet. Nach 45 Minuten langer Sterilisation bei 121 ⁰C liegt der pH-Wert des Mediums bei 6,8 + 0,1. Die Fermentation wird 10 Tage bei 3O + 1 ⁰C geführt. Der Tank wird mit steriler Luft in einem Verhältnis von 0,5 Volumen Luft je Volumen Kulturmedium und Minute belüftet, wobei mit üblichen Rührern mit 300 Umdrehungen/Minute gerührt wird.

Beispiel. 2 Abtrennung von Deoxynarasinkomplex

Der pH-Wert der gesamten Fermentationsmaische (4 1), die nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise unter Verwendung von Medium II erhalten worden ist, wird mit konzentrierter HCl auf 3,0 herbgesetzt, wobei 1 Stunde gerührt wird. Die erhaltene Flüssigkeit wird mit einer Filterhilfe (125 g Hyflo Super-Cel, eine Diatomeenerde, Johns-Manville Corp.) filtriert. Der abgetrennte Mycelrückstand wird in Anteilen unter Verwendung einer Mischvorrichtung mit insgesamt 2 1 Methanol, das 50 g NaHCO... je Liter enthält, extrahiert. Das Methanolfiltrat wird im Vakuum auf ein Volumen von etwa 450 ml eingeengt, und der pH-Wert dieser Lösung wird mit konz. HCl auf 7,5 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird zweimal mit CHCl₃ (500 ml) extrahiert. Die Chloroformextrakte werden vereinigt, über Na₀SO. getrocknet und filtriert.

Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft, wodurch 2,0 g roher Deoxynarasinkomplex erhalten werden.

Beispiel 3 Isolierung von Deoxynarasin und epi-Deoxynarasin

2 g des wie in Beispiel 2 beschrieben erhaltenen rohen Deoxynarasinkomplexes werden in einer möglichst kleinen Menge Benzol gelöst und auf eine Kieselgelsäule (Merck 7729) mit den Abmessungen 1,5 χ 22 cm aufgegeben. Die isolierten Fraktionen, die verwendeten Löungsmittel und die erhaltenen Mengen sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Fraktion

Volumen

1	3,0 1
2	2,0 1
3	600 ml
4 ·	300 ml
5	300 ml
6	900 ml
7	2,0 1
8	300 ml
9	450 ml
10	' 450 ml
11	1,2 1
12	1,2 1
13	1,0 1
14	1,0 1
15	.1,5 1 .
16	1,5 1
17	450 ml

Lösungsmittel

Benzol

Benzol:Ethylacetat Benzol:Ethylacetat Benzol:Ethylacetat Benzol:Ethylacetat Benzol:Ethylacetat Benzol:Ethylacetat Benzol:Ethylacetat Benzol:Ethylacetat Benzol:Ethylacetat Benzol:Ethylacetat Benzol:Ethylacetat Benzol:Ethylacetat Benzol:Ethylacetat Benzol:Ethylacetat Benzol:Ethylacetat Benzol:Ethylacetat Verhältnis

Ausbeute, (mg)*

100 %	24
9:1	20
4:1	85
4:1	5
4:1	7
4:1 :	18
4:1	22
4:1	7
4:1	22
4:1	9
4:1	7 .
4:1	5
4:1	12
3:1	14
3:1	28
3:1	100
3:1	26

Fraktion	Volumen	Lösungsmittel
18	900 ml	Benzol:Ethylacetat
19	1,0 1	Benzol:Ethylacetat
20	300 ml	Ethylacetat
21	150 ml	Ethylacetat
22	150 ml ·	Ethylacetat
23	450 ml	Ethylacetat
24	300 ml	Methanol
25	450 ml	Methanol

Verhältnis	Ausbeute, (mg)*
3:1.	70
3:1	54
100 %	12
100 %	180
100 %	125
100 %	170
100 %	40
100 %	1100

* Nach Trocknen über NaSO., Filtrieren und Eindampfen des Filtrats zur Trockne im Vakuum.

Die Fraktionen werden durch TLC unter Verwendung eines Ethylacetatlösungsmittelsystems untersucht. Die Fraktionen 16 bis

17 (126 mg) enthalten 20-Deoxy-epi-17-narasin. Die Fraktionen

18 bis 23 enthalten eine Mischung aus 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin.

Eine Mischung aus 20-Qeoxynarasin und 20~Deoxy-epi-17-narasin, die wie oben für die Fraktionen 18 bis 23 beschrieben erhalten worden ist, wird durch präparative TLC unter Verwendung eines Ethylacetatlösungsmittelsystems chromatographiert. Die Mischung (105 mg auf einer Platte und 130. mg auf einer anderen Platte) wird in einer kleinen Menge CH„C1„ gelöst und auf eine präparative Silicagelplatte (Merck) aufgebracht. Nach der Entwicklung der Platte werden die beiden getrennten Materialien unter Ultraviolettlicht beobachtet. Jede der den beiden Materialien entsprechenden Flächen wird aus der Platte entfernt und mit CH-Cl^rCH^OH (4:1) extrahiert. In diesem System ist Deoxynarasin die sich langsamer bewegende der beiden Komponenten. Aus der Platte, die 105 mg Material enthält, werden 7,5 mg 20-Deoxy-epi-17-narasin und 27 mg Deoxynarasin gewonnen. Aus der Platte, die 130 mg der Mischung enthält, v/erden 4,0 mg 20-Deoxy-epi-17-narasin und 56 mg 20-Deoxynarasin gewonnen.

Beispiel 4 Andere mögliche Isolierung von 20-Deoxynarasin

95 !.der Gesamtfermentationsmaische werden mit HCl auf einen pH-Wert von 3 eingestellt und 1 Stunde gerührt. Nach Zugabe _von Filterhilfe (Hyflo Supercel, 3 %) wird die Maische filtriert. Das abgetrennte Mycel wird zweimal mit etwa 45 1 Aceton, das 50 g NaHCO₃ je Liter enthält, extrahiert. Die Acetonextrakte werden vereinigt und im Vakuum auf etwa 10 1 wäßrige Lösung eingeengt. Der pH-Wert dieser Lösung wird mit 5n HCl auf 8,0 eingestellt, und die erhaltene Lösung wird

dreimal mit je einem halben Volumen CH₂Cl₃ extrahiert. 'Die CH₂Cl₂~^Extrakte werden vereinigt und im Vakuum bis zu einem öligen Rückstand eingeengt. Dieser Rückstand wird in 500 ml der oberen Phase des Lösungsmittelsystems Hexan!Methanol:Wasser (10:7:1) aufgenommen. Die obere Phase wird sechsmal mit je 300 ml der unteren Phase extrahiert. Diese Extrakte werden vereinigt und im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird in Dioxan gelöst. Die Dioxanlösung wird lyophilisiert, wodurch 19,4 g Deoxynarasinkomplex erhalten werden.

Mehrere in der gleichen Weise erhaltene Proben werden vereinigt (40 g), in Toluol gelöst und auf eine Kieselgelsäule in einem füssigen Chromatographen (Waters' Associates Prep. LC/System 500) aufgegeben. Die Säule wird mit Toluol:Ethylacetat (9:1) als Lösungsmittelsystem mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 250 ml/Minute eluiert, wobei Fraktionen mit einem Volumen von 250 ml aufgefangen werden. Der Gehalt der Fraktionen wird durch TLC verfolgt. Die Fraktionen 37 bis 52 werden vereinigt und im Vakuum zu einem Rückstand eingeengt, der in Dioxan gelöst und zu 7,8 g gereinigtem an 20-Deoxynarasin reichen Material lyophilisiert wird. Dieses Material wird noch einmal wie oben beschrieben chromatographiert. Nach Elution von 50 Fraktionen mit Toluol:Ethylacetat (9:1) wird mit 100-prozentigem Ethylacetat eluiert. Die Fraktionen 51 bis 53 werden vereinigt und im Vakuum eingedampft, und der Rückstand wird in Dioxan gelöst und zu 1,12 g 20-Deoxynarasin als Natriumsalz lyophilisiert.

Beispiel 5 Herstellung von 20-Deoxynarasin, freie Säure

200 mg 20-Deoxynarasin, Natriumsalz v/erden in 10 ml Ethylacetat gelöst. Diese Lösung wird mit 10 ml 0,1n HCl und dann zweimal mit je 5 ml Wasser gewaschen. Die erhaltene organische Schicht wird zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wird in Dioxan gelöst und zu 139,6 ing 20-Deoxynarasin, freie Säure, als weißer Feststoff lyophilisiert.

Beispiel 6 Hühnerfutter für die Coccidiösebekämpfung

Ein ausgeglichenes energiereiches Hühnerfutter zur. Erzielung rascher Gewwichtszunahmen wird aus folgenden Bestandtelen hergestellt:

Bestandteil % kg

gemahlener gelber Mais 50 1 000

Sojabohnenmehl, lösungsmittelextrahiert entschalt, feingemahlen, 50 % Protein 30,9 618

tierisches Fett (Rindertalg) 6,5 130

Trockenfischmehl mit löslichen

Stoffen (60 % Protein) 5,0 100

Distillers Solubles aus Mais

Dicalciumphosphat, Futtersorte Calciumcarbonat

Vitamin-Vormischung (Vitamin A, D, E, K und B₁₇, Cholin, Niacin, Pantothensäure, Riboflavin, Biotin, mit Glucose als Mischgrundlage)

Salz (NaCl)

Spurenmineralien-Vormischung (MnSO₄, ZnO, KJ, FeSO₄, CaCO₃)

2-Amino-4-hydroxybuttersäure (Hydroxyanalogon von Methionin)

4,0	80
1,8	36
0,8	16

0,5	10
0,3	6
0,1	2
0,1	2

Etwa 0,01 Gewichtsprozent Deoxynarasinantibiotikumkomplex, 20-Deoxynarasin oder 20-Deoxy-epi-17-narasin werden in der auf diesem Gebiet üblichen Weise mit diesem Futter vermischt. Mit derartigem Futter gefütterte Hühner, die Wasser ad libitum erhalten, sind gegen Coccidiose geschützt.

Beispiel 7 Verbessertes Rinderfutter

Ein ausgeglichenes hochwertiges Rinderfutter wird aus folgenden Bestandteilen hergestellt:

Bestandteil

feingemahlener Mais 67,8 1

gemahlene Maiskolben 10

dehydratisiertes Alfalfamehl

17 % Protein 5

Mehl aus geschälten, lösungsmittelextrahierten Sojabohnen, 50 % Protein

Zuckerrohrmelasse Harrstoff

Dicalciumphosphat, Futtersorte CaIciumcarbonat

Natriumchlorid

Spurenmineralienvormischung Vitamin A und D^-Vormischung*

Vitamin E-Vormischung** Calciumpropionat

* enthält je 4 54 g: 2 000 000 I. E. Vitamin A; 227 200 I. E. Vitamin D„ uns 385,7 g Sojabohnenfutter mit 1 % ölzusatz.

** Maisdestillationstrockenstoffe mit löslichem Anteil, die 20 000 I. E. d-alpha-Tocopherylacetat je 454 g enthalten.

10	200
5	100
0,6	12
0,5	10,0
0,5	10
0,3	6
0,03	0,6
0,07	1,4
0,05	1,0
0,15	3,0

Etwa 0,004 Gewichtsprozent Deoxynarasinantibiotikumkomplex, 20-Deoxynarasin oder 20-Deoxy-epi-17-narasin werden in üblicher Weise mit diesem Futter vermischt. Das gemischte Futter wird zu einem gekörnten Produkt verpreßt. Bei einer durchschnittlichen täglichen Aufnahme von 16,8 kg dieses Futters je Tier liefert dieses Futter etwa 300 mg des Antibiotikums je Tier und Tag,

Beispiel 8 Verbessertes Schweinefutter

In üblicher Weise wird aus folgenden Bestandteilen eine Vormischung hergestellt:

Bestandteil g/kg

Aktive Verbindung 150,0

Calciumsilicat . 20,0

Calciumcarbonat (Austernschalenmehl) 830,0

Gesamtgewicht 1000 g

Diese Vormischung wird handelsüblichem Schweinefutter in einer zur Erzielung eines Endgehalts von Wirkstoff von 100 g/t zugesetzt.

Claims

Ir f indungsanspr ucii:

1. Verfahren zur Herstellung des antibiotisch wirksamen Deoxynarasinkomplexes aus 20-Deoxynarasin der Formel

C0

I β · · · X

OI β ' · · · O

O β

/O r-\

Γ I

O /

O = β

x λ δ · · »

\ x

O O

208 506,

und 20-Deoxy-epi-17-narasin der Formel

.0

f L vT

ö /

cO O · * ©

O O

oder ihren pharmazeutisch annehmbaren Salzen, dadurch gekennzeichnet , daß ein Stamm von Streptomyces aureofaciens mit praktisch den gleichen biosynthetischen Fähigkeiten wie NRRL 11181 in einem assimilierbare Kohlehydrate, Stickstoff und anorganische Salze liefernde Stoffe enthaltenden Kulturmedium unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung von antibiotischer Aktivität in beträchtlichem Umfang gezüchtet und der Antibiotikumkomplex in Form der Säuren oder der pharmazeutisch annehmbaren Salze gewonnen wird.
2. Verfahren nach Punkt ^i dadurch gekennzeichnet, . daß als Stamm von Streptomyces aureofaciens der als NRRL 11181 bezeichnete Organismus verwendet wird.
3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß der Deoxynarasinantibiotikumkomplex oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon aus dem Kulturmedium isoliert wird.
4. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß 20-Deoxynarasin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon aus dem Deoxynarasinantibiotikurokomplex isoliert wird.
5. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet , daß 20-Deoxy-epi-17-narasin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon aus dem Deoxynarasionantibiotikumkomplex isoliert wird.
6. Verfahren nach einem der Punkte i 1 bis 5, da durch gekennzeichnet, daß 'der Deoxynarasinantibiotikumkomplex, 20-Deoxynarasin oder 20-Deoxyepi-17-narasin in Form eines pharmazeutisch annehmbaren
Salzes gewonnen wird.