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Deoxynarasin-Antibiotika, Verfahren zu ihrer
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Herstellung und ihre Verwendung Die Erfindung betrifft neue Deoxynarasin-Antibiotika,
Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung als antibakterielle Mittel,
insbesondere als Anticoccidiose- und Antischweinedysenteriemittel, sowie ihre Verwendung
zur Er.-höhung der Ausnutzung des Futters bei Wiederkäuern und zur Erhöhung des
Kontraktionsvermögens des Herzmuskels bei Warmer blüter-Säugetieren.
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In der Veterinärmedizin ist man ständig auf der Suche nach neuen verbesserten
Antibiotika. So stellt beispielsweise die Coccidiose weiterhin ein großes Problem
in der industriellen Geflügelzucht dar. Die Coccidiose ist eine Folge der Infektion
durch einen oder mehrere Mikroorganismen der Species Eimeria oder Isospora (vgl.
z. B. die Zusammenfassung von Bund und Farr in "Diseases of Poultrys', 5. Auflage,
Biester and Schwarte, Eds., Iowa State University Press, Ames, Iowa, 1965, S. 1056-1096).
Die wirtschaftlichen Verluste, die durch die Coccidiose hervorgerufen werden, sind
groß, so daß ein Bedarf nach besseren Anticoccidiose-Mitteln besteht.
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Die Förderung des Wachstums bei Wiederkäuern, wie z. B.
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Rindern und Schafen, ist ein weiteres, wirtschaftlich erwünschtes
Ziel in der veterinärmedizinischen Wissenschaft.
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Von besonderem Interesse ist die Wachstumsförderung, die durch Erhöhung
des Grades der Ausnutzung des Futters erzielt wird. Die Mechanismen für die Ausnutzung
der Hauptnährstoffanteile (Kohlenhydrate) im Futter von Wiederkäuern sind bekannt.
Mikroorganismen im Pansen des Wiederkäuers bauen Kohlenhydrate ab unter Bildung
von Monosacchariden und überführen danach diese Monosaccharide in Pyruvat-Vertindungen.
Pyruvate unterliegen einem durch mikrobiologische Prozesse hervorgerufenen Stoffwechsel
unter Bildung von Acetat ten, Butyraten oder Propionaten, die unter dem Sammelbegriff
flüchtige Fettsäuren ( VFA) bekannt sind. Bezüglich einer detaillierteren Diskussion
sei auf Phillipson et al. in "Physiology of Digestion and Metabolism in the Rumb-jant1
(Lang), herausgegeben von der Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England, 1970, 5.
408-4-1O, verwiesen.
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Der relative Wirkungsgrad der VFA-Ausnutzung wird von McCullough in
"Feedstuffs", 19. Juni 1971, S. 19, Eskeland et al. in "J. An. Sci.", 33, 282 (1971),
und Church et al in "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", Band 2, 1971,
S. 622 und 625, diskutiert. Obgleich auch Acetate und Butyrate verwendet bzw. ausgenutzt
werden, werden Propionate mit einem größeren Wirkungsgrad ausgenutzt (verwendet).
Wenn zu wenig Propionat zur Verfügung steht, kann sich in den Tieren eine Ketose
entwickeln. Eine günstige Verbindung stimuliert deshalb die Tiere zur Bildung eines
höheren Anteils an Propionaten aus den Kohlenhydraten, wodurch der Grad der Ausnutzung
der Kohlenhydrate erhöht und das Auftreten der Ketose herabgesetzt werden.
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20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin stellen neue Polyäther-Antibiotika
dar; sie sind dem bekannten Polyäther-Antibiotikum Narasin (antibiotic A-28086 factor
A, US-Patentschriften 4 035 481 und 4 038 384) sehr nahe verwandt Die Struktur,
die in diesen Patentschriften und von Occolowitz et al. in "Biomed. Mass Spectrometry",
3, 272 bis 277 (1976), für Narasin vorgeschlagen wird, wurde kijrzlicb durch H.
Seto et al. in "J. Antibiotics", 30 (6), 530-532 (1977), bestätigt. Es handelt sich
dabei um die folgende Struktur:
Wie Seto et al. berichten, ist Narasin dem Salinomycin (Salinomycin = 4-Demethyl-narasin)
nahe verwandt. Kürzlich haben J. W. Westley et al. in "J. Antibiotics", 30 (7),
610-612
(1977), über die C-17-Epimeren von Deoxy-(0-8)-salinomycin berichtet. Obgleich die
Epimeren von Deoxysalinomycin analog zu den erfindungsgemäßen Deoxynarasin-Epimeren
sind, ist bisher kein chemisches Verfahren bekannt, nach dem die Deoxynarasin-Epimeren
aus den Deoyysalinomycin-Epimeren hergestellt werden können.
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf den Deoxynarasin-Antibiotika-Komplex,
der enthält oder besteht aus mindestens zwei Einzelfaktoren, nämlich 20-Deoxynorasin
und 20-Deoxy-epi-17-narasinO Der Komplex wird gebildet durch Kultivierung eines
Stammes des Mikroorganismus Streptomyces aureofaciens Alggar, NRRL 11181.
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Unter dem hier und auf dem Gebiet der Fermentation verwendete ten
Ausdruck "Antibiotika-Komplex" ist kein chemischer Eomplex, sondern ein Gemisch
aus den gemeinsam gebildeten einzelnen Antibiotika-Faktoren (antibiotischen Faktoren)
zu verstehen. Wie für den Fachmann auf dem Gebiet der Gewinnung von Antibiotika
durch Fermentation bekannt, variiert das Verhältnis der gebildeten Einzel faktoren
in einem Antibiotika-Komplex in Abhängigkeit von den -angewendeten Fermentationsbedingungen.
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Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die Salze, insbesondere die
pharmazeutisch verträglichen Salze von 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin.
Zur Vereinfachung wird bei der nachfolgenden Beschreibung der Erfindung der Ausdruck
"Deoxynarasin-Antibiotikum" verwendet und er bezieht sich auf einen Vertreter, der
ausgewählt wird aus der Gruppe 20--Deoxynarasin, 20-Deoxy-epi-17-narasin, der Salze,
insbesondere der pharmazeutisch verträglichen Salze von
20-Deoxynarasin
und 20-Deoxy-epi-17-narasin und dem -20--Deoxynarasin/20-Deoxy-epi-17-narasin-Antibiotika-Komplex.
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Die erfindungsgemäßen Deoxynarasin-Ant ibiotika hemmen. das Wachstum
von für Tiere und Pflanzen pathogenen Mikroorganismen. Gemäß einem Aspekt dieser
Aktivität stellen die erfindungsgemäßen Deoxynarasin-Antibiotika Anticoccidiose-Mittel
(Mittel gegen Coccidien) dar. Außerdem erhöhen die erfindungsgemäßen Deoxynarasin-Antibiotika
den Grad der AusnUtZ21g des Futters bei Wiederkäuern.
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Der erfindungsgemäße Deoxynarasin-Antibiotika-Komplex umfaßt 20-Deoxynarasin
und 20-Deoxy-epi-17-narasin, die durch Fermentation in Form eines Gemisches gewonnen
werden. 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin werden, wie nachfolgend näher
beschrieben, von dem Deoxynarasin-Komplex abgetrennt und in Form der Einzelverbindungen
isoliert. Der Deoxynarasin-Komplex enthält auch kleinere Faktoren, die bei den nachfolgend
beschriebenen Verfahren entfernt werden. Der Deoxynarasin-Antibiotika-Komplex ist
in den meisten organischen Lösungsmitteln löslich, jedoch in Wasser unlöslich.
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20-Deoxynaraszn 20-Deoxynarasin, einer der erfindungsgemäßen Faktoren,
hat die gleiche absolute Konfiguration wie Narasin. Die Struktur von 20-Deoxynarasin
ergibt sich aus der folgenden Formel I:
20-Deoxy-epi-17-narasin Die Struktur von 20-Deoxy-epi-17-narasin,
dem anderen erfindungsgemäßen Faktor, ergibt sich aus der folgenden Formel II:
Eine der besten Methoden zur Differenzierung von Narasin (A-28086-Faktor
A), 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin ist die Anwendung der 13C-NMR-Spektrometrie
(NMR = kernmagnetische Resonanz). In der folgenden Tabelle 1 sind die 13C-NMR-Spektren
dieser Verbindungen, die jeweils in Form der freien Säure vorlagen, durchgeführt
in Deutelochloroform (Daten in ppm), zusammengefaßt: Tabelle I Narasin 20-Deoxynarasin
20-Deoxy-epi-17-narasin 216.5 216.8 218.0 178.4 177.9 177.6 132.0 125.2 129.2 122.0
121.9 125.8 106.5 105.0 107.0 99.6 99.3 99.4 88.5 88.1 85.6 78.4 78.1 78.2 77.1
76.6 77.7 75.1 75.0 77.0 73.8 73.7 73.3 72.0 72.3 72.6 70.8 - 71.1 71.1 68.5 68.3
69.1 67.6 56.2 57.7 56.1 49.9 49.3 49.9 49.3 48.7 49.3 41.0 38.9 41.1 40.0 36.6
Tabelle
I (Fortsetzung) Narasin 20-Deoxynarasin 20-Deoxy-epi-17-narasin 38.7 38.8 36.4 36.6
36.3 36.2 36.2 35.6 35.7 35.5 32.8 33.9 32.9 31.7 33.7 30.9 31.7 32.8 30.5 30.3
30.5 29.4 29.6 29.3 29.0 29.0 29.0 28.0 28.1 28.2 26.1 25.8 24.7 24.0 23.7 23.3
21.5 21.8 21.8 19.0 18.8 21.1 18.0 17.5 18.4 16.4 16.3 18.2 15.7 15.7 15.8 14.3
14.1 14.3 13.2 13.3 13.7 13.0 13.2 13.5 12.1 12.5 12.5 12.1 12.1 12.1 7.0 7.3 7.7.
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6.3 6.5 6.4
Andere gute Methoden zum Differenzieren
von 20-Deoxynarasin von 20-Deoxy-epi-17-narasin und von den bekannten A-28086-Faktoren
sind z. B. die Papier- und Dünnschichtchromatographie. In der folgenden Tabelle
II sind beispielsweise die Rf-Werte von Narasin (A-28086-Faktor A), A-28086-Faktor
D, 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin in verschiedenen Papierchromatographie-Systemen
unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Nachweisorganismus angegeben.
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Tabelle II Rf-Werte Deoxy-Epideoxy-Lösungsmittelsystem Narasin A-28086D
narasin narasin Wasser:Methanol:Aceton (12:3:1) - eingestellt auf pH 10,5 mit NH4OH
und dann 0,20 0,11 0,08 0,21 herabgesetzt auf pH 7,5 mit H3PO4 Wasser :Methanol
Aceton (12:3:1) - eingestellt auf pH 10,5 mit NH4OH und dann 0,42 0,25 0,21 0,44
herabgesetzt auf pH 7,5 mit HCl 1 % Methylisobutylketon (MIBK), 0,56 0,38 0,33 0,66
0,5 % NH4OH in Wasser Benzol, gesättigt mit 0,51 0,51 0,74 0,55 Wasser Wasser:MIBK:Äthylacetat
0,77 0,61 0,51 0,68
Die Rf-Werte dieser Antibiotika in einem typischen
Dünnschichtchromatographie-System (TLO-System), in dem Silicagel verwendet wird,
sind in der folgenden Tabelle III angegeben.
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Tabelle III Rf-Werte Deoxy- Epideoxy-Lösungsmittel-System Narasin
A-28086D narasin narasin Äthylacetat 0,29 0,35 0,42 0,74 Die Deonarasin-AIltibiotika
(20-Deoxynarasin und 20-Deoxyepi-17-narasin) sind in den verschiedensten organischen
Lösungsmitteln, z. B. in Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid,
Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol, löslich, in nicht-polaren organischen
Lösungsmitteln, wie Hexan, jedoch nur schwach löslich und in Wasser unlöslich. Es
sei jedoch darauf hingewiesen, daß 20-Deoxynarasin in Form der freien Säure in Alkoholen
instabil ist, die es in 20-Deoxy-epi-17-narasin in Form der freien Säure umwandeIn.
So wurden beispielsweise 435,1 mg 20-Deoxynarasinsäure in 40 ml Methanol gelöst
und 4 Stunden lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wurde dann unter
Vakuum zur Trockne eingedampft; der Rückstand wurde in Dioxan wieder aufgelöst und
lyophilisiert, wobei man 417,8 mg 20-Deoxyepi-1 7-narasinsäure erhielt.
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Gemeinsam mit dem Deoxynarasin-Komplex wird auch eine andere Substanz
gebildet, die chromatographisch mit A-28086-1 übereinstimmt, wie in der US-Patentschrift
4 038 384
beschrieben. Obgleich diese Substanz anfänglich gemeinsam
mit den Deoxynarasin-Antibiotika ausfällt, kann sie durch Silicagel-Chromatographie
leicht von diesen abgetrennt werden. Bei der Silicagel-Dünnschichtchromatographie
ist diese Substanz weniger polar als 20-Deoxynarasin oder 20-Deoxyepi-17-narasin,
wenn Äthylacetat als Entwicklungslösungsmittel verwendet wird. Zum Nachweis geeignet
ist ein Vanillin-Sprühreagens (3 °/0 Vanillin in Methanol + 0,5 ml konzentrierte
H2SO4 auf 100 ml Lösung). Nach dem Besprühen mit Vanillin und nach dem Erhitzen
ergibt diese Substanz wie A-28086-1 einen blauen Fleck, während die Deoxynarasin-Antibiotika
hellgelbe Flecken ergeben, die später dunkel werden.
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20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin sind in der Lage, Salze
zu bilden. Die Salze, insbesondere die pharmazeutisch verträglichen Alkalimetall-,
Erdalkalimetall- und Aminsalze von 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin,
sind ebenfalls Teil dieser Erfindung. Unter "pharmazeutisch verträglichen Salzen"
sind Salze zu verstehen, in denen die Toxizität der Verbindung als ganze gegenüber
Warmblüter-Tieren im Verhältnis zu der Nicht-Salzform nicht erhöht ist.
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Zu repräsentativen und geeigneten Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalzen
von 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin gehören die Natrium-, Kalium-, Lithium-,
Cesium-, Rubidium-, Barium-, Calcium- und Magnesiumsalze. Zu geeigneten Aminsalzen
von 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17 narasin gehören die Ammoniumsalze und die
primären, sekundären und tertiären C1-C4-Alkylammonium- und Hydroxy-C2-C4-alkylammoniumsalze.
Zu Beispielen für Aminsalze gehören diejenigen, die bei der Umsetzung von 20-Deoxynarasin
und 20--Deoxy-epi-1 7-narasin mit Ammoniumhydroxid, Methylamin, sec. -Butylamin,
Isopropylamin, Diäthylamin, Diisopropylamin,
Äthanolamin, Triäthylamin,
3-Amino-1-propanol und dergleichen gebildet werden.
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Die Alkalirnetall- und Erdalkalimetall-Kationen-Salze von 20--Deoxynarasin
und 20-Deoxy-epi-17-narasin werden nach Verfahren hergestellt, wie sie üblicherweise
für die Herstellung von kationischen Salzen angewendet werden. So wird beispielsweise
die freie Säureform des Antibiotikums in einem geeigne-ten Lösungsmittel, wie Aceton
oder Dioxaii/Wasser, gelöst und eine die stöchiometrische Menge der gewünschten
anorganischen Base enthaltende Lösung wird dieser Lösung zugesetzt. Das dabei gebildete
Salz kann unter Anwendung von üblichen Verfahren, beispielsweise durch Filtrieren
oder durch Verdampfen des Lösungsmittels, isoliert werden Die mit organischen Aminen
gebildeten Salze können auf ähnliche Weise hergestellt werden. So kann beispielsweise
das gasförmige oder flüssige Amin einer Lösung des antibiotischen Faktors in einer
geeigneten Lösung, wie z. B. Aceton, zugesetzt werden und das Lösungsmittel und
das überschüssige Amin können durch Verdampfen entfernt werden.
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Ein bevorzugtes Verfahren für die Herstellung eines gewünschten Salzes
eines der Deoxynarasin-Antibiotika besteht darin, daß man eine geeignete Vorauswahl
des Isolierungsver fahrens trifft, beispielsweise den pH-Wert der Brühe mit einer
geeigneten Base einstellt oder ein geeignetes kationisches Salz dem Extraktionslösungsmittel
zusetzt.
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Es ist in der Veterinärmedizin allgemein beBannt,daß die Form eines
Antibiotikums nicht wesentlich (signifikant) ist, wenn ein Tier mit dem Antibiotikum
behandelt wird. In den
meisten Fällen verändern die Bedingungen
innerhalb des Tieres das Arzneimittel unter Bildung einer anderen Form als der Form,
in der es verabreicht wurde. Die Salzform, in der es verabreicht werden kann, ist
deshalb unwesentlich für das Behandlungsverfahren. Die Salzform kann jedoch ausgewählt
werden aus Wirtschaftlichkeits-, Zweckmäßigkeits- und Toxizitätsgründen.
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Die erfindungsgemäßen neuen Antibiotika werden gebildet durch Kultivieren
eines Deoxynarasin-bildenden Stammes von Streptomyces aureofaciens unter aeroben
Submers-Bedingungen in einem geeigneten Kuiturmedium, bis eine beträchtliche antibiotische
Aktivität gebildet worden ist. Die Antibiotika werden unter Anwendung verschiedener
Isolierungs- und Reinio gungsverfahren, wie sie üblicherweise auf diesem Gebiet
angewendet werden und allgemein bekannt sind, gewonnen bzw.
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abgetrennt.
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Der für die Bildung (Herstellung) der Deoxynarasin-Antibiotika geeignete
Mikroorganismus wurde erhalten durch durch N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin induzierte
Mutation von Streptorces aureofaciens KRRL 8092. Die taxonomische Basis, aufgrund
deren S. aureofaciens NRRL 8092 als Stamm von Streptomyces aureofaciens Duggar klassifiziert
wurde, ist in der US-Patentschrift 4 038 384 angegeben.
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Die für die Bildung der Deoxynarasin-Antibiotika geeignete Streptomyces
aureofaciens-Kultur wurde hinterlegt und ist Teil der "stock culture collection"
des Northern Regional Research Center, U.S. Dept. of Agriculture, hgricultural Research
Service, Peoria, Illinois1 61604/USA, wo sie für die Öffentlichkeit unter der Nummer
NRRL 11181 verfügbar
ist. Die Hinterlegung in dieser Sammlung erfolgte
am 6. Oktober 1977. Eine weitere Hinterlegung der gleichen Kultur erfolgte am 26.
Oktober 1978 in der "Americo Type Culture Collection"; diese Hinterlegung hat die
Nummer ATCC 31445.
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Die hier durch NRRL 11181 identifizierte Kultur wurde isoliert und
durch Mutation aus einer Kultur von Streptomyces aureofaciens gewonnen, die ursprünglich
aus einer Erdbodenprobe isoliert wurde, die von dem Berge Ararat in der ürkei stammte.
Das ursprüngliche Erdbodenisolat wurde auf Agar-Platten kultiviert und es wurden
Subkulturen hergestellt durch Entnahme von einzelnen Kolonien de:s Mikroorganismsus
von der Oberfläche der Agar-Platte. Eines der einzelnen Isolate, die aus einer Kultur
des ursprünglichen Erdbodenisölats gewonnen wurden, war dann die Kultur, die hier
als NRRL 5758 identifiziert wird.
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Die oben angegebene, in natürlicher Weise ausgewählte Kultur wurde
erneut auf eine Agar-Platte aufgebracht und daraus wurde eine einzelne Kolonne ausgewählt.
Dieses Verfahren der natürlichen Auswahl wurde achtmal wiederholt und für die weitere
Auswahl wurde ein Einzelkolonie-Isolat der neunten Generation verwendet. Das Isolat
der neunten Generation wurde in einem chemisch definierten Agar-Medium mit 1 96
Galactose als einziger Kohlenstoffquelle gezüchtet. Eine Sporensuspension wurde
hergestellt durch Rühren des Agar-Mediums mittels Ultraschall, um die Sporen abzutrennen,
und die Hyphen-Fragmente wurden minimal gehalten durch Filtrieren der Suspension
durch ein Whatman Nr. 1 Filterpapier. Die Sporensuspension wurde in einem komplexen
flüssigen Medium, dessen pH-Wert auf 8,8 eingestellt wurde und das 2 mg/ml N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
enthielt, 72 Stunden
lang bei 300C gezüchtet. Die auf dem Medium
wachsenden Kulturen wurden dann geerntet und mit einer Gewebemahlvorrichtung homogenisiert.
Die homogenisierte Kultur wurde verdünnt und auf Agar-Platten aufgebracht und bei
300C solange inkubiert, bis einzelne Kolonien erkennbar waren. Eine der individuell
ausgewählten Kolonien wurde als Start für eine neue Kultur verwendet, die hier als
NRRL 8092 bezeichnet wird.
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Die mit NRRL 8092 bezeichnete Kultur wurde in einem chemisch definierten
Agar-Medium mit Glucose als einziger Kohlen.stolj' quelle gezüchtet Eine aus Sporen
und Hyphen-Fragmenten bestehende Suspension wurde hergestellt durch Rühren des hL>ar-Mediums
mittels Ultraschall. Die gemischte Sporen- und Hyphen-Suspension wurde in einem
komplexen flüssigen Medium bei einem pH-Wert von 8,8 96 Stunden lang auf einem 3000
Schüttler 2 mg/ml N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin ausge setzt und die Kultur
wurde dann geerntet, homogenisiert und wie in der obigen Stufe beschrieben auf Agar-Platten
auf gebracht. Eine der einzelnen Kolonien, die aus diesen Agar-Platten ausgewählt
wurde , wurde gezüchtet zur Herstellung der Kultur, die hier als NRRL 11181 bezeichnet
wird.
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Es ist für den Fachmann auf diesem Gebiet klar, daß es nsh -der vorliegenden
Erfindung auch möglich ist, weitere Stämme zu erzeugen, die im wesentlichen das
gleiche Biosynthesevermögen wie S. aureofaciens NRRL 11181 (d. h. die Fähigkeit,
20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin zu bilden) haben, indem man S. aureofaciens
NRRL 5758, NRRL 8092 oder NRRL 11181 einer mutagenen Behandlung unterwirft. Obgleich
zur Erzeugung von S. aureofaciens NRRL 11181 N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
verwendet wurde, können zur Indusierung einer ähnlichen Mutagenese auch andere bekannte
Mutagene,
wie ultraviolette Strahlung, Röntgenstrahlung, Hochfrequenzwellen, radioaktive Strahlung
und andere chemische Agentien verwendet werden. Teil der vorliegenden Erfindung
ist deshalb auch das Verfahren zur Gewinnung des Deoxynarasin-Antibiotika-Komplexes,
das darin besteht, daß man einen Mikroorganismus des Genus Streptomyces aureofaciens,
der im wesentlichen das gleiche Biosynthesevermögen wie N 11181 hat, kultiviert.
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Das zum Züchten von Streptomyces aureofaciens NTRRL 11181 verwendete
Kulturmedium kann irgendeines einer Reihe von Medien sein. Zur Erzielung einer wirtschaftlichen
Produktion, einer optimalen Ausbeute und einer leichten Produktisolierung können
jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt sein. So sind beispielsweise bevorzugte
Kohlenhydratquellen bei der großtechnischen Fermentation Tapioka-Dextrin und Saccharose,
obgleich auch Glucose, Maisstärke, Fructose, Mamiose, Maltose, Lactose und dergleichen
verwendet werden können.
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Andere brauchbare Kohlenstoffquellen sind Maisöl, Erdnußöl, SoJabohnenöl
und Fischöl. Eine bevorzugte Stickstoffquelle ist mit einem Enzym hydrolysiertes
Casein, wobei Peptone, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Aminosäuren, wie Glutaminsäure,
und dergleichen ebenfalls geeignet sind, Zu den anorganischen Nährsalzen, die in
die Kulturmedien eingearbeitet werden können, gehören die üblicherweise löslichen
Salze, die Natrium-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlorid-, Carbonat-, Sulfat-,
Nitrat- und ähnliche Ionen liefern.
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Essentielle Spurenelemente, die für das Wachstum und die Entwicklung
des Mikroorganismus erforderlich sind, sollten ebenfalls in dem Kulturmedium enthalten
sein. Diese
Spurenelemente kommen üblicherweise als Verunreinigungen
in anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen vor, die ausreichen, um den Wachstumsanforderungen
des Mikroorganismus zu genügen. Es kann erforderlich sein, geringe Mengen (d. h.
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0,2 ml/l) eines Antischäummittels, wie Polypropylenglykol, den großtechnischen
Fermentationsmedien zuzusetzen, wenn die Schaumbildung zu einem Problem wird. Obgleich
dies nicht wesentlich ist, wird die Antibiotikabildung verbessert durch Zugabe einer
geringen Menge Öl, wie Sojabohnenöl.
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Für die Bildung bzw. Gewinnung von beträchtlichen Mengen an Deoxynarasin-Antibiot
ika ist die aerobe Submers-Fermentation in Tanks (Behältern) bevorzugt. Es können
auch geringere Mengen durch eine Schütt elkolben ~ Kultivierung erhalten werden.
Wegen der Zeitverzögerung bei der Antibiotika-Bildung, die üblicherweise bei der
Inoculierung von großen Taoks mit der Sporenform des Organismus auftritt, ist es
bevorzugt, ein vegetatives Inoculum zu verwenden. Das vegetative Inoculum wird hergestellt
durch Inoculieren eines geringen Volumens des Kulturmediums mit der Sporenform oder
Mycel-Fragmenten des Organismus unter Bildung einer frischen, aktiv wachsenden Kultur
des Organismus. Das vegetati ve Inoculum wird dann in einen größeren Tank (Behälter)
übertragen. Das für das Wachstum (die Züchtung) des vegetativen Inoculums verwendete
Medium kann das gleiche sein wie dasjenige, das für größere Fermentationen verwendet
wird, es können aber auch andere Medien verwendet werden.
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Der Deoxynarasin bildende Organismus kann bei Gemperatuzen zwischen
etwa 20 und etwa 40°C gezüchtet werden. Eine optimale Deoxynarasin-Bildung tritt
bei Temperaturen von etwa 27 bis etwa 300C auf.
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Wie in aeroben Submers-Kultivierungsverfahren üblich, wird sterile
Luft durch das Kulturmedium geleitet. Zur Erzielung eines wirkungsvollen Wachstums
des Organismus liegt das bei der Tankproduiction angewendete Luftvolumen vorzugsweise
oberhalb 0,1 Volumenteilen Luft pro Volumenteil Kulturmedium pro Minute. 1N'ir die
Erzielung einer wirksamen Antibiotika-Produktion liegt das bei der Tankproduktion
angewendete Buftvolumen vorzugsweise oberhalb 0,25 Volumenteilen Luft pro Volumenteil
Kulturmedium pro Minute. Hohe Gehalte an gelöstem Sauerstoff verringern die Antibiotika-Bildung
nicht.
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An die Bi]dung der Antibiotika kann sich während der Fermentation
die Entnahme von Testproben aus der Brühe oder aus Extrakten der Mycel-Feststoffe
anschließen zur Bestimmung der antibiotischen Aktivität gegenüber Organismen, deren
Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika bekannt ist. Ein Versuchsorganismus, der sich
zum Testen der erfindungsgemäßen Antibiotika eignet, ist Bacillus subtilis ATCC
6633. Der Biotest wird zweckmäßig unter Anwendung eines Papierscheibentests auf
Agar-Platten durchgeführt. Ein anderes bequemes Überwachungsverfahren mittels eines
turbidometrischen Tests unter Verwendung eines halbautomatisierten Systems (mikrobiologisches
Autoturb -Assaysystem, Elanco) ist in "J.
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Pharmaceut. Sci.", 60 (5), 764 und 767 (1971), beschrieben.
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Zum Testen der Deoxynarasin-Antibiotika werden die folgenden Testparameter
verwendet: Staphylococcus aureus (H-Heatley) NRRL B-314 in einem Nährbrühenmedium
(pH 7), vier Stunden lang bei 370C inkubiert. Die Testproben und der Standard werden
in Methanol/Wasser (1:1) gelöst. Der Standard, ein A-28086-Faktor A, wird in Konzentrationen
von 1, 2, 3, 4 und 5 g/ml in das AutoturbR-Karrussel eingeführt. Der AnfangspH-Wert
des nicht-inoculierten Kulturmediums variiert mit
dem verwendeten
Medium. Im allgemeinen sollte der pH-Wert innerhalb des Bereiches von 6,0 bis 7,5
liegen. Der ErntepR-Wert am Ende der Fermentation ist in der Regel etwas höher und
liegt innerhalb des Bereiches von 6,5 bis 8,0. Im allgemeinen ist die antibiotische
Aktivität schon am zweiten Tage der Fermentation nachweisbar. Eine maximale Bildung
von antibiotischer Aktivität (Substanz) tritt in der Regel zwischen dem vierten
und dem zehnten Tage auf.
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Nach dieser Bildung (Gewinnung) unter aeroben Submers-Fermentationsbedingungen
können die vorstehend beschriebenen Deoxynarasin-Aritibiotika nach Verfahren aus
dem Rermentstionsmedium gewonnen (abgetrennt) werden, wie sie üblicher weise auf
dem Gebiet der Fermentation angewendet werden. Die während der Fermentation gebildeten
Antibiotika kommen sowohl in der Mycelmasse als auch in der Fermentationsbrülie
vor. Eine maximale Gewinnung (Bildung) der Deoxynarasin-Antibiotika wird erzielt
durch eine Kombination von Verf ahren, die das Filtrieren, Extrahieren und die Adsorptionschromatographie
umfassen. Ein bevorzugtes Lösungsmittel für die Abtrennung der Deoxynarasin-Antibiotika
von der gesamten oder der filtrierten Fermentationsbrühe ist Äthylacetat, andere
üblicherweise verwendete Lösungsmittel sind aber ebenfalls zufriedenstellend.
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Ein besonders vorteilhaftes Verfahren zur Abtrennung der Deoxynarasin-Antibiotika
besteht darin, den pH-Wert der gesamten Fermentationsbrühe auf etwa pH 3,0 herabzusetzen.
Bei diesem pH-Wert werden die Deoxynarasin-Antibiotika bequem zusammen mit der Mtcelmasse
durch Filtrieren abgetrennt.
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Dieses Verfahren ist für die Gewinnung der verwandten Antibiotika,
der A-28086-Faktoren A, B und D und von Salinomycin
in der US-Patentschrift
4 009 262 beschrieben. Ein anderer vorteilhafter Aspekt dieses Verfahrens besteht
darin, daß man ein Bicarbonat, wie z. B. Natriumbicarbonat, in Mengen, die etwa
1 g pro Liter betragen, der gesamten Brühe zusetzt.
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Bei Anwendung dieses Verfahrens werden die Deoxynarasin-Antibiotika
zweckmäßig zusammen mit der Mycelmasse in der Salzform abgetrennt. Methanol ist
ein bevorzugtes Lösungsmittel zur Abtrennung der Antibiotika von der Mycelmasse,
andere niedere Alkohole und Ketone sind aber ebenfalls geeignet.
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Mit Vorteil kann auch eine azeotrope Destillation zur Gewinnung bzw.
Abtrennung der Deoxynarasin-Antibiotika angewendet werden. Bei diesem Verfahren
wird en organisches Lösungsmittel, das mit Wasser ein geeignetes Azeotrop bildet,
der wässrigen Fermentationsbrühe zugesetzt. Diese Lösungsmittel/ Brühe-Mischung
wird einer azeotropen Destillation unterworfen, um mindestens die Hälfte des Wassers
aus der Brühe zu entfernen, wobei eine Wasser/Lösungsmittel-Mischung zurückbleibt,
in der die Deoxynarasin-Antibiotika in dem organischen Lösungsmittel gelöst sind.
Die unlöslichen Nebenprodukte können auf geeignete Weise, beispielsweise durch Filtrieren
oder Zentrifugieren, abgetrennt werden. Die Deoxnarasin-Aiitibiotika können unter
Anwendung bekannter Verfahren, beispielsweise durch Eindampfen des Lösungsmittels,
durch Ausfällen durch Zugabe eines Nicht-Lösungsmittels oder durch Extraktion aus
der organischen Lösung gewonnen (abgetrennt) werden.
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Zu organischen Lösungsmitteln, die mit Wasser geeignete Azeotrope
bilden zur Durchführung eines solchen Gewinnungs-bzw. Abtrennungsverfahrens gehören
beispielsweise
Butylalkohol, Amylalkohol, Hexylalkohol, Benzylalkohol,
Butylacetat, Amylacetat, 1,2-Dichloräthan, 5-Pentanon, 2-Hexanon, Benzol, Cyclohexanon,
Toluol, die Xylole und dergleichen.
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Besonders vorteilhaft ist die Gewinnung bzw. Abtrennung durch azeotrope
Destillation bei großtechnischen Fermentationsverfahren. Das Wasser und das Lösungsmittel,
die über kopf in dem Azeotrop entnommen werden, können nach bekannten Methoden voneinander
getrennt und anschließend für die weitere Verwendung im Kreislauf zurückgeführt
werden. Das auf diese Weise entfernte Wasser ist frei von Verunreinigungen und die
Durchführung eines Abfallbeseitigungsverfahrens ist nicht erforderlich.
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Die weitere Reinigung der DeoxyIlarasin-Antibiotika umfaßt zusätzliche
Extraktions- und Adsorptionsverfahren. Als Adsorptionsmaterialien können mit Vorteil
beispielsweise Silicagel, Kohle, Florisil (Magnesiumsilicat der Firma Floridin Co.,
Tallahassee, Florida/USA) und dergleichen verwendet werden. Alternativ können die
Kulturfeststoffe einschließlich der Bestandteile des Mediums und des Mycels ohne
Extraktion oder Abtrennung als Quelle für den Deoxynarasin Antibiotika-Komplex verwendet
werden, vorzugsweise jedoch nach der Entfernung des Wassers. So kann beispielsweise
das Xulturmedium nach der Bildung der Deoxynarasin-Antibiotika-Aktivität (-Substanz)
getrocknet werden durch Lyophilisieren oder Trommeltrocknen und es kann direkt in
die Futtermittel-Vormischung eingemischt werden.
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Gemäß einem anderen Aspekt kann das Mycel nach der Bildung der Deoxynarasin-Aktivität
In dem Kulturmedium abgetrennt
und getrocknet werden unter Bildung
eines Produktes, das direkt in einer Futtermittel-Vormischung verwendet werden kann.
Wenn das Myzel für diesen Verwendungszweck abgetrennt wird, unterstützt die Zugabe
von Calciumcarbonat (etwa 10 g/l) das Filtrieren und sie ergibt ein verbessertes
getrocknetes Produkt.
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Unter den bisher angewendeten Bedingungen werden 2O-Deoxynarasin und
20-Deozy-epi-17-narasin als Hauptfaktoren von dem vorstehend beschriebenen und mit
NRRL 11181 bezeichneten Stamm von Streptomyces aureofaciens gebildet. Einige kleinere
Faktoren werden ebenfalls von S, aureofaciens NRRS 11181 in Mengen gebildet, die
jedoch für eine Charaliterisierung zu gering sind. Obgleich das Verhältnis der Faktoren
variiert in Abhängigkeit von den angewendeten Fermentations- und Isolierungsbedingungen,
wird im allgemeinen mehr 20-DeoxJr-epi-17-narasin als 20-Deoxynarasin gewonnen (abgetrennt).
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20-Deoxynarasin und 2O-Deoxy-epi-l 7-narasin werden als Einzelverbindungen
voneinander getrennt und isoliert unter Anwendung bekannter Verfahren, beispielsweise
durch Säulenchromatographie, Dünnschichtchromatographie, Gegenstromverteilung und
dergleichen. So wird beispielsweise die Säulenchromatographie über Silicagel angewendet
zur Trennung von 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin durch Eluieren der
Säule mit variierenden Lösungsmittelgemischen. So wird beispielsweise bei Verwendung
von Benzol/Äthylacetat-Lösungsmittelgemischen in einer Silicagel-Säule 20-Deoxy-epi-17-narasin
zuerst eluiert und 20-Deoxynarasin wird später eluiert. Die Dünnschichtchromatographie
mit Silicagel unter Verwendung eines 100 % Äthylacetat-Lösungsmittels ist ein bequemes
Verfahren zur Überwachung des Fortschreitens der
Elution.
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Die erfindungsgemäßen Deoxynarasin-Antibiotika stellen aktiv bakterielle
Mittel dar. Die relative mikrobiologische Aktivität von 20-Deoxy-epi-17-narasin
(freie Säure) ist beispielsweise in der folgenden Tabelle IV angegeben. Es wurde
das konventionelle Scheibendiffusionsverfahren angewendet.
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Tabelle IV Hemmzone (mm) Testorganismus 300 µg/Scheibe 30 µg/Scheibe
Staphylococcus aureus 3055 16,9 13,8 Staphylococcus aureus 3074 19,5 15,4 Staphylococcus.aureus
31302) 19,0 17,2 Streptococcus pyogenes (Gruppe A) 12,0 10,0 Streptococcus sp. (Gruppe
D) 17,0 14,6 Diplococcus pneumoniae 16,0 13,0 % enicillin G resistent 2 Methicillin
resistent Gemäß einem Aspekt hemmen die Deoxynarasin-Antibiotika das Wachstum von
anaeroben Bakterien. Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC), bei denen 20-Deoxy-epi-17-narasin
(freie Säure) verschiedene anaerobe Bakterien hemmt,bestimmt unter Anwendung des
Standard-Agar-Verdünnungs-Tests, sind in der folgenden Tabelle V zusammengefaßt.
Die Endpunkte wurden
nach 24-stündiger Inkubationsperiode abgelesen.
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Tabelle V Anaerobe Bakterien MIC (µg/ml) Actinomyces israelii W855
8 Clostridium perfringens 81 16 Clostridium senticum 1128 16 Eubacterium aerofaciens
1235 16 Peptococcus asaccharolyticus 1302 8 Peptococcus prevoti 1281 4 Peptoste»tococcus
anaerobius 1428 4 Peptostreptococcus intermedius 1264 4 Propionibacterium acnes
79 2 Bacteroides fragilis 111 >128 Die Aktivität gegenüber Mycoplasma ist ein
weiterer nützlicher Aspekt der antimikrobiellen Aktivität der Deoxynarasin-Antibiotika.
Mycoplasma-Mikroorganismen, auch als Pleuropneumonie-artige Organismen (PPLO) bekannt,
sind pathogen für Menschen und verschiedene Tiere. Agentien, die gegenüber PPLO-Organismen
aktiv (wirksam) sind, werden insbesondere in der industriellen Geflügelzucht benötigt.
Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) von 20-Deoxy-epi-17-narasin (freie Säure)
gegenüber beispielhaften Mycoplasma-Organismen, bestimmt durch in vitro-Brühen-Verdünnungs-Untersuchungen,
sind in der folgenden Tabelle VI zusammengefaßt.
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Tabelle VI Organismus MIC (µg/ml) M. gallisepticum 25,0 M. hyorninis
50,0 M. synoviae 50,0 Die Deoxynarasin-Antibiotika stellen auch Antivizenmittel
dar. So ist beispielsweise 20-Deoxy-epi-17-narasin wirksam (aktiv) gegenüber Rhinovirus
vom Typ 3, Vacciniavirus, Herpesvirus und Influenzavirus A, bestimmt unter Anweijdun
von in vitro-Platten-Suppressions-Tests, ähnlich denjenigen, wie sie von Siminoff
in "Applied Microbiology1t, 9 (1), 66 bis 72 (1961), beschrieben worden sind.
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Gemäß einem Aspekt der Erfindung kann deshalb ein Deoxynarasin-Antibiotikum
oral, topisch oder parenteral an Säugetiere verabreicht werden zur Bekämpfung von
Viren. Geeignete Dosiswerte für die Verhütung oder Behandlung von Virenerkrankungen
variieren von etwa 1 bis etwa 5 mg/kg Körpergewicht des Säugetiers in Abhängigkeit
von dem Virus und in Abhängigkeit davon, ob das Arzneimittel prophylaktisch oder
therapeutisch verwendet werden soll. Außerdem können Lösungen, die ein Deoxynarasin-Antibiotikum,
vorzugsweise zusammen mit einem oberflächenaktiven Mittel, enthalten, zur Dekontamination
des in vitro-Habitats, auf dem die Viren, wie z. B. Polio oder Herpes, vorhanden
sind, verwendet werden.
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Lösungen, die etwa 1 bis etwa 15QOjlg/ml eines Deoxynarasin-Antibiotikums
enthalten, sind wirksam zur Bekämpfung von Viren Die akuten Toxizitäten von 20-Deoxy-epi-17-narasin
(freie
Säure) und 20-Deoxynarasin (Na-Salz) bei der intraperitonealen Verabreichung an
Mäuse, ausgedrückt durch die LD50, betragen 201 mg/kg bzw. 5 mg/kg.
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Die Anticoccidiose-Aktivität (Anticoccidien-Aktivität) ist eine wichtige
Eigenschaft der erfindungsgemäßen DeoxynarasIn-Antibiotika. So haben beispielsweise
in vitro-Versuche gezeigt, daß 20-Deoxynarasin (Na-Salz) und 20-Deoxy-epi-17-narasin
(freie Säure) aktiv (wirksam) gegenüber Eimeria tenella sind, dem Protozoenorganismus,
der am häufigsten mit der Coccidiose assoziiert ist, in Konzentrationen von nur
0,2 ppm.
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Ein Fütterungsversuch bei jungen Hühnchen hat bestätigt, daß die Deoxynarasin-Antibiotika
in vivo eine Antioccidiose-Aktivität aufweisen. In diesem Versuch verhütete 20-Deoxynarasin
(Na-Salz), verabreicht in einer Menge von 100 ppm in dem Futter für Hühner, die
mit Simeria tenella verseucht waren, die Mortalität, verbesserte ihre Gewichtszunahme
und setzte die Anzahl der Verletzungen der Hühner herab. Die Ergebnisse dieses Versuchs
sind in der folgenden Tabelle VII zusammengefaßt.
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Tabelle VII 1 Mortalität Gewichts- Bewertung der Behandlung (%) zunahme(g)
Verletzungen2) infizierte Eontrolltiere 37,5 114 4,00 20-Deoxynarasin (100 ppm)
0 185 0,13
bei Käfige mit jeweils vier Hühnern pro Behandlung 2)
maximal mögliche Bewertung = 4,00.
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Zur Verhütung oder Behandlung von Coccidiose bei Geflügel wird eine
gegen Coccidiose wirksame Menge Deoxynarasin-Antsbiotikum an Vögel verabreicht,
vorzugsweise täglich oral, Das Deoxynarasin-Antibiotikum kann auf vielen verschiedenen
Wegen zugeführt werden, am zweckmäßigsten wird es jedoch zusammen mit einem physiologisch
verträglichen Träger zugeführt, vorzugsweise in dem von den Vögeln aufgenommenen
Unter.
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Obgleich die verschiedensten Faktoren bei der Bestimmung einer geeigneten
Konzentration des Deoxynarasin-Antibiotikums berücksichtigt werden müssen, liegen
die Verabreichungsmengen im allgemeinen innerhalb des Bereiches von 0,003 bis 0,03
Gew.%, bezogen auf das nicht mit einem Arz neimittel versetzte Futter, vorzugsweise
innerhalb des Bcreiches von 0,004 bis 0,02 Gew.%.
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Die Erfindung betrifft auch gegen Coccidiose wirksame Futtermittel
bzw. Futterzusammensetzungen für Geflügel, enthaltend oder bestehend aus dem Geflügelfutter
und etwa 35 bis etwa 180 g eines Deoxynarasin-Antibiotikums pro Tonne.
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Die Fähigkeit, den Ausnutzungswirkungsgrad des Futters bei Tieren
zu verbessern, ist eine weitere wichtige Eigenschaft der erfindungsgemäßen Deoxynarasin-Antibiotika.
So verbessern beispielsweise Deoxynarasin-Antibiotika den Futter-Ausnutzungswirkungsgrad
bei Wiederkäuern mit einer gut entwikkelten Pansenfunktion.
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Wie bereits erörtert, wird der Wirkungsgrad der Eohlenhydrat-Ausnutzung
bei Wiederkäuern erhöht durch Behandlungen, welche die Pansenflora des Tieres stimulieren
zur Bildung von Propionatverbindungen anstatt von Acetat- oder Butyratverbindungen.
Der Wirkungsgrad der Futterausnutzung kann überwacht werden durch Beobachtung der
Bildung und Konzentration von Propionatverbindungen in der Pansenflüssig keit unter
Anwendung von Verfahren, wie sie beispielsweise in der US-Patentschrift 4 038 384
beschrieben sind.
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Die Ergebnisse von in vitro-2ests mit 20-Deoxynarasin (Na-Salz) und
20-Deoxy-epi-17-narasin (freie Säure), die das Verhältnis zwischen den Konzentrationen
von flüchtigen Stoffen zu Fettsäure (VFA) in den behandelten Kolben und den Konzentrationen
in Kontrollkolben zeigen, sind in der folgenden Tabelle VIII angegeben.
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Tabelle VIII Verhältnis der Konzentrationen in behandelten Kolben
zu denjenigen in Kontrollkolben Dosis Acetat Propionat Butyrat Gesamt-Verbindung
(µg/ml) (mol %) (mol %) (mol %) VFA 20-Deoxy-epi-17-narasin 10 0,9093 1,2665* 0,6560
1,0325 5 0,9237 1,1856* 0,8201 1,0487 " 2 0,9581 1,0858 0,9414 1,0717 20-Deoxynarasin
1 0,8727 1,4597* 0,3942 1,2096 " 0,3 0,9084 1,3799* 0,4582 1,1829 Il 0,1 0,9504
1,2148* 0,6870 1 1,1892
* statistisch signifikant (P< 0,01)
nach dem Doppel-Ansatz-lSD-Test ( R. G. D. Steel und J. H. freie in "Principles
and Procedures of Statistics", McGraw-Hill, New Kork, N.X./USA, 1960, S. 106) Die
erfindungsgemäßen Deoxynarasin-Antibiotika sind in der Regel wirksam in bezug auf
die Erhöhung der Bildung von Propionaten und sie erhöhen dadurch den Wirkungsgrad
der Futterausnutzung, wenn sie oral in Dosen von etwa 0,05 bis etwa 5,0 mg/kg/Tag
an Wiederkäuer verabreicht werden. Die vorteilhaftesten Ergebnisse werden in Dosen
von etwa 0,1 bis etwa 2,5 mg/kg/Tag erzielt. Eine bevorzugte Methode der Verabreichung
eines erfindungsgemäßen Antibiotikums besteht darin, es mit dem Tierfutter zu mischen;
es kann jedoch auch auf andere Weise verabreicht werden, beispielsweise in Form
von Tabletten, Veterinärpräparaten, Kugeln oder Kapseln.
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Die Formulierung dieser verschiedenen Dosierungsformen kann unter
Anwendung von Verfahren erfolgen, wie sie in der Veterinärmedizin allgemein bekannt
sind. Jede einzelne Dosierungseinheit sollte eine Menge einer erfindungsgemäßen
Verbindung enthalten, die in direkter Beziehung steht zu der geeigneten täglichen
Dosis für das zu behandelnde Tier.
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Die Erfindung betrifft ferner Futterzusammensetzungen (Futtermittel),
die zum Mästen von Wiederkäuern, wie Rindern und Schafen, geeignet sind. Diese Futtermittel
(Butterzusammehsetzungen) enthalten Viehfutter und 1 bis 30 g eines Deoxynarasin-Antibiotikums
pro Tonne.
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Die Schweinedysenterie ist eine übliche Erkrankung in den USA und
anderen ländern, die jährlich weltweit große
Verluste an den Beständen
von Schweinezüchtern verursacht.
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In der US-Patentschrift 3 947 586 ist angegeben, daß Polyäther-Antibiotika
brauchbar sind für die Verhütung und Behandlung der Schweinedysenterie. Da die erfindungsgemäßen
Deoxynarasin-Antibiotika neue Vertreter der Klasse der Polyäther-Antibiotika darstellen,
sollten sie auch wirksam sein in bezug auf die Verhütung und Behandlung der Schweinedysenterie.
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Er die Verhütung und Behandlung (Bekämpfung) der Dysenterie bei Schweinen
wird vorzugsweise eine wirksame Menge eines Deoxynarasin-Antibiotikums in die Futterration
eingearbeitet. Die erfindungsgemäßen Deoxynarasin-Antibiotika sollten in der Regel
wirksam sein in bezug auf die Verhütung oder Bekämpfung der Schweinedysenterie,
wenn sie in Dosen von etwa 35 bis etwa 150 g der aktiven Verbindung pro Tonne oral
an Schweine verabreicht werden. Eine besonders bevorzugte Dosis (Menge) sollte etwa
100 g aktive Verbindung pro Tonne betragen. Obgleich die bevorzugte Methode der
Verabreichung darin besteht, sie mit dem Tierfutter zu mischen, kann sie auch auf
andere Weise verabreicht werden, beispielsweise in Tabletten, Veterinärpräparaten,
Kugeln oder Kapseln. Jede einzelne Dosierungseinheit sollte eine solche Menge eines
erfindungsgemäßen Antibiotikums enthalten, die in direkter Beziehung steht zu der
geeigneten täglichen Dosis für das zu behandelnde Tier.
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Die Erfindung betrifft ferner Futtermittel bzw. Futterzusammensetzungen
für Schweine, die enthalten oder bestehen aus dem Schweinefutter und der wirksamen
Menge eines Dxynarasin-Antibiotikums. Wie bereits erläutert, ist eine wirksame Menge
in der Regel eine solche innerhalb des Bereiches
von etwa 35 bis
etwa 150 g eines Deoxynarasin-Antibiotikums pro Tonne Futter.
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Die erfindungsgemäßen Deoxynarasin-Antibiotika stellen Antivirenmittel
dar und sie sind auch aktiv (wirksam) gegenüber anaerobenBakterien, wie Clostridium
perfringens. Die Deoxynarasin-Antibiotika sind deshalb günstig für die Behandlung
oder Verhütung der Enteritis bei Hühnern, Schweinen, Rindern und Schafen und für
die Behandlung der Enterotoxamie bei Wiederkäuern.
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Bestimmte Deoxynarasin-Verbindungen (20-Deoxynarasin und seine Salze)
weisen Ionenbindungs- und Ionentransporteigenschaften auf und stellen daher Ionophore
(lonenträger) dar (vgl. B. C. Pressman,"Alkali Metal Chelators - The Ionophores",
in "Inorganic Biochemistry", Band 1, G. L. Eichhorn, Elsevier, 1973). Diese Verbindungen
können verwendet werden, wenn die selektive Entfernung eines speziellen Kations
erwünscht ist. Zu Beispielen für diese Verwendungszwecke gehören die Entfernung
und Rückgewinnung -von Silberionen aus photographischen Lösungen, die Entfernung
von toxischen Kationen aus Industrieabwasserströmen, bevor diese Ströme in die Umwelt
abgelassen werden, und die Entsalzung von Meerwasser. Eine Deoxynarasin-Verbindung
kann auch als eine Komponente einer ionenspezifischen Elektrode verwendet werden
(vgl. die US-Patentschrift 3 753 887). Diese Verbindungen verändern die Kationenpermeabilität
sowohl von natürlichen als auch von künstlichen Membranen. Eine Deoxynarasin-Verbindung
kann deshalb als eine Komponente in einer Membran für den selektiven Transport von
Kationen gegen einen Konzentrationsgradienten verwendet werden. Eine potentielle
Anwendung dieser Eigenschaft ist die
Rückgewinnung von Schwermetallen
und Edelmetallen auf kommerzieller Basis (vgl. E. L. Cussler, D. F. Evans und Sister
M. A. Matesick in "Science", 172, 377 (1971)).
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Gemäß einem anderen Aspekt sind 20-Deoxynarasin und seine Salze aktiv
(wirksam) als Inhibitor des Enzyms ATP-ase. ATP-ase, ein alkalimetallempfindliches
Enzym, das in Zellenmembranen zu finden ist, ist an der für den aktiven Transport
erforderlichen Energie beteiligt. Der Ausdruck "aktiver Transport" bezieht sich
auf die Energie. benötigenden Reihen von Arbeitsgängen, wodurch intracelluläre und
extracellulare Flüssigkeiten (Fluids) ihre Zusammensetzungen beibehalten.
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Inhibitoren der AEP-ase setzen die für den aktiven Transport erforderliche
Energie herab. In vitro-Tests haben gezeigt, daß 20-Deoxynarasin (Na-Salz) den Kationentransport
von ATP-ase in Leber-Mitochondrien in einer halben Wirkungskonzentration von 0,065
µg/ml hemmen.
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20-Deoxynarasin und seine Salze stellen auch potentielle cardiotonische
Mittel dar. Tests, in denen isolierte Meerschweinchen-Atria verwendet wurden, haben
gezeigt, daß beispielsweise 20-Deoxynarasin das Herzkontraktionsvermögen erhöht.
Die Ansprechempfindlichkeit bei diesem Test ist ausgedrückt als Prozentsatz der
maximalen Kontraktionsspannung, die durch eine Erregungsdosis von Norepinephrin
(10-4 M) hervorgerufen werden konnte. 20-Deoxynarasin (Na-Salz) ergab bei einer
Molkonzentration von 10 5 eine mittlere Zunahme (+ Standardabweichung) der Kontraktionsspannung
von 43,8 + 1,4 % (n = 4). Bezüglich einer näheren Beschreibung dieses Tests vgl.
die US-Patentschrift 3 985 893.
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Die vorliegende Erfindung umfaßt auch das Verfahren zur
Verbesserung
des Kontraktionsvermögens des Herzmuskels bei Warmblüter-Säugetieren, das darin
besteht, daß man eine wirksame nicht-toxische Dosis von 20-Deoxynarasin oder eines
pharmazeutisch verträglichen Salzes davon verabreicht. Eine wirksame nicht-toxische
Dosis ist eine Dosis innerhalb des Bereiches von etwa 30 bis etwa 500 P g/kg Körpergewicht.
Eine bevorzugte Dosis liegt innerhalb des Bereiches von etwa 30 bis etwa 100j£g/kg
Körpergewicht. Bei diesem Verfahren wird das Antibiotikum parenteral, beispielsweise
durch intravenöse Infusion, verabreicht. Eine geeignete Methode der Verabreichung
ist die Tropfenmethode, bei der das Antibiotikum in einer Standard-i. v.-Lösung,
wie z. B. einer Dextroselöslmg, verabreicht wird.
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20-Deoxynarasin wird vorzugsweise in Dosen unterhalb etw 100/ag/kg
verabreicht, bis die gewünschte Erhöhung des Kontraktionsvermögens festgestellt
wird. Danach kann die verabreichte 20-Deoxynarasin-Menge reguliert werden durch
die In; fusionsgeschwindigkeit bzw. -rate, die erforderlich ist, urn die gewünschte
Ansprechempfindlichkeit aufrechtzuerhalten.
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Wie bei der klinischen Verabreichung von anderen ionotropen Mitteln
kann die verabreichte Dosis von 20-Deoxynarasin in einem gegebenen klinischen Falle
in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren, wie z. B. der individuellen Verträglichkeit
von 20-Deoxynarasin, der Art der Herz-Störung, beispielsweise dem Grad der Schädigung
des Herzmuskels, und dem Alter und dem generellen physischen Zustand des Patienten
variieren.
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Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß man das positiv
ionotrope Mittel 20-Deoxynarasin in den verschiedensten klinischen Situationen verwenden
kann, die allgemein
als cardiogener Schock bezeichnet werden. Diese
Zustände umfassen beispielsweise den Myocardinfarkt, das Kongestions Herzversagen
und den nachoperativen cardiogenen Schock.
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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert,
ohne jedoch darauf beschränlct zu sein.
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Beispiel 1 (A) Schüttelkolben-Fermentation Es wurde eine Kultur von
Streptomyces aureofaciens NRRL 11181 hergestellt und auf einem Schrägagar mit der
nachfolgend angegebenen Zusammensetzung gehalten: Komponente Menge K2HPO4 2 g MgSO4.
7H20 0,25 g NE4N°3 2 g CaC03 2,5 g FeSO4. 7H20 0,001 g MonCl2.7H2O 0,001 g ZnSO4.7H2O
0,001 g Glucose 10 g Agar 20 g entionisiertes Wasser ad 1 1 pH-Wert (nicht eingestellt)
7,7
Der Schrägagar wurde mit Streptomyces aureofaciens NRRL 11181
inokuliert und der inokulierte Schrägagar wurde bis zu 7 Tage lang bei 30°C inkubiert.
Die gereifte Schrägagarkultur wurde mit sterilem Rinderserum bedeckt und mit einer
sterilen Öse angekratzt, um die Sporen zu lockern. Die dabei erhaltene Rinderserumsuspension
von Sporen und Mycel-Fragmenten wurde zu maximal 6 Pellets lyophilisiert. Ein auf
diese Weise hergestelltes lyophilisiertes Pellet wurde zum Inokulieren von 50 ml
eines vegetativen Mediums mit der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung- verwendet:
Komponente Menge Glucose 20 g Sojabohnenmehl 15 g Maisquellwasser 10 g CaCO3 2g
Leitungswasser ad 1 1 pH-Wert eingestellt auf 6,5 durch Zugabe von 5 n NaOH Das
inokulierte vegetative Medium wurde in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben etwa 24 bis
etwa 48 Stunden lang auf einem Schüttler, der sich über einen Bogen von 5,1 cm (2
inch) im Durchmesser mit 250 UpM drehte, bei 30°C inkubiert. Das vorstehend beschriebene
inlcubierte vegetative Medium (50 ml) wurde zum Inokulieren von 250 ml eines deiinachfolgend
angegebenen Fermentationsmedien verwendet:
Medium I Komponente
Menge Tapioca-Dextrin* 60 g Enzym-hydrolysiertes Casein** 6 g enzymatisches Hydrolysat
von Casein*** 2 g CaCO3 2 g MgSO4.7H2O 0,5 g Endmelasse 15 g gereinigtes Soäabohnenöl
5,0 ml/l Leitungswasser ad 1 1 pH-Wert (nicht eingestellt) 6,6 * Stadex 11 der Firma
A. E. Staley, Decatur, Illinois/ USA ** Amber EHC der Firma Amber Laboratories,
Juneau, Wisc./USA N-Z-Amine A der Firma Sheffield Chemical Co., Norwich, New York/USA
Medium II Komponente Menge Tapioca-Dextrin* 30 g Glucose 15 g Enzym-hydrolysiertes
Casein ** 3 g
enzymatisches Hydrolysat von Casein*** 1 g Hefeextrakt
2,5 g CaCO3 2 g MgSO4.7H2O 1 g Endmelasse @ 15 g gereinigtes Sojabohnenöl 5,0 ml/l
Leitungswasser ad 1 1 pH-Wert (nicht eingestellt) 6,4 * Stadex 11 der Firma A. E.
Staley, Decatur, Illinois/USA ** Amber EHC der Firma Amber Laboratories, Juneau,
Wisc./USA *** N-Z kmine A der Firma Sheffield Chemical Co., Norwich, New York/USA
Medium III Komponente Menge Sojabohnenmehl 25 g Glucose 20 g CaC03 2,0 g Na2SO4.1OH2O
1,0 g gereinigtes Sojabohnenöl 20 ml Methyloleat 20 ml FeSO4.7H2O 0,6 g
MnCl2a4E20
0,3 g Ascorbinsäure 0,018 g entionisiertes Wasser ad 1 1 pH-Wert (nicht eingestellt)
6,5 Das Fermentationsmedium wurde bis zu 10 Tage lang bei 300C auf einem sich mit
250 UpM über einen Bogen von 5,1 cm (2 inch) drehenden Schüttler inkubiert.
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(B) Tank-Fermentation Die Tank-Fermentation wurde durchgeführt unter
Verwendung von vegetativen und Fermentationsmedien, wie sie in dem Abschnitt A für
die Schüttelkolben-Fermentation beschrieben worden sind. Für die Tank-Fermentation
wurden 10 ml des v-egetativen Mediums zum Inokulieren von 400 ml eines vegetativen
Mediums der zweiten Stufe in einem 2-l-Erlenmeyer-Kolben verwendet. Nach 24-stündiger
Inkubation bei 3000 wurden 800 ml des vegetativen Mediums der zweiten Stufe zum
Inokulieren von 100 1 Fermentationsmedium in einem 165-1-Fermentationstank verwendet.
Der pH-Wert des Mediums nach 45-minütiger Sterilisierung bei 12100 betrug etwa 6,8
+ 0,1. Man ließ die Fermentation 10 Tage lang bei 30 + 100 ablaufen. Der Tank wurde
mit steriler Luft in einer Geschwindigkeit von 0,5 Volumenteilen Luft pro Volumenteil
Kulturmedium pro Minute belüftet, wobei mit konventionellen Rührern mit 300 UpM
gerührt wurde.
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Beispiel 2 Abtrennung des Deoxynarasin-Komplexes Der pH-Wert der gesamten
Fermentationsbrühe (4 1), die nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren unter
Verwendung des Mediums II erhalten worden war, wurde durch Zugabe von konzentrierter
HCl auf pH 3,0 gesenkt, -wobei 1 Stunde lang gerührt wurde. Die dabei erhaltene
Lösung wurde mit einem Filterhilfsmittel (125 g Hyflo Super-Cel, eine Diatomeenerde
der Firma Johns-Manville Corp.) filtriert. Der abgetrennte Mycel-Kuchen wurde chargenweise
unter Verwendung eines Mischers mit insgesamt 2 1 Methanol, das pro Liter 50 g NaH003
enthielt, extrahiert. Das Methanolfiltrat wurde unter Vakuum bis auf ein Volumen
von etwa 450 ml eingedampft, der pH-Wert dieser Lösung wurde durch Zugabe von konzentrierter
HCl auf pH 7,5 eingestellt. Die dabei erhaltene Lösung wurde zweimal mit 500 ml
CHCl3 extrahiert. Die CHCl3-Extrakte wurden miteinander vereinigt, über Na2S04 getrocknet
und filtriert.
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Das Filtrat wurde unter Vakuum eingedampft, wobei man 2,0 g des rohen
Deoxynarasin-Komplexes erhielt.
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Beispiel 3 Isolierung von Deoxynarasin und epi-Deoxynarasin 2 g des
wie in Beispiel 2 beschrieben erhaltenen rohen Deoxynarasin-Komplexes wurden in
einer minimalen Menge Benzol gelöst und auf eine 1,5 cm x 22 cm große Säule mit
Silicagel (Merck 7729) aufgegeben. Die isolierten Fraktionen, die verwendeten Lösungsmittel
und die erhaltenen Mengen sind in
der folgenden Tabelle angegeben:
Lösungs- Ausbeute Fraktion Volumen mittel Verhältnis (mg)* 1 3,0 1 Benzol 100 %
24 2 2,0 1 Benzol:Äthyl- 9:1 20 acetat 3 600 ml " 4:1 85 4 300 ml " " 5 5 300 ml
1 " 7 6 900 ml " " 18 7 2,0 l " " 22 8 300 ml " " " 7 9 450 ml " " 22 10 450 ml
" " 9 11 1,2 l " " 7 12 1,2 l " " 5 13 1,0 l " " 12 14 1,0 1 " 3:1 14 15 1,5 l "
" 28 16 1,5 l " " 100 17 450 ml " " 26 18 900 ml " " 70 19 1,0 l " " 54 20 300 ml
Äthylacetat 100 % 12 21 150 ml " 180
Lösun 5- Ausbeute Fraktion
Volumen mittel Verhältnis (mg)* 22 150 ml Äthylacetat 100 % 125 23 450 ml " 1I 170
24 300 ml Methanol I1 40 25 450 ml " I1 1100 *erhalten nach dem Trocknen über Na2SO4,
dem Filtrieren und Eindampfen des Filtrats bis zur Trockne unter Vakuum Die Fraktionen
wurden durch TLC unter Verwendung eines Äthylacetat-Lösungsmittelsystems überwacht.
Die Fraktioneii 16-17 (126 mg) enthielten 20-Deoxy-epi-17-narasin. Die Fraktionen
18-23 enthielten ein Gemisch aus 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-1 7-narasin.
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Ein Gemisch von 20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin, das wie
oben für die Fraktionen 18 bis 23 angegeben erhalten worden war, wurde durch präparative
TLC unter Verwendung eines Äthylacetat-Lösungsmittelsystems chromatographiert.
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Das Gemisch (105 mg auf einer Platte und 130 mg auf einer anderen
Platte) wurde in einer geringen Menge CH2Cl2 gelöst und auf eine präparative Silicagel-Platte
(Merck) aufgebracht. Nachdem die Platte sich entwickeln lassen geworden war, wurden
die beiden getrennten Materialien, in ultraviolettem Licht betrachtet. Jede der
die beiden Materialien repräsentierenden Flächen wurde von der Platte entfernt und
mit CH2C12:CH30E (4:1) extrahiert. In diesem System war Deoxynarasin die sich langsamer
bewegende Komponente unter den beiden Komponenten. Aus der 105 mg Material enthaltenden
Platte
wurden 7,5 mg 20-Deoxy-epi-17-narasin und 27 mg Deoxynarasin gewonnen. Von der 130
mg des Gemisches enthaltenden Platte wurden 4,0 mg 20-Deoxy-epi-17-narasin und 56
mg 20-Deoxynarasin gewonnen.
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Beispiel 4 Andere Isolierung von 20-Deoyynarasin 95 1 der gesamten
Fermentationsbrühe wurden durch Zugabe von HOl auf einen pH-Wert von etwa 3 eingestellt
und dann 1 Stunde lang gerührt. Es wurde ein Filterhilfsmittel (Eyflo Supercel,
3 %) zugegeben und die Brühe wurde filtriert. Der abgetrennte Mycel-Kuchen wurde
zweimal mit etwa 45 1 Aceton, das pro Liter 50 g NaHC03 enthielt, extrahiert. Die
Acetonextrakte wurden miteinander vereinigt und unter Vakuum eingeengt, wobei man
etwa 10 1 einer wässrigen Lösung erhielt.
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Der pH-Wert dieser Lösung wurde durch Zugabe von 5 n HCl auf 8,0 eingestellt
und die dabei erhaltene Lösung wurde dreimal mit 1/2 Volumenteilen CH2C12 extrahiert.
Die CH2Cl2-Extrakte wurden miteinander vereinigt und unter Vakuum eingedampft, wobei
man einen öligen Rückstand erhielt. Dieser Rückstand wurde in 500 ml der oberen
Phase des Lösungsmittelsystems Hexan:Methanol:Wasser (10:7:1) aufgenommen. Die obere
Phase wurde sechsmal mit 300-ml-Portionen der unteren Phase ex*rahiert. Diese Extrakte
wurden miteinander vereinigt und unter Vakuum eingeengt, wobei man einen Rückstand
erhielt. Dieser Rückstand wurde in Dioxan gelöst, die Dioxanlösung wurde lyophilisiert,
wobei man 19,4 g Deoxynarasin-Komplex erhielt.
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Mehrere Proben, die auf die gleiche Weise erhalten worden waren, wurden
miteinander vereinigt (40 g), in Toluol gelöst und in einem Flüssigchromatographen
auf eine Silicagelsäule aufgegeben (Waterst Associates Prep. LC/System 500). Die
Säule wurde mit einem Toluol:Äthylacetat(9:1)-Lädungsmittelsystem bei einer Durchflußrate
von 250 ml/Minute eluiert, die gesammelten Fraktionen hatten ein Volumen von 250
ml.
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Der Fraktionengehalt wurde durch TLC überwacht. Die Fraktionen 37
bis 52 wurden miteinander vereinigt und unter Vakuum eingeengt, wobei man einen
Rückstand erhielt, der in Dioxan wieder aufgelöst und lyphilisiert wurde unter Bildung
von 7,8 g eines gereinigten Materials, das reich an 20-Deoxynarasin war. Dieses
Material wurde erneut unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Waters' Prep.
LC/System 500 chromatographiert. Nach dem Eluieren von 50 Fraktionen mit dem Toluol:Äthylacetat(9
:1 )-Lösungsmittelsystem wurde das Eluierungslösungsmittel geändert, so daß es zu
100 % aus Athylacetat bestand. Die Fraktionen 51 bis 53 wurden miteinander vereinigt
und unter Vakuum eingedampft, wobei man einen Rückstand erhielt, der in Dioxan gelöst
und lyphilisiert wurde unter Bildung von 1,12 g 20-Deoxynarasin in Form seines Natriumsalzes.
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Beispiel 5 Herstellung von 20-Deoswslarasin in Form der freien Säure
200 mg 20-Deoxynarasin-Natriumsalz wurden in 10 ml Äthylacetat gelöst. Diese Lösung
wurde mit 10 ml 0,1 n HCl und dann zweimal mit 5 ml Wasser gewaschen. Die dabei
erhaltene organische Schicht wurde zur Trockne eingedampft, wobei man
einen
Rückstand erhielt, der in Dioxan wieder aufgelöst und lyophilisiert wurde unter
Bildung von 139,6 mg 20-Deoxynarasin in Form einer freien Säure als weißer Fest
stoff.
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Beispiel 6 Hühnerration für die Coccidiose-Kontrolle Ein ausgewogenes
energiereiches Futter (Ration), das zum Füttern von Hühnern zur Erzielung einer
schnellen. Gewichtszunahme geeignet war, wurde nach dem folgenden Rezept hergestellt:
Komponente ~~~~~ kg (lbs) gemahlener gelber Mais 50 454 (1000) Sojabohnenmehl, mit
Lösungsmittel extrahiert, von Hülsen befreit, fein gemahlen, 50 % Protein 30,9 280,6
(618) Tierfett (Rindertal.g) 6,5 59,0 (130) getrocknetes Fischmehl mit löslichen
Bestandteilen (60 % Protein) 5,0 45,4 (100) lösliche Destillationsbestandteile aus
Mais 4,0 36,3 (80) Dicalciumphosphat, Futterqualität 1,8 16,3 (36) Calciumcarbonat
0,8 7,3 (16) Vitamin-Vormischung (Vitamine A, D, E, K und B12, Cholin, Niacin, Pantothensäure,
Riboflavin, Biotin, mit Glucosefüllmittel) 0,5 4,54 (10) Salz (NaCl) 0,3 2,72 (6)
Komponente
% kg (lbs) mineralische Spurenelemente-Vormischung 0,1 0,91 (2) (MnSO4, ZnO, KJ,
FeSO4, CaCO3) 2-Amino-4-hydroxybuttersäure (Hydroxy-Analoges von Methionin) 0,1
0,91 (2) Der Deoxynarasin-Antibiotika-Komplex, 20-Deoxynarasin oder 20-Deoxy-epi-17-narasin
(etwa 0,01 Gew.%) wurde unter Anwendung von üblichen Futtermischmethoden mit diesem
Futter (Ration) gemischt. Die mit einem solchen Futter gefütterten Hühner mit Wasser
in beliebiger Menge waren gegen die Einwirkung der Coccidiose geschützt.
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Beispiel 7 Verbessertes Rinderfutter Wie nachfolgend angegeben wurde
ein ausgewogenes hochkörniges Rinderfutter hergestellt: Bestandteil k kg (lbs) fein
gemehlener Mais 67,8 615,6 (1356) gemahlene Maiskolben 10 90,8 (200) dehydratisiertes
Alfalfa-Mehl, 17 % Protein 5 45,4 (100) von Hülsen befreites Sojabonenmehl, mit
Lösungsmittel extrahiert, 50 % Protein 10 90,8 (200) Zuckerrohr-Melasse 5 45,4 (100)
Bestandteil
% kg (lbs) Harnstoff 0,6 5,5 (12,0) Dicalciumphosphat, Futterqualität 0,5 4,54 (10,0)
Calciumcarbonat 0,5 4,54 (10,0) Natriumchlorid 0,3 2,72 (6,0) mineralische Spurenelement-Vormischung
0,03 0,27 (0,6) Vitamin A und D2-Vormischung* 0,07 0,64 (1,4) Vitamin E-Vormischung**
0,05 0,45 (1,0) Calciumpropionat 0,15 1,36 (3,°) * enthaltend pro 0,454 kg (lbs)
2.000.000 1. U. Vitamin A, 227.200 I. U. Vitamin D2 und 385,7 g Sojabohnenfutter
mit 1 % zugesetztem Öl **durch Mais-Destillation getrocknete Körner mit löslichen
Bestandteilen, enthaltend 20.000 1. U. d-alpha-Tocopherylacetat pro 0,454 kg (lbs).
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Der Deoxynarasin-Antibiotika-Komplex, 20-Deoxynarasin oder 20-Deoxy-epi-17-narasin
(etwa 0,004 Gew.%) wurde unter Anwendung von üblichen Methoden mit diesem Futter
(dieser Ration) gemischt. Das gemischte Futter wurde zu Pellets gepreßt. Bei einer
durchschnittlichen täglichen Fütterungsmenge von 6,8 kg (15 lbs) Butter pro Tier
ergab dieses Futter etwa 300 mg Antibiotikum pro Tier pro Tag.
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Beispiel 8 Verbessertes Schweinefutter Unter Anwendung von Standardverfahren
wurde aus den nachfolgend angegebenen Komponenten eine Vormischung hergestellt:
Komponente g/kg; aktive Verbindung 150,0 Calciumsilicat 20,0 Calciumcarbonat (Austernschalenmehl)
830,0 Gesamtgewicht 1000 g Diese Vormischung wurde einem kommerziellen Schweine
futter zugesetzt unter Anwendung der üblichen Futtermischverfahren, wobei man einen
Endgehalt an aktiver Verbindung von 100 g/t erhielt.
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Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung betrifft die Erfindung einen
Deoxynorasin-Antibiotika-Komplex, der enthielt oder besteht aus 20-Deoxynarasin
und 20-Deoxy-epi-17-narasin, der hergestellt wird durch aerobe Submers-Fermentation
von Streptomyces aureofaciens NRRL 11181.
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20-Deoxynarasin und 20-Deoxy-epi-17-narasin werden auf chromatographischem
Wege voneinander getrennt und isoliert. Der Deoxynarasin-Komplex, das 20-Deoxynarasin
und das 20-Deoxy-epi-17-narasin stellen antibakterielle und Anticoccidien-Mittel
dar und sie erhöhen auch den Ausnutzungsgrad des Futters bei Wiederkduern.