DD252116A5 - Verfahren zur bekaempfung von pflanzennematoden - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues, verbessertes Verfahren zur Bekaempfung von Pflanzennematoden. Erfindungsgemaess wird auf das Blattwerk von Pflanzen, auf den Boden, in dem sie wachsen, oder in deren Staemme eine nematozid-wirksame Menge der Fermentationsbruehe oder Vollmaische des Mikroorganismus Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus mit der Hinterlegungs-Zugangsnummer NRRL 15773 aufgebracht. Die Maische enthaelt zweckmaessig Mittel, die als LL-F28249 a, b, g, d, e, z, h, U, j, k, l, m, n und v bezeichnet sind.

Description

Zur Bekämpfung von Pflanzennematoden sind bereits zahlreiche Mittel und Verfahren bekannt, die jedoch häufig den Forderungen der Praxis nicht voll entsprechen.

Ziel der Erfindung:

Ziel der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Bekämpfung von Pflanzennematoden bereitzustellen. Hierzu soll ein neuer Mikroorganismus verwendet werden.

In der US-PS 3950 360 v/erden bestimmte durch Züchtung eines Streptomyces Mikroorganismus gewonnene antibiotische Substanzen beschrieben und daß diese Verbindungen als Insektizide und Akarazide nützlich seien. Wie man aber aus den einen solchen Miktroorganismus identifizierenden Merkmalen feststellen kann, unterscheidet sich der erfindungsgemäße

-3.10.8S- 37784b

Mikroorganismus, und seine aktiven Bestandteile werden von einem völlig anderen Mikroorganismus gewonnen. Des weiteren betrifft eine ganze Serie-von US-PSn bestimmte Verbindungen, die durch Fermentation von Streptomyces avermitilis, eines sich vom erfindungsgemäßen deutlich unterscheidenden Mikroorganismus, gewonnen werden (US-PS 4.171.3H; US-PS 4.199.569; US-PS 4.206.205; US-PS 4.310.519; US-PS 4.333.925). Die US-PS 4.423.209 betrifft das Verfahren zur Umwandlung von einigen dieser weniger wünschenswerten Komponenten in bevorzugtere. Die erfindungsgemäßen aktiven Mittel, die als LL-P28249 « , (h , ¹P > (Γ > t> '% ' Ή ' ^e ' ^b » ^ > λ., M, \> und O identifiziert ?/erden, stammen aus der Fermentation eines vor kurzem entdeckten und bisher noch nicht gezüchteten Mikroorganismus. Die erfindungsgemäßen Verbindungen und/oder die Fermentationsbrühe oder Vollmaische des Mikroorganismus Streptomyces cyamsogriseus ssp noncyanogenus FRHL 15773 plus die pharmazeutisch und pharmakologisch-annehmbaren Salze davon (zusammen als Wirkstoff bezeichnet) ergeben die Mittel, mit denen das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird.

Tabelle A Vergleich von P 28249 und ISP 5534 auf ISP-Morphologie-

Testnährsubstraten	ITBS-ISCC)	ISP 5534
(Zahlen stammen von	F 28249
Nährsubstrat

Hefe-Malζ (ISP 2)

Anorganische

Salze

Stärke (ISP 4)

Glycerol-Asparagin (ISP 5)

Hafermehl (ISP 3)

A.m.'

v.m.

S.p. A.m.

V.m. S.p.

A.m. V.m.

S.p. A.m. V.m. S.p.

mittelgrau (265)

hell-lederfarben

(75)

dunkelgelb-braun

hellbraun

hell-oliv-grau (112) bis mittelgrau (265)

dunkelgrau bis schwarz (266-267).

gräulich-gelblich-braun

263 (weiß) bis gelblich-grau(93)

schwarz (267) bis hell-olivbraun (96)

leicht bräunlich gelb-grau (93) farblos leicht gelblich

hell bis mittelgrau (264-265)

hell-lederfarbenweiß bis schwarzblau (188)

hellbraun mittelgrau (265) '

grau-purpurartigblau (204)

keine

263 weiß bis hellgrau (264)

grau-purpurartigblau (203-204)

hell-gelblich-grau keine

farblos

keine

A.m. = Luftmyzel

V.m. = vegetatives Myzel

S.p. = lösliches Pigment

Tabelle B Vergleich von Lederle F 28249 mit ISP 3534 (Gordon Tests)

P 28249 ISP 5534

Züchtung auf/bei

Salicin +

Erzeugung von

Urease +

Decaboxylierung von

Mucate - +

Säureproduktion

Raffinose - +

Sucrose - +

Beide Stämme zeigen folgende Reaktionen:

Positiv Hydrolyse von Casein, Hypoxantiiin, Xanthin, Tyrosin, Adrenin, Kartoffelstärke, Gelatine und Esculin;

Erzeugung von Phosphatase

Sensibilität für Lysezym

Decarboxylierung von Acetat, Citrat, Lactat, Malat,

Oxalat und Propionat

Säureproduktion von Arabinose, Cellobiose, Dextrin, Fructose, Galactose, Glucose, Glycerol, Lactose, Maltose, Mannose, c^ -Methyl-D-glucosid, Rhamnose,

Salicin, Trehalose.

l'Tegativ Erzeugung von ITitratreduktase

Decarboxylierung von Benzoat und Tartrat' ''Säure von Adonitol, Dulcitol,'Erythritol, Inositol, Mannitol, Sorbitol, β -Methyl-D~xylosid. Züchtung auf 5 % HaCl

Der volle Name des Mikroorganismus LL-P28249, MRL Nr. 15773 hinsichtlich Gattung, Art und Unterart ist Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus; um aber abzukürzen, wird er in der Beschreibung und den Ansprüchen wie oben geschrieben angegeben.

Der S-tamm wird· aufgrund der Morphologie und der Zellchemie· ,. (Gehalt des L-Isomeren von Diaminopimelinsäure) der Gattung Streptomyces zugeordnet. Die Morphologie und die physiologischen Daten des Stammes stellen diesen in die Nähe von S. cyaneogriseus, wie durch ISP 5534 (ATCC 27426) vertreten. Dann wurden Vergleiche hinsichtlich der Bildung von grauen löslichen Luftmyzelpigmenten auf Nährsubstraten (Tabelle A) und geknäulten Ketten von glatten Conidien (3 bis 25 Sporen .je Kette) angestellt. Der erfindungsgemäße Stamm ist gegenüber blauem löslichem Pigment negativ, worin der Vergleichsstamm, ISR 5534» positiv ist. Die Stämme zeigen ähnliche Reaktionen bei den ISP-Kohlehydrat-Verwertungstests und zeigen sich positiv bei Arabinose, Fructose, Glucose, Rhamnose und Xylose, während sie negativ bei Inositol, Mannitol, Raffinose und Sucrose reagieren (ISP 5534 leicht positiv). Die Stämme unterscheiden sich jedoch in verschiedenen Merkmalen (Tabelle B) und den 53 bei den Gordon-Tests. Diese Unterschiede unterstützen die Schaffung einer Unterart von S. cyaneogeneeus für den erfindungsgemäßen Mikroorganismus.

- 6 Darlegung des V/es ens der Erfindung:

Erfindungsgemäß ist das neue Verfahren zur Bekämpfung von Pflanzennematoden dadurch gekennzeichnet, daß auf das Blattwerk von Pflanzen, auf den Boden, in dem sie wachsen, oder in deren Stämme eine nemazod-wirksame Menge der Permentationsbrühe oder ^"ollmaische des Mikroorganismus Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus mit der Hinterlegungs-Zugangsnunnner HRRL 15773 aufgebracht wird.

Zweckmäßig enthält hierbei die Permentationsbrühe als LL-P 28249 & , LL-P 28249 ß , LL-P 28249 f, LL-P 28248cf, LL-P 28249 £ , LL-P 28249.ξ , LL-P 28249 η , LL-P 28249 θ , LL-P 28249 L , LL-P 28249 K , LL-P 28249 λ', LL-P 28249 /*, LL-P 28249V und LL-P 28249 <Ü bezeichnete Mittel oder die' pharmazeutisch und pharmakologisch-aanehmbaren Salze davon.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden etwa 0,1 bis 1,4 kg je Hektar des Wirkstoffes aufgebracht.

Die obengenannte Kultur von Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus LL-P 28249, die die Mittel LL-P 28249 J- , (J , ψ > (T» 6 j % > ^ j £ ' ^-' A. j ί- j /'S und ^o erzeugt, wurde aus in Südaustralien gefundenen! Mallee-Sand isoliert.

Das Verfahren zur Herstellung der Mittel ist Gegenstand der prioritätsgleichen Patentanmeldung AP A 61 K/277 057 1, aus der diese Anmeldung ausgeschieden wurde.

Die Struktur und die Stereochemie von LL-P 29249 sind nicht vollkommen definiert, aber die vorgeschlagenen Strukturen werden anschließend gezeigt. Die Komponente LL-P 29249 ist mit Hondamycin (Albimycin) verwandt, das in The Journal of Antibiotics, 2_2, Ή?. 11, 521 bis 526 (1969) beschrieben ist.

OH

LL-F28249a-p

Komponente

LL-F282490!· LL-P28249 ß» LL-P28249 f LL-P28249cT LL-P28249 I LL-P28249 % LL-P28249 % LL-P28249 θ LI-P28249 I LL-P28249 K LL-P28249A LL-P28249 μ

R,

CH₃ CH₃ GH₃ CH(CH₃)

CH(CH₃) CH(CH₃) CH(CH₃) CH₃

CH(CH₃) (

R₂

H H GH

H H H H H CH

R₃

CH,

ch"

CH"

CIl'

CH

CIi

CH

CHoCH, 2

CH

GH₃ CH CH „ CH

^R4

CH CH CH CH CH CH CH A-B

B-C

CH₂CH CH-,

CH-

CH CH

OH

CH₂OH

CH

-0-CH₂- -O-CH₂- -0-CHo-

-0-CH₂- -O-CH₂- -0-CH₂- -0-CH₂- -O-CHo-

-0-CHo-

CH

CH-CH	CH=C	ι
CH-CH	CH=C	OO
CH-GH	CH=C	I
CH-CH	CH=O
CH-CH	CH=C
CH-CH	CH=C
C=GH	CH-CH
CH-CH	CH=C
CH-CH	CH=G
CH-CH	CH=C
CH-CH	CH=C
CH-CH	CH=C

OH

LL-F28249v

H₃C

OH

OH

HO CH₃ CH₃ CH₃ CH₃

LL-F28249üJ

- 11 In den Zeichnungen stellen dar:

Pig. 1: Charakteristisches Ultraviolett-Äbsorptionsspektrum der LL-F28249ijC , KHRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 2: Charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum der LL-P28249.5C , MHRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Fig. 3' Charakteristisches magnetisches Protonen-EIernresonanzspektrum der LL-P28249 Φ , ITRRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCl--Losung. ~*

Pig. 4: Charakteristisches magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum der LL-F28249ot/ , MRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCIo-Lb"sung.

Pig. 5- Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-P28249oo, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 6: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-F28249ß, KRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 7: charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum der LL-P28249A , HHRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 8: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-F28249 jS , NRRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCl-,.

Pig. 9: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-P28249fb , NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 10: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-P28249f, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 11: Charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum der Verbindung LL-P28249-f, NRRL 15773.

Pig. 12: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der Verbindung LL-P28249-/"\ NRRL 15773, in CDCl₃.

Pig. 13: Charakteristisches magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum der LL-P28249·^, NRRL 15773, bezeichneten Verbindung in CDCl^.

Pig. 14: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der- LL-P28249ψ, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 15: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-P28249^, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 16: Charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum der LL-P28249Ö, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 17: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-P28249O , I¹TRRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCl-,.

Pig. 18: Charakteristisches magnetisches Kernresonanzspektrum der LL-P28249O , NRRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDClτ.

Pig. 19·· Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-P28249O, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 20: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum ' der LL-P28249 cf, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 21: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanz s ρ ek trum der LL-P28249 cT, WRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCl-,.'

Pig. 22: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-P28249 (T, ITERL 15773 bezeichneten Verbindung.·

Pig. 23: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-D28249 £ _s KRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 24: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-P28249E , HERL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCl-,.' .. .

Pig. 25: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-P28249 i , IiRRL 1 5773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 26: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrurn der LL-P28249 f , URRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig, 27: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-P28249^ , ERRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCl-,.

Pig. 28: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-P28249j£ , KRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 29: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-P28249T| , MRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 30: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-P28249 \ , IiRRL 15773 bezeicheten Verbindung in CDCI^·

Pig, 31: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-P28249^!>| , KRRL 15773 bezeichneten Verbindung .

Pig. 32: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-P28249 β, MRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 33: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-P28249 θ , NRRL .15773 bezeichneten Verbindung in CDCl.-,.

Pig. 34: Charakteristisches Slektronenstoß-Massenspektrum der LL-P28249 β, KRRL 15773 bezeichneten Verbindung. ·

Pig. 35: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-P28249 θ , ITRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 36: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-F28249 L·.,. NRRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCl.,.

Pig. 37: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-P28249 I , KRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 38: Charakteristisches magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum der LL-P28249& , KRRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCl.,-Lösung.

Pig. 39: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-P28249 K, KRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 40: Charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum der LL-P28249 ^, HRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Fig. 41: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-F28249 K,URRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Fig. 42: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-F28249 K, MRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Fig. 43·* Charakteristisches magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum der LL-F28249 K, HRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Fig. 44: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-F28249λ, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Fig. 45: Charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum der LL-F28249A, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Fig. 46: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-F28249 λ» MRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Fig. 47: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-F28249 Λ, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Fig. 48: Charakteristisches magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum der LL-F28249 Λ > NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Fig. 49: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-F28249/S NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Fig. 50: Charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum der LL-F28249 //·, MRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 51: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-P28249/S ITPJlL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 52: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-F28249/", HRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 53: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-P28249 λ? , IiHRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 54: Charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum der LL-P28249 \> , IiRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 55: Charakteristisches Slektronenstoß-Massenspektrum der LL-P28249 v¹, IiRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 56: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-P28249 ^ , KHRl 15773 bezeichneten Verbindung.

Pig. 57: Charakteristisches magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum der LL-P28249^ , ITRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Es wurde entdeckt, daß die oben genannten Mittel sowie die Permentationsbruhe und die Vollmaische des Mikroorganismus u.a. besonders v/irksam für die Bekämpfung von Pflanzennematoden geeignet sind.

Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde durch den Erfolg bei der Ifekämpfung der frei-lebenden Bodennematode (Σ. elegans demonstriert. Zusammensetzungen, die diese Wirkstoffe zur Bekämpfung von Pflanzennematoden enthalten, können entweder als Flüssigkeit oder oberflächenaktive Pulver formuliert werden. Flüssige Zusammensetzungen enthalten etwa 5 % bis 20 % H/M des Wirkstoffes (aktive Substanz, Permenta-

^.W» Sm S ί

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tionsbi-ühe, Vollniaische oder Salze) mit. entsprechenden Mengen eines Lösungsmittels wie Methanol, Ethanol, Aceton, Acetonitril, und andere und als Rest Wasser. Oberflächenaktive Pulver enthalten etwa 5 % bis 20 %, M/M des Wirkstoffes, etwa 1 % bis 10 % oberflächenaktives Mittel und inerte Trägermittel wie Tonarten, Vermiculit, Ruß oder dergleichen. Etwa 0,1 bis 1,4 kg je Hektar werden auf das Blattwerk von Pflanzen, den Boden, in dem diese wachsen, oder deren Stämme-aufgebracht.

Diese Mittel sind auch als lokale Insektizide, Magengifte und systemische Insektizide wirksam und sind besonders wirksam bei der Bekämpfung von Insekten der Gattungen Lepedoptera, Coleoptera, Homoptera, Deptera und Thyeanoptera. Pflanzenmilben, Akariden, können ebenfalls durch die erfindungsgemässen Mittel bekämpft werden.

Diese Mittel werden im allgemeinen als verdünnte,- feste oder flüssige Zusammensetzungen auf den Fortpflanzungsboden, die Nahrungsquelle oder die Wirtspflanze solcher Insekten und/oder Akariden aufgebracht. Die Anwendungsmenge für solche Stellen umfaßt etwa 0,01 kg/ha bis etwa 8,0 kg/ha, vorzugsweise etwa 0,05 kg/ha bis etwa 0,5 kg/ha.

Für die erfindungsgemäßen oberflächenaktiven Pulver brauchbare oberflächenaktive Mittel umfassen die normalerweise für die Formulierung solcher oberflächenaktiver Pulver verwendeten, vorzugsweise Alkylbenzensulfonatriumsalze. Bentonit, Ton oder Gemische davon sind bevorzugte Trägermittel. Außerdem haben die erfindungsgemäßen Wirkstoffe auch systemische insektizide Wirksamkeit gegen m. ovinus bei Schafen gezeigt.

In der Praxis sind im allgemeinen etwa 0,02 rag/kg/Tag bis etwa 3,0 mg/kg/Tag für die Bekämpfung parasitischer Infektionen bei Rindern, Schafen und Schweinen sowie Haustieren wirksam. Für längere Anwendung können so geringe Mengen wie 0,002 mg/kg Körpergewicht/Tag angewendet werden.

In der Praxis werden auch etwa 0,1 mg je kg bis 100 mg je kg für mit.Helminthen infizierte Tiere angewendet.

Die physikalisch-chemischen Merkmale derd , (ζ, , ψ, </% £ , <£ , γγ θ j L, k, Λ, Ju, \) und to Komponenten von LL-P28249 werden anschließend beschrieben:

1) Relative Molekülmasse:612 (PAB-MS);

2) Molekülformel: ~* C^rHp₀O₀;

3) Spezifische optische Drehung [_dj _ß = +133 + 3 (C 0,3, Aceton);

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: wie in Pig. 1 dargestellt _UVCH₃OH_{= 244} ^_{1 (} ^ _{28 000)}.

MAX

5) Infrarot-Absorptionsspektrum: wie in Pig. II dargestellt (KBr Scheibe): 3439, 2960, 2925, 1714, 1454, 1374, 1338, 1171 ,' 1120, 996, 967 cm"¹ ;

6) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum (CDClo)^: wie in Pig. Ill dargestellt;

7) Magnetisches Kohlenstoff-1 3-Kernresonanzspektrum (CDCl.-,): wie in Pig. IV dargestellt und in Tabelle I beschrieben; und

8) Elektronenstoß-Massenspektrum: wie in Pig. V dargestellt mit genauen Massemessungen und vorgeschlagenen Slementzusammensetzungen nach Tabelle II.

LL-P28249ß :

1) Relative Molekülmasse: 584 (PAB-MS);

2) Molekül formel: C₃₄H^Og; ·

3) Spezifische optische Drehung: £c&_7 ^ = +125° (C₅ 0,30 Aceton);

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: wie in Pig. IV dargestellt _UVCH₃OH _{= 244 m (} ^ _{25 600)}.

MAX

5) Infrarot-Absorptionsspektrum: Wie in Pig. VII dargestellt (KBr Scheibe): 352O₅ 2910, 1735, 1717, 1450, 1375, 1335, 1180, 11 TO, 1119, 9-93, 727 cm"¹;

6) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum (CDGIo): Wie in Fig. VIII dargestellt;

7) Magnetisches Kohlenstoff-1 3-Kernresonanzspektrum (CDCl-,): Wie in Fig. XXZVIII dargestellt und in Tabelle II A beschrieben; und

8) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig. IX dargestellt, mit genauen Kassemessungen und vorgeschlagenen Elernentzusammensetzungen nach Tabelle III.

LL-F28249 :

1) Relative Molekülmasse: 598 (FAB-MS);

2) Holekülformel: C^r-H^O^;

35 50 α

— -τ 2β ο

3) Spezifische optische Drehung: /j6__/ _D = +150 + 4

(C 0,3, Aceton);

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Wie in Fig. X gezeigt

UV^CH3^0H = 244 nm (6 27 100);

MAX

5) Infrarot-AbsorptionsSpektrum: Wie in Fig. XI gezeigt (KBr Scheibe): 3510, 2910, 1735, 1715, 1452, 1375, 1338, 1182, 1172, 1119, 995 cm"¹;

6) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum (CDCl^): V/ie in Fig. XII gezeigt;

7) Magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum (CDCl-.): Wie in Fig. XIII gezeigt und in Tabelle IV beschrieben; und

8) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig. XIV gezeigt, mit genauen Massemessungen und vorgeschlagenen Elementzusammensetzungen nach Tabelle V.

1) Relative Molekülmasse: 806 (FAB-MS);^

2) Molekülformel: C₄₅H^-O₁₂;

3) Spezifische optische Drehung: /ck,_7 -q = . -49. + 3 (C 0,35, Methanol);

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Wie in Pig. XV gezeigt

UV^CH3^0H = 225 mn (£ 27 4OO) IvIAX 232 (£25 700);

5) Infrarot-Absorptionsspektrum: Wie in Pig. XVI gezeigt (KBr Scheibe): 3580, 2965, 2935, 2880, 1703, .16.47, 1458, I38O. 1292, 1223, 1135,. 1098, 984 "cm"¹ ;

6) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum (CDCl-O: Wi in-Pig. XYII gezeigt;

7) Magnetisches Kohlenstoff--13-Kernresonanzspektrum (CDCIo): Wie in Pig. XYIII gezeigt und in Tabelle YI beschrieben; und

8) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Pig. XIX gezeigt, mit genauen Mass ernes sung en und vorgeschlagenen Elementzusammenset zunsen nach Tabelle YII.

LL-P28249CT:

1) Relative Molekülmasse: 616 (SI-MS);

2) Molekülformel: C₃₅Hc₂ ⁰Q;

3) HPLC-Retetionsvolumen von 14,0 ml in dem in Tabelle VIII angegebenen System;

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Methanol): Wie in Pig. . XX gezeigt;

5) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum (CDClO: Wie in Pig. XXI gezeigt; und

6) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Pig. XXlI gezeigt.

LL-F28249 t :

1 ) -Relative Moleküiiaasse: 598 (ΞΙ-MS);

2) Molekülformel: C₃₅H₅₀O₈;

3) HPLC-Hetentionsvolumen von 14,8 ml in dem in Tabelle VIII angegebenen System;

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Methanol): Wie in Fig. ηττττ gezeigt;

5) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum (CDCl₃) ^: Wie in Pig. ZXIV gezeigt; und.

6), Slektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig. IQ[Y gezeigt. LL-F28249 ί :

1) Relative Molekülmasse: 598 (EI-MS);

2) Molekülformel: C₃₅H₅₀O₈;

3) HPLC-Retentionsvolumen von 16,0 ml in dem in Tabelle VIII angegebenen System;

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Methanol): Wie in Fig. XXVI gezeigt;

5) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum (CDCl₃): Wie in Fig. XXVII gezeigt; und

6) 'Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig. XXVIII gezeigt. LL-28249^. :

1 ) ' Relative Molekülmasse: 612 (EI-BiS);

2) . Molekülformel: C₃^H₅₂O₈;

3) HPLC-Retentionsvolumen von 23,5 ml in dem in Tabelle VIII angegebenen System;

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Methanol):. wie in Fig. XXIX gezeigt;

- 22 -

fts. V «"·

5) Hagnetiscb.es Protonen-Kernresonanzspektrum (CDClO: Wie in Fig. XXX gezeigt;

6) Blektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Pig. -XXXI gezeigt. LL-F28249e :

1). Relative Molekülmasse: 626 (EI-HS);

2) Molekülformel: C-^Hc.0_Q;

3) HPLC-Retentionsvolumen von 24,5 ml in dem in Tabelle VIII angegebenen System;

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Methanol): Wie in Fig.

XXXII gezeigt;

5) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum (CDCl-): Wie in Fig. XX]QII gezeigt; und

6) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig. XXXIV gezeigt. LL-28249 L :

1) Relative Molekülmasse: 626'(EI-MS);

2) Molekülformel: Cn₇Hr-„0_Q;

3) HPLC-Rerentionsvolumen von 26,0 ml in dem in Tabelle VIII angegebenen System;

4) Ultraviolett-Äbsorptionsspektrum (Methanol): Wie in Fig. XjQiV gezeigt;

5) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum (CDCl-,): Wie in Fig. XiCiVI gezeigt; .

6) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig. XICiVII gezeigt. LL-F28249 K:

1) Relative Molekülmasse: 584 (EI-MS);

2) Molekülformel: C₃₅H^₂O₇;

3) Spezifische optische Drehung: /ÖC_7 ρ = +189° (C 0,165 Aceton); *

4) Ultravioiett-Absorptionsspektrum: Wie in Pig. JC[XIX gezeigt _UVCH₃OH _{= 241} ^_{n (Ξ 20 400)}.

MAX

5) Infrarot-Absorptionsspektrum: Wie in Pig. XL gezeigt (KBr Scheibe);

6) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Pig. XLI gezeigt;

7) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum (CDCIo): Wie in Pig. XLII gezeigt; und

8) Magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum (CDCIo): Y/ie in Pig. XLIII gezeigt und in Tabelle LX beschrieben.

LL-28249 A:

1) Relative Molekülmasse: 626 (PAB-MS);

2) Molekülformel: C₃-H₅₄O₈;

3) Spezifische optische Drehung: £ÖC_7 ^ = +145° (C, 0,23 Aceton);

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Wie in Pig. XLIV gezeigt

UyCH₃OH _ _{244 m} (_{E 30 000}).

MAX

5) Infrarot-Absorptionsspektrum: Wie in Pig. XLV gezeigt (KBr Scheibe);

6) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Pig. XLVI gezeigt;

7) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum (CDCIo): Wie in Pig. XLVII gezeigt; und

8) Magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum (CDCIo): Wie in Pig. XLVIII gezeigt und in Tabelle X beschrieben.

1) Relative Molekülmasse: 612(EI-MS);

2) Molekülformel: C₃₇H^O,,;

3) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Wie in Pig, ZLlX gezeigt _uyCH₃OH ₌ 241 nm (E 16 800);

MAZ

4) Infrarot-Absorptionsspektrum: Wie in Pig. L gezeigt (KBr Scheibe);

5) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Pig» LI gezeigt;

6) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum (CDCl-J: Wie in Pig. LII gezeigt.

LL-P28249 9 :

1) Relative Molekülmasse: 592 (SI-MS);

2) Molekülformel: C₃₆H₄₈O₇;

3) Spezifische optiache Drehung: £cL_7 _D = +1 31 ° ~ (C 0,325, Aceton);

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Wie in Pig. LlII ge- ' zeigt _UVCH₃OH _{= 25}g _{(E 20 500)}. _{358 (s 8} 33Q).

IiAZ

5) Infrarot-Absorptionsspektrum: Wie in Pig. LIV gezeigt (KBr Scheibe);

6) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Pig. LV gezeigt;

Magnetisches Protonen-Pig. LVI gezeigt; und

Magnetisches Kohlenstc

Wie in Pig. LVII gezeigt und in Tabelle Xl beschrieben.

7) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum (CDCl-,): Wie in

8) Magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum (CDCl₃):

Tabelle 1 Kohlenstoff-1 3-HIvIR-Da ten für LL-J?28249^

Kohlen- Chemische Umlagerung Protonen- Kohlen- Chemische Umlagerung Protonen-

stoff (ppm) Substitution stoff (pjorn) Substitution

1 173,4 . * q² 18 67,8 CH

2 142,8 CH 19 67,7 , CH

3 139,4 q 20 48,4 CH₂

4 137,7 q 21 45,7 CH

5 137,3 q' 22 41,1 ' OH₂

6 137,2 CH 23 40,7 CH₂

7 130,6 q 24 36,1 CH₂ ,

8 123,3 CH 25 36,0 CH ' w

ο VT!

9 120,3^J CH 26 35,9 CH ,

118,0 CH 27 34,7 CH₂

99,7 q 28 26,8 CH

80,2 q 29 22,8⁴ CH₃ '

79,3 CH 30 22,2 CH₃

76,7 CH 31 19,9 CIL

69,3 CH 32 15,5 . CH₃ ³

68,5 CH 33 -13,9 , CH₃

68,4 CH₂ 34 11,0 CH₃

Unterhalb von TMS; CDClο-lösung.

-* ' q = Quarternärer Kohlenstoff.

ro -^»4 zwei unaufgelöste Signale.

Tabelle II iaassenmessungen hoher Auflösung für Ιι-1?28249<7ί

m/z Elementzusammensetzung

612,3705 ^C36^H52°8

594,3543 C₀₆H₅₀O₇

576,3472 ^H₄₈O₆

484,3211 ^C30^H44°5

482,2648 °29^Η3β°6

466,3097 . ^C30^H42°4

448,2987 ^G ₃O^H4O°3

442,2375 . C₂₆H₃₄O₆

425,2327 ^C26^H33°5

354,2181 ^C23^H30°3

314,1877 ' ^C20^H26°3

278,1144 C₁₅H₁₈O₅

265,1786 ^C16^H25°3

248,1405 ^C15^H2O°3

247,1705 C₁₆H₂₃O₂

237,1838 C₁₅H₂₅O₂

219,1740 ^C15^H23°

151,0753 ^C9^H11°2

Tabelle Ha Kohlenstoff-1 3-MvIR-Daten für LL-F28249 ß .

Kohlen- Chemische Umlagerung Kohlenstoff Chemische Umstoff (ppm)^x lagerung (ppm)

1	173,3
2	142,6
3	139,5
4	13.7,7
5	137,3
6	133,9
7	123,8
8	123,4
9	120,3
10	120,2
11	118,0
IV)	99,7
13	80,2
14	79,4
15	76,7
16	69,2
17	68,6
χ	Unterhalb ν
XX

18	68,3
19	67,8
20	67,7
21	48,4
22	45,7
23	41 ,0
24	40,8
25	36,1
26	.35,9
27	34,7
28	22,3
29	19,8
30	15,5
31	13,8
32	13,1
33	10,8

Zwei unaufgelöste Signale.

Tabelle III Massemessungen hoher Auflösung für LL-F28249 ο

m/z Elementzusammensetzung;

584,3388 C₃₄H₄₈O₈

566,3306 ; C₃₄H₄₆O₇

456,2864 .^C28^H40°5

442,2392 C₂₆H₃₄O₆

438,2780 . C₂₈H₃₈O₄

425,2331 . ^C26^H33°5

354,2187 ' C₂₃H₃₀O₃

314,1858 ^C2O^H26°3

278,1168 C₁₅H₁₈O₅

237,1491 ' C₁₄H₂₁O₃

219,1380 ' C₁₄H₁₉O₂

209,1534 ^C13^H21°2

191,1418 C₁^H₁QO

151,0750 ^C9^H11°2

- 29 -

	Tabelle IV	stoff	t
	Kohlenstoff-13-ΝΜϊ	19	ehe Umlagerung
Kohlenv	l-Daten für .LL-F28249	20	(ppm)
stoff	Chemische Umlagerung Kohlen- Chemis	21	68,3
1	(ppm)	22	67,9
2	173,6	23	57,7
3	142,4	24	48,5
4	139,9	25	45,8
5	137,3	26	41,2
6	136,0	27'	40,8
7	134,0	28	36,2
8.	123,8	29	36,1
9	123,6	30	36,0
10	120,4	31	34,8
11	119,6	32	22,3
12	118,5	33	19,9
13	99,8	34	15,5
14	80,5	35	13,8
15	77,8 .		13,1
16	77,0		10,8
17	76,8
18	69,3
68,6

¹ Unterhalb von TMS; CDCl--Losung.

Tabelle v" Massemessungen hoher Auflösung für LL-F28249 ψ

m/g - Elementzusammensetzung

598,3543 ^C35^H5O°8

580,3422 C₃₅H₄₈O₇

562,3292 ^C ₃5^H46°6

496,2824 ' ^c ₃0^H40°6

484,2440 ^C28^H36°7

478,2687 ^c ₃O^H38°5.

456,2576 . ^C27^H36°6

438,2772 ^C28^H ₃8°4

425,2341 C₂₆H₃₃O₅

420,2651 ^C28^H36°3

354,2199 C₂₃H₃₀O₃

314,1875 ^G20^H26°3

292,1307 ^C16^H2O°5

288,2075 ^C19^H28°2

248,1397 ^C15^H2O°3

237,1490 ^C14^H21°3

219,1382 ^C14^H19°2

209,1544 C₁₃H₂₁O₂

191,1435 G₁₃H₁₉O

.151,0759 . C₉H₁-IO₂

- 31 -

Tabelle VI Kohlenstoff -1 3-HMR-Da ten für LL-F2-8249

Kohlen- Chemische Umlagerung stoff (ppm)

-1 Kohlen- Chemische Umlagerung stoff (ppm)

10 11 12 13 14 15 16

220,7 219,6 165,2 148,7 133,1 132,3 132,1 130,2

122,3 100,0 82,9 75,9 73,0 72,7 72,6 72,1 69,0

67,3 63,6

51,4 46,2 45,7 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44

42,2^C

40,4

38,3

37,6

36,1

34,8

33,5

30,1

26,6

25,4

24,5

23,0

21,1

17,9

14,3

14,2

12,1

11,5

10,9

8,7

8,3

5,7

Unterhalb von TMS; CDCl₃-Losung. Zwei unaufgelöste Signale.

- 32 -

Tabelle VII Hassemessungen, hoher Auflösung; für LL-?28249 ^

' ^w-/^z Element zusammensetzung

462,3350 ^C2S^H46°5

444,3237 ^G28^H44°4

425,2534 C₂₃H₃₇O₇

407,2439 ^C23^H35°6

406,3046 ^C25^H42°4

307,2895 ^C25^H39°3

337,2010 ^C19^H29°5

' 297,2031 ^C17^H29°4

279,1944 C₁₇H₂₇O₃

261,1851 ^C17^H25°2

253,1797 °15^H25°3

235,1697 ^C15^H23°2

224,1754 ^C14^H24°2

209,1530 °13^H21°2

207,1744 ^C14^H23°

184,1458 ^C11^H2O°2

179,1048 C₁₁H₁₅O₂

173,1205 ^C9^H17°3

167,1051 C₁₀H₁₅O₂

. 155,1069 ^C9^H15°2

Tabelle VIII HPLC Re tent ions volumina für ίΙ-Ρ28249ο^ , cf, £ ', % . V . , θ-, und

Verbindung Retentionsvolumen (ml)

LL-P28249 . . 19,8

LL-P28249 14,0

LL-F28249 14,8

LL-P28249 16,0

LL-P28249 23,5

LL-F28249 24,5

LL-P28249 26,0

Das System besteht aus einer Säule, 3,9 rum x 30 cm, gefüllt mit C^g-Umkehrphasen-Füllung, entwickelt mit Methanol:Wasser (80:20) bei 1,0 ml/Minute, Nachweis durch Absorptionsvermögen bei 254 an.

	(ppm) s	IX	K
	.173,9	für LL-P28249	sehe Umlagerung
Tabelle	140,7	ohlen- Chemi	(ppm)
Kohlenstoff-1 3-MvS-Daten	138,3	toff	56,7
Kohlen- Chemische Umlagerung K	136,6	19	, 48,4
stoff	136,5	20	' 47,7
1	133,8	21	41,1
2	124,7	22	40,6
3	124,4.	23	37,1
4	123,8	14	36,3
5	120,1	25	36,0
6	119,5	26	35,9
7	99,7	27	34,6
8	77,2	28	22,0
9	76,6	29	19,3
10	76,5	30	16,0
11	'69,3	31	13,8
12	68,6	32	13,3
13	67,3	33	13,1
H	34	10,7
15	35
16
17
18

Unterhalb von TMS; CDCl-Lösung, übereinstimmend mit CDCl-,-Signalen.

- 35 -

Tabelle II Kohlenstoff-13-HMR-Daten für LL-F26249 A

Kohlen- Chemische Umlagerung Kohlen- Chemische Umlagerung

stoff (ppm)+ stoff (ppm)

1 173,6 19 68,3

2 142,5 20 67,9

3 139,8 21 57,8

4 137,4 22 48,6

5 137,2 23 . 45,8

6 136,0 24 41,2

7 130,7 25 40,9

8 123,6 26 36,1⁺⁺

9 120,3 27 36,0

10 · 119,7 28 34,9

11 . 118,6 29 26,9

12 -99,8 30 23,O⁺⁺

13 80,5 31 22,4

14 77,7 32 20,0

15 7-7,6- 33 15,7

16 76,7 34 14,0

17 69,3 35 11,1

18 68,6

¹ Unterhalb von TMS; CDCl,-Losung

Zwei unaufgelöste Signale.

- 36 -

	(ppm)	F28249 λ)
	167,4	Chemische Umlagerung
Tabelle XI	150,5	(ppm)
Kohlenstoff-13-iMR-Daten für LL-	142,9	69, A-
Kohlen- Chemische Umlag	142,0	68,7
stoff	/137,2++	68,3
1	132,1	48,4
2	130,7	41,0++
3	125,8	35,9
4	125,5'	35,6
VJl	124,2	. 35,5
6	123,7	34,4
7	123,2	29,7
.8	121,3	26,8
9	118,0	22,9
10	100,0	22,8
11	•76,7	22,1 .
12	74,6	15,3
13	+ Unterhalb von TMS; C	13,9
H	;erung Kohlen	11 ,0
15	stoff
16	1.8
17	19
20 .
21
22
23
24
25
26
27 .
28
29
30
. 31
32
33
34
IDCl ^-Lösung

Zwei unaufgelöste Signale.

	Chroma	Tabelle XII
	TLC +	tographische Werte
	gegen Rf	HPLC +
Komponente	1 ,00	Retenti onsze"? t (Minuten)
	0,797	13,8
(I	1 ,42	' 9,3
T	0,758	12,6
ei	1 ,06	10,4
i	1 ,12	10,9
	1,03	11,5
	1,27	16,2
G	1,27	17,3
L IA.	1,83	18,2
λ	1 ,56	24,7
,/Λ	1,92	19,1
	1,95	38,0
O	0,212	42,3
	7,1

Analtech Silica GHLF250 /u, entwickelt mit Ethylacetat:Methylenchlorid . (1:3), Nachweis durch Verkohlen mit EUSO. .

Altez Ultrasphere ODS 5 /U, 4,6 nm χ 25 cm, entwickelt mit 85 % Methanol in Wasser bei 1,0 rnl/Minute, Nachweis durch Absorptionsvermögen bei 254

Die neuen LL-F28249o^ , (!> , f, <Γ, ί, % , \ , Q , L , K, Λ, /S O und ^C3 bezeichneten Mittel werden während der Züchtung von Streptomyces cyaneogrises noncyanogehus, NRRL 15773^ unter gesteuerten Bedingungen gewonnen.

Dieser Organismus wird in der KuItürSammlung der Medical Research Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New York, unter der Kulturnummer LL-F28249 aufbewahrt. Eine lebensfähige Kultur dieses Mikroorganismus wurde bei dem Patent Culture Collection Laboratory, Northern Regional Research Center, U. S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604 hinterlegt und der ständigen Sammlung einverleibt. Er ist der Öffentlichkeit unter seiner ..Zugangsnummer NRRL 15773 in dieser Sammlung frei zugänglich.

Für die Herstellung dieser neuen Mittel ist die Erfindung nicht auf diesen speziellen Organismus beschränkt. Tatsächlich ist es der Wunsch und die Absicht, die Verwendung natürlich vorkommender Mutanten dieses Organismus sowie induzierter Mutanten, die von diesem Organismus durch verschiedene, dem Fachmann bekannte mutagene Maßnahmen wie Einwirkung von Stickstoffsenfgas, Röntgenbestrahlung, Ultraviolettstrahlung, N'-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, Actinophagen und dergleichen erzeugt werden, einzubeziehen. Ebenfalls wird gewünscht und beabsichtigt, inter- und intraspezifische genetische Rekombinanten, die durch genetische, dem Fachmann bekannte Techniken wie beispielsweise Konjugation, Transduktion und genetische technische Vorgänge erzeugt wurden, mit einzubeziehen.

Allgemeine Fermentationsbedingun^en

Die Züchtung von Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus, NRRL 15773, kann in den verschiedensten flüssigen Nährsubstraten vorgenommen werden. Für die Erzeugung der Mittel

LL-P28249 Φ , fc , ψ, (Γ, t > ^ > -n » ö » L , K₅ λ » /U, P und CO brauchbare Substrate enthalten assimilierbare Kohlenstoffquellen wie Dextrin,'Sucrose, Heiasse, Glycerol'usw.; eine assimilierbare Stickstoffquelle wie Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren, Maisquellwasser usw.; und anorganische Anionen und Kationen wie Kalium, Katrium, Ammonium, Calcium, Sulfat, Carbonat, Phosphat, Chlorid usw. Spurenelemente wie Bor, Molybdän, Kupfer usw. werden als Verunreinigungen von anderen Bestandteilen des Substrates bereitgestellt. Die Belüftung in Behältern und Flaschen wird durch Blasen von steriler Luft durch das Fermentationsmedium oder auf dessen Oberfläche erzielt. Weitere Bewegung in Tanks wird durch einen mechanischen Schnellrührer erreicht. Bei Bedarf kann ein Antischaummittel wie Siliconöl zugesetzt werden.

Ausführungsbeispiele:

Beispiel 1 Herstellung von Inokulum

lach folgender Formel wurde ein typisches Substrat hergestellt, das für die Züchtung der verschiedenen Stufen von Inokulum verwendet wurde:

Dextrose 1,0 %

Dextrin ' 2,0 %

Hefeextrakt 0,5 55

KZ Amin 0,5 %

Calciumcarbonat 0,1 %

Wasser qs 100 %

Dieses Substrat wurde sterilisiert. Eine 100-ml-Portion die*- ses in einem Kolben befindlichen sterilen Substrates wurde mit Myzelschnitzeln von einer Schrägagarkultur von Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus KKRI 15773 geimpft,

Das Substrat wurde danach 48 bis 72 Stunden lang "bei 28 G kräftig auf einem Drehschüttler bewegt, wodurch das Primärinökulum gewonnen ?nirde. Dieses Primärinokulum wurde anschließend zum Impfen eines Liters des obigen sterilen Substrate verwendet, das dann 48 Stunden lang bei 28 ⁰C aerob gezüchtet wurde, ^¹¹¹ das S ekundär inokulum zu erhalten.

Beispiel 2 Fermentation

Ein Fermentationssubstrat folgender Formulierung wurde zubereitet:

Dextrin	1 ,0 %
So.japepton	1 ,0 %
Melasse	2,0 %
Calciumcarbonat	0,1 %
Wasser qs	100 %

Dieses Substrat wurde sterilisiert, und anschließend wurde eine 30-Liter-Portion mit einem Liter nach Beispiel 1 hergestellten Sekundärinokulum geimpft. Die Fermentation wurde bei 30 °C mit einem sterilen Luftstrom von 30 Litern pro Minute, einem Gegendruck von 8 psig und Bewegung durch einen mit 500 U/min betriebenen Schnellrührer 91 Stunden lang vorgenommen, worauf die Maische geerntet wurde.

Beispiel 3

Isolierung von LL-F28249 el· , & und <f

Eine Gesamtmenge von 26 Litern der nach der Beschreibung in Beispiel 2 hergestellten Vollerntemaische wurde mit 1500 g Diatomeenerde vermischt und filtriert. Der Myzelkuchen wurde

mit 5 Litern Wasser gewaschen, und das Filtrat und die Waschlösung wurden verworfen. Der Myzelkuchen wurde im Laufe einer Stunde' mit 10 Litern Methanol vermischt, anschließend' filtriert und mit 5 Litern Methanol gewaschen. Der Methanolextrakt und die LIethanolwaschlösung wurden zusammengenommen und zu einem wäßrigen Rückstand von etwa 1 bis 2 Litern eingedampft. In diesen wäßrigen Rückstand wurde seine doppelte Volumenmenge Methylenchlorid gegeben, und es wurde 1/2 Stunde lang gemischt. Die Methylenchloridphase wurde abgetrennt und danach zu einem Sirup eingeengt, so daß 27 g Rohmaterial entstanden. Diese 27 g Rohmaterial wurden in einem Gemisch von Methylenchlorid und Methanol gelöst, durch Baumwolle und wasserfreies Natriumsulfat filtriert und dann eingedampft, wodurch 7,0 g eines Öls gewonnen wurden.

Sine 170-g-Portion Silicagel wurde in 12,5 % Ethylacetat in Methylenchlorid aufgeschlämmt und zur Bildung einer Säule von 2,5 x 58 cm gegossen. Das Öl wurde in 12,5 % Ethylacetat in Methylenchlorid gelöst und auf die Säule aufgegeben. Die Säule wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch entwickelt. Die mobile Phase wurde anfangs mit 1,3 ml/Minute geführt, und 15-Minuten-Praktionen wurde gesammelt. Nach 10 Fraktionen verlangsamte sich die Fließgeschwindigkeit auf etwa 0,5 ml/-Minute, so nahmen die Fraktionen 1 bis 10 von 20 ml gleichmäßig auf etwa 10 ml ab und die Fraktionen 11 bis 98 auf etwa 7 ml. Bei Fraktion 99 wurde die Fließgeschwindigkeit erhöht, um 25-ml-Fraktionen in 10 Minuten zu erhalten. Insgesamt wurden 105 Fraktionen gesammelt. Diese Fraktionen wurden durch Dünnschichtchromatographie in Ethylacetat:Methylenchlorid (1:1) getestet.

Die Fraktionen 30 bis 54 wurden zusammengenommen und eingedampft und ergaben 1,08 g eines LL-F28249 -f enthaltenden Öls.

Die Fraktionen 55 bis 62 wurden zusaininengenommen und eingedampft und ergaben 150 mg LL-F28249 c^ und (I enthaltenden Feststoff. ·

Die 150 mg des LL-F28249 & und ß enthaltenden Feststoffes wurden durch präparative HPLC unter Anwendung einer Umkehrphasensäule (Whatman C8, 2,2 χ 50 cm), die mit 80 % (V/V) Methanol in "wasser entwickelt wurde, chromatographiert. Die Fließgeschwindigkeit betrug etwa 10 ml/Hinute, und 2-Iüinuten-Fraktionen wurden gesammelt.

Die Fraktionen 58 bis 69 wurden zusammengenommen, das Methannol wurde verdampft, t-Butanol wurde zugegeben, und das Gemisch wurde lyophilisiert, wodurch 60 mg reines LL-F28249cⁱ-' gewonnen wurden.

Die Fraktionen 40 bis 43 wurden zusammengenommen, das Methanol wurde verdampft, und die zurückbleibende wäßrige Suspension wurde mit Methylenchlorid extrahiert, wodurch nach Eindampfung 10 mg reines LL-F28249 fa gewonnen wurden.

Die 1,08 g des LL-F28249 f enthaltenden Öles wurden in 10 % Ethylacetat in Methylenchlorid gelöst und auf eine mit SiIicagei gefüllte Säule (2,5 x 50 cm) aufgegeben. Die Säule wurde mit 10 % Ethylacetat in Methylenchlorid entwickelt, wobei die Eluierung bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Minute erfolgte und 12-Minuten-Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen 19 bis 29 wurden zusammengenommen und zu einem Rückstand eingedampft. Dieser Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasenchromatographie, wie für die ot und (3 Komponenten beschrieben, gereinigt. Die Fraktionen 55 bis 62 wurden zusammengenommen, das Methanol wurde unter Vakuum verdampft, t-Butanol wurde zugegeben, und das Gemisch wurde lyophilisiert und ergab 60 mg reines LL-F28249 >γ.

- 43 Beispiel 4 Großtechnische Fermentation ' · ^; - -

Sin Inokulum von Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus, ilRRL 15773 wurde nach der Beschreibung von Beispiel 1 hergestellt, wobei 100 ml Primärinokulum zur Erzeugung von 10 Litern Sekundärinokulum verwendet wurden.

Zwei 300-Liter-Fermentationen wurden nach der Beschreibung von Beispiel 2 durchgeführt, wobei 10 Liter des obigen Sekundär inukulums für je 300 Liter Fermentationssubstrat verwendet wurden. Fach Ablauf von 118 Stunden wurden die Maischen geerntet.

Beispiel 5 Isolierung von LL~F28249fj

Sine Gesamtmenge von 450 Litern Erntemaische von den zwei in Beispiel 4 beschriebenen 300-Liter-Fermentationen wurden wie im" ersten Teil von Beispiel 3 beschrieben behandelt, so daß Rohmaterial in Form eines Sirups gewonnen wurde.

Dieser sirupartige Rückstand wurde mit Hexan zur Entfernung nicht-polarer Stoffe gewaschen, und die zurückbleibenden 9 g unlösliches Material wurden der Sephadex LH-20-7erteilungschromatographie unterzogen.

Die Chromatographie-Säule wurde mit 9 Litern Sephadex LH-20, das zuvor in Methanol gequollen worden war, vorbereitet, um eine Säule von 10 χ HO cm zu erhalten. Die Säule wurde äquilibriert, indem etwa 4800 ml mobile Phase (Methylenchlorid: Hexan:Methanol (10:10:1) mit einer Fließges.chwindigkeit von 5 ml/Minute hindurchgeleitet wurden. Die 9 g unlösliches Ma-

terial wurden in 50 ml der mobilen Phase auf die Säule aufgegeben. Es wurde ein erster Vorlauf von 2150 ml mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/Minute erzielt. Die Fließgeschwindigkeit wurde anschließend auf 8 ml/Minute erhöht, und Fraktionen wurden, aller 45 Minuten gesammelt. Die Fraktionen 9 bis 12 wurden zusammengenommen, und die Lösungsmittel wurden unter Vakuum verdampft, so daß 4>9 g Rückstand gewonnen wurden.

Dieser Rückstand wurde in einem 1:1-Gemisch von Cyclohexan und Sthylacetat gelöst und bei Raumtemperatur zum langsamen Verdunsten stehen gelassen. Durch die Zugabe von n-Kexan entstand ein Präzipitat, das gesammelt wurde und 3>1 g Feststoff ergab.

Eine 3₅0-g-Portion dieses Feststoffes wurde durch Ausfällung aus 25 ml Methylenchlorid unter Verwendung von 50 ml n-Hexan weiter gereinigt.

Das auf diese Weise gewonnene Präzipitat wurde wieder in 15 ml Methylenchlorid gelöst und mit 25 ml n-Kexan ausgefällt, so daß 510 mg reines LL-F28249 & gewonnen wurden.

Beispiel 6

Isolierung von LL-F28249 ^, t , % , % , 0 und L

Die Fraktionen 4 bis 7 von der in Beispiel 5 beschriebenen Sephadex-LH-20-Säule wurden zusammengenommen und die Lösungsmittel unter Vakuum verdampft, so daß 1,9 g Rückstand blieben.

Dieser Rückstand wurde auf einer 200-g-Silicagel-Säule (2,5 cm χ 83 cm) unter Verwendung von 10 fj Etbylacetat in Methylenchlorid.als Eluierungsmittel chromatographiert. Die

Fließgeschwindigkeit betrug etwa 2 ml/LIinute, und Fraktionen wurden aller 12 Minuten gesammelt.

Die Fraktionen 65 bis 67 und 73 bis 79 wurden alle zusammengenommen und die Lösungsmittel unter Vakuum verdampft, so daß 250 mg Rückstand blieben.

Diese 250 mg Rückstand wurden der präparativen Umkehrphasenchromatographie nach der Beschreibung in Beispiel 3 unterzogen, nur wurde 75 % Methanol in Wasser als mobile Phase verwendet. Die Pließgeschwindigkeit betrug etwa 10 ml/Minute. Die erste 2000-ml-Portion Eluat wurde in den Abfall geleitet, danach wurden 72 Fraktionen in Abständen von 2,0 Minuten gesammelt. Nachdem ein weiterer Seil Sluat beseitigt worden war, wurden (zwischen 3OO und 400 ml) Fraktionen wieder, aber im Abstand von 2,5 Minuten gesammelt.

Die Fraktionen wurden wie unten angegeben zusammengenommen. Die zusammengenommenen Fraktionen wurden über Wacht unter einer Abzugshaube zum Verdunsten stehen gelassen, danach .wurden die Komponenten in Methylenchlorid extrahiert. Each der Verdampfung des Lösungsmittels wurde jeweils etwa 1 mg von den reinen Komponenten gewonnen.

Zusammengenommene Fraktionen Verbindung

7-10 LL

19-22 LL-F28249 t

28 - 31 LL-P28249J

81 - 83 LL-F28249H

86 - 88 LL-F28249 Q

93 - 95 LL-F28249 I

Beispiel 7 Isolierung von LL-F28249 ^ Λ.> und. 9'

Eine Gesamtmenge von 3SO Litern der Fermentationsmaische, die von den nach der Beschreibung in Beispiel 2 durchgeführten Fermentationen geerntet worden war, wurde im wesentlichen nach der Beschreibung im ersten Abschnitt von Beispiel 3 behandelt und ergab 120 ml Methylenchloridkonzentrat. Dieses Konzentrat wurde mit 200 ml Hexan verdünnt und JToer Nacht bei 4 ⁰C gekühlt. Das resultierende Präzipitat wurde durch Filtration entfernt und verworfen. Das Filtrat wurde mit 300 ml Hexan verdünnt. Das resultierende Präzipitat (A) wurde durch Filtration gesammelt und aufbewahrt. Dieses Filtrat wurde zur Trockne eingedampft, und der ölige Rückstand wurde danach in 200 ml Methylenchlorid gelöst und mit 1700 ml Hexan verdünnt. Das resultierende Präzipitat (3) wurde durch Filtration gesammelt und aufbewahrt. Dieses Filtrat wurde zu einem öligen Rückstand eingeengt, der dann wieder in 50 ml Methylenchlorid gelöst wurde, 950 ml Methanol wurden dazugegeben, und diese .-Lösung wurde 3 Tage lang bei 4 ⁰C aufbewahrt. Das resultierende Präzipitat wurde durch Filtration entfernt und verworfen. Das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft, und der Rückstand (C) wurde mit (A) und (B) zusammengenommen und der Chromatographie wie folgt unterzogen: 5,0 χ 109 cm-Säule war mit breiigem V/oelm-TSC-Silicagel in Ethylacetat+Metlaylenchlorid (1:9) gefüllt. Die Säule wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch bei einer Geschwindigkeit von25 ml/Minute entwickelt. Die ersten 2 Liter Auslaufstrom wurden verworfen, dann wurden sechzehn 400-ml-Fraktionen gesammelt.

Die Fraktionen 2 und 3 wurden zusammengenommen und eingedampft und ergaben 3,9 g öliges Material (D).

Die Fraktionen 4 bis 7. wurden zusammengenommen und eingedampft und ergaben 3,5 g öliges Material, das in Hexan gelöst und auf einer mit 300 g breiigem Woelm-Silicagel in Ethylacetat:Hexan (1:4) gefüllten 2,5 x 110 cm-Säule chromatographiert wurde. Die Säule wurde mit dem gleichen Lösungsmittelsystem mit einer Geschwindigkeit 7on 4 ml/Minute entwickelt, wobei Fraktionen in Abständen von 7 Minuten gesammelt wurden.

Die Fraktionen 45 bis 54 wurden zusammengenommen und eingedampft und ergaben 0,3 g Material (E).

Die Fraktionen 63 bis 135 wurden zusammengenommen, bis zur Trockne eingedampft, danach wieder in 6-Butanol gelöst und lyophilisiert und ergaben 4,6 g gräulichen Feststoff (F).

LL-F28249 K. und /·»

Material (D) und (E) wurden zusammengenommen und auf einer mit 3OO g Woelm-Silicagel gefüllten 2,5 x 110 cm-Säule unter Entwicklung mit Sthylacetat:Hexan (1:9) chromatographiert. Die Fließgeschwindigkeit wurde auf 4 ml/Minute gehalten, und Fraktionen wurden in Abständen von 7 Minuten gesammelt.

Die Fraktionen 67 bis 115 wurden zusammengenommen und zur Trockne eingedampft und ergaben 920 mg Rückstand (G).

Dieser Rückstand (G) wurde durch präparative HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasensäule (Whatman C8, 2,2 χ 50 cm) und Entwicklung mit 85 % (V/V) !,!ethanol in Wasser chromatographiert. Die Fließgeschwindigkeit betrug etwa 10 ml/LIinute, und in.Abhängigkeit von 2,5 Minuten wurden Fraktionen gesammelt.

Die Fraktionen 33 bis 40 wurden zusammengenommen, zur Entfer-'nung von Liethanol eingeengt und anschließend mit Methylenchlorid extrahiert. Der nach dem Eindampfen gewonnene. Rückstand.-wurde in t-Butanol gelöst und danach lyophilisiert und ergab 60 mg 11-F28249 .

Die Fraktionen 52 bis 58 wurden ähnlich behandelt und ergaben eine geringe Menge LL-F28249 .

LL-F28249 λ

Eine 1-g-Portion von Material (F) wurde nach obiger Beschreibund durch Umkehrphasen-HPLC chromatographiert, nur wurden 80 % (V/V) Methanol in Wasser als Eluierungsmittel verwendet.

Die Fraktionen 61 bis 75 wurden zusammengenommen und wie oben behandelt, so daß 100 mg LL-F28249 Λ gewonnen wurden.

LL-F28249 1

Eine 396-g-Portioh eines Materials, das im wesentlichen das gleiche wie das obige Material (D) war, wurde in 500 ml Methanol gelöst, und anschließend mehrere Stunden lang bei 4 ⁰C gekühlt. Das resultierende Präzipitat wurde durch Filtration entfernt, mit kaltem Methanol gewaschen und verworfen. Das mit der Waschlösung zusammengenommene Filtrat wurde eingedampft. Das zurückbleibende öl wurde in Hexan gelöst und auf eine mit trockenem Silicagel gefüllte 5 x 50-cm-Säule (MaI-linkrodt SilicAR cc-7) aufgegeben. Die Säule wurde mit Ethylacetat:Hexan (1,5:8,5) mit einer Geschwindigkeit von etwa 50 ml/Minute eluiert.

Es wurden vier Fraktionen gesammelt:

Fraktion Volumen (Liter)

1 1

2 ' 4 '

3 1

4 2

Fraktion 3 wurde eingedampft und ergab 5,0 g Rückstand, der durch präparative Umkehrphasen-HPLC (Waters Cj₈, 5 x 60 cm) gereinigt wurde. Die Säule wurde anfangs mit 16 Litern 80 % Methanol in Wasser (V/V) bei 100 ml/Minute entwickelt, anschließend mit 6,4 Litern 84 % Methanol in Wasser (V/V). Der erste Liter Auslaufstrom wurde verworfen, und danach wurden Fraktionen von 400 ml gesammelt.

Die Fraktionen 44 bis 47 wurden zusammengenommen und wie oben beschrieben behandelt, so daß 330 mg LL-F28249 ^ als schwach gelber Feststoff gewonnen wurden.

Beispiel 8 Anti-nstmatode Wirksamkeit von LL-F28249, IRRL 15773

Bei diesem in vitro Versuch soll die frei lebende iiematode Caenorhabditis elegans (p_. elegans) zum Nachweis der antinematoden Wirksamkeit von Fermentationsbrühen gegen Bodenmikroorganismen benutzt werden. Das Versuchsverfahren besteht darin, daß 50 /Ul jeder Brühe in eine der 96 Vertiefungen einer Hikrokulturplatte mikropipottiert werden und 10 ,ul einer drei- bis vier Tage alten Kultur von C_. elegans (in allen Entwicklungsstadien), in C. briggsae Maintance Medium suspendiert, hinzugegeben v/erden. Die V/irkungen der Fermentationsbrühen werden beobachtet und 48 Stunden nach dem ersten Vermischen von Brühe und Ilematoden notiert.

. - 50 -

LL-F28249, IKRL 15773s Brühe tötete alle ausgewachsenen Organismen und reduzierte das überleben und die Beweglichkeit verschiedener Larvenstadien sowohl bei'dem ersten Versuch als auch bei.einem Wiederholungsversuch erheblich.

Beispiel 9 Insektizide Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen

Die insektizide Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen gegen eine Vielzahl von Insekten bei verschiedenen Konzentrationen von Wirkstoff in Aceton-Wasser-Lösungen wird durch die folgenden Insektiziden Testbeispiele bestimmt. Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle XVI zusammengefaßt.

A) Heliothis virescens, Eier, Baumwollkapselwurm.

Ein junges 7 bis 8 cm langes Baumwollblatt wird in eine Testsuspension eingetaucht und drei Sekunden lang darin bewegt. Eier werden auf Mull gesammelt, der in Quadrate von 10 bis 20 mm geschnitten wird., die -etwa 50 bis 100 Eier (6 bis 30 Stunden alt) enthalten. Ein Mullquadrat mit Eiern wird gleichfalls in die Testsuspension eingetaucht und auf das behandelte Blatt gelegt. Die Kombination wird zum Trocknen unter den Abzug gelegt. Danach wird die Kombination in eine 8-Unzen-Dixie-Schale lir. 2168-ST (240 ml, 6 cm hoch,, oberer Durchmesser 9,5 cm, unterer Durchmesser 8 cm) gegeben, die ein 5 cm langes Stück feuchten Dentaldocht enthält. Sin durchsichtiger Plastedeckel wird oben auf die Schale gelegt, und die Behandlung wird drei (3) Tage lang weitergeführt, bevor Sterblichkeit s zählung en vorgenommen werden..

B) Aphis fabae, gemischte Instar, Bohnenblattläuse.

Töpfe, die eine etwa 5 cm hohe einzelne Pflanze der Kapuziner-

kresse (TrοpaeοIum sp) enthalten, werden mit etwa 100 Blattläusen einen Tag vor dem Versuch infiziert. In einem Abzug wurde jede-Pflanze mit der Testsuspension bei 2'Umdrehungen auf einem Drehtisch mit 4 U/min unte'r Verwendung eines DeViI-luss-Zerstäuber Ur. 154 gespritzt. Die Töpfe werden seitlich, auf weiße Emailleschüsseln gesetzt und zwei (2) Tage lang dort gehalten. Danach werden die Sterblichkeitsbeurteilungen der Blattläuse vorgenommen.

C) Empoasca abrupta, Erwachsene "Westliche Kartoffelblatt hüpfer" ^

Ein etwa 5 cm langes Sieva-Limabohnenblatt wird in die Testsuspension eingetaucht und drei (3) Sekunden lang darin bewegt und danach zum Trocknen unter einen Abzug gelegt. Das Blatt wird in eine 100 χ 10 mm große Petrischale gelegt, die ein feuchtes Filterpapier auf dem Schalenboden enthält. Danach werden 10 ausgewachsene "Blatthüpfer" in .jede Schale gegeben, und die Behandlung wird drei (3) Tage lang fortgeführt, worauf die Sterbliciakeitszählungen vorgenommen werden.

D) Trichoplusia ni, dritte Instar-Larven, "Kohlspanner".

Die bis zu einer Länge von 7 bis 8 cm gewachsenen Blätter einer Sieva-Limabohnenpflanze werden in eine Testsuspension eingetaucht und drei (3) Sekunden lang darin bewegt und danach zum Trocknen unter einen Abzug gelegt. Ein Blatt wird danach abgeschnitten und in eine 100 χ 10 mm größe Petrischale, die ein feuchtes Filterpapier auf dem Boden enthält, gelegt, und zehn dritte Instar-Larven v/erden darin untergebracht. Die Schale wird drei (3) Tage stehen gelassen, bevor Beurteilungen über die Sterblichkeit und reduzierte Futteraufnähme angestellt werden.

Ξ) Spodoptera eridanis, dritte Instar-Larven, "Südlicher Heerwurm".

Die Blätter einer Sieva-Limabohnenpflanze mit einer Länge von 7 bis 8 cm werden in die Testsuspension eingetaucht und drei (3) Sekunden lang darin bewegt und dann zum Trocknen unter einen Abzug gelegt. Ein Blatt wird danach abgeschnitten und in.eine, ein feuchtes Filterpapier auf dem Boden enthaltende Petrischale von 100 χ 10 mm gelegt, und zehn (10 dritte Instar-Larven werden hinzugegeben. Die Schale wird fünf (5) Tage lang stehen gelassen, bevor Beurteilungen hinsichtlich der Sterblichkeit, reduzierten Futteraufnähme oder irgendwelcher Störungen der normalen Häutung angestellt werden.

F) Heliothis virescens, dritte Instar-Larven, Baumwollkapselwurm

Baumwollkeimblätter werden in die Testsuspension eingetaucht und zum Trocknen unter einen Abzug gelegt. Das Keimblatt wird in 4 Stücke geschnitten, und jedes Stück wird in eine 30-ml-Plastemedizinschale, die ein 5 bis 7 mmuanges Stück feuchten Dentaldochtes enthält, gegeben. In jede Schale wird eine dritte Instar-Larve gelegt, und ein Pappdeckel wird auf jede Schale gelegt. Die Behandlungen werden drei (3) Tage lang fortgeführt, bevor Zählungen der Sterblichkeit und Beurteilungen über reduzierte Futteraufnähme angestellt werden.

G) Mus ca domestica, Hausfliege.

Die verlangte Konzentration der.Testverbindung wird zu dem Standard-CSMA-Luzerne-Kleie-Larvenmedium gegeben, lull bis 4 Stunden alte Hausfliegeneier werden in das behandelte Medium gegeben. Das behandelte Medium wird stehen gelassen, und Beobachtungen hinsichtlich des Eischlüpfens, Larvenwachstums und des Auskriechens von erwachsenen Tieren werden angestellt.

— 53 — H) Tribolium confusurg, amerikanischer Reismehllcäf er.

Amerikanische Reismehllcäf er (Tribolium confusum) werden von Laboratoriumskolonien, die auf einem Gemisch von Weizenvollkorn- und Weißmehl gezüchtet wurden, bezogen. Pur diesen Test wird Weißmehl mit einer Acetonlösung des Testmaterials behandelt, wofür 1 ml Lösung pro 5 Gramm Mehl in einem 30-ml-Weithalskolben verwendet werden. Das Aceton kann über lacht unter einem Abzug verdunsten. Der Inhalt wird mit einem Spachtel gerührt,, um durch die Testlösung gebildete Klumpen zu zerteilen. Der Kolben wird danach auf einen VORTES-GEIiIE "^L -Vibrationsmischer gestellt, um die Testmaterialien gründlich mit dem Putter zu vermischen. Zehn ausgewachsene amerikanische Reismehlkäfer werden in jeden Kolben gegeben und der Kolben wird lose verschlossen. lach fünf (5) Tagen Zeit zur Eiablage v/erden die Käfer entnommen und Aufzeichnungen über die Sterblichkeit gemacht. Zwei (2) und vier (4) Wochen nach dem anfänglichen Befall werden Beobachtungen über die Anzahl und Größe der von den sich entwickelnden Larven im behandelten Mehl erzeugten Spuren angestellt. Solche Beobachtungen liefern einen Hinweis auf verzögertes Wachstum» Absterben von Eiern'oder Larven oder irgendwelche anderen Störungen im normalen Entwicklungsverlauf. Nach etwa neun (9) Wochen bei 27 ⁰C schlüpfen die erwachsenen Käfer, und die abschließenden Beobachtungen v/erden durch Sieben des Inhalts jedes Kolbens durch ein 50-Maschen-Sieb vorgenommen. Diese Beobachtungen betreffen die Anzahl erwachsener Tiere, Puppen und Larven, sowie die Untersuchung der Rückstände, die nicht durch das Sieb hindurchgingen, um zu ermitteln, ob sich darin irgendwelche abgestorbenen Eier oder Keonatem befinden.

D Tetranychus urticae (P-resistenter Stamm), Gemeine Spinnmilbe

Sieva-Limabohnenpflanzen mit 7 bis 8 cm langen Blättern werden ausgewählt und auf eine Pflanze je Topf reduziert. Ein kleines Stück wird von einem der Hauptkolonie entnommenen Blatt abgeschnitten und auf jedes Blatt der Testpflanzen gelegt. Das erfolgt etwa zwei (2) Stunden vor der Behandlung, damit die Milben auf die Testpflanze kriechen und Eier ablegen können. Die Größe des abgeschnittenen Stückes wird variiert, damit etwa 100 Milben je Blatt erhalten werden. Zum Zeitpunkt der Behandlung wird das zur Übertragung der Milben verwendete Blattstück entfernt und weggeworfen. Die mit Milben infizierten Pflanzen werden in die Testformulierung eingetaucht und.drei (3) Sekunden lang darin bewegt und unter einen Abzug zum Trocknen gelegt. Die Pflanzen werden zwei (2) Tage lang stehen gelassen, bevor mit den Beurteilungen über die Abtötung ausgewachsener Tiere unter Verwendung des ersten Blattes begonnen wird. Das zweite Blatt wird weitere fünf (5) Tage an der Pflanze gelassen, bevor Beobachtungen über die Abtötung von Eiern und/oder frisch geschlüpfte Nymphen angestellt werden.

J) "Südl eher Heerwurin" (Spodoptera eridania) , dritte Instar, systemischer Stengelschnitt-Test.

Die Verbindung wird als Emulsion formuliert, die 0,1 g Testmaterial, 0,1 g poiyethoxyliertes Pflanzenöl in 0,4 g Wasser, 10 ml Aceton und 90 ml Wasser enthält. Dieses Gemisch wird zehnfach, mit Wasser verdünnt, um die 100 ppm Emulsion für den Test zu gewinnen. Sieva-Limabohnenpflanzen mit gerade entwickelten Primärblättern werden für diesen Versuch verwendet. Diese. Blätter werden mindestens 2,5 cm über dem Erdboden abgeschnitten, um eine Verunreinigung mit Bodenbakterien zu verhindern, die zu einem Paulen des Stengels während des Tests führen könnten. Die zerschnittenen Stengel

werden in die Testemulsion gelegt, lach drei (3) Tagen Aufnahme, wird ein Blatt abgeschnitten und' in eine 100 χ 10 mm große. Petrischale, die ein feuchtes' Filterpapier auf dem Boden und zehn dritte Instar-Larven enthält, gelegt, ilach drei (3) Tagen werden Zählungen der Sterblichkeit und Beurteilungen über reduzierte Putteraufnähme angestellt.

palffli, Blasenfüßer.

Stark infizierte Blätter von Baumwollsämlingen werden unter Peldbedingungen mit den verlangten Konzentrationen gespritzt. Die Anzahl der Blasenfüßer wird vor und nach dem Spritzen gezahlt. Die prozentuale Bekämpfung basiert auf diesen Zählungen.

^) Tetraychus urticae (P-resistenter Stamm), Gemeine Spinnmilbe

Die Verbindung wird als Emulsion formuliert, die 0,1 g des Testmaterials, 0,1 g polyethoxyliertes Pflanzenöl in 0,4 g Wasser, 10 ml Aceton und 90 ml Wasser enthält. Dieses Gemisch wird zehnfach mit Wasser verdünnt, um die 100 ppm Emulsion für den Versuch zu gewinnen. Sieva-Limabohnenpflanzen mit gerade entwickelten Primärblättern werden für den Versuch verwendet. Sie werden mindestens 2,5 cm über dem Erdboden abgeschnitten, um eine Verunreinigung durch Bodenbakterien zu verhindern, die zum Paulen des Stengels während des Tests führen könnten. Die geschnittenen Stengel werden in die Testemulsion gegeben. Jedes Blatt wird mit' annähernd 100 ausgewachsenen Milben infiziert und drei (3) Tage lang liegen gelassen, bevor Zählungen der Sterblichkeit vorgenommen* werden.

Tabelle XVI

Insektizide und mitizide Aktivität von ff-28249 Q^ und P-28249

Prozentuale Sterblichkeit

Verbindung Konz« Kohl- Südl. Baum- Baum- Boh- Westl. Reis- Haus- BIa- MiI-in käfer Heer- woll- woll- nen Kar- mehl- file- sen ben ppm wurm kap- kap- blatt- tof- käfer- gen füs-

sel- sei- laus fei- Larven lar- ser v/urm wurm blatt- u./oder ven Eier käfer -Puppen

Systemische

Pflanzenaktivität Südl. MTl-Heer- ben wurm

P-28249	1000	100	100	100	-	-	55	100	100	93	-	-
P-28249	300	10O+	-	100	100	-	50	-	100	89		100
P-28249	100	-	6O+	10O+	100	100	-	97	-	-	100
P-28249	1000	-	40	5O+	100	100	20	-	-	100
P-28249	100		0	0	0	100	0			90

Putteraufnahme reduziert (Anti-Preß-Eigenschaften)

Claims (3)

- 57. Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bekämpfung von Pflanzennematöden, gekennzeichnet dadurch, daß auf das Blattwerk von Pflanzen, auf den Boden, in dem sie wachsen, oder in deren Stämme eine nematozid-wirksame Menge einer Fermentationsbrühe oder Vollmaische des Mikroorganismus Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus mit der Hinterlegungs-Zugangsnummer I¹JPlRL 15773 aufgebracht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Fermentationsbrühe oder Vollmaische des Mikroorganismus Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus mit. der

. Hinterlegungs-Zugangsnummer HRRL 15773 Mittel enthalt, die als LL-F28249 <^~ , LL-P28249 β , LL-F28249 ψ , LL-F28249 (f , LL-F28249 I , LL-F28249 % , LL-F28249 U , : LL-F28249 Ö , LL-F28249 <- , LL-F28249 K , LL-P28249 Λ , LL-F28249 /* , LL-F28249 ^ und LL-F28249 <ö bezeichnet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß etwa 0,1 bis 1,4 kg Fermentationsbrühe oder

'Vollmaische je Hektar aufgebracht werden.

- Hierzu 57 Blatt Zeichnungen -