DD253643A5 - Verfahren zur herstellung von neuen, zur bekaempfung von pflanzennematoden geeigneten antibiotischen verbindungen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen antibiotischen Verbindungen mit den Bezeichnungen LL-F 28249 a, -b, -g, -d, -e, -z, -h, -q, -j, -k, -l, -m, -n und -v. Es ist dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus Streptomyces cyaneogriseus noncyanegenus NRRL 15773 oder eine LL-F 28249 a, b, g, d, e, z, h, q, j, k, l, m, n und v erzeugende Mulante davon in einem fluessigen Naehrsubstrat, das assimilierbare Quallen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Anionen und Kationen enthaelt, aerob fermentiert wird, bis eine nennenswerte Menge von LL-F 28249 a, b, g, d, e, z, h, q, j, k, l, m, n undv in den Naehrsubstrat erzeugt worden ist, woraufhin die obigen Verbindungen daraus gewonnen werden. Die neuen Verbindungen stellen verbesserte Wirkstoffe zur Bekaempfung und Verhuetung helminthischer, arthropod-ectoparasitischer und akarizider Infektionen bei Warmbluetern dar.

Description

Hierzu 57 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen, zur Bekämpfung von Pflanzennematoden geeigneten antibiotischen Verbindungen, die gemeinsam als LL-F 28249 bezeichnet werden. Im einzelnen sind die neuen Verbindungen zur Behandlung oder Bekämpfung helmintischer, arthropod — ectoparasitischer und akarizider Infektionen bei Warmblütern geeignet.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die oben genannten Erkrankungen haben nicht nur vernichtende Wirkungen, sondern sie führen auch zu schwerwiegenden wirtschaftlichen Problemen und Verlusten bei Landwirten, die fleischliefernde Tiere wie Schweine, Schafe, Rinder, Ziegen, Kaninchen und Geflügel halten. Außerdem bilden derartige Erkrankungen eine große Gefahr für Haustiere, wie Pferde, Hunde und Katzen. Obwohl man diese Erkrankungen seit vielen Jahren kennt und Medikamente zur Behandlung und/oder Verhütung solcher Erkrankungen zur Verfügung stehen, wird erfindungsgemäß eine vollkommen neue Reihe aktiver Mittel, die von einem bisher unbekannten Mikroorganismus isoliert wurden, für die Verhütung, Behandlung oder Bekämpfung dieser Erkrankungen eingesetzt. _:

Zum Beispiel werden in der US-PS 3.950.360 bestimmte durch Züchtung eines Streptomyces Mikroorganismus gewonnene antibiotische Substanzen beschrieben und daß diese Verbindungen als Insektizide und Akarazide nützlich seien. Wie man aber aus den einen solchen Mikroorganismus identifizierenden Merkmalen feststellen kann, unterscheidet sich der erfindungsgemäße Mikroorganismus, und seine aktiven Bestandteile werden von einem völlig anderen Mikroorganismus gewonnen. Des weiteren betrifft eine ganze Serie von US-PSn bestimmte Verbindungen, die durch Fermentation von Streptomyces avermitilis, eines sich vom erfindungsgemäßen deutlich unterscheidenden Mikroorganismus, gewonnen werden (US-PS 4.171.314; US-PS 4.199.569; US-PS 4.206.205; US-PS 4.310.519; US-PS 4.333.925). Die US-PS 4.423.209 betrifft das Verfahren zur Umwandlung von einigen dieser weniger wünschenswerten Komponenten in bevorzugtere. Die erfindungsgemäßen aktiven Mittel, die als LL-F 28249a, ß, y, S, ε, ζ, η, Θ, ι, κ, λ, μ, ν und ω identifiziert werden, stammen aus der Fermentation eines vor kurzem entdeckten und bisher noch nicht gezüchteten Mikroorganismus. Die erfindungsgemäßen Verbindungen und/oder die Fermentationsbrühe oder Vollmaische des Mikroorganismus Streptomyces cyaneorgriseus ssp. noncyanogenus NRRL 15773 plus die pharmazeutisch und pharmakologisch-annehmbaren Salze davon (zusammen als Wirkstoff bezeichnet) ergeben außerdem ausgezeichnete und wirksame Behandlungen dieser schweren Erkrankungen bei Warmblütern und/oder können diese verhüten.

Tabelle A Vergleich von F 28249 und ISP 5534 auf ISP-Morphologie-Testnährsubstraten

(Zahlen stammen von NBS-ISCC)

Nährsubstrat	A.m.1	F28249	ISP 5534
Hefe-Malz		mittelgrau	hell bis mittelgrau
(ISP2)	V.m.	(265)	(264-266)
		hell-lederfarben	hell-lederfarben-
		(75)	weiß bis schwarz
	S.p.	dunkelgelb-braun	blau (188)
	Ä. m.	hellbraun	hellbraun
Anorganische		hell-oliv-grau	mittelgrau (265)
Salze		(112)bis
Stärke (ISP 4)	V.m.	mittelgrau (265)
		dunkelgrau bis	grau-purpurartig-
	S.p.	schwarz (266-267)	blau (204)
		gräulich-gelblich	keine
	A.m.	braun
Glycerol-		263 (weiß) bis	263 weiß bis hell
Asparagin	V.m.	gelblich-grau (93)	grau (264)
(ISP 5)		schwarz (267) bis	grau-purpurartig-
		hell-oliv-braun	blau (203-204)
	S.p.	(96)
	A.m.	leicht bräunlich	hell-gelblich-grau
Hafermehl	V.m.	gelb-grau (93)	keine
ISP3)	S.p.	farblos	farblos
	leicht gelblich	keine

A.m. = Luftmyzel V.m. = vegetatives Myzel S.p. = lösliches Pigment

Tabelle B Vergleich von Lederle F 28249 mit ISP 5534 (Gordon Tests)

F28249

ISP 5534

Züchtung auf/bei

Salicin 1O⁰C 45 °C

Erzeugung von

Urease

Decarboxylierung von

Mucate

Säureproduktion

Raffinose Sucrose

Beide Stämme zeigen folgende Reaktionen:

Positiv Hydrolyse von Casein, Hypoxanthin, Xanthin, Tyrosin, Adrenin, Kartoffelstärke, Gelatine und Esculin; Erzeugung von Phosphatase Sensibilität für Lysozym Decarboxylierung von Acetat, Citrat, Lactat, Malat, Oxalat und Propionat Säureproduktion von Arabinose, Cellobiose, Dextrin, Fructose, Galactose, Glucose, Glycerol, Lactose, Maltose,

Mannose, a-Methyl-D-glucosid, Rhamnose, Salicin, Trehalose. Negativ Erzeugung von Nitratreduktase Decarboxylierung von Benzoat und Tartrat Säure von Adonitol, Dulcitol, Erythritol, Inositol, Mannitol, Sorbitol, /3-Methyl-D-xylosid.

Züchtung auf 5% NaCI

Der volle Name des Mikroorganismus LL-F 28249, NRRL N.15773 hinsichtlich Gattung, Art und Unterart ist Streptomyces cyaneogrisens noccyanegenus, im folgenden wird aber häufig nur die obige Kurzbezeichnung verwendet. Der Stamm wird aufgrund der Morphologie und der Zellchemie (Gehalt des L-Isomeren von Diaminopimelinsäure der Gattung Streptomyces zugeordnet. Die Morphologie und die physiologischen Daten des Stammes stellen diesen in die Nähe von S. cyaneogriseus, wie durch ISP 5534 (ATCC 27426) vertreten. Dann wurden Vergleiche hinsichtlich der Bildung von grauen löslichen Luftmyzelpigmenten auf Nährsubstraten (Tabelle A) und geknäulten Ketten von glatten Conidien (3 bis 5 Sporen je Kette) angestellt. Der erfindungsgemäße Stamm ist gegenüber blauem löslichem Pigment negativ, worin derVergieichsstamm, ISR 5534, positiv ist. Die Stämme zeigen ähnliche Reaktionen bei den ISP-Kohlehydrat-Verwertungstests und zeigen sich positiv bei Arabinose, Fructose, Glucose, Rhamnose und Xylose, während sie negativ bei Inositol, Mannitol, Raffinose und Sucrose reagieren (ISP 5534 leicht positiv). Die Stämme unterscheiden sich jedoch in verschiedenen Merkmalen (Tabelle B) von den 53 bei

den Gordon-Tests. Diese Unterschiede unterstützen die Schaffung einer Unterart von S. cyaneogenesusfür den bei der Erfindung verwendeten Mikroorganismus.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, einen verbesserten Wirkstoff zur Bekämpfung des vorgennanten Infektionens bereitzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

DerErfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zurHerstellung von Verbindungen mit den Bezeichnungen LL-F 28249a, ß, y, δ, ε, ξ, η, Θ, ι, κ, λ, μ, ν und ω bereitzustellen.

Die Kultur von Streptorhycescyaneogriseusnoncyanegenus (LL-F 28249 und unter NRRL Nr. 15773 hinterlegt) wurde aus in Südaustralien gefundenem Mallee-Sand isoliert.

Die gestellte Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß der Organismus Streptomyces cyaneogriseusnoncyanegenus, NRRL 15773 oder eine LL-F 28249α, β, γ, E, ξ, η, Θ, ι, κ, λ, μ, β, ν und ω erzeugende Mutante davon in einem flüssigen Nährsubstrat, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Anionen und Kationen enthält, aerob fermentiert wird, bis eine nennenswerte Menge von LL-F 28249a, 0, y, δ, ε, ξ, η. Θ, ι, κ, λ, β, ν und ω im Nährsubstrat erzeugt wurden, woraufhin die obigen Verbindungen daraus gewonnen werden.

Zweckmäßig wird hierbei das Nährsubstrat mit einer lebensfähigen Kultur des obigen Organismus bzw. der betreffenden Mutante davon geimpft. Die Fermentationskultur wird zweckmäßig 80 bis 200 Stunden lang unter steriler Belüftung und Bewegung bei einer Temperatur von 24 bis'32⁰C gehalten, woraufhin man die Maische erntet und die Verbindungen extrahiert.

Die Struktur und die Stereochemie von LL-F 29249 sind nicht vollkommen definiert, aber die vorgeschlagenen Strukturen werden anschließend gezeigt. Die Komponente LL-F 29249 ist mit Hondamycin (Albimycin) verwandt, das in The Journal of Antibiotics, 22, Nr. 11, 521 bis 526 (1969) beschrieben ist.

OH

CH

LL-F 28249^μ	Ri	R2	R3	Ra	R5	R6	R5+ Re	A-B	B-C
Komponente	CH(CHa)2	H	CH3	CH3			-0-CH2-	CH-CH	CH=C
LL-F28249a	CH3	H	CH3	CH3			-0-CH2-	CH-CH	CH=C
LL-F28249/3	CH3	CH3	CH3	CH3			-0-CH2-	CH-CH	CH=C
LL-F28249y	CH3	CH3	CH3	CH3	OH	CH2OH		CH-CH	CH=C
LL-F282496	CH(CH3I2	H	H	CH3			-0-CH2-	CH-CH	CH=C
LL-F282498	CH2CH3	H	CH3	CH3			-0-CH2-	CH-CH	CH=C
ίί-Ρ28249ζ	CH(CH3)2	H	CH3	CH3			-0-CH2-	C=CH	CH-CH
LL-F28249n	CH(CH3),	H	CH3	CH2CH3			-0-CH2-	CH-CH	CH=C
LL-F28249©	CH(CH3J2	H	CH2CH3	CH3			-0-CH2-	CH-CH	CH=C
LL-F282491	CH3	CH3	CH3	CH3	H	CH3		CH-CH	CH=C
LL-F28249K	CH(CHs)2	CH3	CH3	CH3			-0-CH2-	CH-CH	CH = C
LL-F28249\	CH(CHs)2	CH3	CH3	CH3	H	CH3		CH-CH	CH=C
LL-F28249M

OH

OH

H₃C

HO

OH

In den Zeichnungen stellen dar:

Fig. 1: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-F28249a, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Fig.2: Charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum der LL-F28249a, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-F2.8249a, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDC^-Lösung.

Charakteristisches magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum der LL-F28249a, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCI₃Lösung.

Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-F28249a, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-F28249/3, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum der LL-F28249ß, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-F28249/3, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung JnCDCI₃.

Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-F28249/3, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-F28249-y, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum der Verbindung LL-F28249y, NRRL 15773.

Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der Verbindung LL-F28249-y, NRRL 15773, in CDCI₃.

Charakteristisches magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum der LL-F28249y, NRRL 15773, bezeichneten

Verbindung in CDCI₃. · '

Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-F28249y, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-F28249ü), NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum der LL-F28249co, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-F28249co, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCI₃.

Fig.5: Fig. 6: Fig.7: Fig.8:

Fig.9: Fig.10: Fig. 11: Fig.12: Fig.13:

Fig. 14: Fig. 15: Fig.16: Fig. 17:

Fig. 18: Charakteristisches magnetisches Kernresonanzspektrum der LL-F28249co, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCI₃.

Fig. 19: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-F28249co, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.20: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-F282498, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.21: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-F28249S, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCI₃.

Fig.22: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-F282493, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.23: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-F28249s, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig. 24: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-F28249s, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCI₃.

Fig.25: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-F28249e, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig. 26: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der ίί-Ρ28249ζ, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig. 27: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der ίί-Ρ28249ζ, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCI₃.

Fig.28: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der ίί-Ρ28249ζ, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.29: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-F28249r], NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.30: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-F28249 η, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCI₃.

Fig.31: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-F28249r|, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.32: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-F282498, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.33: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-F282498, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCI₃.

Fig.34: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-F282499, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.35: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-F28249i, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.36: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-F28249i, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCI₃.

Fig.37: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-F282491, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.38: "Charakteristisches magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum der LL-F28249ß, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung in CDCI₃-Lösung.

Fig. 39: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-F28249K, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.40: Charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum der LL-F28249κ, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.41: Charakteristisches Elektronenstoß-Massensprektrum der LL-F28249K, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.42: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-F28249k, NRRL 15773 bezeichneten

Verbindung

Fig.43: Charakteristisches magnetisches Kohlenstoff-13-Kemresonanzspektrum der LL-F28249«, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Fig.44: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-F28249λ, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.45: Charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum der LL-F28249A, NRRL 15773 bzeichneten Verbindung. Fig.46: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-F28249X, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.47: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-F28249A, NRRL 15773 bezeichneten

Verbindung

Fig.48: Charakteristisches magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum der LL-F28249λ, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Fig.49: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-F28249p, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung! Fig. 50: Charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum der LL-F28249μ, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.51: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-F28249p, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.52: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-F28249μ, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

Fig. 53: Charakteristisches Ultraviolett-Absorptionsspektrum der LL-F28249v, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig. 54: Charakteristisches Infrarot-Absorptionsspektrum der LL-F28249 v, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.55: Charakteristisches Elektronenstoß-Massenspektrum der LL-F28249v, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung. Fig.56: Charakteristisches magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum der LL-F28249v, NRRL 15773 bezeichneten

Verbindung

Fig. 57: Charakteristisches magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum der LL-F28249v, NRRL 15773 bezeichneten Verbindung.

- b - <COO OtO

Es wurde entdeckt, daß die oben genannten Mittel sowie die Fermentationsbrühe und die Vollmaische des Mikroorganismus besonders wirksam für die Bekämpfung helminthischer, arthropodectoparasitischer und akarider Infektionen bei fleischliefernden Tieren wie Rindern, Schaferi, Schweinen, Kaninchen, Geflügel wie Hühnern, Truthühnern, Enten, Gänsen, Wachteln und Fasanen sowie Haustieren sind.

In der Praxis besteht das erfindungsgemäße Verfahren der Verhütung, Bekämpfung oder Behandlung dieser Infektionen bei Warmblütern darin, daß diesen oral, parenteral oder lokal eine prophylaktisch, pharmazeutisch oder therapeutisch-wirksame Menge der Fermentationsbrühe oder der Vollmaische des Mikroorganismus Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus, NRRL 15773, der Fermentationsbrühe oder Vollmaische des Mikroorganismus, welche die LL-F 28249 α, β, γ, δ, ε, ζ, η, θ, ι, κ, λ, μ, ν und ω, als LL-F28249am LL-F28249ß, LL-F28249y, LL-F28249S, LL-F28249s, .LL-F28249ζ, LL-F28249n, LL-F282499, LL-F282491, LL-F28249K, LL-F28249A, LL-F28249p, LL-F28249 ν, LL-F28249ü) bezeichneten Verbindungen nach der hier erfolgten Identifikation und Charakterisierung, oder die pharmazeutisch und pharmakologisch-annehmbaren Salze davon enthält (insgesamt als Wirkstoff bezeichnet).

Obwohl die Verarbeitung der Verbindung oder Fermentationsbrühe/Vollmaische (im folgenden Brühe oder Maische) im allgemeinen am praktischsten in oder mit dem Futter oder im Trinkwasser erfolgen wird, können die oben genannten Verbindungen, Brühe oder Maische oder pharmazeutisch und pharmakologisch-annehmbaren Salze davon auch den einzelnen Wirten in Form von Tabletten, Arzneitränken, Gelen, Kapseln oder dergleichen oder durch Injektion in Form einer Paste, eines Gels, Pellets oder einer Lösung verabreicht werden. Diese zuletzt genannten Verabreichungsmethoden sind natürlich für die Behandlung großerTiergruppen weniger angebracht, eignen sich aber durchaus bei wenigen Tieren oder auf individueller Basis.

Wenn die Mittel (Antibiotika) LL-F 28249 α, β, γ, δ, ε, ζ, η, θ, ι, κ, λ, μ, ν oder ω oder wenn die Fermentationsbrühe oder Vollmaische von Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus NRRL 15773 als prophylaktische oder therapeutische Behandlungen von helminthischen, arthropod ectoparasitischen und akäraziden Infektionen bei Tieren und Geflügel angewendet werden, werden im allgemeinen etwa0,05ppm bis 500,0 ppm, und vorzugsweise 0,1 ppm bis 300 ppm, des Mittels, der Brühe oder Maische nach obiger Beschreibung, wenn sie dem Tier im Futter oder dem Trinkwasser verabreicht werden, zur Verhütung, Bekämpfung oder Behandlung dieser Infektionen bei den genannten Tieren wirksam sein.

Mit Arzeimitteln behandeltes Futter (medikamentöse Futter), das für das erfindungsgemäße Verfahren brauchbar ist, wird im allgemeinen durch gründliches Vermischen von etwa 0,00001 Ma.-% bis etwa 0,01 Ma.-% des Mittels (Antibiotikums) oder der oben beschriebenen Brühe oder Maische mit ein em ernährungswissenschaftlich abgestimmten Futter, zum Beispiel dem in den folgenden Beispielen beschriebenen Futter hergestellt.

Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Mittel und/oder Brühe oder Maische für die Verhütung oder Bekämpfung von Helminthen, arthropoden Ectoparasiten und Akariden wird die aktive Substanz normalerweise zuerst als Tierfutter-Vormischung hergestellt. Die Vormischung enthält normalerweise einen verhältnismäßig hohen Prozentsatz des Wirkstoffes und wird im allgemeinen mit dem Tierfutter unmittelbar vor der Verabreichung vermischt. Auf Wunsch kann die Futtervormischung auch als aufgestreuter Zusatz für die tägliche Ration des Tieres verwendet werden.

Für die erfindungsgemäße Praxis brauchbare Futtervormischungen oder Konzentrate können durch Vermischen von etwa 0,1 bis 0,5Ma.-% der oben erläuterten Mittel, Brühe oder Maische oder pharmazeutisch und pharmakologisch-annehmbaren Salze davon mit etwa 99,9 bis 95 Ma.-% eines geeigneten Trägermittels oder Verdünnungsmittels zubereitet werden.

Trägermittel, die sich für die Herstellung der Futterzusatzpräparate eignen, sind die folgenden: Luzernemehl, Sojabohnenmehl, Baumwolisamenölmehl, Leinsamenölmehl, Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Calciumsulfat, Maismehl, Zuckerrohrmelasse, Harnstoff, Knochenmehl, Maiskolbenmehl, Reisschalenmehl und dergleichen. Das Trägermittel unterstützt eine im wesentlichen gleichmäßige Verteilung des Wirkstoffes in dem fertigen Futter, in das der Zusatz eingemischt wird. Es erfüllt somit eine wichtige Funktion, indem es die einwandfreie Verteilung des Wirkstoffes, z.B. von etwa 0,1 ppm bis 100 ppm davon im gesamten Futter garantiert. Diese sind 0,00001 bis 0,01 Ma.-% Wirkstoff im fertigen Futter äquivalent. In der Praxis werden normalerweise ein oder mehrere Pfund Vormischung je Tonne Futter zugesetzt, um die erwünschte Menge von Mittel (Antibiotikum) oder Brühe oder Maische in dem fertigen Futter zu erhalten.

Wenn der Zusatz oder die Vormischung als aufgestreute Ergänzung für das Futter verwendet wird, wird dadurch gleichfalls die gleichmäßige Verteilung des Wirkstoffes auf der Oberseite des angereicherten Futters gesichert.

Da die erfindungsgemäßen Verbindungen und ihre pharmazeutisch und pharmakologisch-annehmbaren Salze in Wasser ziemlich unlöslich sind, empfiehlt es sich im allgemeinen bei der Verabreichung jeder derartigen Verbindung.im Trinkwasser des Tieres, den Wirkstoff in einem organischen Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol, Aceton, DMSO, Ölsäure, Linolsäure, Propylenglycol oder dergleichen aufzulösen und mit der Lösung eine geringe Menge von oberflächenaktivem Mittel und/oder Dispergiermittel zu vermischen, wodurch die Auflösung und/oder Dispersion des Wirkstoffes im Trinkwasser des Tieres gewährleistet wird.

Wenn die Behandlung einer kleinen Gruppe der größeren fleischliefernden Tiere zur Bekämpfung parasitischer Infektionen erforderlich ist, dann können die Mittel LL-F28249 α, β, γ, δ, ε, ζ, η, θ, ι, κ, λ, μ, ν und ω, die Brühe oder Maische oder die pharmazeutisch oder pharmakologisch-annehmbaren Salze davon dem Wirtstier mit Erfolg oral in Form eines medikamentösen Gels täglich verabreicht werden.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe haben darüber hinaus nematozide Wirksamkeit bei Pflanzennematoden gezeigt, wie durch den Erfolg bei der Bekämpfung derfreilebenden Bodennematode C. elegans demonstriert wurde. Zusammensetzungen, die diese Wirkstoffe zur Bekämpfung von Pflanzennematoden enthalten, können entweder als Flüssigkeiten oder oberflächenaktive Pulver formuliert werden. Flüssige Zusammensetzungen enthalten etwa 5% bis 20% M/M des Wirkstoffes (aktive Substanz, Fermentationsbrühe, Vollmaische oder.Salze) mit entsprechenden Mengen eines Lösungsmittels wie Methanol, Ethanol, Aceton, Acetonitril, und andere und als Rest Wasser. Oberflächenaktive Pulver enthalten etwa 5% bis 20%, M/M des Wirkstoffes, etwa 1 % bis 10% oberflächenaktives Mittel und inerte Trägermittel wie Tonarten, Vermiculit, Ruß oder dergleichen. Etwa 0,1 bis 1,4kg je Hektar werden auf das Blattwerk von Pflanzen, den Boden, in dem diese wachsen, oder deren Stämme aufgebracht.

Diese Mittel sind auch als lokale Insektizide, Magengifte und systemische Insektizide wirksam und sind besonders wirksam bei der Bekämpfung von Insekten der Gattungen Lepedoptera, Coleoptera, Homoptera, Deptera und Thysanoptera. Pflanzenmilben, Akariden, können ebenfalls durch die erfindungsgemäßen Mittel bekämpft werden.

Diese Mittel werden im allgemeinen als verdünnte, feste oder flüssige Zusammensetzungen auf den Fortpflanzungsboden, die Nahrungsquelle oder die Wirtspflanze solcher Insekten und/oder Akariden aufgebracht. Die Anwendungsmenge für solche Stellen umfaßt etwa 0,01 kg/ha bis etwa 8,0 kg/ha, vorzugsweise etwa 0,05 kg/ha bis etwa 0,5 kg/ha.

Für die erfindungsgemäßen oberflächenaktiven Pulver brauchbare oberflächenaktive Mittel umfassen die normalerweise für die Formulierung solcher oberflächenaktiver Pulver verwendeten, vorzugsweise Alkylbenzensulfonatnatriumsalze, Bentonit, Ton oder Gemische davon sind bevorzugte Trägermittel. Außerdem haben die erfi.ndungsgemäßen Wirkstoffe auch systemische insektizide Wirksamkeit gegen m. ovinus bei Schafen gezeigt.

In der Praxis sind im allgemeinen etwa 0,02 mg/kg/Tag bis etwa 3,0 mg/kg/Tag für die Bekämpfung parasitischer Infektionen bei Rindern, Schafen und Schweinen sowie Haustieren wirksam, für längere Anwendung können so geringe Mengen wie 0,002 mg/ kg Körpergewicht/Tag angewendet werden.

in der Praxis werden auch etwa 0,1 mg je kg bis 100mg je kg für mit Helminthen infizierte Tiere angewendet.

Die physikalisch-chemischen Merkmale der α, β, γ, δ, ε, ζ, η, θ, ι, κ, λ, μ, ν und ω Komponenten von LL-F28249 werden anschließend beschrieben:

1) Relative Molekülmasse: 612(FAB-MS);

2) Molekülformel: C₃₆H₅₂O₈;

3) Spezifische optische Drehung [α] ο⁶ =+133 ± 3° (C 0,3, Aceton);

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: WieinFig.1 dargestelltUV ^CH3OH = 244 nm (ε 28 000);

5) lnfrarot-Absorptio.nsspektrum:WieinFig.lldargestellt(KBrScheibe):.3439,2960,2925,1714,1454,1374,1338,1171,1120, 996, 967crrT¹;

6) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig.Ill dargestellt;

7) Magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig. IV dargestellt und in Tabelle I beschrieben; und

8) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig. V dargestellt mit genauen Massemessungen und vorgeschlagenen Elementzusammensetzungen nach Tabelle II.

1) Relative Molekülmasse: 584(FAB-MS);

2) Molekülformel: C₃₄H₄₈O₃;

3) Spezifische optische Drehung: [α] ο⁶ = +125° (C, 0,30 Aceton);

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Wie in Fig. IV dargestellt UV ^chJ3°^H = 244 nm (ε25 600);

IVl Αλ

5) Infrarot-Absorptionsspektrum: Wie in Fig.VII dargestellt (KBr Scheibe): 3520, 2910,1 735,1 717,1 450,1 375,1 335,1180, 1170,1119,993,727cm"¹;

6) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig. VIII dargestellt;

7) Magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig.XXXVIII dargestellt und in Tabelle HA beschrieben; und

8) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig. IX dargestellt, mit genauen Massemessungen und vorgeschlagenen Elementzusammensetzungen nach Tabelle III.

1) Relative Molekülmasse: 598 (FAB-MS);

2) Molekülformei: C₃₅H₅₀O₈;

3) Spezifische optische Drehung: [α] d⁶ = +150 ± 4° (C 0,3, Aceton);

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Wie in Fig.X gezeigt UV CH₃OH = 244 nm (ε 27 100);

MAX

5) Infrarot-Absorptionsspektrum: Wie Fig.Xl gezeigt (KBr Scheibe): 3510,2910,1735,1 715,1 452,1 375,1 338,1182,1172,1119, 995cm"¹;

6) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig.XII gezeigt;

7) Magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig.XIII gezeigt und in Tabelle IV beschrieben; und

8) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig. XIV gezeigt, mit genauen Massemessungen und vorgeschlagenen Elementzusammensetzungen nach Tabelle V.

LL-F 28249 ω:

1) Relative Molekülmasse: 806(FAB-MS);

2) Molekülformel: C₄₅H₇₄Oi₂;

3) Spezifische optische Drehung: [α] §⁶ = -49 ± 3 (C 0,35, Methanol);

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Wie in Fig. XV gezeigt UV CH₃OH ₌ 225 nm (ε 27 400)

MAX 232πιτι(ε25700);

5) Infrarot-Absorptionsspektrum: Wie in Fig.XVI gezeigt (KBr Scheibe): 3480, 2965, 2935, 2880,1 703,1 647,1 458,1 380,1 292, 1223,1135,1098,984cm"¹;

6) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig.XVlI gezeigt;

7) Magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig.XVIII gezeigt und in Tabelle Vl beschrieben; und

8) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig. XIX gezeigt, mit genauen Massemessungen und vorgeschlagenen Elementzusammensetzungen nach Tabelle VII.

ö - £.UO OtO

1) Relative Molekülmasse: 616(EI-MS);

2) Molekülformel: C₃₅H₅₂O₉;

3) HPLC-Retentionsvolumen von 14,OmI indem in Tabelle VIII angegebenen System;

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Methanol): Wie in Fig.XX gezeigt;

5) Magnetisches Protonen-Kemresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig.XXl gezeigt; und

6) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig.XXII gezeigt. LL-F28249S:

1) Relative Molekülmasse: 598 (EI-MS);

2) Molekülformel: C₃₅H₅₀O₈;

3) HPLC-Retentionsvolumen von 14,8ml in dem in Tabelle VIII angegebenen System;

4) Ultraviolett-Absoptionsspektrum (Methanol): Wie in Fig.XXIII gezeigt;

5) Magnetisches Protonen-Kemresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig.XXIV gezeigt; und

6) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig.XXV gezeigt. ίί-Ρ28249ζ:

1) Relative Molekülmasse: 598(EI-MS);

2) Molekülformel: C₃₅H₅₀O₈;

3) HPLC-Retentionsvolumen von 16,0ml in dem in Tabelle VIII angegebenen System;

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Methanol): Wie in Fig.XXVI gezeigt;

5) Magnetisches Protonen-Kemresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig.XXVII gezeigt; und

6) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig.XXVIII gezeigt. LL-F28249n:

1) Relative Molekülmasse: 612 (EI-MS);

2) Molekütformel: C₃₆H₅₂O₈;

3) HPLC-Retentionsvolumen von 23,5ml indem in Tabelle VIII angegebenen System;

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Methanol): Wie in Fig.XXIX gezeigt;

5) Magnetisches Protonen-Kemresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig.XXX gezeigt;

6) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig.XXXI gezeigt. LL-F282499:

1) Relative Molekülmasse: 626(EI-MS);

2) Molekülformel: C₃₇H₅₄O₈;

3) HPLC-Retentionsvolumen von 24,5ml in dem in Tabelle VIII angegebenen System;

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Methanol): Wie in Fig.XXXII gezeigt;

5) Magnetisches Protonen-Kemresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig.XXXIII gezeigt; und

6) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig.XXXIV gezeigt. LL-F 282491:

1) Relative Molekülmasse: 626(EI-MS);

2) Molekülformel: C₃₇H₅₄O₈;

3) HPLC-Retentionsvolumen von 26,0 ml in dem in Tabelle VIII angegebenen System;

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (Methanol): Wie in Fig.XXXV gezeigt;

5) Magnetisches Protonen-Kemresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig.XXXVI gezeigt;

6) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig.XXXVII gezeigt. LL-F28249K:

1) Relative Molekülmasse: 584(EI-MS);

2) Molekülformel: C₃₅H₅₂O₇;

3) Spezifische optische Drehung: [α] q⁶ = +189° (C 0,165 Aceton);

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:Wiein Fig.XXXIXgezeigtUV CH₃OH = 241 nm(E20400);

MAX

5) Infrarot-Absorptionsspektrum: Wie in Fig.XL gezeigt (KBr Scheibe);

6) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig.XLI gezeigt;

7) Magnetisches Protonen-Kemresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig.XLII gezeigt; und

8) Magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig.XLIII gezeigt und in Tabelle IX beschrieben. LL-F28249A:

1) Relative Molekülmasse: 626(FAB-MS);

2) Molekülformel: C₃₇H₅₄O₈;

3) Spezifische optische Drehung: [α] ο⁶ = +1.45° (C, 0,23 Aceton);

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Wie in Fig.XLIV gezeigt UV CH₃OH ₌ 244 nm (E 30 000);

5) Infrarot-Absorptionsspektrum: Wie in Fig.XLV gezeigt (KBr Scheibe);

6) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig.XLVI gezeigt;

7) Magnetisches Protonen-Kemresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig.XLVII gezeigt; und

8) Magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig.XLVIII gezeigt und in Tabelle X beschrieben. LL-F28249u:

1) Relative Molekülmasse: 612(EI-MS);

2) Molekülformel: C₃₇H₅₆O₇;

3) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Wie in Fig.XLIX gezeigt UV CH₃OH _ ₂41 nm (E 16800);

MAX

4) Infrarot-Absorptionsspektrum: Wie in Fig. L gezeigt (KBr Scheibe);

5) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig.Ll gezeigt;

6) Magnetisches Protonen-Kemresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig. LII gezeigt.

1) Relative Molekülmasse: 592(Ei-MS);

2) Molekülformel: C₃₆H₄₈O₇;

3) Spezifische optische Drehung: [α] §⁶ +131°—-(C 0,325, Aceton);

4) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Wie in Fig. LIII gezeigt UV CH₃OH ₌ 256 (E 20 500); 358 (E 8 830);

5) Infrarot-Absorptionsspektrum: Wie in Fig. LIV gezeigt (KBr Scheibe);

6) Elektronenstoß-Massenspektrum: Wie in Fig.LV gezeigt;

7) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig. LVI gezeigt; und

8) Magnetisches Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum (CDCI₃): Wie in Fig. LVII gezeigt und in Tabelle Xl beschrieben.

Tabelle I Kohlenstoff-13-NMR-Daten für LL-F28249Q

Kohlen	Chemische Umlagerung	Protonen-	Kohlen	Chemische Umlagerung	Protonen-
stoff	(ppm)	Substitution	stoff	(ppm)	Substitution
1	173,4	q2	18	67,8	CH
2	142,8	CH	19	67,7	CH
3	139,4	q	20	48,4	CH2
4	137,7	q	21	45,7	CH
5	137,3	q	22	41,1	CH2
6	137,2	CH	23	40,7	CH2
7	130,6	q	24	36,1	CH2
8	123,3	CH	25	36,0	CH
9	120,33	CH	26	35,9	CH
10	118,0	CH .	27	34,7	CH2
11	' 99,7	q	28	26,8	CH
12	80,2	q	29	22,8"	CH3
13	79,3	CH	30	22,2	CH3
14	76,7	CH	31	19,9	CH3
15	69,3	CH	32	15,5	CH3
16	68,5	CH	33	13,9	CH3
17	. 68,4	CH2	34	11,0	CH3

¹ UnterhalbvonTMSiCDCIa-Lösung.

² q = Quarternärer Kohlenstoff. ³'⁴ Zwei unaufgelöste Signale.

Tabellen Massenmessungen hoher Auflösung für LL-F28249a

m/z Elementzusammensetzung

612,3705	C36Hg2Os
594,3543	C36H50O7
576,3472	C36H48O6
484,3211	C30H44O5
482,2648	C29H38O6
466,3097	C30H42O4
448,2987	C3oH4o03
442,2375	C26H34O6
425,2327	C26H33O5
354,2181	C23H30O3
314,1877	C2OH26O3
278,1144	Ci5H-IsOs
265,1786	Ci6H25O3
248,1405	C15H20O3
247,1705	C16H23O2
237,1838	Ci5H25O2
219,1740	C15H23O
151,0753	C9H11O2

Tabellella

Kohlenstoff-13-NMR-Daten für LL-F28249 β

Kohlenstoff	Cherr
(ppm)*
1	173,3
2	142,6
3	139,5
4	137,7
5.	137,3
6	133,9
7	123,8
8	123,4
9	120,3
10	120,2
11	118,0
12	99,7
13	. 80,2
14	79,4
15	76,7
16	69,2
17	68,6

Chemische Umlagerung

Kohlenstoff	Chemi
(ppm)
18	68,3
19	67,8
20	67,7
21	48,4
22	45,7
23	41,0
24	40,8
25	36,1
26	35,9**
27	34,7
28	22,3
29	19,8
30	15,5
31	13,8
32	13,1
33	10,8

* Unterhalb von TMS; CDCI₃-Lösung ** Zwei unaufgelöste Signale.

Tabelle III

Massenmessungen hoher Auflösung für LL-F28249 β

Elementzusammensetzung

584,3388	C34H48O8
566,3306	C34H46O7
456,2864	C28H40O5
442,2391	C26H34O6
438,2780	C28H38O4
425,2331	C26H33O5
354,2187	C23H30O3
314,1858	C20H26O3
278,1168	C15H18O5
237,1491	C14H2i03
219,1380	Ci4HigO2
209,1534	C13H21O2
191,1418	C^H^O
151,0750	C9H11O2

Tabelle IV Kohlenstoff-13-NMR-Daten für LL-F28249Y

Kohlenstoff	Cherr
(ppm)
1	173,6
2	142,4
3	139,9
4	137,3
CJl	136,0
6	134,0
7	123,8
8	123,6
9	120,4
10	119,6
11	118,5
12	99,8
13	80,5
14	77,8
CJl	77,0
16	76,8
17	69,3
18	68,6

Chemische Umlagerung¹

Kohlenstoff	Che
(ppm)
19	68,3
20	67,9
21	57,7
22	48,5
23	45,8
24	41,2
25	40,8
26	36,2
27	36,1
28	36,0
29	34,8
30	22,3
31	19,9
32	15,5
33	13,8
34	13,1
35	10,8

Chemische Umlagerung

Unterhalb von TMS; CDC^-Lösung.

Tabelle V Massemessungen hoher Auflösung für LL-F28249y

m/z Elementzusammensetzung

598,3543	C35H50U8
580,3422	C35H48O7
562,3292	^35Π46θ6
496,2824	C30H40O6
484,2440	C28H36O7
478,2687	C30H38O5
456,2576	C27H36O6
438,2772	C2SH38O4
425,2341 .	C26H33O5
420,2651	C28H36O3
354,2199	C23H30O3
314,1875	C20H26O3
292,1307	Ci6H2o05
288,2075	C19H28O2
248,1397	C15H20O3
237,1490	C14H2IO3
219,1382	C14H19O2
209,1544	C13H21O2
191,1435	Ci3HigO
151,0759	C9H11O2

Tabelle Vl Kohlenstoff-13-NMR-Daten für LL-F28249aj

Kohlen	Chemische Umlagerung1	Kohlen	Chemische Umlagerung
stoff	(ppm)	stoff	(ppm)
1	220,7	23	42,22
2	219,6	24	40,4
3	165,2 . ·	25	38,3
4	148,7	26	37,6
5	133,1	27	36,1
6	132,3	28	34,8
7	132,1	29	33,5
8	130,2	30	30,1
9	122,3	31	26,6
10	100,0	32	25,4
11	82,9	33	24,5
12	75,9	34	23,0
13	73,0	35	21,1
14	72,7	36	17,9
15	72,6	37	14,3
16	72,1	38	14,2
17	69,0	39	12,1
18	67,3	40	11,5
19	63,6	41	10,9
20	51,4	42	8,7
21	46,2	43	8,3
22	45,7	44	5,7

1 Unterhalb von TMS; CDCI₃-LoSUrIg.

2 Zwei unaufgelöste Signale.

Tabelle VII Massemessungen hoher Auflösung für LL-F28249y

m/z

Elementzusammensetzung

462,3350	C28H46O5
444,3237	C28H44O4
425,2534	C23H37O7
407,2439	C23H35O6
406,3046	C2SH42O7
387,2895	C25H39O3
337,2010	C19H29O5
297,2031	C17H29O4
279,1944	C17H27O3
261,1851	C17H25O2
253,1797	C15H25O3
235,1697	C15H23O2
224,1754	C14H24O2
209,1530	C13H21O2
207,1744	C14H23O
184,1458	C11H20O2
179,1048	CnH15C^
173,1205	C9H17O3
167,1051	C10Hig02
155,1069	C9H15O2

Tabelle Viii

HPLC Retentionsvolumina für LL-F28249a, δ, ε, ζ, η, Θ und ι

Verbindung

Retentionsvolumen* (ml)

LL-F 28249 α LL-F 28249 δ LL-F 28249 ε LL-F 28249 ζ LL-F 28249 η LL-F 28249 Θ LL-F 282491

19,8 14,0 14,8 16,0 23,5 24,5 26,0

Das System besteht aus einer Säule, 3,9mm χ 30cm, gefüllt mit de-Umkehrphasen-Füllung, entwickelt mit MethanoliWasser (80:20) bei 1,0ml/Minute, Nachweis durch Absorptionsvermögen bei 254nm.

Tabelle IX Kohlenstoff-13-NMR-Daten für LL-F28249K

Kohlen	Chemische Umlagerung	Kohlen	Chemische Umlagerung
stoff	(ppm)*	stoff	(ppm)
1	173,9	19	56,7
2	140,7	20	48,4
3	138,3	21	47,7
4	136,6	22	41,1
CJl	136,5	23	40,6
6	133,8	24	37,1
7	124,7	25	36,3
8	124,4	26	36,0
9	123,8	27	35,9
10	120,1	28	34,6
11	118,5	29	22,0
12	99,7	30	19,3
13	77,2	31	16,0
14	76,6**	32	13,8
15	76,5	33	13,3 . .
ia	69,3	34	13,1
17	68,6	35	10,7
18	67,3

Unterhalb von TMS; CDCI₃-LOSUHg. Übereinstimmend mit CDCI₃-Signalen.

- ia-

Tabelle X Kohlenstoff-13-NMR-Daten für LL-F28249X

Kohlen	Chemische Umlagerung	Kohlen	Chemische Umlagerung
stoff	(ppm)+ ,	stoff	(ppm)
1	173,6	19	68,3
2	142,5	20	67,9
3	139,8	21	57,8
4	137,4	22	48,6
5	137,2	23	45,8
6	136,0	24	41,2
7	130,7	25	40,9
8	123,6	26	36,1++
9	120,3	27	36,0
10	119,7	28	34,9
11	118,6	29	26,9
12	99,8	30	23,0++
13	80,5	31	22,4
14	77,7	32	20,0
15	77,6	33	15,7
16	76,7	34	14,0
17	69,3	35	11,1
18	68.6

⁺ Unterhalb von TMS; CDCI₃-LOSUPg

⁺⁺ Zwei unaufgelöste Signale.

Tabelle Xl Kohlenstoff-13-NMR-Daten für LL-F28249v

Kohlen	Chemische Umlagerung	Kohlen	Chemische Umlagerung
stoff	(ppm)+	stoff	(ppm)
1	167,4	18	69,4
2	150,5	19	68,7
3	142,9	20	68,3
4	142,0	21	48,4
CJl	137,2++	22	41,0++
6	132,1	23	35,9
7	130,7	24	• 35,6
8	125,8	25	35,5
9	125,5	26	34,4 .
10	124,2	27	29,7
11	123,7	28	26,8
12	123,2	29	22,9
13	121,3	30	22,8
14	118,0	31	22,1
15	100,0	32	15,3
16	76,7	33	13,9
17	74,6	34	11,0

⁺ Unterhalb von TMS; CDCl₃-Lösung ⁺⁺ Zwei unaufgelöste Signale.·

Tabelle XII· Chromatographische Werte

TLC+	HPLC++
Komponente	gegen Rf
a	1,00
β	0,797
7	1,42
δ	0,758
ε	1,06
ζ	1,12
η	1,03
Θ	1,27
ι	1,27
κ	1,83
λ	1,56
μ	1,92
ν	1,95
ω	0,212

Retentionszeit (Minuten)

13,8 9,3 12,6 10,4 10,9 11,5 16,2 17,3 18,2 24,7 19,1 38,0 42,3 7,1

⁺ Analtech Silica GHLF25C^, entwickelt mit Ethylacetat:Methylenchlorid (1:3), Nachweis durch Verkohlen mit H₂SO₄.

⁺⁺ Altex Ultrasphere 0DS5M, 4,6mm χ 25cm, entwickelt mit 85% Methanol in Wasser bei 1,0ml/Minute, Nachweis durch Absorptionsvermögen bei 254nm.

Die neuen LL-F28249 α, β, y, δ, ε, ζ, η, Θ, ι, κ, λ, μ, ν und ω bezeichneten Mittel werden während der Züchtung von Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus, NRRL15773, unter gesteuerten Bedingungen gewonnen.

Dieser Organismus wird in der Kultursammlung der Medical Research Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New York, unter der Kulturnummer LL-F28249 aufbewahrt. Eine lebensfähige Kultur dieses Mikroorganismus wurde bei dem Patent Culture Collection Laboratory, Northern Regional Research Center, U. S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604 hinterlegt und der ständigen Sammlung einverleibt. Er ist der Öffentlichkeit unter seiner Zugangsnummer NRRL15773 in dieser Sammlung frei zugänglich.

Für die Herstellung dieser neuen Mittel ist die Erfindung nicht auf diesen speziellen Organismus beschränkt. Tatsächlich ist es der Wunsch und die Absicht, die Verwendung natürlich vorkommender Mutanten dieses Organismus sowie induzierter Mutanten, die von diesem Organismus durch verschiedene, dem Fachmann bekannte mutagene Maßnahmen wie Einwirkung von Stickstoffsenfgas, Röntgenbestrahlung, Ultraviolettstrahlung, N'-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, Actinophagen und dergleichen erzeugt werden, einzubeziehen. Ebenfals wird gewünscht und beabsichtigt, inter- und intraspezifische genetische Rekombinanten, die durch genetische, dem Fachmann bekannte Techniken wie beispielsweise Konjugation, Transduktion und genetische technische Vorgänge erzeugt wurden, mit einzubeziehen

Allgemeine Fermentationsbedingungen

Die Züchtung von Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus, NRRL15773, kann in den verschiedensten flüssigen Nährsubstraten vorgenommen werden. Für die Erzeugung der Mittel LL-F28249a, β, γ, δ, ε, ζ, η, Θ, ι, κ, λ, μ, ν und ω brauchbare Substrate enthalten assimilierbare Kohlenstoffquellen wie Dextrin, Sucrose, Melasse, Glycerol usw.; eine assimilierbare Stickstoffquelle wie Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren, Maisquellwasser usw.; und anorganische Anionen und Kationen wie Kalium, Natrium, Ammonium, Calcium, Sulfat, Carbonat, Phosphat, Chlorid usw. Spurenelemente wie Bor, Molybdän, Kupfer usw. werden als Verunreinigungen von anderen Bestandteilen des Substrates bereitgestellt. Die Belüftung in Behältern und Flaschen wird durch Blasen von steriler Luft durch das Fermentationsmedium oder auf dessen Oberfläche erzielt. Weitere Bewegung in Tanks wird durch einen mechanischen Schnellrührer erreicht. Bei Bedarf kann ein Antischaummittel wie Siliconöl zugesetzt werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Herstellung von Inokulum

Nach folgender Formel wurde ein typisches Substrat hergestellt, das für die Züchtung der verschiedenen Stufen von Inokulum verwendet wurde:

Dextrose	1,0 °/<
Dextrin	2,0 °/<
Hefeextrakt	0,5 °/c
NZAmin	0,5 °/<
Calciumcarbonat	0,1 °/<
Wasser qs	100%

Dieses Substrat wurde sterilisiert. Eine 100-ml-Portion dieses in einem Kolben befindlichen sterilen Substrates wurde mit Myzelschnitzeln von einer Schrägagarkultur von Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus NRRL15773 geimpft. Das Substrat wurde danach 48 bis 72 Stunden lang bei 28°C kräftig auf einem Drehschüttler bewegt, wodurch das Primärinokulurri gewonnen wurde. Dieses Primärinokulum wurde anschließend zum Impfen eines Liters des obigen sterilen Substrates verwendet, das dann 48 Stunden lang bei 28°C aerob gezüchtet wurde, um das Sekundärinokulum zu erhalten.'

Beispiel 2 Fermentation

Ein Fermentationssubstrat folgender Formulierung wurde zubereitet:

Dextrin	1,0°/
Sojapepton	1,0 °/ί
Melasse	2,0°/
Calciumcarbonat	0,1°/
Wasser as	100%

Dieses Substrat wurde sterilisiert, und anschließend wurde eine 30-Liter-Portion mit einem Liter nach Beispiel 1 hergestellten Sekundärinokulum geimpft. Die Fermentation wurde bei 3O⁰C mit einem sterilen Luftstrom von 30 Litern pro Minute, einem Gegendruck von 8psig und Bewegung durch einen mit 500U/min betriebenen Schnellrührer91 Stunden lang vorgenommen, worauf die Maische geerntet wurde.

Beispiel 3

Isolierung von LL-F28249a, β und γ

Eine Gesamtmenge von 26 Litern der nach der Beschreibung in Beispiel 2 hergestellten Vollerntemaische wurde mit 1 500g Diatomeenerde vermischt und filtriert. Der Myzelkuchen wurde mit 5 Litern Wasser gewaschen, und das Filtrat und die Waschlösung wurden verworfen. Der Myzelkuchen wurde im Laufe einer Stunde mit 10 Litern Methanol vermischt, anschließend filtriert und mit 5 Litern Methanol gewaschen. Der Methanolextrakt und die Methanolwaschlösung wurden zusammengenommen und zu einem wäßrigen Rückstand von etwa 1 bis 2 Litern eingedampft. In diesen wäßrigen Rückstand wurde seine doppelte Volumengenge Methylenchlorid gegeben, und es wurde V2 Stunde lang gemischt. Die Methylenchloridphase wurde abgetrennt und danach zu einem Sirup eingeengt, so daß 27 g Rohmaterial entstanden.

Diese 27 g Rohmaterial wurden in einem Gemisch von Methylenchlorid und Methanol gelöst, durch Baumwolle und wasserfreies Natriumsulfat filtriert und dann eingedampft, wodurch 7,0g eines Öls gewonnen wurden.

Eine 170-g-Portion Silicagel wurde in 12,5% Ethylacetat in Methylenchlorid aufgeschlämmt und zur Bildung einer Säule von 2,5 χ 58cm gegossen. Das Öl wurde in 12,5% Ethylacetat in Methylenchlorid gelöst und auf die Säule aufgegeben. Die Säule wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch entwickelt. Die mobile Phase wurde anfangs mit 1,3ml/Minute geführt, und 15-Minuten-Fraktionen wurden gesammelt. Nach 10 Fraktionen verlangsamte sich die Fließgeschwindigkeit auf etwa 0,5ml/ Minute, so nahmen die Fraktionen 1 bis 10 von 20 ml gleichmäßig auf etwa 10 ml ab und die Fraktionen 11 bis 98 auf etwa 7 ml.

Bei Fraktion 99 wurde die Fließgeschwindigkeit erhöht, um 25-ml-Fraktionen in 10 Minuten zu erhalten. Insgesamt wurden Fraktionen gesammelt. Diese Fraktionen wurden durch Dünnschichtchromatographie in Ethylacetat:Methylenchlorid (1:1) getestet.

Die Fraktionen 30 bis 54 wurden zusammengenommen und eingedampft und ergaben 1,08g eines LL-F28249-y enthaltenden Öls. Die Fraktionen 55 bis 62 wurden zusammengenommen und eingedampft und ergaben 150 mg LL-F28249a und β enthaltenden Feststoff.

Die 150 mg des LL-F28249« und β enthaltenden Feststoffes wurden durch präparative HPLC unter Anwendung einer Umkehrphasensäule (Whatman C8, 2,2 x 50cm), die mit 80% (V/V) Methanol in Wasser entwickelt wurde, chromatographiert.

Die Fließgeschwindigkeit betrug etwa 10ml/Minute, und 2-Minuten-Fraktionen wurden gesammelt.

Die Fraktionen 58 bis 69 wurden zusammengenommen, das Methanol wurde verdampft, t-Butanol wurde zugegeben, und das Gemisch wurde lyophilisiert, wodurch 60 mg reines LL-F28249a gewonnen wurden.

Die Fraktionen 40 bis 43 wurden zusammengenommen, das Methanol wurde verdampft, und die zurückbleibende wäßrige Suspension wurde mit Methylenchlorid extrahiert, wodurch nach Eindampfung 10 mg reines LL-F28249/3 gewonnen wurden.

Die 1,08g des LL-F28249y enthaltenden Öles wurden in 10% Ethylacetat in Methylenchlorid gelöst und auf eine mit Silicagel gefüllte Säule (2,5 χ 50cm) aufgegeben. Die Säule wurde mit 10% Ethylacetat in Methylenchlorid entwickelt, wobei die Eluierung bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Minute erfolgte und 12-Minuten-Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen 19 bis 29 wurden zusammengenommen und zu einem Rückstand eingedampft. Dieser Rückstand wurde durch präparative Umkehrphasenchromatographie, wie für die α und β Komponenten beschrieben, gereinigt. Die Fraktionen 55 bis wurden zusammengenommen, das Methanol wurde unter Vakuum verdampft, t-Butanol wurde zugegeben, und das Gemisch wurde lyophilisiert und ergab 60mg reines LL-F28249y.

Beispiel 4 .

Großtechnische Fermentation

Ein Inokulum von Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus, NRRL15773 wurde nach der Beschreibung von Beispiel 1 hergestellt, wobei 100ml Primärinokulum zur Erzeugung von 10 Litern Sekundärinokulum verwendet wurden. Zwei 300-Liter-Fermentationen wurden nach der Beschreibung von Beispiel 2 durchgeführt, wobei 10 Liter des obigen Sekundärinokulumsfür je 300 Liter Fermentationssubstrat verwendet wurden. Nach Ablauf von 118 Stunden wurden die Maischen geerntet.

Beispiel 5

Isolierung von LL-F28249qj

Eine Gesamtmenge von 450 Litern Erntemaische von den zwei in Beispiel 4 beschriebenen 300-Liter-Fermentationen wurden wie im ersten Teil von Beispiel 3 beschrieben behandelt, so daß Rohmaterial in Form eines Sirups gewonnen wurde.

Dieser sirupartige Rückstand wurde mit Hexan zur Entfernung nichtpolarer Stoffe gewaschen, und die zurückbleibenden 9g unlösliches Material wurden der Sephadex LH-20-Verteilungschromatographie unterzogen.

Die Chromatographie-Säule wurde mit 9 Litern Sephadex LH-20, das zuvor in Methanol gequollen worden war, vorbereitet, um eine Säule von 10 χ 110cm zu erhalten. Die Säule wurde äquilibriert, indem etwa 4800 ml mobile Phase (Methylenchlorid:Hexan:Methanol [10:10:1]) mit einer Fließgeschwindigkeit von 5ml/Minute hindurchgeleitet wurden. Die 9g unlösliches Material wurden in 50 ml der mobilen Phase auf die Säule aufgegeben. Es wurde ein erster Vorlauf von 2150 ml mit einer Fließgeschwindigkeit von 5ml/Minute erzielt. Die Fließgeschwindigkeit wurde anschließend auf 8 ml/Minute erhöht, und

Fraktionen wurden alle 45 Minuten gesammelt. Die Fraktionen 9 bis 12 wurden zusammengenommen, und die Lösungsmittel wurden unter Vakuum verdampft, so daß 4,9g Rückstand gewonnen wurden.

Dieser Rückstand wurde in einem 1:1-Gemisch von Cyclohexan und Ethylacetat gelöst und bei Raumtemperatur zum langsamen Verdunsten stehen gelassen. Durch die Zugabe von η-Hexan entsteht ein Präzipitat, das gesammelt wurde und 3,1 g Feststoff ergab.

Eine 3,0-g-Portion dieses Feststoffes wurde durch Ausfällung aus 25 ml Methylenchlorid unter Verwendung von 50 ml n-Hexan weiter gereinigt.

Das auf diese Weise gewonnene Präzipitat wurde wieder in 15 ml Methylenchlorid gelöst und mit 25 ml η-Hexan ausgefällt, so daß 510mg reines LL-F28249w gewonnen wurden.

Beispiel 6

Isolierung von LL-F282498, ε, ζ, η, Θ und ι

Die Fraktionen 4 bis 7 von der in Beispiel 5 beschriebenen Sephadex-LH-20-Säule wurden zusammengenommen und die Lösungsmittel unter Vakuum verdampft, so daß 1,9g Rückstand blieben.

Dieser Rückstand wurde auf einer 200-g-Silicagel-Säule (2,5cm x 83cm) unter Verwendung von 10% Ethylacetat in Methylenchlorid als Eluierungsmittel chromatographiert. Die Fließgeschwindigkeit betrug etwa 2 ml/Minute, und Fraktionen wurden alle 12 Minuten gesammelt.

Die Fraktionen 65 bis 67 und 73 bis 79 wurden alle zusammengenommen und die Lösungsmittel unter Vakuum verdampft, so daß 250mg Rückstand blieben.

Diese 250 mg Rückstand wurden der präparativen Umkehrphasenchromatographie nach der Beschreibung in Beispiel 3 unterzogen, nur wurde 75% Methanol in Wasser als mobile Phase verwendet. Die Fließgeschwindigkeit betrug etwa 10ml/ Minute. Die erste 2000-ml-Portion Eluat wurde in den Abfall geleitet, danach wurden 72 Fraktionen in Abständen von 2,0 Minuten gesammelt. Nachdem ein weiterer Teil Eluat beseitigt worden war, wurden (zwischen 300 und 400 ml) Fraktionen wieder, aber im Abstand von 2,5 Minuten gesammelt.

Die Fraktionen wurden wie unten angegeben zusammengenommen. Die zusammengenommenen Fraktionen wurden über Nacht unter einer Abzugshaube zum Verdunsten stehen gelassen, danach wurden die Komponenten in Methylenchlorid extrahiert. Nach der Verdampfung des Lösungsmittels wurde jeweils etwa 1 mg von den reinen Komponenten gewonnen.

Zusammengenommene Fraktionen Verbindung

7-10 LL-F 28249 δ

19-22 LL-F 28249 ε

28-31 LL-F 28249 ζ

81-83 LL-F 28249 η

86-88 LL-F 28249 Θ

93-95 LL-F 282491

Beispiel 7

Isolierung von LL-F28249K, λ, μ und v

Eine Gesamtmenge von 390 Litern der Fermentationsmaische, die von den nach der Beschreibung in Beispiel 2 durchgeführten Fermentationen geerntet worden war, wurde im wesentlichen nach der Beschreibung im ersten Abschnitt von Beispiel 3 behandelt und ergab 120ml Methylenchloridkonzentrat. Dieses Konzentrat wurde mit 200 ml Hexan verdünnt und über Nacht bei 4°C gekühlt. Das resultierende Präzipitat wurde durch Filtration entfernt und verworfen. Das Filtrat wurde mit 300 ml Hexan verdünnt. Das resultierende Präzipitat (A) wurde durch Filtration gesammelt und aufbewahrt. Dieses Filtrat wurde zur Trockne eingedampft, und der ölige Rückstand wurde danach in 200 ml Methylenchlorid gelöst und mit 1 700ml Hexan verdünnt. Das resultierende Präzipitat (B) wurde durch Filtration gesammelt und aufbewahrt. Dieses Filtrat wurde zu einem öligen Rückstand eingeengt, der dann wieder in 50ml Methylenchlorid gelöst wurde, 950 ml Methanol wurden dazugegeben, und diese Lösung wurde 3 Tage lang bei 4°C aufbewahrt. Das resultierende Präzipitat wurde durch Filtration entfernt und verworfen. Das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft, und der Rückstand (C) wurde mit (A) und (B) zusammengenommen und der Chromatographie wie folgt unterzogen: Die 5,0 χ 109cm-Säule war mit breiigem Woelm-TSC-Silicagel in EthylacetatiMethylenchlorid (1:9) gefüllt. Die Säule wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch bei einer Geschwindigkeit von 25 ml/Mi nute entwickelt. Die ersten 2 Liter Auslaufstrom wurden verworfen, dann wurden sechzehn 400-mi-Fraktionen gesammelt.

Die Fraktionen 2 und 3 wurden zusammengenommen und eingedampft und ergaben 3,9g öliges Material (D).

Die Fraktionen 4 bis 7 wurden zusammengenommen und eingedampft und ergaben 9,5g öliges Material, das in Hexan gelöst und auf einer mit 300 g breiigem Woelm-Silicagel in Ethylacetat:Hexan (1:4) gefüllten 2,5 χ HOcm-Säule chromatographiert wurde. Die Säule wurde mit dem gleichen Lösungsmittelsystem mit einer Geschwindigkeit von 4ml/Minute entwickelt, wobei Fraktionen in Abständen von 7 Minuten gesammelt wurden.

Die Fraktionen 45 bis 54 wurden zusammengenommen und eingedampft und ergaben 0,3g Material (E).

Die Fraktionen 63 bis 135 wurden zusammengenommen, bis zur Trockne eingedampft, danach wieder in t-Butanol gelöst und lyophilisiert und ergaben 4,6g gräulichen Feststoff (F).

LL-F28249Kund^

Material (D) und (E) wurden zusammengenommen und auf einer mit 300g Woelm-Silicagel gefüllten 2,5 χ 110cm-Säule unter Entwicklung mit Ethylacetat:Hexan (1:9) chromatographiert. Die Fließgeschwindigkeit wurde auf 4ml/Minute gehalten, und Fraktionen wurden in Abständen von 7 Minuten gesammelt.

Die Fraktionen 67 bis 115 wurden zusammengenommen und zur Trockne eingedampft und ergaben 920 mg Rückstand (G).

Dieser Rückstand (G) wurde durch präparative HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasensäule (Whatman C8, 2,2 χ 50cm) und Entwicklung mit 85% (V/V) Methanol in Wasser chromatographiert. Die Fließgeschwindigkeit betrug etwa 10 ml/Minute, und in Abständen von 2,5 Minuten wurden Fraktionen gesammelt.

Die Fraktionen 33 bis 40 wurden zusammengenommen, zur Entfernung von Methanol eingeengt und anschließend mit Methylenchlorid extrahiert. Der nach dem Eindampfen gewonnene Rückstand wurde in t-Butanol gelöst und danach lyophilisiert und ergab 60mg LL-F28249K.

- "I / - £9O OtO

Die Fraktionen 52 bis 58 wurden ähnlich behandelt und ergaben eine geringe Menge LL-F28249^.

Eine 1-g-Portion von Material (F) wurde nach obiger Beschreibung durch Umkehrphasen-HPLC Chromatographien, nur wurden 80% (V/V) Methanol in Wasser als Eluierungsmittel verwendet.

Die Fraktionen 61 bis 75 wurden zusammengenommen und wie oben behandelt, so daß 100 mg LL-F28249λ gewonnen wurden.

Eine396-g-Portion eines Materials, das im wesentlichen das gleiche wie das obige Material (D) war, wurde in 500 ml Methanol gelöst und anschließend mehrere Stunden lang bei 4⁰C gekühlt. Das resultierende Präzipitat wurde durch Filtration entfernt, mit kaltem Methanol gewaschen und verworfen. Das mit der Waschlösung zusammengenommene Filtrat wurde eingedampft. Das zurückbleibende Öl wurde in Hexan gelöst und auf eine mit trockenem Silicagel gefüllte 5 x 50-cm-Säule(MallinkrodtSilicARcc-

7) aufgegeben. Die Säule wurde mit Ethylacetat: Hexan (1,5:8,5) mit einer Geschwindigkeit von etwa 50 ml/Minute eluiert.

Es wurden vier Fraktionen gesammelt

Fraktion	Volumen (Liter)
1	1
2	4
3	1
4	2

Fraktion 3 wurde eingedampft udn ergab 5,0g Rückstand der durch präparative Umkehrphasen-HPLC (Waters C₁₈, 5 x 60cm) gereinigt wurde. Die Säule wurde anfangs mit 16 Litern 80% Methanol in Wasser (V/V) bei 100 ml/Minute entwickelt, mit 6,4 Litern 84% Methanol in Wasser (V/V). Der erste Liter Auslaufstrom wurde verworfen, und danach wurden Fraktionen von 400ml gesammelt.

Die Fraktionen 44 bis 47 wurden zusammengenommen und wie oben beschrieben behandelt, so daß 390mg LL-F28249 ν als schwach gelber Feststoff gewonnen wurden.

Beispiel 8 Antinematode Wirksamkeit von LL-F28249, NRRL15773

Bei diesem in vitro Versuch soll die frei lebende Nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) zum Nachweis der antinematoden Wirksamkeitvon Fermentationsbrühen gegen Bodenmikroorganismen benutzt werden. Das Versuchsverfahren besteht darin, daß 50 /xl jeder Brüheineineder96 Vertiefungen einer Mikrokulturplatte mikropipettiert werden und 10μΙ einer drei bis vier Tage alten Kultur von C. elegans (in allen Entwicklungsstadien), in C. briggsae Maintance Medium suspendiert, hinzugegeben werden. Die Wirkungen der Fermentationsbrühen werden beobachtet und 48 Stunden nach dem ersten Vermischen von Brühe und Nematoden notiert.

LL-F28249, NRRL15773, Brühe tötete alle ausgewachsenen Organismen und reduzierte das Überleben und die Beweglichkeit verschiedener Larvenstadien sowohl bei dem ersten Versuch als auch bei einem Wiederholungsversuch erheblich.

Beispiel 9 Anthelminthische Wirksamkeitvon LL-F28249, NRRL15773 in vivo

Mit diesem in vivo System soll die potentielle anthelminthische Aktivität aller Fermentationsprodukte nachgewiesen werden, von denen festgestellt wurde, daß sie anti-nematode Wirksamkeit gegen C. elegans besitzen. Proben von LL-F28249, NRRL15773, werden in das Futter in Konzentrationen von 0,0031 % bis 2,0% (31 ppm bis 20000 ppm) eingemischt. Medikamentöses Futter, das die verschiedenen Konzentrationen von LL-F28249, NRRL15773, enthält, wird mit 400 Trichostrongylus colubriformis des dritten Larvenstadiums infizierten Rennmäusen vorgesetzt. Das medikamentöse Futter wird nach Belieben vom siebenten Tag nach der Infektion ab dreieinhalb bis vier Tage lang gegeben, worauf die Rennmäuse seziert werden. Die Eingeweide werden entfernt und zwei Stunden lang in Wasser in einem Inkubator mit 45°C gegeben, damit die Parasiten aus dem Gewebe hervorkommen können. Die Wirksamkeit jeder Behandlung wird durch Zählen der Anzahl der gesammelten T. colubriformis im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle bestimmt. Die Ergebnisse dieser Versuche, die in der folgenden Tabelle XIII zusammengefaßt sind, demonstrieren die anthelminthische Wirksamkeit von LL-F28249, wenn es im Futter verabreicht wird, und wenn es als einmaliger oraler Arzneitrank und durch subkutane Injektion verabreicht wird.

Tabelle XIII

Anthelminthische Wirksamkeit aktiver Substanzen von LL-F28249, NRLL15773-Kultur gegen Trichostrongylus colubriformis in der Rennmaus

F28249

In medikamentösem Futter, nach Belieben

Vollmaische	Konz. (ppm)	500,0	250,0	125,0	100,0 100,0 0,5	50,0 100,0 0,1 "	50,0 100,0 0,1	62,5	0,025
(lyophilisiert)	Wirksamkeit %	100,0	98,0	88,0	100,0	100,0 0,1	60,0	40,0	6,0 0,025
a	Konz. (ppm)	20,0	0,5	0,1	78,0 — 0,1 30,0 als subkutane Injektion	0,05	10,0
	Wirksamkeit %	100,0 100,0 97,0 als einmaliger oraler Arzneitrank	100,0 100,0 0,2	31,0
Vollmaische (lyophilisiert) a	Dosis (mg/kg) Wirksamkeit % Dosis (mq/kq)	200,0 100,0 10,0	99,5	25,0 88,0 0,05
Ύ	Wirksamkeit%	100,0	99,0 0,05
ω		—	15,0
Vollmaische (lyophilisiert) a	Dosis (mq/kq) Wirksamkeit Dosis (mq/kq)	200,0 100,0 1,0	25,0 70,0
	Wirksamkeit %	100,0

Beispiel 10 Anthelminthische Aktivität von LL-F28249a gegen parasitische IMematoden bei Schafen

Bei diesem Versuch soll die Aktivität von LL-F28249a gegen die wirtschaftlich bedeutenden Parasiten von Schafen ermittelt werden. Die Schafe werden versuchsweise mit infektiösen Larven von Haemonchus contortus, Ostertagia circumcincta und Trichostrongylus coluriformis geimpft, um Infektionen zu schaffen, gegen die LL-F28249a beurteilt werden soll. Einundzwanzig Tage nach der Impfung werden die Infektionsgrade durch Standard-Stoll-Nematodenanzahl-Zählverfahren ermittelt, um die Anzahl von Eiern jeder Spezies pro Gramm Exkremente zu bestimmen. Die Schafe werden willkürlich drei Wiederholungsbehandlungs- und Kontrollgruppen aufgrund der Nematoden-Eizählungen zugeordnet. Zweiundzwanzig Tage nach der Infektion werden die Schafe mit LL-F28249 α unter Anwendung der in der folgenden Tabelle XIV angeführten Dosismengen und Verabreichungswege behandelt. Sieben und acht Tage nach der Behandlung werden die Schafe getötet, und die Würmer werden unter Anwendung von herkömmlichen anthelminthischen Beurteilungsverfahren gesammelt. Die Wirksamkeit jeder Behandlung gegen jede Spezies wird durch einen Vergleich der Anzahl von Würmern bei der jeweiligen Dosismenge mit der Anzahl von Würmern, die bei den drei unbehandelten Kontrolltieren gefunden wurden, ermittelt. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen, die in der folg enden Ta bei le XIV zusammengefaßt sind, zeigen den hohen Wirkungsgrad von LL-F28249a als anthelminthisches Mittel.

Tabelle XIV

Anthelminthische Wirksamkeit von LL-F28249« gegen Haemonchus, Ostertagia und Trichostrongylus bei Schafen

mg/kg

Verabreich, art

Wirksamkeit% gegen

Haemonchus

Ostertagia

T. colubriformis

oral

oral

oral

IM

IM

100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

100,0 100,0 95,4 100,0 100,0

99,9

99,9

99,0

•100,0

100,0

Durchschnittsanzahl dergesammelten Würmer (Bereich)

2 683,0

881,0

16 200,0

IM .= Intramuskulär

Beispiel 11 Wirksamkeit von antibiotischem LL-F28249 α gegen parasitische Insekten, Melophagus pvinus (die Schaf lausfliege) bei Schafen

Dieser Versuch wird gleichzeitig bei dem gleichen Schaf vorgenommen, das für die Bestimmung der anthelminthischen Aktivität nach" Beispiel 10 herangezogen wurde. Während des Umganges mit den Schafen vorder Behandlung werden die Schafe auf das Vorhandensein von natürlichem Befall durch M. ovinus hin beobachtet. Sieben Tage nach der Behandlung wird eine Hälfte jedes Schafes auf Anzeichen von anti-ectoparasitischer Aktivität bei Nekropsie untersucht.

Die linke Seite jedes Schafes wird vorsichtig mit elektrischen Scheren geschoren und auf lebende und tote Schaflausfliegen hin untersucht. Der Grad der Verseuchung wird durch die Anzahl der in der Wolle während der Untersuchung gefundenen Puppen approximiert und von 0 bis + + + bewertet, das keine Puppen bis viele Puppen angibt. Die Anzahl der Schaflausfliegen wird von jedem Schaf ohne Kenntnis der Behandlungsgrade notiert, um Vorurteile auszuschließen. Anfangs wurden die Schaflausfliegen

als tot oder lebendig eingestuft, aber mit zu nehmenden Erfahrungen wurden ei nigeSchafl ausfliegen wegen anormal langsamen Verhaltens als sterbend eingestuft.

Obwohl es große Unterschiede in der Anzahl von auf Schafen gefundenen Schaf lausfliegen gibt, zeigen die in der folgenden Tabelle XV zusammengefaßten Ergebnisse, daß LL-F28249a gegen M. ovinus wirksam ist, und daß dieses Mittel systemische ectoparasitische Aktivität besitzt. Bei behandelten Tieren wird die Anzahl der lebenden SchafIausfliegen wirksam verringert, und die Anzahl dertoten Schaflausfliegen nahm bei den intramuskulär behandelten Schafen zu.

Tabelle XV

Wirksamkeit des Mittels LL-F28249a gegen Melophagus ovinus bei Schafen

Dosis Verabreich.- Durchschnittl. Anzahl von Schaflausfliegen^a

mg/kg art

lebend tot %

1,0 intramuskulär , 1,67 1,67 78,22

OJ? intramuskulär 1,0 4,33 86,96

1,0 oral 7,67 0,0 0,0

0,2 oral 2,67 3,0 65,0

OjI oral 22,0 1^67 J)₁O

Kontrolle keine 7,67 0,67 —

a Drei Schafe je Dosis ·

Durchschn. Anzahl in Kontrolle - Durchschn. Anzahl der behandelten b Wirksamkeit"/=, = 100 χ

Durchschn. Anzahl in Kontrolle

Beispiel 12 Insektizide Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen

Die insektizide Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen gegen eine Vielzahl von Insekten bei verschiedenen Konzentrationen von Wirkstoff in Aceton-Wasser-Lösungen wird durch die folgenden Insektiziden Testbeispiele bestimmt. Die Ergebnisse dieses Test sind in Tabelle XVI zusammengefaßt, a) Heliothis virescens. Eier, Baumwollkapselwurm.

Ein junges 7 bis 8cm langes Baumwollblatt wird in eine Testsuspension eingetaucht und drei Sekunden lang darin bewegt. Eier werden auf Mull gesammelt, der in Quadrate von 10 bis 20mm geschnitten wird, die etwa 50 bis 100 Eier (6 bis 30 Stunden alt) enthalten. Ein Mullquadrat mit Eiern wird gleichfalls in die Testsuspension eingetaucht und auf das behandelte Blatt gelegt. Die Kombination wird zum Trocknen unter den Abzug gelegt. Danach wird die Kombination in eine 8-Unzen-Dixie-Schale Nr. 2168-St (240 ml, 6cm hoch, oberer Durchmesser 9,5cm, unterer Durchmesser 8cm) gegeben, die ein 5 cm langes Stück feuchten Dentaldocht enthält. Ein durchsichtiger Plastedeckel wird oben auf die Schale gelegt, und die Behandlung wird drei (3) Tage lang weitergeführt, bevor Sterblichkeitszählungen vorgenommen werden.

B) Aphis fabae, gemischte Instar, Bohnenblattläuse.

Töpfe, die eine etwa 5cm hohe einzelne Pflanze der Kapuzinerkresse (Tropaeolum sp) enthalten, werden mit etwa 100 Blattläusen einen Tag vordem Versuch infiziert. In einem Abzug wurde jede Pflanze mit der Testsuspension bei 2 Umdrehungen auf einem Drehtisch mit 4 U/min unter Verwendung eines Devilluss-Zerstäubers Nr. 154 gespritzt. Die Töpfe werden seitlich auf weiße Emailleschüsseln gesetzt und zwei (2) Tage lang dort gehalten. Danach werden die Sterblichkeitsbeurteilungen der Blattläuse vorgenommen.

C) Empoasca abrupta. Erwachsene „Westliche Kartoffelblatthüpfer"

Ein etwa 5cm langes Sieva-Limabohnenblatt wird in die Testsuspension eingetaucht und drei (3) Sekunden lang darin bewegt und danach zum Trocknen unter einen Abzug gelegt. Das Blatt wird in eine 100 χ 10mm große Petrischale gelegt, die ein feuchtes Filterpapier auf dem Schalenboden enthält. Danach werden 10 ausgewachsene „Blatthüpfer" in jede Schale gegeben, und die Behandlung wird drei (3) Tage lang fortgeführt, worauf die Sterblichkeitszählungen vorgenommen werden.

D) Trichoplusia ni, dritte Instar-Larven, „Kohlspanner".

Die bis zu einer Länge von 7 bis 8cm gewachsenen Blätter einer Sieva-Limabohnenpflanze werden in eine Testsuspension eingetaucht und drei (3) Sekunden lang darin bewegt und danach zum Trocknen unter einen Abzug gelegt. Ein Blatt wird danach abgeschnitten und in eine 100 χ 10 mm große Petrischale, die ein feuchtes Filterpapier auf dem Boden enthält, gelegt, und zehn dritte Instar-Larven werden darin untergebracht. Die Schale wird drei (3) Tage stehen gelassen, bevor Beurteilungen über die Sterblichkeit und reduzierte Futteraufnahme angestellt werden.

E) Spodoptera eridanis, dritte Instar-Larven, „Südlicher Heerwurm".

Die Blätter einer Sieva-Limabohnenpflanze mit einer Länge von 7 bis 8cm werden in die Testsuspension eingetaucht und drei (3) Sekunden lang darin bewegt und dann zum Trocknen unter einen Abzug gelegt. Ein Blatt wird danach abgeschnitten und in eine, ein feuchtes Filterpapier auf dem Boden enthaltende Petrischale von 100 x 10mm gelegt, und zehn (10) dritte Instar-Larven werden hinzugegeben. Die Schale wird fünf (5) Tage lang stehen gelassen, bevor Beurteilungen hinsichtlich der Sterblichkeit, reduzierten Futteraufnahme oder irgendwelcher Störungen der normalen Häutung angestellt werden.

F) Heliothis virescens, dritte Instar-Larven, Baumwollkapselwurm

Baumwollkeimblätter werden in die Testsuspension eingetaucht und zum'Trocknen unter einen Abzug gelegt. Das Keimblatt wird in 4 Stücke geschnitten, und jedes Stück wird in eine 30-ml-Plastemedizinschale, die ein 5 bis 7 mm langes Stück feuchten Dentaldochtes enthält, gegeben, in jede Schale wird eine dritte Instar-Larve gelegt, und ein Pappdeckel wird auf jede Schale gelegt. Die Behandlungen werden drei (3) Tage lang fortgeführt, bevor Zählungen der Sterblichkeit und Beurteilungen über reduzierte Futteraufnahme angestellt werden.

G) Musca domestica, Hausfliege.

Die verlangte Konzentration der Testverbindung wird zu dem Standard-CSMA-Luzerne-Kleie-Larvenmedium gegeben. Null bis

4 Stunden alte Hausfliegeneier werden in das behandelte Medium gegeben. Das behandelte Medium wird stehen gelassen, und Beobachtungen hinsichtlich des Eischlüpfens, Larvenwachstum und des Auskriechens von erwachsenen Tieren werden angestellt.

H) Tribolium confusum, amerikanischer Reismehlkäfer.

Amerikanischer Reismehlkäfer (Tribolium confusum) werden von Laboratoriumskolonien, die auf einem Gemisch von Weizenvollkorn- und Weißmehl gezüchtet wurden, bezogen. Für diesen Test wird Weißmehl mit einer Acetonlösung des Testmaterials behandelt, wofür 1 ml Lösung pro 5 Gramm Mehl in einem 30-ml-Weithalskolben verwendet werden. Das Aceton kann über Nacht unter einem Abzug verdunsten. Der Inhalt wird mit einem Spachtel gerührt, um durch die Testlösung gebildete Klumpen zu zerteilen. Der Kolben wird danach auf einen VORTES-GENIE®-Vibrationsmischer gestellt, um die Testmaterialien gründlich mit dem Futter zu vermischen. Zehn ausgewachsene amerikanische Reismehlkäfer werden in jeden Kolben gegeben und der Kolben wird lose verschlossen. Nach fünf (5) Tagen Zeit zur Eiablage werden die Käfer entnommen und Aufzeichnungen über die Sterblichkeit gemacht. Zwei (2) und vier (4) Wochen nach dem anfänglichen Befall werden Beobachtungen über die Anzahl und Größe der von den sich entwickelnden Larven im behandelten Mehl erzeugten Spuren angestellt. Solche Beobachtungen liefern einen Hinweis auf verzögertes Wachstum, Absterben von Eiern oder Larven oder irgendwelche anderen Störungen im normalen Entwicklungsverlauf. Nach etwa neun (9) Wochen bei 27⁰C schlüpfen die erwachsenen Käfer, und die abschließenden Beobachtungen werden durch Sieben des Inhalts jedes Kolbens durch ein 50-Maschen-Sieb vorgenommen.

Diese Beobachtungen betreffen die Anzahl erwachsener Tiere, Puppen und Larven, sowie die Untersuchung der Rückstände, die nicht durch das Sieb hindurchgingen, um zu ermitteln, ob sich darin irgendwelche abgestorbenen Eier oder Neonaten befinden.

I) Tetranychus urticae (P-resistenter Stamm), Gemeine Spinnmilbe

Sieva-Limabohnenpflanzen mit 7 bis 8cm langen Blättern werden ausgewählt und auf eine Pflanze je Topf reduziert. Ein kleines Stück wird von einem der Hauptkolonie entnommenen Blatt abgeschnitten und auf jedes Blatt der Testpflanzen gelegt. Das erfolgt etwa zwei (2) Stunden vor der Behandlung, damit die Milben auf die Testpflanze kriechen und Eier ablegen können. Die Größe des abgeschnittenen Stückes wird variiert, damit etwa 100 Milben je Blatt erhalten werden. Zum Zeitpunkt der Behandlung wird das zur Übertragung der Milben verwendete Blattstück entfernt und weggeworfen. Die mit Milben infizierten Pflanzen werden in die Testformulierung eingetaucht und drei (3) Sekunden lang darin bewegt und unter einen Abzug zum Trocknen gelegt. Die Pflanzen werden zwei (2) Tage lang stehen gelassen, bevor mit den Beurteilungen über die Abtötung ausgewachsener Tiere unter Verwendung des ersten Blattes begonnen wird. Das zweite Blatt wird weitere fünf (5) Tage an der Pflanze gelassen, bevor Beobachtungen über die Abtötung von Eiern und/oder frisch geschlüpfte Nymphen angestellt werden.

J) „Südlicher Heerwurm" (Spodoptera eridania), dritter Instar, systemischer Stengelschnitt-Test.

Die Verbindung wird als Emulsion formuliert, die 0,1 g Testmaterial, 0,1 g polyethoxyliertes Pflanzenöl in 0,4g Wasser, 10ml Aceton und 90 ml Wasser enthält. Dieses Gemisch wird zehnfach mit Wasser verdünnt, um die TOO ppm Emulsion für den Test zu gewinnen. Sieva-Limabohnenpflanzen mit gerade entwickelten Primärblättern werden für diesen Versuch verwendet. Diese Blätter werden mindestens 2,5cm über dem Erdboden abgeschnitten, um eine Verunreinigung mit Bodenbakterien zu verhindern, die zu einem Faulen des Stengels während des Tests führen könnten. Die zerschnittenen Stengel werden in die Testemulsion gelegt. Nach drei (3) Tagen Aufnahme, wird ein Blatt abgeschnitten und inefrie 100 x 10 mm große Petrischale, die ein feuchtes Filterpapier auf dem Boden und zehη dritte Instar-Larven enthält, gelegt. Nach drei (3) Tagen werden Zählungen der Sterblichkeit und Beurteilungen über reduzierte Futteraufnahme angestellt.

K) Thrips palmi, Blasenfüßer.

Stark infizierte Blätter von Baumwollsämlingen werden unter Feldbedingungen mit den verlangten Konzentrationen gespritzt.

Die Anzahl der Blasenfüßer wird vor und nach dem Spritzen gezählt. Die prozentuale Bekämpfung basiert auf diesen Zählungen.

L) Tetranychus urticae (P-resistenter Stamm), Gemeine Spinnmilbe

Die Verbindung wird als Emulsion formuliert, die 0,1 g des Testmaterials, 0,1 g polyethoxyliertes Pflanzenöl in 0,4g Wasser, 10 ml Aceton und 90 ml Wasser enthält. Dieses Gemisch wird zehnfach mit Wasser verdünnt, um die 100 ppm Emulsion für den Versuch zu gewinnen. Sieva-Limabohnenpflanzen mit gerade entwickelten Primärblättern werden für den Versuch verwendet.

Sie werden mindestens 2,5cm über dem Erdboden abgeschnitten, um eine Verunreinigung durch Bodenbakterien zu verhindern, die zum Faulen des Stengels während des Tests führen könnten. Die geschnittenen Stengel werden in die Testemulsion gegeben.

Jedes Blattwird mit annähernd 100 ausgewachsenen Milben infiziert und drei (3) Tage lang liegen gelassen, bevor Zählungen der Sterblichkeit vorgenommen werden.

Tabelle XVI

Insektizide und mitizide Aktivität von F-28.249« und F-28.249y Prozentuale Sterblichkeit

	Konz.	Kohl	Südl.	Baum-	Baum-	Boh-	Westl.	Reis-	Haus-	Bla	Mil	Systemische
	in	käfer	Heer	woll-	woll-	nen-	Kar-	mehl-	flie-	sen	ben	Pflanzen-
	ppm		wurm	kap-	kap-	blatt-	tof-	käfer-	gen-	fü		äktivität
Verbindung				sel-	sel-	laus	fel-	Larven	lar-	ßer		Südl. MiI-
				wu rm	wurm-		blatt-	u./oder	ven			Heer- ben
					Eier		käfer	-Puppen				wurm
	1000	100	100	100	—	—	55+	100	100	93	—
	300	10O+	—	100	100	—	50	—	100	89	100
	100	—	6O+	10O+	100	100	—	97	—	—	100
F-28.249a	1000	—	40	5O+	100	100	20	—	—.	—	100	— —
F-28.249«	100	—	0	0	0	100	0	—	—	—	90	— —
F-28.249a											60 100
F-28.249y											— —
F-28.249y											— —

⁺ Futteraufnahme reduziert (Anti-Freß-Eigenschaften)

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von neuen, zur Bekämpfung von Pflanzennematoden geeigneten antibiotischen Verbindungen mit den Bezeichnungen

LL-F 28249a, LL-F 28249,3, LL-F 28249?

LL-F 282496, LL-F 28249ε, LL-F 28249ξ,

LL-F 28249η, LL-F 28249Θ, LL-F 28249ι,

LL-F 28249k, LL-F 28249Λ, LL-F 28249Μ,

LL-F 28249V und LL-F 28249ω, gekennzeichnet dadurch, daß der Organismus Streptomyceccyaneogriseusnoncyanegenus, NRRL 15773 oder eine LL-F 28249a, ß,y, 8, ε, ζ, η, Θ, ι, κ, λ, μ, ν und ω erzeugende Mutante davon in einem flüssigen Nährsubstrat, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Anionen und Kationen enthält, aerob fermentiert wird, bis eine nennenswerte Menge von LL-F 28249a, ß, y, δ, ε, ξ, η, Θ, ι, κ, λ, μ, ν und ω in dem Nährsubstrat erzeugt worden ist, woraufhin die obigen Verbindungen daraus gewonnen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß bei der aeroben Fermentierung das Nährsubstrat, das mit einer lebensfähigen Kultur des Organismus Streptomyces cyaneogriseus noncyanegenus NRRL15733 oder einer LL-F 28249a,/3, γ, δ, ε, ξ, η, Θ, ι, κ, λ, μ, ν und ω erzeugenden Mutante davon geimpft wurde, die Fermentationskultur 80 bis 200 Stunden lang unter steriler Belüftung und Bewegung bei einer Temperatur von 24 bis 32°C gehalten wird, woraufhinman die Maische erntet und die Verbindungen extrahiert.